CN103146792A - 龟裂链霉菌发酵生产土霉素的培养基及发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素的培养基及发酵方法，本发明通过采用低温黄豆饼粉代替常规的黄豆饼粉，停止动物性蛋白物质，及优化培养基配方，从而解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现土霉素稳定、高效的生产。同时，利用本发明所提供的培养基及方法发酵生产土霉素，可提高发酵单位，使土霉素的发酵单位达到34000u/ml以上，同国内常规工艺相比，发酵单位提高了6%以上；缩短发酵周期，与现有技术相比，缩短5%以上，提高土霉素产量，提高生产效率，达到节能降耗的目的。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素的培养基及发酵方法。
背景技术
土霉素为广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都有抑制作用，对衣原体、立克次氏体、霉形体、螺旋体等也有一定的抑制作用。土霉素主要用于防治畜禽大肠杆菌、沙门氏菌感染、巴氏杆菌、布氏杆菌感染及猪喘气病、鸡慢性呼吸道病；也常用于治疗狗的立克次氏体病、猫的传染性贫血，预防狗的衣原体病和钧端螺旋体病；局部用于坏死杆菌所引起的子宫内膜炎及组织坏死等；作为饲料舔加剂使用，具有促进生长和提高饲料转化率的作用。
据报道，国内生产土霉素采用发酵模式，存在的主要问题有以下几点：
1 种子、发酵培养基成分复杂。国内采用发酵模式生产土霉素，其发酵培养基中氮源分别由动物性蛋白和植物性蛋白混合组成，其成分比例对发酵结果影响较大。使用花生饼粉和棉籽饼粉作为发酵培养基的氮源，由于其质量差，杂质含量高，影响菌种代谢产物，导致发酵液颜色加深，发酵单位较低，发酵单位一般为20000～23000，最终影响产品质量；如果动物性蛋白配伍比例高，则发酵过程中会产生大量泡沫，如不严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌。同时由于发酵液粘度较高，对后提炼的收率影响较大。
2 土霉素发酵培养添加的有机氮源动物性蛋白质，如鱼粉、脂肪类提取物，由于受到市场行情和季节的影响，采购的成本和压力大。
3 土霉素发酵模式采用三级发酵。发酵周期长，能耗高；工艺控制较为复杂，特别是温度、搅拌速度、补料和pH控制参数对发酵单位、发酵液体积影响较大。
4 由于受到培养基配方、生产工艺和发酵环境的影响，国内土霉素生产厂家的发酵技术水平差异大，其发酵水平控制在20000～30000u/ml。
发明内容
本发明目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现土霉素稳定、高效生产的龟裂链霉菌发酵生产土霉素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产土霉素的发酵方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中包含有低温黄豆饼粉。
上述一级种子培养基的组成为：玉米浆3～4ml/L、低温黄豆饼粉5～10g/L、硫酸铵6～8g/L、玉米淀粉15～20g/L、碳酸钙2～3g/L、氯化钠0.9～1g/L、磷酸二氢钾0.3～0.4g/L、氯化钴0.004～0.007g/L、酵母粉5～10g/L、麦芽糊精15～20g/L、玉米油15～20g/L。
上述二级种子培养基的组成为：玉米浆15～20ml/L、低温黄豆饼粉22～25g/L、硫酸铵50～80g/L、玉米淀粉80～90g/L、碳酸钙14～16g/L、氯化钠0.9～1.1g/L、磷酸二氢钾3.0～4.0g/L、氯化钴0.006～0.008g/L、酵母粉60～70g/L、麦芽糊精50～60g/L、玉米油20～25g/L。
上述发酵培养基的组成为：玉米浆80～100ml/L、低温黄豆饼粉100～120g/L、硫酸铵300～320g/L、玉米淀粉580～600g/L、碳酸钙45～50g/L、氯化钠0.9～1.1g/L、磷酸二氢钾10.0～12.0g/L、氯化钴0.006～0.008g/L、酵母粉230～250g/L、麦芽糊精50～60g/L、固体消泡剂（聚硅氧烷）2～3g/L、淀粉酶1～3g/L、硫酸锌10～12g/L。
利用上述培养基的发酵方法，其特征在于采用双种方式进行发酵，具体工艺步骤为：
1） 一级种子培养：
首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，分别将已经培养好的龟裂链霉菌母瓶发酵液接入两个一级种子罐进行培养，接种量控制在一级种子培养基体积的6～10％。其中一个种子罐的培养基体积是另一个一级种子培养基体积的一半。
培养条件为：罐压0.05～0.06MPa；罐温29～31℃；空气流量：0～8h，20～30m3/h；8h～移种：50～60m3/h；搅拌转速100～120r/min；pH6～8；培养时间25～35h。
移种标准：一级种子培养结束，其菌体浓度20～25%；pH值6～8；无其它杂菌污染。
2） 二级种子培养：
先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将上述一级种子液分别移入两个二级种子罐进行培养。其中一个二级种子罐的培养基体积是另一个二级种子培养基体积的一半。
培养条件为：罐压0.05～0.06MPa；罐温29～31℃；空气流量90～100m3/h；搅拌转速100～130r/min；pH值6～8；培养时间：30～40h。
移种标准：二级种子培养结束，其菌体浓度30～35%；pH值6～8；周期30～40h；无其它杂菌污染。
3） 发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。
发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在5～7；
b 温度：采用变温控制方法，0～40h：培养温度28～29℃；40～100h：培养温度29～30℃；100h～发酵结束：培养温度30～31℃；
c搅拌转速：90～130r/min；
d 发酵周期：培养时间150～160h；
e 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
f pH控制：发酵过程中pH控制在5.0～7.0；
g 空气流量：0～20h：150～200m3/h；20～100h：300～400m3/h；100h～发酵结束：250～300m3/h。
发酵培养停止条件为：
a 发酵效价每6～8h取样检测，前、后检测的发酵单位相差在500u/ml以内；
b 发酵单位在34000u/mL以上；
c pH值5.0～7.0。
在发酵过程中采用流加法进行补料，包括补糖、补水和补氨：
a 补麦芽糖工艺控制：
发酵前40h不用进行补糖。
发酵时间在40～100h，要求发酵液总糖含量控制在6～8%。每隔6～8h检测发酵液总糖含量。
发酵时间在100～150h，要求发酵液总糖含量控制在4～4.5%。每隔6～8h检测发酵液总糖含量。
发酵时间在150h～发酵结束，要求发酵液总糖含量控制在1.5～2.5%。每隔6～8h检测发酵液总糖含量。
b补水工艺控制：发酵过程中，按照工艺要求必须定时补入一定量的水，其目的是控制发酵液的粘度和菌体浓度，有利于次级代谢产物的生成。
发酵前40h不用进行补水。
发酵时间在40～100h，要求发酵液菌体浓度控制在40～50%。每隔6～8h检测发酵液总糖含量。
发酵时间在100～150h，要求发酵液菌体浓度控制在30～40%，每隔4～6h检测发酵液总糖含量。
发酵时间在150h～发酵结束，停止补水。
c 补氨工艺：氨水浓度为25～30%。
发酵前30h，pH不进行控制。
发酵时间在30～100h，pH控制在6.6～7.0。
发酵时间在100h～发酵结束，pH控制在6.0～6.5。
所述双种培养过程中，第二次种子培养的培养基体积是第一次种子培养的培养基体积的一半。
本发明的技术优势：
1 本发明确认了种子培养基、发酵培养基C/N最佳配伍比例。
2 本发明中的有机氮源主要是植物性蛋白，而且发酵培养基配方停止使用棉籽饼粉、花生饼粉和其他动物性蛋白物质，避免了影响发酵液颜色、发酵单位、预处理过滤速度和成品质量的不利因素。
3 本发明采用低温黄豆饼粉代替常规的黄豆饼粉原料，低温工艺生产的黄豆饼粉保护黄豆中的蛋白质，使其不受温度破坏，有利于发酵培养。
4 本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了最佳的土霉素发酵工艺路线，明确了工艺控制参数。
本发明通过优化培养基配方，从而解决了原辅料的成本问题，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现土霉素稳定、高效的生产。同时，利用本发明所提供的培养基及方法发酵生产土霉素，可提高发酵单位，使土霉素的发酵单位达到34000u/ml以上，同国内常规工艺相比，发酵单位提高了6%以上；缩短发酵周期，与现有技术相比，缩短5%以上，提高土霉素产量，提高生产效率，达到节能降耗的目的。
本发明适用于土霉素工业化大生产，能够满足年产1000吨以上的技术需求。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用龟裂链霉菌：生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量：pH6～8；菌体浓度10～30%；镜检无杂菌；发酵单位25000～30000u/ml。
下述发酵采用双种发酵，其中1号一级种子培养基对应1号二级种子培养基。
实施例1
一级种子培养基制备：种子罐体积1m3，有效体积为0.8m3。分别配置2个一级种子培养基。
（1号）一级种子培养基配制过程：玉米浆2.4L、低温黄豆饼粉4kg、硫酸铵4.8kg、玉米淀粉12kg、碳酸钙1.6kg、氯化钠0.72kg、磷酸二氢钾0.24kg、氯化钴3.2g、酵母粉4kg、麦芽糊精12kg、玉米油12kg。一级种子液体积为0.8m3。
（2号）一级种子培养基配制过程：玉米浆1.2L、低温黄豆饼粉2kg、硫酸铵2.4kg、玉米淀粉6kg、碳酸钙0.8kg、氯化钠0.36kg、磷酸二氢钾0.12kg、氯化钴1.6g、酵母粉2kg、麦芽糊精6kg、玉米油6kg。一级种子液体积为0.4m3。
二级种子培养基制备：种子罐体积10m3，有效体积为8m3。分别配置2个二级种子培养基。
（1号）二级种子培养基配制过程：玉米浆120kg、低温黄豆饼粉176kg、硫酸铵400kg、玉米淀粉640kg、碳酸钙112kg、氯化钠7.2kg、磷酸二氢钾24kg、氯化钴48g、酵母粉480kg、麦芽糊精400kg、玉米油160kg。配置体积为8m3。
（2号）二级种子培养基配制过程：玉米浆60kg、低温黄豆饼粉88kg、硫酸铵200kg、玉米淀粉320kg、碳酸钙56kg、氯化钠3.6kg、磷酸二氢钾12kg、氯化钴24g、酵母粉240kg、麦芽糊精200kg、玉米油80kg。配置体积为4m3。
发酵培养基制备过程：发酵罐体积100m3，有效体积为80m3。
玉米浆6400L、低温黄豆饼粉8000kg、硫酸铵24000kg、玉米淀粉46400kg、碳酸钙3600kg、氯化钠72kg、磷酸二氢钾800kg、氯化钴0.48kg、酵母粉18400kg、麦芽糊精4000kg、固体消泡剂（聚硅氧烷）160kg、淀粉酶80kg、硫酸锌800kg。
一级种子培养过程控制：
（1号）一级种子培养基配制过程：
将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度17.8%，pH7.1、摇瓶效价27569u/ml）的龟裂链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入一级种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.1%,罐压控制在0.05MPa；罐温29～31℃；空气流量：0～8h：20m3/h；8h～移种：50m3/h；搅拌转速100r/min。一级种子培养结束，pH7.5；菌体浓度21.3%；镜检无杂菌；培养时间25h。
（2号）一级种子培养基配制过程：
将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度19.2%，pH7.3、摇瓶效价28035u/ml）的龟裂链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入一级种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.5%,罐压控制在0.05MPa；罐温29～31℃；空气流量：0～8h：20m3/h；8h～移种：50m3/h；搅拌转速100r/min。一级种子培养结束，pH7.3；菌体浓度20.8%；镜检无杂菌；培养时间25h。
二级种子培养过程控制：
（1号）二级种子培养基配制过程：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.05MPa；罐温29～31℃；空气流量90m3/h；搅拌转速100r/min。二级种子培养结束，pH7.5；菌体浓度31.2%；镜检无杂菌；培养时间31h。
（2号）二级种子培养基配制过程：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.05MPa；罐温29～31℃；空气流量90m3/h；搅拌转速100r/min。二级种子培养结束，pH7.4；菌体浓度30.8%；镜检无杂菌；培养时间30.4h。
发酵培养基过程控制：将2个批次的二级发酵种子液符合移种条件，全部转移至发酵罐进行培养。发酵培养基灭菌，pH为6.4，罐压控制在0.05MPa；发酵温度按照工艺要求采取变温控制方法；搅拌转速90r/min； 空气流量：0～20h：150m3/h、20～100h：300m3/h、100h～发酵结束：250m3/h；发酵过程中按照工艺规定，采用流加法进行补料。发酵结束，菌检无其它杂菌；pH为6.1,发酵单位为34503u/ml。发酵周期为157h。
实施例2
一级种子培养基制备：种子罐体积1m3，有效体积为0.8m3。分别配置2个一级种子培养基。
（1号）一级种子培养基配制过程：玉米浆2.8L、低温黄豆饼粉6kg、硫酸铵5.6kg、玉米淀粉14kg、碳酸钙2kg、氯化钠0.76kg、磷酸二氢钾0.28kg、氯化钴4.4g、酵母粉6kg、麦芽糊精14kg、玉米油14kg。一级种子液体积为0.8m3。
（2号）一级种子培养基配制过程：玉米浆1.4L、低温黄豆饼粉3kg、硫酸铵2.8kg、玉米淀粉7kg、碳酸钙1kg、氯化钠0.38kg、磷酸二氢钾0.14kg、氯化钴2.2g、酵母粉3kg、麦芽糊精7kg、玉米油7kg。一级种子液体积为0.4m3。
二级种子培养基制备：种子罐体积10m3，有效体积为8m3。分别配置2个二级种子培养基。
（1号）二级种子培养基配制过程：玉米浆140kg、低温黄豆饼粉188kg、硫酸铵520kg、玉米淀粉680kg、碳酸钙120kg、氯化钠8kg、磷酸二氢钾28kg、氯化钴56g、酵母粉520kg、麦芽糊精440kg、玉米油180kg。配置体积为8m3。
（2号）二级种子培养基配制过程：玉米浆70kg、低温黄豆饼粉94kg、硫酸铵260kg、玉米淀粉340kg、碳酸钙60kg、氯化钠4kg、磷酸二氢钾14kg、氯化钴28g、酵母粉260kg、麦芽糊精220kg、玉米油90kg。配置体积为4m3。
发酵培养基制备过程：发酵罐体积100m3，有效体积为80m3。玉米浆7200L、低温黄豆饼粉8800kg、硫酸铵24800kg、玉米淀粉47200kg、碳酸钙3800kg、氯化钠80kg、磷酸二氢钾880kg、氯化钴0.56kg、酵母粉19200kg、麦芽糊精4400kg、固体消泡剂（聚硅氧烷）200kg、淀粉酶160kg、硫酸锌880kg。
一级种子培养过程控制：
（1号）一级种子培养基配制过程：
将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度19.4%，pH6.9、摇瓶效价27895u/ml）的龟裂链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入一级种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的8%,罐压控制在0.055MPa；罐温29～31℃；空气流量：0～8h：25m3/h；8h～移种：55m3/h；搅拌转速110r/min。一级种子培养结束，pH7.2；菌体浓度22.1%；镜检无杂菌；培养时间31h。
（2号）一级种子培养基配制过程：
将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度18.9%，pH7.2、摇瓶效价28112u/ml）的龟裂链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入一级种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的8%,罐压控制在0.055MPa；罐温29～31℃；空气流量：0～8h：25m3/h；8h～移种：55m3/h；搅拌转速110r/min。一级种子培养结束，pH7.1；菌体浓度22.4%；镜检无杂菌；培养时间31.2h。
二级种子培养过程控制：
（1号）二级种子培养基配制过程：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.055MPa；罐温29～31℃；空气流量95m3/h；搅拌转速115r/min。二级种子培养结束，pH7.3；菌体浓度31.2%；镜检无杂菌；培养时间34.5h。
（2号）二级种子培养基配制过程：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.055MPa；罐温29～31℃；空气流量95m3/h；搅拌转速115r/min。二级种子培养结束，pH7.4；菌体浓度32.7%；镜检无杂菌；培养时间35.8h。
发酵培养基过程控制：将2个批次的二级发酵种子液符合移种条件，全部转移至发酵罐进行培养。发酵培养基灭菌，pH为6.7，罐压控制在0.055MPa；发酵温度按照工艺要求采取变温控制方法；搅拌转速110r/min； 空气流量：0～20h：175m3/h、20～100h：350m3/h、100h～发酵结束：280m3/h；发酵过程中按照工艺规定，采用流加法进行补料。发酵结束，菌检无其它杂菌；pH为6.1,发酵单位为35207u/ml，发酵周期为152h。
实施例3
一级种子培养基制备：种子罐体积1m3，有效体积为0.8m3。分别配置2个一级种子培养基。
（1号）一级种子培养基配制过程：玉米浆3.2L、低温黄豆饼粉8kg、硫酸铵6.4kg、玉米淀粉16kg、碳酸钙2.4kg、氯化钠0.8kg、磷酸二氢钾0.32kg、氯化钴5.6g、酵母粉8kg、麦芽糊精16kg、玉米油16kg。一级种子液体积为0.8m3。
（2号）一级种子培养基配制过程：玉米浆1.6L、低温黄豆饼粉4kg、硫酸铵3.2kg、玉米淀粉8kg、碳酸钙1.2kg、氯化钠0.4kg、磷酸二氢钾0.26kg、氯化钴2.8g、酵母粉4kg、麦芽糊精8kg、玉米油8kg。一级种子液体积为0.4m3。
二级种子培养基制备：种子罐体积10m3，有效体积为8m3。分别配置2个二级种子培养基。
（1号）二级种子培养基配制过程：玉米浆140kg、低温黄豆饼粉188kg、硫酸铵520kg、玉米淀粉680kg、碳酸钙120kg、氯化钠8kg、磷酸二氢钾28kg、氯化钴56g、酵母粉520kg、麦芽糊精440kg、玉米油180kg。配置体积为8m3。
（2号）二级种子培养基配制过程：玉米浆70kg、低温黄豆饼粉94kg、硫酸铵260kg、玉米淀粉340kg、碳酸钙60kg、氯化钠4kg、磷酸二氢钾14kg、氯化钴28g、酵母粉260kg、麦芽糊精220kg、玉米油90kg。配置体积为4m3。
发酵培养基制备过程：发酵罐体积100m3，有效体积为80m3。
玉米浆8000L、低温黄豆饼粉9600kg、硫酸铵25600kg、玉米淀粉48000kg、碳酸钙4000kg、氯化钠88kg、磷酸二氢钾960kg、氯化钴0.64kg、酵母粉20000kg、麦芽糊精4800kg、固体消泡剂（聚硅氧烷）240kg、淀粉酶240kg、硫酸锌960kg。
一级种子培养过程控制：
（1号）一级种子培养基配制过程：
将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度18.6%，pH7.0、摇瓶效价28251u/ml）的龟裂链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入一级种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的7.4%,罐压控制在0.06MPa；罐温29～31℃；空气流量：0～8h：30m3/h；8h～移种：60m3/h；搅拌转速120r/min。一级种子培养结束，pH7.4；菌体浓度24.7%；镜检无杂菌；培养时间34.5h。
（2号）一级种子培养基配制过程：
将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度18.7%，pH7.1、摇瓶效价28154u/ml）的龟裂链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入一级种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的7.2%,罐压控制在0.06MPa；罐温29～31℃；空气流量：0～8h：30m3/h；8h～移种：60m3/h；搅拌转速120r/min。一级种子培养结束，pH7.1；菌体浓度24.5%；镜检无杂菌；培养时间34.7h。
二级种子培养过程控制：
（1号）二级种子培养基配制过程：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.06MPa；罐温29～31℃；空气流量100m3/h；搅拌转速130r/min。二级种子培养结束，pH7.5；菌体浓度34.3%；镜检无杂菌；培养时间38.2h。
（2号）二级种子培养基配制过程：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.06MPa；罐温29～31℃；空气流量100m3/h；搅拌转速130r/min。二级种子培养结束，pH7.5；菌体浓度34.1%；镜检无杂菌；培养时间39h。
发酵培养基过程控制：将2个批次的二级发酵种子液符合移种条件，全部转移至发酵罐进行培养。发酵培养基灭菌，pH为6.4，罐压控制在0.06MPa；发酵温度按照工艺要求采取变温控制方法；搅拌转速130r/min； 空气流量：0～20h：200m3/h、20～100h：400m3/h、100h～发酵结束：300m3/h；发酵过程中按照工艺规定，采用流加法进行补料。发酵结束，菌检无其它杂菌；pH为6.2,发酵单位为34893u/ml，发酵周期为154h。
上述实施例1、2和3中的补料包括补糖、补水和补氨：
a 补麦芽糖工艺控制：
发酵前40h不用进行补糖。
发酵时间在40～100h，要求发酵液总糖含量控制在6～8%。每隔6～8h检测发酵液总糖含量。
发酵时间在100～150h，要求发酵液总糖含量控制在4～4.5%。每隔6～8h检测发酵液总糖含量。
发酵时间在150h～发酵结束，要求发酵液总糖含量控制在1.5～2.5%。每隔6～8h检测发酵液总糖含量。
b补水工艺控制：发酵过程中，按照工艺要求必须定时补入一定量的水，其目的是控制发酵液的粘度和菌体浓度，有利于次级代谢产物的生成。
发酵前40h不用进行补水。
发酵时间在40～100h，要求发酵液菌体浓度控制在40～50%。每隔6～8h检测发酵液总糖含量。
发酵时间在100～150h，要求发酵液菌体浓度控制在30～40%，每隔4～6h检测发酵液总糖含量。
发酵时间在150h～发酵结束，停止补水。
c 补氨工艺：氨水浓度为25～30%。
发酵前30h，pH不进行控制。
发酵时间在30～100h，pH控制在6.6～7.0。
发酵时间在100h～发酵结束，pH控制在6.0～6.5。
对比实施例
一级种子培养基制备：种子罐体积1m3，有效体积为0.8m3。
一级种子培养基配制过程：玉米浆3.1L、棉籽饼粉3.6kg,花生饼粉4.1kg、硫酸铵5.5kg、玉米淀粉14.3kg、碳酸钙2.1kg、氯化钠0.8kg、磷酸二氢钾0.31kg、氯化钴4.5g、酵母粉6.2kg、麦芽糊精14.2kg、玉米油13.9kg。一级种子液体积为0.8m3。
二级种子培养基制备：种子罐体积10m3，有效体积为8m3。
二级种子培养基配制过程：玉米浆141kg、棉籽饼粉38.5kg,花生饼粉42kg、硫酸铵521kg、玉米淀粉679kg、碳酸钙121kg、氯化钠8.1kg、磷酸二氢钾29kg、氯化钴55g、酵母粉523kg、麦芽糊精443kg、玉米油182kg。配置体积为8m3。
发酵培养基制备：发酵罐体积100m3，有效体积为80m3。
发酵培养基配置过程：玉米浆7250L、棉籽饼粉5600kg,花生饼粉4800kg、硫酸铵24830kg、玉米淀粉47210kg、碳酸钙3805kg、氯化钠81kg、磷酸二氢钾881kg、氯化钴0.57kg、酵母粉19280kg、麦芽糊精4430kg、固体消泡剂（聚硅氧烷）198kg、淀粉酶161kg、硫酸锌881kg。
一级种子培养基配制过程：将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度19.0%，pH7.1、摇瓶效价28124u/ml）的龟裂链霉菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入一级种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的8%,罐压控制在0.05MPa；罐温29～31℃；空气流量：0～8h：25m3/h；8h～移种：55m3/h；搅拌转速110r/min。一级种子培养结束，pH6.9；菌体浓度21.2%；镜检无杂菌；培养时间31h。
二级种子培养过程控制：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.05MPa；罐温29～31℃；空气流量95m3/h；搅拌转速115r/min。二级种子培养结束，pH7.2；菌体浓度30.9%；镜检无杂菌；培养时间34.2h。
发酵培养基过程控制：二级种子液符合移种条件，全部转移至发酵罐进行培养。发酵培养基灭菌，pH为6.6，罐压控制在0.05MPa；发酵温度按照工艺要求采取变温控制方法；搅拌转速110r/min； 空气流量：0～20h：175m3/h、20～100h：350m3/h、100h～发酵结束：280m3/h；发酵过程中按照工艺规定，采用流加法进行补料。发酵结束，菌检无其它杂菌；pH为6.3,发酵单位为23478u/ml，发酵周期为161h。
Claims (13)
1.一种龟裂链霉菌发酵生产土霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中包含有低温黄豆饼粉。
2.按照权利要求1所述的龟裂链霉菌发酵生产土霉素培养基，其特征在于上述一级种子培养基的组成为：玉米浆3～4ml/L、低温黄豆饼粉5～10g/L、硫酸铵6～8g/L、玉米淀粉15～20g/L、碳酸钙2～3g/L、氯化钠0.9～1g/L、磷酸二氢钾0.3～0.4g/L、氯化钴0.004～0.007g/L、酵母粉5～10g/L、麦芽糊精15～20g/L、玉米油15～20g/L。
3.按照权利要求1所述的龟裂链霉菌发酵生产土霉素培养基，其特征在于上述二级种子培养基的组成为：玉米浆15～20ml/L、低温黄豆饼粉22～25g/L、硫酸铵50～80g/L、玉米淀粉80～90g/L、碳酸钙14～16g/L、氯化钠0.9～1.1g/L、磷酸二氢钾3.0～4.0g/L、氯化钴0.006～0.008g/L、酵母粉60～70g/L、麦芽糊精50～60g/L、玉米油20～25g/L。
4.按照权利要求1所述的龟裂链霉菌发酵生产土霉素培养基，其特征在于上述发酵培养基的组成为：玉米浆80～100ml/L、低温黄豆饼粉100～120g/L、硫酸铵300～320g/L、玉米淀粉580～600g/L、碳酸钙45～50g/L、氯化钠0.9～1.1g/L、磷酸二氢钾10.0～12.0g/L、氯化钴0.006～0.008g/L、酵母粉230～250g/L、麦芽糊精50～60g/L、固体消泡剂（聚硅氧烷）2～3g/L、淀粉酶1～3g/L、硫酸锌10～12g/L。
5.一种利用权利要求1至4任意一项培养基的发酵方法，其特征在于采用双种方式进行发酵，其工艺步骤为：将已经培养好的龟裂链霉菌母瓶发酵液分别按照一级种子培养基体积的6～10％的接种量接入到配置好的两个一级种子罐中进行培养，至菌体浓度20～25%，pH值6～8时，分别移种至两个二级种子罐中进行培养，至菌体浓度30～35%；pH值6～8时，合并二级种子液并接入到发酵罐中培养，至发酵单位34000u/mL时发酵终止。
6.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于上述一级种子培养条件为：罐压0.05～0.06MPa；罐温29～31℃；空气流量：0～8h，20～30m3/h；8h～移种：50～60m3/h；搅拌转速100～120r/min；pH6～8；培养时间25～35h。
7.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述二级种子培养条件为：罐压0.05～0.06MPa；罐温29～31℃；空气流量90～100m3/h；搅拌转速100～130r/min；pH值6～8；培养时间：30～40h。
8.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在5～7；
b 温度：采用变温控制方法，0～40h：培养温度28～29℃；40～100h：培养温度29～30℃；100h～发酵结束：培养温度30～31℃；
c搅拌转速：90～130r/min；
d 发酵周期：培养时间150～160h；
e 压力控制：罐压0.05～0.06MPa； f pH控制：发酵过程中pH控制在5.0～7.0；
g 空气流量：0～20h：150～200m3/h；20～100h：300～400m3/h；100h～发酵结束：250～300m3/h。
9.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征是：在发酵过程中采用流加法进行补料，包括补糖、补水和补氨。
10.按照权利要求9所述的发酵方法，其特征在于上述补糖时补充麦芽糖，发酵前40h不用进行补糖，发酵时间在40～100h，且发酵液中总糖含量低于6%，补入20%的麦芽糖，控制总糖含量为6～8%；发酵时间在100～150h，且发酵液中总糖含量低于4%，补入20%的麦芽糖，控制总糖含量为4～5%；发酵时间在150h～发酵结束，且总糖含量低于1.5%，补入20%的麦芽糖，控制总糖含量为1.5～2.5%。
11.按照权利要求9所述的发酵方法，其特征在于上述补水控制过程为：发酵前40h不用进行补水，发酵时间在40～100h，如果菌体浓度低于40%，加入灭菌水，控制发酵液菌体浓度在40～50%；发酵时间在100～150h，如果菌体浓度低于30%，加入灭菌水，控制发酵液菌体浓度在30～40%；发酵时间在150h～发酵结束，停止补水。
12.按照权利要求9所述的发酵方法，其特征在于上述补氨控制过程为：发酵前30h，pH不进行控制；发酵时间在30～100h，若pH＜6.6，加入氨水，调节pH至6.6～7.0；发酵时间在100h～发酵结束，若pH＜6.0，加入氨水，调节pH控至6.0～6.5；上述氨水浓度为25～30%。
13.按照权利要求5所述的双种发酵方法，其特征是：所述双种培养过程中，其中一个种子罐中培养基体积是另一个种子罐中培养基体积的一半。
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