CN102864173A - 黄麻链霉菌nf0919菌株代谢产物在防治草莓病害上的应用 - Google Patents

Abstract

一种黄麻链霉菌NF0919菌株代谢产物在防治草莓病害上的应用。本发明为黄麻链霉菌NF0919菌株（其在CGMCC的保藏编号为CGMCCNo.3968，菌种专利号为ZL201010236886.1）发酵液中活性代谢产物的提取方法，及代谢产物能有效防治由植物病原真菌围小丛壳菌（Glomerellacingulata）侵染引发的草莓炭疽病、灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）侵染引发的草莓灰霉病、尖孢镰刀菌草莓专化型（FusarumoxysporiumSchl.f.sp.fragariaeWinksetWillams）侵染引发的草莓枯病和由大丽花轮枝孢菌（Verticilliumalboatrum和Verticilliumdahliae）侵染引发的草莓黄萎病等多种草莓病害。

Description

黄麻链霉菌NF0919菌株代谢产物在防治草莓病害上的应用

发明领域

本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株代谢产物及其在防治草莓病害上应用，属于生物农药技术领域。 

背景技术

由植物病原真菌围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的草莓炭疽病、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染引发的草莓灰霉病、尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarum oxysporium Schl.f.sp.fragariae Winks et Willams）侵染引发的草莓枯病和由大丽花轮枝孢菌（Verticillium alboatrum 和 Verticillium dahliae）侵染引发的草莓黄萎病是草莓上主要的真菌病害。草莓病害防治效果的高低，将直接影响到作物产量和种植户的收益。草莓病害的防治当前主要通过化学防治来防控。主要用以下化学药剂防治：嘧菌酯（azoxystrobin）、醚菌酯(kresoxim-methyl)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯肟菌酯(enestroburin)、啶酰菌胺（boscalid）、多菌灵(carbendazim)、吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和咪鲜胺（prochloraz）等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造成炭疽病菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗（耐）药性，生产上屡屡出现防治失败的事例。 

目前成功用于防治病害的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治控制病害的生防菌属（种）主要有（1）木霉菌属真菌（Trichodermaspp.）中的绿色木霉（Trichoderma viride）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）；（2）芽孢杆菌属细菌（Bacillus spp.）中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；（3）假单胞菌属细菌（Pseudomonas spp.）中的荧光假单胞细菌（Pseudomonas fluorescens）等。 

因草莓是即采即食的应时鲜果，且无果皮防护，所以对药剂的选择有很大的局限性。因此对草莓病害的生物防治在生产上具有一定迫切需求。本发明提供的可同时兼治草莓各类病害的颉颃细菌黄麻链霉菌NF0919菌株，在现有技术中没有提及和公开。 

发明内容

提供黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，及提取物在防治草莓炭疽病、草莓灰霉病、草莓枯萎病和草莓黄萎病上的应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL 201010236886.1。分类命 名为：黄麻链霉菌（拉丁文学名为Streptomyces corchorusii），已于2010年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No. 3968。本发明的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，包括以下步骤：

（A）菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10 d，挑取1 cm²大小的菌块接种于50 mL一级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），置于170 rpm摇床上30℃振荡培养44～48 h，其中所述的50 mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K₂HPO₄  0.2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl 和K₂HPO₄  含量的单位比例为W/V；

（B）二级种子培养液的培养

将步骤（A）所得一级种子培养液按5%（V/V）的接种量接入50 mL二级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），170 rpm、30 ℃摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V；所述的50 mL二级种子培养液的成分（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.2%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，淀粉酶0.01%，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃ 、K₂HPO₄、MgSO₄ 和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

（C）发酵培养液的培养

将步骤（B）所得二级种子培养液按5%（V/V）的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100%，消泡剂1.6 L，搅拌速度为360 rpm, 发酵温度为36 ℃，发酵时间为72 h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.6%，K₂HPO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，MgSO₄ 0.05%，CaCO₃ 0.1%，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄ 、NaCl 、MgSO₄ 和CaCO₃ 含量的单位比例为W/V；所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；

（D）NF0919菌株发酵液中代谢产物分离方法

把步骤（C）所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2.0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35℃真空干燥得提取物。

本发明的有益效果是： 

本发明提供黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，并证明其提取物可同时防治草莓果实、叶柄和叶片上的多种病害。大田防治结果表明，该菌株代谢产物对草莓炭疽病、草莓灰霉病、草莓枯萎病和草莓黄萎病均有很好的防治效果。

具体实施方式

实施例

本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL201010236886.1。本发明黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，包括以下步骤： 

（A）菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10 d，挑取1 cm²大小的菌块接种于50 mL一级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），置于170 rpm摇床上30℃振荡培养44～48 h，其中所述的50 mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K₂HPO₄  0.2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl 和K₂HPO₄  含量的单位比例为W/V；

（B）二级种子培养液的培养

将步骤（A）所得一级种子培养液按5%（V/V）的接种量接入50 mL二级种子培养液中（250 mL三角瓶装培养液50 mL），170 rpm、30 ℃摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V；所述的50 mL二级种子培养液的成分（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.2%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，淀粉酶0.01%，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃ 、K₂HPO₄、MgSO₄ 和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

（C）发酵培养液的培养

将步骤（B）所得二级种子培养液按5%（V/V）的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100%，消泡剂1.6 L，搅拌速度为360 rpm, 发酵温度为36 ℃，发酵时间为72 h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为（W/V）：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.6%，K₂HPO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，MgSO₄ 0.05%，CaCO₃ 0.1%，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄ 、NaCl 、MgSO₄ 和CaCO₃ 含量的单位比例为W/V；所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；

（D）NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法

把步骤（C）所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2.0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35℃真空干燥得提取物。

本实施例的实施效果：

（1）NF0919菌株发酵液的提取物，对草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、草莓枯萎病菌和草莓黄萎病菌的室内毒力测定

NF0919菌株发酵液的提取物对草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、草莓枯萎病菌和草莓黄萎病菌的室内毒力测定方法如下：

取适量提取物，用无菌水梯度稀释，制成含提取物浓度分别10、5、2.5、1.25、0.625、0 mg/L的PDA平板，并设无菌水为空白对照，对照药剂用化学药剂为98%多菌灵（Carbendazim）按上述相同稀释浓度制成含药PDA平板。用直径为4 mm的打孔器分别在长有草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、草莓枯萎病菌和草莓黄萎病菌的PDA平板的边缘打取菌饼，将菌饼接种到上述含药（提取物和多菌灵）平板中央，每个病原菌的每个浓度设4个重复。将平板置于25℃保温培养箱中，培养72 h。用十字交叉法测定菌落净生长直径(菌落净生长直径=菌落直径 － 菌饼直径) ，计算抑制率。抑制率=（空白对照菌落净生长直径 － 含药的菌落净生长直径）/空白对照菌落净生长直径×100%。用DPS 13.0软件计算毒力回归方程。

NF0919发酵液的提取物对草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、草莓枯萎病菌和草莓黄萎病菌的室内毒力测定结果： 

毒力测定结果表明，NF0919菌株发酵液的提取物对草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、草莓枯萎病菌和草莓黄萎病菌菌丝的生长均有强烈抑制作用(表1)，EC₅₀值（表3）分别为0.6097 mg/L、0.5031mg/L、1.0854mg/L和1.0119 mg/L。相比之下，相同稀释倍数条件下98%多菌灵对草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、草莓枯萎病菌和草莓黄萎病菌的菌丝生长抑制率（表2）较低，其EC₅₀值（表3）分别为3.4557 mg/L、1.7461mg/L、2.8954 mg/L和1.9036 mg/L。NF0919发酵液活性的提取物对草莓病原菌的室内毒力极显著高于化学药剂多菌灵。

表1. NF0919菌株发酵液的提取物对草莓病原菌的平均抑制率 

浓度（mg/L）	10	5	2.5	1.25	0.625	0
							对草莓炭疽病菌的平均抑制率（%）	94.31	89.26	78.65	64.87	51.25	0
对草莓灰霉病菌的平均抑制率（%）	98.74	88.75	76.63	69.87	54.12	0
							对草莓枯萎病菌的平均抑制率（%）	87.89	76.48	66.76	51.49	40.28	0
对草莓黄萎病菌的平均抑制率（%）	90.71	81.62	68.45	54.84	39.88	0

表2. 98%多菌灵对草莓病原菌的平均抑制率

浓度（mg/L）	10	5	2.5	1.25	0.625	0
							对草莓炭疽病菌的平均抑制率（%）	68.14	55.86	43.85	34.59	21.80	0
对草莓灰霉病菌的平均抑制率（%）	88.45	69.47	54.15	42.88	29.15	0
							对草莓枯萎病菌的平均抑制率（%）	70.84	59.72	48.16	34.89	24.51	0
对草莓黄萎病菌的平均抑制率（%）	79.25	68.46	56.74	43.68	26.85	0

表3. NF0919菌株发酵液的提取物对草莓病原菌的毒力测定结果

（2）NF0919菌株发酵液的提取物对草莓病害的田间防效试验

在江苏省句容市白兔镇, 大棚草莓园, 草莓品种为红颊。试验处理方案如下：

(A) 草莓炭疽病的防治

药剂处理方法：NF0919菌株发酵液提取物3000倍液，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产) 800倍液，空白对照为不防治, 小区面积40 m², 随机区组排列，4次重复。处理时间为2011年11月，防治间隔期10天，连续细喷雾防治3次，用水量为50公斤/667m²，最后一次防治后10天调查病情指数；

(B) 草莓灰霉病的防治

药剂处理方法：NF0919菌株发酵液提取物3000倍液，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产) 800倍液，空白对照为不防治, 小区面积40 m², 随机区组排列，4次重复。处理时间为2012年2月，防治间隔期10天，连续细喷雾防治3次，用水量为50公斤/667m²，最后一次防治后10天调查病情指数；

(C) 草莓枯萎病的防治

药剂处理方法：NF0919菌株发酵液提取物3000倍液，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产) 800倍液，在草莓移栽时每棵苗灌200ml药液，空白对照灌清水, 400棵苗每小区, 随机区组排列，4次重复。灌根时间在2011年8月26日，60天后调查病情指数；

(D) 草莓黄萎病的防治

药剂处理方法：NF0919菌株发酵液提取物3000倍液，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产) 800倍液，在草莓移栽时每棵移栽草莓苗灌200ml药液，空白对照灌清水, 400棵苗每小区, 随机区组排列，4次重复。灌根时间在2011年8月27日，60天后调查病情指数；

结果与分析：NF0919菌株发酵液提取物3000倍液草莓炭疽病、草莓灰霉病、草莓枯萎病和草莓黄萎病的防治效果分别为98.70%、97.41%、91.66%和89.93%（表4），而对照药剂50%多菌灵可湿性粉剂800倍液对草莓炭疽病、草莓灰霉病、草莓枯萎病和草莓黄萎病的防治效果分别为79.78%、66.62%、46.49%和35.42%（表4）。

以上结果表明，NF0919菌株发酵液中代谢产物提取物的田间防治效果显著高于对照药剂，NF0919菌株发酵液提取物对草莓多种病害的兼治作用显著。试验中所有处理均未发生药害现象，表明NF0919菌株发酵液中代谢产物使用安全。 

表4  NF0919菌株发酵液的提取物对草莓病害的田间防治试验结果 

注：不同大写字母表示 P < 0.01。 

Claims (3)

1.黄麻链霉菌（Streptomyces corchorusii）NF0919菌株（该菌种特性见专利ZL 201010236886.1）发酵液中代谢产物的提取方法。

2.根据权利要求1所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取物，在防治草莓炭疽病、草莓灰霉病、草莓枯萎病和草莓黄萎病上应用。

3.权利要求1所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（A）菌株的活化与一级种子培养液的培养

将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30℃培养10 d，挑取1 cm²大小的菌块接种于50 mL一级种子培养液中，置于170 rpm摇床上30℃振荡培养44～48 h，其中所述的50 mL一级种子培养液的成分为：可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K₂HPO₄  0.2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl 和K₂HPO₄  含量的单位比例为W/V；

（B）二级种子培养液的培养

将步骤（A）所得一级种子培养液按5%的接种量接入50 mL二级种子培养液中，170 rpm、30 ℃摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V；所述的50 mL二级种子培养液的成分：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.2%，CaCO₃ 0.1%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄ 0.05%，淀粉酶0.01%，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO₃ 、K₂HPO₄、MgSO₄ 和淀粉酶含量的单位比例为W/V；

（C）发酵培养液的培养

将步骤（B）所得二级种子培养液按5%的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为：溶氧100%，消泡剂（XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂）1.6 L，搅拌速度为360 rpm, 发酵温度为36 ℃，发酵时间为72 h，pH 6.8～7.2，所述的发酵培养液的成分为：马铃薯淀粉8.5%，棉籽蛋白2.6%，K₂HPO₄ 0.05%，NaCl 0.2%，MgSO₄ 0.05%，CaCO₃ 0.1%，pH7.2-7.4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K₂HPO₄ 、NaCl 、MgSO₄ 和CaCO₃ 含量的单位比例为W/V；

（D）NF0919菌株发酵液中代谢产物提取方法

把步骤（C）所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2.0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35℃真空干燥得提取物。