CN111057742A - 一种改进的多抗霉素生物效价测定培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改进的多抗霉素生物效价测定培养基及其制备方法，由上层培养基和下层培养基组成，其中，上层培养基由以下配方组成：蔗糖0.5%‑3%，L‑天冬酰胺0.01%‑0.2%，磷酸二氢钾0.01%‑0.2%，蔬菜汁0.5%‑5%，琼脂10%‑20%，余量为纯水；下层培养基由以下配方组成：蔗糖0.5%‑3%，L‑天冬酰胺0.01%‑0.2%，磷酸二氢钾0.01%‑0.2%，琼脂10%‑20%，余量为纯水。与原有PDA培养基相比，其制备方法简单，培养基培养的指示菌菌落生长更加良好稳定且培养时间缩短，抑菌圈边缘更为清晰易于观察与测量，有效节省成本。

Description

一种改进的多抗霉素生物效价测定培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种改进的多抗霉素生物效价测定培养基及其制备方法。

背景技术

多抗霉素（Polyoxin）是金色链霉菌所产生的代谢产物，属于广谱性抗生素类杀菌剂。多抗霉素具有较好的内吸传导作用，其作用机理是干扰病菌细胞壁几丁质的生物合成，使菌体细胞壁不能进行生物合成从而导致病菌死亡，此外还具有抑制病菌产孢和病斑扩大的作用。多抗霉素因其组分不同而作用对象不同，主要是一类以a、b组份为主，主要用于防治苹果斑点落叶病，轮纹病，梨黑斑病，葡萄灰霉病，草莓、黄瓜、甜瓜的白粉病，霜霉病，人参黑斑病和烟草赤星病等十多种作物病害。另一类以d、e、f组份为主，主要用于水稻纹枯病的防治。多抗霉素是一种高效、低毒、无环境污染的安全生物农药，因此被广泛应用于粮食作物、特用作物、水果和蔬菜等重要病害的防治，在农药防治方面占有重要地位。

PDA培养基是人们对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar(Medium)。PDA培养基是培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌最常用的培养基之一，也常用来培养各种植物病菌。其制备方法是将马铃薯洗净去皮，再称取200 g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20-30 min，能被玻璃棒戳破即可），用六到八层纱布过滤，加热，再据实际实验需要加15-20 g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20 g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000 mL，分装试管或者锥形瓶，加棉塞、包扎，115℃灭菌20-30 min后取出备用。

现有多抗霉素生物效价测定方法主要是管碟法中的二剂量法，其指示菌主要为烟草赤星病菌、斑点落叶病菌。管碟法是当前测定抗生素生物效价最常用的方法之一。管碟法抗生素效价测量实验包括配制试验所需的样品及药品、加注培养基、放置小钢管、滴加抗生素溶液、双碟中菌株的培养、抑菌圈测量六个步骤。其中培养基的质量严重影响着真菌的生长时长及抑菌圈的大小和清晰度。

当前多抗霉素生物效价测定指示菌主要为斑点落叶病菌和烟草赤星病菌，其培养基主要为PDA培养基。但是马铃薯的淀粉含量严重影响培养基的质量且PDA培养基灭菌后颜色较重，不利于抑菌圈的观察。此外，用PDA培养基培养斑点落叶病菌时培养时间较长，抑菌圈模糊，非常不利于观察。因此，对于多抗霉素，寻求一种稳定的能够有效改善多抗霉素抑菌圈培养时长及清晰度的生物效价测定培养基是非常有必要的。

发明内容

为解决现有技术测定多抗霉素生物效价时存在的上述问题，本发明提供一种改进的多抗霉素生物效价测定培养基及其制备方法，有效解决抑菌圈清晰度不高、边缘模糊、指示菌培养时间过长的问题。与PDA培养基相比，由于PDA培养基的营养成分主要来源于土豆，而本发明的培养基含有蔗糖、L-天冬酰胺、磷酸二氢钾及蔬菜汁，营养成分更加全面，比例控制更加得当，更适宜微生物生长。此外，本发明的培养基颜色较PDA培养基浅，培养出的指示菌菌落生长更加良好稳定、抑菌圈更加清晰、且培养时间缩短，有效节省经济成本。

本发明采用如下技术方案：一种改进的多抗霉素生物效价测定培养基，由上层培养基和下层培养基组成，其中，上层培养基由以下配方组成：蔗糖0.5%-3%，L-天冬酰胺0.01%-0.2%，磷酸二氢钾0.01%-0.2%，蔬菜汁0.5%-5%，琼脂10%-20%，余量为纯水；下层培养基由以下配方组成：蔗糖0.5%-3%，L-天冬酰胺0.01%-0.2%，磷酸二氢钾0.01%-0.2%，琼脂10%-20%，余量为纯水。

在本发明的优选的实施方案中，上层培养基由以下配方组成：蔗糖1%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，蔬菜汁1.6%，琼脂1.5%，余量为纯水；下层培养基由以下配方组成：蔗糖1%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，琼脂1.8%，余量为纯水。

在本发明的优选的实施方案中，所述的蔬菜汁包括但不限于西红柿汁、黄瓜汁、菠菜汁、胡萝卜汁中的一种或几种，最优选为西红柿汁。

本发明还包括所述的多抗霉素生物效价测定培养基的制备方法，按比例称取配方中的各个组分，放置室温后调节其pH为5.9-6.3，再分别分装得到上层培养基和下层培养基，然后通过灭菌得到。

在本发明的优选的实施方案中，所述的蔬菜汁在测定多抗霉素效价时倾倒上层培养基前且培养基温度降为60℃左右时添加，并提前在紫外灯照射下灭菌30-45 min。

在本发明的优选的实施方案中，所述的蔬菜汁为去皮且经过煮沸的西红柿汁，占上层培养基的质量比例为1.0-3.0%，最佳为1.6%左右。

在本发明的优选的实施方案中，所述的上层培养基蔗糖的质量占比1%，L-天冬酰胺占比0.05%，磷酸二氢钾占比0.05%，琼脂占比15%，余量为纯水。

在本发明的优选的实施方案中，所述的下层培养基蔗糖的质量占比1%，L-天冬酰胺占比0.05%，磷酸二氢钾占比0.05%，琼脂占比18%，余量为纯水。

在本发明的优选的实施方案中，放置室温后调节其pH为6.1。

在本发明的优选的实施方案中，所述的灭菌为在110-130℃下灭菌20-30 min；更优选为在121℃下灭菌30 min。

更优选的，所述的多抗霉素生物效价测定培养基的制备方法包括以下步骤：

1）蔬菜汁的制备：取250 g西红柿，纯水清洗干净，去掉表皮，切碎加500 mL纯水煮沸15-20 min，用4-6层纱布过滤，得到西红柿汁，放至室温后密封，4℃冰箱保存备用，使用前应在紫外灯照射下灭菌30-45 min；

2）上层培养基的制备：蔗糖1%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，蔬菜汁1.6%，琼脂15%，余量为纯水，加热煮沸15-30 min至琼脂完全溶解，用4-6层纱布过滤，放置室温后调节其pH在5.9-6.3之间，分装得到上层培养基。其中蔬菜汁在测定生物效价时倾倒上层培养基前且培养基温度降为60℃左右时添加，避免蔬菜汁的营养被多次高温破坏；

3）下层培养基的制备：蔗糖1%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，琼脂18%，余量为纯水，加热煮沸15-30 min至琼脂完全溶解，用4-6层纱布过滤，放置室温后调节其pH在5.9-6.3之间，分装得到下层培养基；

4）将分装好的上、下层培养基在110-130℃下灭菌20-30 min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1）本发明的培养基通过组分的优化选取和复配、制备方法的优化获得上下层培养基，再将上下培养基进行灭菌得到。采用本发明的多抗霉素生物效价测定培养基，与原有的PDA培养基相比，其营养成分更加全面，并且更加适宜微生物的生长，并且培养基原料溶解速度更快，培养基的澄清度更高，操作步骤更为简单，节省时间。

2）本发明通过蔗糖、L-天冬酰胺、磷酸二氢钾及蔬菜汁的组合添加，并且对添加方式和添加时机进行了优化设计，使得营养成分得以最大程度的保留。

3）采用本发明的多抗霉素生物效价测定培养基，培养出的斑点落叶病菌菌落质量更好，产生的抑菌圈更为清晰便于观察与测量，培养时间更短，有效节省成本。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明：

图1为培养了19h的斑点落叶病菌抑菌圈（蔬菜培养基）；

图2为培养了19h的斑点落叶病菌抑菌圈（PDA培养基）；

图3为培养了19h的斑点落叶病菌抑菌圈（蔬菜培养基和PDA培养基对比）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。

对比例1

原多抗霉素生物效价测定培养基的制备方法：

1）20%土豆水溶液的制备：将土豆去皮切成2-3mm厚的土豆片后用纯水煮沸20 min后用4-6层纱布过滤。

2）上层培养基的制备：葡萄糖1.0%，琼脂1.5%，用20%的土豆水溶液加热溶解，115℃下灭菌30 min后备用。

3）下层培养基的制备：琼脂1.6%，纯水加热溶解，115℃下灭菌30 min后备用。

实施例1

本实施例公开了多抗霉素生物效价测定培养基制备的一种具体实施方式，包括如下步骤：

1）蔬菜汁的制备：取250 g西红柿，纯水清洗干净，去掉表皮，切碎加500 mL纯水煮沸15min，用4-6层纱布过滤，得到西红柿汁，放至室温后密封，4℃冰箱保存备用。蔬菜汁使用前应在紫外灯照射下灭菌30-45 min。

2）上层培养基的制备：蔗糖1.0%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，蔬菜汁1.6%，琼脂1.5%，余量为纯水，加热煮沸15-30min，用4-6层纱布过滤，放置室温后调节其pH在5.9-6.3之间，分装得到上层培养基。其中蔬菜汁在测定生物效价倾倒上层培养基前添加，避免蔬菜汁的营养被多次高温破坏。

3）下层培养基的制备：蔗糖1%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，琼脂1.8%，余量为纯水，加热煮沸15-30 min，用4-6层纱布过滤，放置室温后调节其pH在5.9-6.3之间，分装得到下层培养基。

4）将分装好的上、下层培养基在110-130℃下灭菌20-30 min。

将对比例1和实施例1得到的培养基进行比较，结果如表1所示。

表1 对比例1和实施例1得到的培养基对比

可见，采用实施例1得到的生物效价测定培养基质量更加稳定，培养基原料的选择更加广泛，用量减少且培养基澄清度更高。培养出的斑点落叶病菌菌落形态更加稳定良好，抑菌圈边缘更为清晰，易于观察与测量。此外，采用实施例1得到的生物效价测定培养基培养斑点落叶病菌时长缩短，有效节省时间。

从图1中可以看到，蔬菜培养基生长出的菌落质量较好，抑菌圈边缘较为清晰光滑圆整。

从图2中可以看到，PDA培养基培养出的菌落质量不稳定，抑菌圈边缘非常模糊，不清晰，且多气生菌丝，且抑菌圈不圆整。

从图3的对比图中可以看到，培养相同时间，蔬菜培养基的抑菌圈已经生长良好，且光滑圆整，非常清晰，适宜测量，但是土豆培养基抑菌圈边缘非常模糊且不圆整，整个PDA培养基较蔬菜培养基模糊。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种改进的多抗霉素生物效价测定培养基，其特征在于，由上层培养基和下层培养基组成，其中，上层培养基由以下配方组成：蔗糖0.5%-3%，L-天冬酰胺0.01%-0.2%，磷酸二氢钾0.01%-0.2%，蔬菜汁0.5%-5%，琼脂10%-20%，余量为纯水；下层培养基由以下配方组成：蔗糖0.5%-3%，L-天冬酰胺0.01%-0.2%，磷酸二氢钾0.01%-0.2%，琼脂10%-20%，余量为纯水。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，上层培养基由以下配方组成：蔗糖1%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，蔬菜汁1.6%，琼脂1.5%，余量为纯水；下层培养基由以下配方组成：蔗糖1%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，琼脂1.8%，余量为纯水。

3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述的蔬菜汁包括但不限于西红柿汁、黄瓜汁、菠菜汁、胡萝卜汁中的一种或几种，优选为西红柿汁。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的培养基的制备方法，其特征在于，按比例称取配方中的各个组分，放置室温后调节其pH为5.9-6.3，再分别分装得到上层培养基和下层培养基，然后通过灭菌得到。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的蔬菜汁在测定多抗霉素效价时倾倒上层培养基前且培养基温度降为60℃左右时添加，并在紫外灯照射下灭菌30-45 min。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的蔬菜汁为去皮且经过煮沸的西红柿汁，占上层培养基的质量比例为1.0-3.0%，最佳为1.6%左右。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的上层培养基蔗糖的质量占比1%，L-天冬酰胺占比0.05%，磷酸二氢钾占比0.05%，琼脂占比15%，余量为纯水；所述的下层培养基蔗糖的质量占比1%，L-天冬酰胺占比0.05%，磷酸二氢钾占比0.05%，琼脂占比18%，余量为纯水。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，放置室温后调节其pH为6.1。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的灭菌为在110-130℃下灭菌20-30 min；更优选为在121℃下灭菌30 min。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

1）蔬菜汁的制备：取250 g西红柿，纯水清洗干净，去掉表皮，切碎加500 mL纯水煮沸15-20 min，用4-6层纱布过滤，得到西红柿汁，放至室温后密封，4℃冰箱保存备用，使用前应在紫外灯照射下灭菌30-45 min；

2）上层培养基的制备：蔗糖1%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，蔬菜汁1.6%，琼脂15%，余量为纯水，加热煮沸15-30 min至琼脂完全溶解，用4-6层纱布过滤，放置室温后调节其pH在5.9-6.3之间，分装得到上层培养基；

其中蔬菜汁在测定生物效价倾倒上层培养基前且培养基温度降为60℃左右时添加，避免蔬菜汁的营养被多次高温破坏；

3）下层培养基的制备：蔗糖1%，L-天冬酰胺0.05%，磷酸二氢钾0.05%，琼脂18%，余量为纯水，加热煮沸15-30 min至琼脂完全溶解，用4-6层纱布过滤，放置室温后调节其pH在5.9-6.3之间，分装得到下层培养基；

4）将分装好的上、下层培养基在110-130℃下灭菌20-30 min。

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