CN102690778A

CN102690778A - 一种制备龟裂链霉菌孢子的方法

Info

Publication number: CN102690778A
Application number: CN2012101843994A
Authority: CN
Inventors: 郑万静; 齐巧娟; 赵丽红; 徐亲民
Original assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Shengxue Dacheng Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2012-06-06
Filing date: 2012-06-06
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2032-06-06
Also published as: CN102690778B

Abstract

本发明公开了一种龟裂链霉菌孢子的制备方法，它包括以下步骤：（a）为以谷粒为培养载体，室温下用水或稀营养液将谷粒浸泡2~6h，沥除水分，制成湿谷粒；（b）在湿谷粒外层包裹麸皮粉，高压蒸汽灭菌；冷却，接种土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子悬浮液，培养至龟裂链霉菌孢子成熟。本发明可大幅度提高了龟裂链霉菌孢子的批次产量，同时可大大提高龟裂链霉菌孢子的保藏期限。

Description

一种制备龟裂链霉菌孢子的方法

所属技术领域

本发明涉及土霉素发酵生产菌种的培养制备方法，具体地说是龟裂链霉菌孢子的制备方法。

技术背景

孢子制备是发酵工业生产中不可缺少的一个环节，孢子质量的好坏将直接影响到发酵生产的成功与否。土霉素发酵生产所用龟裂链霉菌菌种孢子，历来都是在琼脂斜面上制备。斜面的种类依使用容器的不同而分为试管斜面和扁瓶斜面两种，后者因斜面表面积大，在生产中使用更为广泛。但这种斜面孢子因受平面表面积的限制，生长的孢子数量难以满足生产的要求。对于每个大试管来说，充其量也就30~40亿个孢子，每个扁瓶也只有200亿左右孢子。在发酵生产上接种一个2m³的种子罐，一般需要9支大试管斜面或3瓶扁瓶斜面，致使接种操作十分烦杂，也是造成杂菌污染的一个隐患。另外。琼脂斜面在冰箱中存放容易干缩而一步步缩小其表面积，更不能通过真空干燥方法延长其保存期，其有效保存时间往往不超过一个月。这就不得不在生产中频繁更换孢子批号，往往造成生产的不稳定，同时也加大了菌种孢子制备的工作量。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种新的制备龟裂链霉菌孢子的方法，以有效提高生产批次的产量、提高所得龟裂链霉菌孢子的保藏期限。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现：

本发明所提供的一种龟制备裂链霉菌孢子的方法，它包括以下步骤：

（a）为以谷粒为培养载体，室温下用水或稀营养液将谷粒浸泡2~6 h，沥除水分，制成湿谷粒；

（b）在湿谷粒外层包裹麸皮粉，然后平铺于培养容器中进行高压蒸汽灭菌；

（c）冷却至33~36℃，按照3~9亿个孢子/10 g谷粒的比例，接种土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子悬浮液1~5 mL，充分摇匀，置33~38℃恒温室培养3~4 d，转入28~31℃恒温室继续培养1~2 d至龟裂链霉菌孢子成熟。

上述的龟裂链霉菌孢子悬浮液可采用常规方法制成：

（a）配制麸皮斜面，茄瓶斜面装量为50mL，大管斜面为15mL，盖上棉赛，两层纱布，进行消毒，冷却到60℃左右铺成斜面。麸皮斜面的组成为：以质量百分比计，麸皮3~10%，琼脂1~3%，余量为自来水；

（b）用接种针挖取120#砂土孢子约5mg接种到茄瓶培养基上；

（c）接种好的茄瓶斜面置33~38℃恒温室培养3~4 d，转入28~31℃恒温室继续培养1~2 d至龟裂链霉菌孢子成熟。

（d）把长好的成熟茄瓶斜面加50 mL水或大管斜面加10 mL水，使用接种针或接种铲刮制成孢子悬浮液。

本发明通过使用松散的颗粒状谷粒作为培养载体从而有效提高了孢子生长环境的体表面积，从而大幅度提高了龟裂链霉菌孢子的批次产量（即每个培养容器中所生长的龟裂链霉菌孢子数量）。同时，由于谷粒在干燥状态下不会或很少干缩，因此对可含有成熟龟裂链霉菌孢子的培养载体进行真空干燥，然后密封保存，由此大大提高了龟裂链霉菌孢子的保藏期限。

本发明所述的谷粒优选去壳谷粒，由此有利于谷物浸泡后能充分吸水或营养液，也更便于龟裂链霉菌菌丝的深入生长。

谷粒的浸泡时间以谷粒将水分吃透又保持一定硬度为宜，特别是要保证在灭菌后谷粒熟透而相互之间又不粘连。为此，在不同的室温下需要浸泡不同的时间，如夏天2~3 h，冬天5~6 h，春秋3~5 h。一般以控制浸泡后的谷粒含水量40%~60%为准，最好是45%~50%。如浸泡后含水量偏高，可摊开后用风扇吹一会，以降低水分含量。

本发明所述谷粒可以是小麦粒、大麦粒、大米粒、小米粒或其他谷物的完整颗粒。

如所述谷粒选择麦粒，其平铺在培养容器底部的厚度优选50mm。所述谷粒为米粒，其平铺在平底容器底部的厚度为20mm。

本发明可根据谷粒所含营养多寡和性质的不同，选择水浸泡或是营养液浸泡。由于谷粒本身所含的营养一般都比较丰富，故即使采用营养液浸泡，也只是稀营养液（如选择使用0.01%玉米浆营养液，可以略微增加磷含量，利于孢子的丰满程度），其主要目的是为了调节培养载体中的还原糖和磷酸盐含量，以满足微生物生长和孢子生成的需要，特别是满足前期菌丝生长的营养需要而又避免菌丝过分生长抑制孢子的生成。湿谷粒中的还原糖含量可控制在0.1%~0.5%之间，最好是在0.2%~0.3%之间，溶磷含量60~120 ppm，最好是80~100 ppm。

蛋白质类高分子氮源对于龟裂链霉菌孢子的形成是必不可少的，而某些谷粒中的蛋白质含量不足，或所含的蛋白质种类不适合龟裂链霉菌孢子形成的需要，为此可以在浸泡后的谷粒中混入一定细度的小麦麸皮粉，使其均匀包裹在谷粒的外表面。所用的麸皮粉细度以20~60目为宜，最好是30~40目。

为了确保培养过程中通气良好，所选用的培养容器如大底三角瓶、扁平罗氏瓶、扁平茄形瓶或大试管，其谷粒装量不能过多，一般以平铺后形成≤50mm厚度为宜。

分装后将培养容器的瓶口部塞盖、密闭，牛皮纸包头后121℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却至35℃左右用龟裂链霉菌孢子悬浮液接种。

灭菌后的谷粒中龟裂链霉菌孢子接种量一般控制在3~9亿个/10 g，最好是5~6亿个/10 g。在这一接种量下，为了不过分加大谷粒的含水量，接种的孢子悬浮液以孢子含量5~8×10⁸个/mL为宜，最好是6~7×10⁸个/mL，如是，每个茄形瓶的接种量应为2~3 mL，每个大试管的接种量应为0.7~1.0 mL。

为了加快培养前期菌丝的生长速度，培养温度可控制在33~38℃之间，最好是35~36℃之间。菌丝生长充分后则改为28~31℃之间培养，最好是在29~30℃之间培养。

为了使谷粒不沾壁，以便菌丝在谷粒的各个表面均匀生长，在33~38℃培养的前两日每天要轻轻摇动谷粒一次，直至出现肉眼可辩的灰色孢子后不再摇动，直至孢子长满并成熟。

培养成熟的谷粒孢子经孢子计数和无菌检查后可立即用于土霉素发酵种子罐的接种，也可在真空干燥后置4℃冰箱保存一段时间后使用，干燥温度不得超过40℃，4℃保存时间不得超过半年。如此，可以三个月至半年时间为间隔，批量制备谷粒孢子一次，从而保持三个月至半年时间的生产种子质量稳定。

具体实施方式

以下是本发明实施的举例，不作为发明范围的限制。

实施例1：

挑选颗粒饱满、无虫蛀、无黑头、颜色均匀的小麦粒，在脱皮机上进行脱皮，剔除有裂纹、破碎的颗粒，晾干，必要使用风扇吹干，以防霉变、酸败。

取自来水在室温（约26℃）下浸泡脱皮后的麦粒3 h左右（泡好的麦粒用手捏只有约1/3表层发软，麦芯较硬，用牙咬会裂成两半，不粘连）。沥除水，制成湿粒（沥除水后，置于牛皮纸上，不断称重，至吃水量达50%为好）。

在浸泡好的麦粒中加入40目2%的小麦麸皮粉，轻轻地充分振摇，使其均匀地包裹在湿麦粒的表面，按照30 g/茄形瓶或10 g/大试管的装量进行分装，121±1℃（0.11±0.05 MPa）高压蒸汽灭菌30 min，取出冷却至35℃左右。

配制龟裂链霉菌孢子悬浮液：

（a）配制麸皮斜面，茄瓶斜面装量为50mL，大管斜面为15mL，盖上棉赛，两层纱布，进行消毒，冷却到60℃左右铺成斜面。麸皮斜面的组成为：以质量百分比计，麸皮3%，琼脂3%，余量为自来水；

（b）用接种针挖取120#砂土孢子2mg接种到茄瓶培养基上；

接种好的大管斜面置33℃恒温室培养4 d，转入31℃恒温室继续培养1~2 d至龟裂链霉菌孢子成熟。取长好的120#龟裂链霉菌的大管孢子斜面上加上10 mL无菌水，使用接种针刮制成孢子悬浮液（约7亿孢子量/mL），按照0.8 mL/10 g麦粒的接种量接种至茄形瓶/大试管中，摇匀使麦粒外表面均匀沾上孢子液，平铺在33~38℃恒温室培养3~4 d，转入28~31℃恒温室继续培养1~2 d。培养第一天、第二天摇动麦粒至所有麦粒不会粘壁，第三天、第四天不再翻动。

培养成熟后用稀释梯度法进行孢子计数，结果为600亿/茄形瓶，300亿/大试管，而同时期培养的对照茄形瓶和大试管斜面分别为200亿和30亿个孢子。

实施例2：

挑选颗粒整齐均匀，大小适中的小米，冷藏备用。

每管装小米5 g加自来水10 mL，茄瓶装小米15 g，加自来水30 mL，盖好塞子，包上双层纱布，进行消毒。

121±1℃（0.11±0.05 MPa）灭菌30 min，取出冷却至35℃左右，敲碎。

用接种针挖取122#砂土孢子约2 mg接种到大管麸皮斜面培养基上，麸皮斜面的组成为：以质量百分比计，麸皮10%，琼脂1%，余量为自来水。接种好的大管斜面置38℃恒温室培养4 d，转入31℃恒温室继续培养1~2 d至龟裂链霉菌孢子成熟。取长好的122#龟裂链霉菌的大管孢子斜面上加上10 mL无菌水，使用接种针刮制成孢子悬浮液（约7.5亿孢子量/mL），按照0.4 mL/5 g小米粒的接种量接种至茄形瓶/大试管中，摇匀使麦粒外表面均匀沾上孢子液，平铺培养，在33~38℃恒温室培养3~4 d，转入28~31℃恒温室继续培养1~2 d至孢子成熟。培养第一天、第二天摇动培养基，至所有麦粒不会粘壁，第三天、第四天不再翻动。

培养成熟后用稀释梯度法进行孢子计数，结果为800亿/茄形瓶，300亿/大试管，而同时期培养的对照茄形瓶和大试管斜面分别为200亿和30亿个孢子。

实施例3：

挑选颗粒饱满、无虫蛀、无黑头、颜色均匀的大麦粒，在脱皮机上进行脱皮，剔除有裂纹、破碎的颗粒，晾干，必要使用风扇吹干，以防霉变、酸败。

按照重量比为1:3，取自来水在室温（约26℃）下浸泡脱皮后的麦粒3 h左右，泡好的大麦粒用手捏只有约1/2表层发软，麦芯较硬，用牙咬会裂成两半，不粘连。沥水后置于牛皮纸上，不断称重，至吃水量达45%~50%为好。

在浸泡好的麦粒中加入40目3%的小麦麸皮粉，轻轻地充分振摇，使其均匀地包裹在湿麦粒的表面，按照30 g/茄形瓶或10 g/大试管的装量进行分装，121±1℃（0.11±0.05 MPa）灭菌30 min，取出冷却至35℃左右。

用接种针挖取123#砂土孢子约2mg接种到大管麸皮斜面培养基上，麸皮斜面的组成为：以质量百分比计，麸皮3~10%，琼脂1~3%，余量为自来水。接种好的大管斜面置33~38℃恒温室培养3~4 d，转入28~31℃恒温室继续培养1~2 d至龟裂链霉菌孢子成熟。取长好的120#龟裂链霉菌的大管孢子斜面上加上10 mL无菌水，使用接种针刮制成孢子悬浮液（约6.5亿孢子量/mL），按照0.8 mL/10 g大麦粒的接种量接种至茄形瓶/大试管中，摇匀使麦粒外表面均匀沾上孢子液，平铺培养，在33~38℃恒温室培养3~4 d，转入28~31℃恒温室继续培养1~2 d至孢子成熟。培养第一天、第二天摇动培养基，至所有麦粒不会粘壁，第三天、第四天不再翻动。

对比实施例1

常规孢子的制备方法：

（a）根据配方称取麸皮和琼脂，加自来水，茄瓶斜面装量为50 mL，盖上棉赛，两层纱布，进行消毒，冷却到60℃左右铺成斜面。麸皮斜面的组成为：以质量百分比计，麸皮3~10%，琼脂1~3%，余量为自来水；

（b）用接种针挖取120#砂土孢子约5 mg接种到茄瓶培养基上；

对比实施例2

（a）根据配方称取麸皮和琼脂，加自来水，大管斜面装量为15 mL，盖上棉赛，两层纱布，进行消毒，冷却到60℃左右铺成斜面。麸皮斜面的组成为：以质量百分比计，麸皮3~10%，琼脂1~3%，余量为自来水；

（b）用接种针挖取120#砂土孢子约5 mg接种到茄瓶培养基上；

实施例4

采用实施例1所制备小麦粒孢子，按照10 mL水/10 g小麦粒孢子的浓度制备小麦粒孢子悬液，以1~2 mL孢子液接种至母瓶培养基，30℃，220 rpm，培养26 h~28 h。以5%接种量接种至发酵培养基，30℃，220 rpm，培养5 d后放瓶，检测土霉素效价。按照对比实施1方法制备常规茄瓶斜面孢子，挖去斜面2cm²接种母瓶为对照，汇总实验数据如下：

由上表可看出，小麦粒孢子茄形瓶/大管小麦粒孢子的发酵效价较正常斜面孢子有提高。

实施例5

实施例1、2、3制备的成熟茄形瓶孢子分别在0.1 MPa真空度及室温下干燥24 h，4℃冷藏保存。保存180 d后接种摇瓶验证其生产能力。按照对比实施1方法制备常规茄瓶斜面孢子，挖去新鲜斜面2 cm²接种母瓶为对照，30℃，220 rpm，培养26 h~28 h。以5%接种量接种至发酵培养基，30℃，220 rpm，培养5 d后放瓶，检测土霉素效价。结果见下表：

从表中数据可看出：麦粒孢子冷藏180 d后生产能力较对照斜面孢子高。

实施例6

按照实施例1、2、3方法分别制备小麦粒、小米粒和大麦粒孢子，将制备成熟的孢子分别在0.1 MPa真空度及室温下干燥24 h，4℃冷藏保存180 d；同时按照对比实施1方法制备常规茄瓶斜面孢子，成熟后4℃冷藏保存180 d。

按照10 mL水/10 g小麦粒、小米粒和大麦粒孢子的浓度制备各谷粒孢子悬液，以1~2 mL孢子液接种至母瓶培养基，挖去常规茄瓶斜面2 cm²接种母瓶，30℃，220 rpm，培养26 h~28 h。以5%接种量接种至发酵培养基，30℃，220 rpm，培养5 d后放瓶，检测土霉素效价。以新鲜茄瓶斜面为对照。结果见下表：

从以上表中数据可看出，小麦粒、小米粒和大麦粒孢子经真空干燥保藏180d后效价仍较常规新鲜斜面孢子高，而常规斜面孢子经180 d保藏后效价降低明显。

Claims

1. 一种龟裂链霉菌孢子的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

(a)为以谷粒为培养载体，室温下用水或稀营养液浸泡2~6 h，沥除水，制成湿谷粒；

(b)在湿谷粒外层包裹麸皮粉，然后平铺于培养容器中进行高压蒸汽灭菌；

(c)冷却到33~36℃时，按照3~9亿个孢子/10 g谷粒的比例，接种土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子悬浮液1~5 mL，充分摇匀，置33~38℃恒温室培养3~4 d，转入28~31℃恒温室继续培养1~2 d至孢子成熟。

2. 根据权利要求1所述龟裂链霉菌孢子的制备方法，其特征在于所述谷粒为去壳谷粒。

3. 根据权利要求1或2所述龟裂链霉菌孢子的制备方法，其特征在于所述谷粒浸泡后的含水量可控制在40%~60%。

4. 根据权利要求1或2所述龟裂链霉菌孢子的制备方法，其特征在于所述谷粒浸泡后的含水量控制在45%~50%。

5. 根根据权利要求1所述龟裂链霉菌孢子的制备方法，其特征在于所述谷粒其平铺在培养容器底部的厚度为50 mm。

6. 根根据权利要求1所述龟裂链霉菌孢子的制备方法，其特征在于所述湿谷粒其还原糖含量控制在0.1%~0.5%之间，溶磷含量控制在60~120 ppm。

7.根根据权利要求6所述龟裂链霉菌孢子的制备方法，其特征在于所述湿谷粒其还原糖含量控制在0.2%~0.3%之间，溶磷含量控制在80~100 ppm。

8. 根据权利要求7所述龟裂链霉菌孢子的制备方法，其特征在于所述麸皮粉细度为20~60目。

9. 根据权利要求1或2所述龟裂链霉菌孢子的制备方法，其特征在于c步所述接种土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子的接种量控制在5~6亿个/10 g谷粒。