CN1696290A - 产黄青霉的一种转运蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了产黄青霉的一种转运蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供产黄青霉的一种转运蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №：1cDNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的cDNA序列；4)序列表中的SEQID №：3。产黄青霉的一种转运蛋白是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。构建增加该基因拷贝的工程菌可以有效提高β－内酰胺类抗生素产量。

Description

产黄青霉的一种转运蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种转运蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及产黄青霉的一种转运蛋白及其编码基因与在β-内酰胺类抗生素生产中的应用。

背景技术

β-内酰胺类抗生素是目前已知的抗生素中毒性最低、品种最多、临床应用最广的一类。其中最重要的为青霉素和头孢菌素C，以它们为原料经过化学或酶反应得到中间体，可得到一系列半合成青霉素和半合成头孢菌素，这些中间体主要包括6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基去乙酰头孢烷酸(7-ADCA)和氯甲基头孢苄酯(GCLE)、7-氨基头孢烯酸(7-ACA)。6-APA、7-ADCA、GCLE都由青霉素制得，7-ACA由头孢菌素C制得。这些中间体的获得使得半合成抗生素，特别是半合成头孢菌素的品种不断增加。目前，全世界临床应用的半合成青霉素和半合成头孢菌素品种已经超过了120种，占世界抗感染药物市场65％以上。

在工业生产中，青霉素和头孢菌素C分别由产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和产黄顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)产生。目前，它们的生物合成途径已经清楚：由三个前体氨基酸(α-氨基己二酸、半胱氨酸、缬氨酸)开始，经过缩合、环化反应后形成异青霉素N，这一过程在两种微生物中是一致，然后由此分叉，再经一系列反应，最终分别得到青霉素和头孢菌素C。与青霉素和头孢菌素C生物合成相关的关键基因都已被克隆(Ingolia&Queener，Med.Res.Rev.9：245-264，1989；Aharonowitz，et al.，Ann.Rev.Microbiol.46：461-495，1992；Ullán，et al.，J.Biol.Chem.277：46216-46225，2002)。

发酵过程中，青霉素和头孢菌素C都分泌到培养基中。在对发酵菌种进行改良中发现，β-内酰胺类抗生素的分泌是一个主动过程，需要转运蛋白的参与，但目前对其机制还知之甚少。WO01/32904提供了通过增强“ATP结合性盒型”转运蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)的活性来提高β-内酰胺抗生素分泌的方法，同时提供了相应的ABC转运蛋白基因的编码序列。在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中，Andrade等(Mol.Gen.Genet.，263：966-977，2000)报道了atrD基因编码的ABC转运蛋白在青霉素分泌中的作用。Ullán等(Mol.Gen.Genet.，267：673-683，2002)利用转录分析的方法，在产黄顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum)头孢菌素“早期”生物合成基因簇中发现了一个编码多药外排泵(multidrug efflux pump)蛋白的基因cefT，通过增加产黄顶头孢霉C10菌株中该基因的拷贝数，提高了宿主头孢菌素C的产量。

发明内容

本发明的目的是提供产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的一种与β-内酰胺类抗生素相关的转运蛋白及其编码基因。

本发明所提供的产黄青霉(Penicillium chrysogenum)转运蛋白的编码基因，来源于产黄青霉菌，名称为pctA，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的cDNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的cDNA序列；

4)序列表中的SEQ ID №：3。

序列表中的SEQ ID №：1的cDNA序列长度为1842bp，读码框是自5’端第67位核苷酸到第1761位核苷酸。

序列表中的SEQ ID №：3的DNA序列长度为3655bp，读码框是自5’端第1459位核苷酸到第3153位核苷酸，该序列中还包含有pctA基因的启动子、终止子等调控序列。

产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的一种转运蛋白，名称为PctA，是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2是由564个氨基酸残基组成的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体，如pPEPCT(物理图谱如图1)，pPCT(物理图谱如图2)等。

本发明的另一个目的是提供pctA基因在β-内酰胺抗生素生产上的应用。

实验证明，利用含有序列表中序列1的核苷酸序列以及相应的调控元件，构建转基因载体，并用其转化β-内酰胺抗生素生产菌，可以提高β-内酰胺抗生素的分泌，从而最终提高其产量。调控元件包括启动子与终止子，这些元件可以是该基因自身的，也可以是已经证实在丝状真菌有效的其他序列，比如，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)色氨酸合成酶基因trpC启动子与终止子，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因gpdA的启动子，粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)交叉途径控制基因cpc-1启动子，酵母cycl基因的终止序列(cyclTT)，以及产黄青霉青霉素生物合成关键酶ACVS、IPNS、AT基因的启动子与终止子等。

本发明提供了产黄青霉(Penicillium chrysogenum)中与β-内酰胺抗生素相关的一种转运蛋白及其编码基因，并构建了增加该基因拷贝数的工程菌，可以提高β-内酰胺抗生素的产量，降低β-内酰胺抗生素的生产成本。

附图说明

图1为pPEPCT载体的物理图谱

图2为pPCT载体的物理图谱

图3为PCR产物的电泳图

图4为TMHMM服务器对转运蛋白的跨膜区分析结果

图5为pPEPCT和pPCE9载体转基因菌株细胞内外7-ADCA含量比较图

具体实施方式

除有特别说明外，本发明中所用的试剂均为市售分析纯试剂，购自天津试剂公司。

实施例1、pctA基因的克隆

将产黄青霉菌ATCC10003(X-1612)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养基中培养24h，过滤收菌丝，取0.1g湿菌丝液N₂研磨，加1ml Trizol试剂(Invitrogen公司，15596-026)抽提产黄青霉总RNA，将所得产黄青霉总RNA溶解于DEPC水中，-70℃下保存备用。

为去除可能的DNA污染，取产黄青霉总RNA 5μg，在100μl反应体系内，加入5μlRQ1 RNase-Free DNase(Promega公司，M6101)，10μl RQ1 RNase-Free DNase反应缓冲液(10×)，37℃保温30分，用酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于10μl DEPC水。取5μl去除DNA的RNA样品，用随机引物(Random Hexamers，Promega公司，C1181)进行反转录，得到cDNA，所用反转录酶为SuperScript^TM II RNase H^-(Invitrogen公司，18064-022)。

以5’-ATCTGGCAGACCATTCTAATACTC-3’和5’-ATCAACCGATCTTATGCTC-3’为引物，分别以cDNA和经RQ1 RNase-Free DNase处理的RNA为模板进行PCR扩增，PCR条件为：94℃，5分；94℃1分，60℃1分，72℃1.5分-40循环；72℃7分；4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖电泳，结果如图3所示，只有cDNA扩增出了相应长度的片段，RNA模板则没有扩增条带。M道为DNA分子量标准，1道为RT-PCR产物，2道为RNA-PCR产物。将RT-PCR产物按常规方法克隆测序，测序结果表明该RT-PCR产物具有序列表中序列1的核苷酸序列，长度为1842bp。通过序列分析和GenBank数据库检索，表明该序列的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)为自5’端的第67到第1761位碱基，长度为1695bp，没有内含子，将其命名为pctA。在序列分析时还发现在ORF起始密码子ATG前21bp处，同相位有终止密码子TAG，由此说明我们得到了该基因的全长序列。

该基因ORF片段的读码框编码564个氨基酸，如序列表中序列2所示。该氨基酸序列与主要易化超家族(major facilitator superfamily，MFS)的转运蛋白氨基酸序列有很高的相似性：与啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)多胺转运蛋白Tpo3p、Tpo2p(NP_015482、NP_011654)氨基酸序列的一致性最高，皆为55％；与产黄顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)多药抗性蛋白(CefT，CAD32176)氨基酸序列的一致性为44％；与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)多药抗性蛋白(CAD29613)氨基酸序列的一致性为39％。

用TMHMM服务器(http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对该蛋白质序列进行了跨膜区分析，结果如图4所示，显示该蛋白存在12个跨膜区，分别位于130-152位、167-189位、201-223位、227-249位、256-278位、293-315位、364-386位、396-418位、438-460位、464-486位、499-521位、531-553位氨基酸残基处，具有典型的转运蛋白特征。(图4中标注1为跨膜区，2为膜外区，3为膜内区)

实施例2、产黄青霉基因转化载体(pPIPKA和pPCE9)的构建

酵母表达载体pPICZA和克隆载体pCR4Blunt-TOPO均购自Invitrogen公司。

将产黄青霉菌ATCC10003(X-1612)培养在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养基中24h，菌丝过滤后，加液N₂磨碎，用Easy-DNA kit(Invitrogen公司，K1800-01)提取得到产黄青霉基因组DNA。

本发明选用腐草霉素抗性的编码基因作为筛选标记，腐草霉素抗性的编码基因Shble来自于酵母表达载体pPICZA。在该载体中，Sh ble基因受酵母的TEF1(Transcriptionelongation factor 1)启动子和原核启动子EM7的双重调控，3’端则为酵母CYC1基因的终止序列(cyclTT)。为了在产黄青霉中应用该抗性，需引入能被丝状真菌产黄青霉RNA聚合酶识别的启动子，本发明选用产黄青霉中异青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的启动子Pipns。

根据文献(Carr et al.，Gene 48：257～266，1986)，设计引物pip1：5’-TCGCGGATCCTGTCCCTAGTGCTGGGCTTGAAGTATG-3’和pip2：5’-TGGAAGCCATGGTGTCTAGAAAAATAATGGTGAAAACT-3’，以产黄青霉ATCC10003(x-1612)菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR条件为：94℃，5分；94℃1分，62℃1分，72℃1分-30循环；72℃7分；4℃保存，得到1.16kb的Pipns序列。对PCR产物克隆测序，结果表明该PCR产物长度为1168bp，和文献报道基本一致，只在589位由G变为A。在所得PCR产物的5’和3’端分别引入BamH I和Nco I酶切位点，用T₄DNA连接酶(Promega公司，M1801)与pGEM-T载体(Promega公司，A1360)在16℃连接12小时，得到质粒pGEM-T/Pipns。

利用引物：pk1 5’-TGAAGCTTGTCAGCTACTGGGCTATCAGGAC-3’、pk25’-ACA GATCTAAAGTGCCACCTGTATGCGGTGTG-3’，以pCR4Blunt-TOPO质粒为模板，PCR扩增得到卡那霉素的抗性基因(kan^r)，并在其5’端和3’端分别引入Hind III、Bgl II酶切位点。

pPICZA质粒用Hind III/Bgl II双酶切后回收2.46kb片段，与经过同样酶切的kan^r片段在16℃连接12小时，得到pPICZA/kan质粒，然后采用CaCl₂转化法转化大肠杆菌DH5α，筛选同时具有卡那霉素和腐草霉素抗性的阳性克隆，从中提取pPICZA/kan质粒。

pPICZA/kan质粒经BamH I/NcoI部分消化，回收3.1kb片段。pGEM-T/Pipns同样用BamH I/NcoI酶切，回收1.16kb片段。将两片段在16℃连接12小时，得到产黄青霉的转化载体，定名为pPIPKA。

根据文献中公开的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的青霉素N扩环酶基因(cefE)(Kovacevic et al.J Bacteriol.171：754-760，1989)序列，设计引物：

CEF1：5’-GTGAGAGTCCATGGACACGACGGTGCCCACCTTCAGCCTG-3’

CEF2：5’-TTAGATAAGCTTCGCCTTGACCGCGGTGAGGTCGACTC-3’

用棒状链霉菌染色体DNA为模板，以CEF1、CEF2为引物进行PCR扩增，得到0.9kb的PCR产物，该PCR产物为cefE开放阅读框，其5’端引入了Nco I内切酶位点，3’端引入了Hind III内切酶位点。

将克隆的棒状链霉菌的扩环酶基因cefE(包括ORF及其本身的终止序列)与IPNS基因的启动子Pipns连接，得到表达盒pcef。将此表达盒pcef克隆于pPIPKA的BamHI/Hind III位点，所得质粒定名为pPCE9。该质粒含有IPNS基因启动子Pipns启动的棒状链霉菌的扩环酶基因，用该质粒转化产黄青霉，其阳性克隆菌株可直接发酵得到半合抗中间体7-ADCA。

实施例3、利用pctA基因提高7-ADCA产量

1、构建载体pPEPCT

以5’-TTTATCACAGTTTGCAGCCTATTT-3’和5’-TGATTTACACCGTCTCCCAGTT-3’为引物，以产黄青霉ATCC10003基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化后按常规方法进行测序，结果为序列表中序列3的核苷酸序列，长度为3655bp。该序列除含有pctA基因的编码区(自5’端第1459bp到3153bp)外，还包含有启动子、终止子等调控序列。将pPCE9载体用Hind III酶切、Klenow酶(Promega公司，M220A)补平，然后用T₄DNA连接酶与PCR产物在16℃连接12小时，得到载体pPEPCT，其物理图谱如图1所示。

2、产黄青霉转化与阳性克隆筛选

采用Ca-PEG介导的原生质体转化法来转化细胞。具体操作按Cantoral的方法(Bio/Technol.5：494-497，1987)进行，分别用pPEPCT载体和pPCE9载体转化产黄青霉ATCC10003。阳性克隆在含有腐草霉素的YPD选择性培养基筛选，各得到阳性克隆330个、282个。

3、转基因菌株分泌7-ADCA检测

将所得阳性菌株按2×10⁶分生孢子/ml接种到种子培养基，在26℃下培养48小时，种子培养基配方为(g/l)：葡萄糖，30；乳糖，10；棉籽饼粉，10；酵母粉，10；玉米浆，10；(NH₄)₂SO₄，2；KH₂PO₄，1；CaCO₃，5；pH5.8。然后将种子培养物以5％接种量接种到发酵培养基，26℃下培养144小时。发酵培养基为(g/l)：乳糖，120；棉籽饼粉，30；玉米浆，20；(NH₄)₂SO₄，5；KH₂PO₄，1；K₂SO₄，5；CaCO₃，10；pH6.5。

发酵结束后，以8000g离心力离心发酵液15分钟除去菌丝体，得到发酵上清液。上清液进行HPLC分析，分析条件见表1。

        表1目的产物HPLC分析条件

时间	％甲醇	％乙酸水(pH3.0)
				2	98
6	2	98
			21	55	45
27	55	45
			28	2	98
分析柱：Kromasil KR100-10C18(250×4.6mm)检测波长：260nm流速：1ml/min检测器：Waters 2487目的峰保留时间：16.8分钟

按照峰面积计算7-ADCA的产量，以pPCE9载体282个转基因菌株的平均产量为100％，pPEPCT转基因菌株7-ADCA的平均产量提高了26.5％。两种载体的转基因菌株7-ADCA产量的比较如表2所示。

    表2两种载体的转基因菌株7-ADCA产量的比较

转化载体	阳性克隆数	7-ADCA平均产量
			pPCE9(c)	282	100％
pPEPCT(ct)	330	126.5％

4、转基因菌株细胞内外7-ADCA含量比较

各取60株两种载体的阳性克隆株，按照步骤3的培养方法进行接种和发酵培养。10ml 144小时的发酵液8000g离心力离心15分钟，上清液用HPLC测定7-ADCA含量。沉淀菌丝加入10m175％乙醇重悬，静置60分钟，萃取出细胞中的7-ADCA。离心上清用于HPLC分析。按峰面积计算产量，换算成每毫升菌液的7-ADCA含量。结果表明，pPCE9转基因菌株中，胞内7-ADCA的含量占63％，胞外占37％，而pPEPCT转基因菌株细胞内外的含量分别为43％、 57％。这种差异体现了pPEPCT载体中所含编码转运蛋白的基因序列转化进细胞后，促进了7-ADCA的分泌，从而导致产量的增加。

实施例4、利用pctA基因提高青霉素的产量

将载体pPIPKA用Hind III和BamH I酶切后，用Klenow酶补平，回收大片段，与实施例3中得到的PCR产物在16℃温度下连接12小时，得到载体pPCT，其功能图谱如图2所示。

按实施例3所述方法用载体pPCT转化产黄青霉菌株ATCC10003，筛选得到157株阳性菌株。按照标准方法(Brownlee et al，J Gen Microbio1，3：347-352，1949)检测青霉素产量，并参照Lein的方法(Overproduction of microbial metabolites，Z.Vanek and ZHostalek eds，pp105-139，1986)对筛选到的高单位菌株利用摇瓶发酵进行复试。结果表明，工程菌与出发菌株相比，其青霉素产量明显提高，最高提高幅度超过了20％。

                           序列表

<160>3

<210>1

<211>1842

<212>cDNA

<213>产黄青霉(Penicillium chrysogenum)

<400>1

atctggcaga ccattctaat actcccaaaa atccttccac tgccataggc tctcatattt     60

attattatgt cttcgacgat accagaagaa ggctcggaga ccccggagcc cttgcatgcc    120

cagcacctat ctatggccga aacgcaagag agcctccgca accggggcat cgcagaaact    180

cctcaagcat tggattacaa ctacccggct attggacatg acaaagaccc tgtatttccc    240

gaggagtaca ccgttgagac gagtactggt cttgttcccc aaagaaccct ggagcagatc    300

cgatctcatg gttctatctc atcgacgaag atcggaacac caacaaacga ggtcaacgcc    360

gacatcgaaa aaggaggaaa gggccctacg gagttcgtga cattcaccat cggcgatcct    420

gaacacccct acaattggtc ccgtgcttat cgctggtata tcactcttgt cgcctcggca    480

cttgtggtat gtgtcgcatt cgggtcctcc attgtcaccg gaggattggg tttgattgaa    540

gaacaataca acgtctctct cgaagttgca atcctaacat gttcaatcat ggtctgcgga    600

ttcgcagttg gccctctact ctggtctccc ctctctgaga tcatcggtcg aaggcctgta    660

tacatcatct ctctcgtttt atatgtgatt ttcaacatcc catgcgctct atccccaaac    720

atcggtggct tgctcgtctg ccgattccta tgcggtgtct tctctagttc aggcctttcc    780

ctcgctggtg gcaccattgc cgatatttgg agcattgagg agcgcgggat ggccattgca    840

tactttgctg ctgcaccata ctgcggccct gtactcggcc ctatcgtgac aggttggatc    900

aatgttggaa cgggccgcct cgacctcttc ttctgggtga acctagcttt cgccggtgcc    960

atcatggtca tgatcggcct tgtcccggag acatatgctc cagtgatcct gaagcggcgt   1020

gccgcaaaac tccgcaaaga aaccggaaaa aacatcatca ccgagcaaga aaaaacgaag   1080

ctcacattcc gagaaatcgc tcgcacaagc ctgatcagac ccatcactat gattatgaca   1140

gagcccgtcc tcgaccttat gtgcatgtat attgttctga tctatgcaat gctctacgcc   1200

ttcttcttcg catacccggt catcttcacc aagctctatg gctacaacga cggccagatc   1260

gggctcatgt ttattcccat tctgatcggc gccggtttcg cccttgttgt cacacccgcc   1320

atcgagggca agttccggaa aatctgtagc acgaggtctc caacaccaga ggaccgactc   1380

cacgctgcac tgattggtgc accttttatc ccaatcgcct tcttcatcct gggcgctacc   1440

tcctacaagc atattatctg ggttggacct gcttcgtcgg ggattgcctt tggcttcggc   1500

atggtgttgt gctactatgc agtgaataac tatatcatcg actcgtacca gaagtacgct   1560

gcgtcggctt tggcggccaa ggtcttcctc cgctctggtg gtggcgcggc tttcccgctg   1620

ttcactacgc agatgtatga tcgtcttggg ttgcagtggg cttcttggct gcttgctttc   1680

attggcgttg ccatggtctt cattccatat atcttctact tctttggggc gggcctgcgc   1740

gcaagactta cccgggatta ggagaattgc tgctcctgct gtttctttct tttttcttca   1800

tggaaaaagg ttagaacgtt cgggagcata agatcggttg at                      1842

<210>2

<211>564

<212>PRT

<213>产黄青霉(Penicillium chrysogenum)

<400>2

Met Ser Ser Thr Ile Pro Glu Glu Gly Ser Glu Thr Pro Glu Pro Leu

1               5                   10                  15

His Ala Gln His Leu Ser Met Ala Glu Thr Gln Glu Ser Leu Arg Asn

            20                  25                  30

Arg Gly Ile Ala Glu Thr Pro Gln Ala Leu Asp Tyr Asn Tyr Pro Ala

        35                  40                  45

Ile Gly His Asp Lys Asp Pro Val Phe Pro Glu Glu Tyr Thr Val Glu

    50                  55                  60

Thr Ser Thr Gly Leu Val Pro Gln Arg Thr Leu Glu Gln Ile Arg Ser

65                  70                  75                  80

His Gly Ser Ile Ser Ser Thr Lys Ile Gly Thr Pro Thr Asn Glu Val

                85                  90                  95

Asn Ala Asp Ile Glu Lys Gly Gly Lys Gly Pro Thr Glu Phe Val Thr

            100                 105                 110

Phe Thr Ile Gly Asp Pro Glu His Pro Tyr Asn Trp Ser Arg Ala Tyr

        115                 120                 125

Arg Trp Tyr Ile Thr Leu Val Ala Ser Ala Leu Val Val Cys Val Ala

    130                 135                 140

Phe Gly Ser Ser Ile Val Thr Gly Gly Leu Gly Leu Ile Glu Glu Gln

145                 150                 155                 160

Tyr Asn Val Ser Leu Glu Val Ala Ile Leu Thr Cys Ser Ile Met Val

                165                 170                 175

Cys Gly Phe Ala Val Gly Pro Leu Leu Trp Ser Pro Leu Ser Glu Ile

            180                 185                 190

Ile Gly Arg Arg Pro Val Tyr Ile Ile Ser Leu Val Leu Tyr Val Ile

        195                 200                 205

Phe Asn Ile Pro Cys Ala Leu Ser Pro Asn Ile Gly Gly Leu Leu Val

    210                 215                 220

Cys Arg Phe Leu Cys Gly Val Phe Ser Ser Ser Gly Leu Ser Leu Ala

225                 230                 235                 240

Gly Gly Thr Ile Ala Asp Ile Trp Ser Ile Glu Glu Arg Gly Met Ala

                245                 250                 255

Ile Ala Tyr Phe Ala Ala Ala Pro Tyr Cys Gly Pro Val Leu Gly Pro

            260                 265                 270

Ile Val Thr Gly Trp Ile Asn Val Gly Thr Gly Arg Leu Asp Leu Phe

        275                 280                 285

Phe Trp Val Asn Leu Ala Phe Ala Gly Ala Ile Met Val Met Ile Gly

    290                 295                 300

Leu Val Pro Glu Thr Tyr Ala Pro Val Ile Leu Lys Arg Arg Ala Ala

305                 310                 315                 320

Lys Leu Arg Lys Glu Thr Gly Lys Asn Ile Ile Thr Glu Gln Glu Lys

                325                 330                 335

Thr Lys Leu Thr Phe Arg Glu Ile Ala Arg Thr Set Leu Ile Arg Pro

            340                 345                 350

Ile Thr Met Ile Met Thr Glu Pro Val Leu Asp Leu Met Cys Met Tyr

        355                 360                 365

Ile Val Leu Ile Tyr Ala Met Leu Tyr Ala Phe Phe Phe Ala Tyr Pro

    370                 375                 380

Val Ile Phe Thr Lys Leu Tyr Gly Tyr Asn Asp Gly Gln Ile Gly Leu

385                 390                 395                 400

Met Phe Ile Pro Ile Leu Ile Gly Ala Gly Phe Ala Leu Val Val Thr

                405                 410                 415

Pro Ala Ile Glu Gly Lys Phe Arg Lys Ile Cys Ser Thr Arg Ser Pro

            420                 425                 430

Thr Pro Glu Asp Arg Leu His Ala Ala Leu Ile Gly Ala Pro Phe Ile

        435                 440                 445

Pro Ile Ala Phe Phe Ile Leu Gly Ala Thr Ser Tyr Lys His Ile Ile

    450                 455                 460

Trp Val Gly Pro Ala Ser Ser Gly Ile Ala Phe Gly Phe Gly Met Val

465                 470                 475                 480

Leu Cys Tyr Tyr Ala Val Asn Asn Tyr Ile Ile Asp Ser Tyr Gln Lys

                485                 490                 495

Tyr Ala Ala Ser Ala Leu Ala Ala Lys Val Phe Leu Arg Ser Gly Gly

            500                 505                 510

Gly Ala Ala Phe Pro Leu Phe Thr Thr Gln Met Tyr Asp Arg Leu Gly

        515                 520                 525

Leu Gln Trp Ala Ser Trp Leu Leu Ala Phe Ile Gly Val Ala Met Val

    530                 535                 540

Phe Ile Pro Tyr Ile Phe Tyr Phe Phe Gly Ala Gly Leu Arg Ala Arg

545                 550                 555                 560

Leu Thr Arg Asp

<210>3

<211>3655

<212>DNA

<213>产黄青霉(Penicillium chrysogenum)

<400>3

tttatcacag tttgcagcct atttaggccg ggagggaaag tgtcgagttg aggacaccga      60

aaagggcttg gtcatagcgt ggattgataa cagtccagac acacttcgcc gccgggaggc     120

catcttaaag aaagaacgcc aggagaaggg agacgaagag cgagagcaac gcttgattca     180

agaccagatt aagcgcgccc agcaaacggc gctggctggc agcactacga cagaaccgga     240

acccgaggca agattgttgc agaggaagga aggagaaaag atgaagttga atcttggact     300

tggctcgaag aaggcagatg caaagcctgc atcgcctcct acggcaacaa cgacagcgga     360

gtcgccggaa gaaaaagatg cacaaaagga tgcaccgaca ggaaacagcg actctcccgc     420

tccgtctgcg cctaccgcac ccgtcaaaat atcgatgtca atgggtacac agaagccgaa     480

aaatgtgttt gcagcagcag ctaagaagaa ccccttggct gggaaaaagg gttctatatt     540

cacggctcct aagaaaatga ctgagcagga aaggattatg agagctgaaa tggaggcaat     600

ggagcgcaaa cgggcccgtc cggactcggg attcacgaac aaacgaccga agatcacttg     660

aattgacatg atttacatag agaaaacaca tacccagcta cccggcccat gcggttgagc     720

ctatcgccct gcacaaacct tatgggagga tttgggccgg gtaagtcgtt tcttcaaatt     780

ccttccgttt gtatcatgca cagtatgtgg gacttcaaga ggtactcgat catattgtat     840

tcaaacagtt gtcttagcat tgtccatagg tgatcgtata taaaaccgtg ggtggaatcc     900

aacctccgaa atatatctac aactattccc attaaccttt cctagcgaag tcgagttttg     960

tgatctattt ggaaagtggg atcgaaacgt acctgggcat cgcatatata gcaattactt    1020

gctagcattc acgcgagctt ttggtgttga atggaagact gacgtgtctg agacctccac    1080

gggccgaaaa agaaccgggc cgttggaaac ctgatcggat cacactaagc gcagtctggc    1140

ctatcgggcg tgatgctaca aatctaaact tgggttggat tcgacgtctt atagtagatg    1200

cgcacacggc gatcgctcgg accgagcttt taccgctcac attgcgactg gtttagtgag    1260

ccattttctg cgatgccgac tttccggtga tcgtccggta tatctcggag atgggtcggc    1320

gttgcaagta tatacctgac acctttgcaa gcctccttgg gagtataagt atctgcaata    1380

tcgcctttaa gtatctggca gaccattcta atactcccaa aaatccttcc actgccatag    1440

gctctcatat ttattattat gtcttcgacg ataccagaag aaggctcgga gaccccggag    1500

cccttgcatg cccagcacct atctatggcc gaaacgcaag agagcctccg caaccggggc    1560

atcgcagaaa ctcctcaagc attggattac aactacccgg ctattggaca tgacaaagac    1620

cctgtatttc ccgaggagta caccgttgag acgagtactg gtcttgttcc ccaaagaacc    1680

ctggagcaga tccgatctca tggttctatc tcatcgacga agatcggaac accaacaaac    1740

gaggtcaacg ccgacatcga aaaaggagga aagggcccta cggagttcgt gacattcacc    1800

atcggcgatc ctgaacaccc ctacaattgg tcccgtgctt atcgctggta tatcactctt    1860

gtcgcctcgg cacttgtggt atgtgtcgca ttcgggtcct ccattgtcac cggaggattg    1920

ggtttgattg aagaacaata caacgtctct ctcgaagttg caatcctaac atgttcaatc    1980

atggtctgcg gattcgcagt tggccctcta ctctggtctc ccctctctga gatcatcggt    2040

cgaaggcctg tatacatcat ctctctcgtt ttatatgtga ttttcaacat cccatgcgct    2100

ctatccccaa acatcggtgg cttgctcgtc tgccgattcc tatgcggtgt cttctctagt    2160

tcaggccttt ccctcgctgg tggcaccatt gccgatattt ggagcattga ggagcgcggg    2220

atggccattg catactttgc tgctgcacca tactgcggcc ctgtactcgg ccctatcgtg    2280

acaggttgga tcaatgttgg aacgggccgc ctcgacctct tcttctgggt gaacctagct    2340

ttcgccggtg ccatcatggt catgatcggc cttgtcccgg agacatatgc tccagtgatc    2400

ctgaagcggc gtgccgcaaa actccgcaaa gaaaccggaa aaaacatcat caccgagcaa    2460

gaaaaaacga agctcacatt ccgagaaatc gctcgcacaa gcctgatcag acccatcact    2520

atgattatga cagagcccgt cctcgacctt atgtgcatgt atattgttct gatctatgca    2580

atgctctacg ccttcttctt cgcatacccg gtcatcttca ccaagctcta tggctacaac    2640

gacggccaga tcgggctcat gtttattccc attctgatcg gcgccggttt cgcccttgtt    2700

gtcacacccg ccatcgaggg caagttccgg aaaatctgta gcacgaggtc tccaacacca    2760

gaggaccgac tccacgctgc actgattggt gcacctttta tcccaatcgc cttcttcatc    2820

ctgggcgcta cctcctacaa gcatattatc tgggttggac ctgcttcgtc ggggattgcc    2880

tttggcttcg gcatggtgtt gtgctactat gcagtgaata actatatcat cgactcgtac    2940

cagaagtacg ctgcgtcggc tttggcggcc aaggtcttcc tccgctctgg tggtggcgcg    3000

gctttcccgc tgttcactac gcagatgtat gatcgtcttg ggttgcagtg ggcttcttgg    3060

ctgcttgctt tcattggcgt tgccatggtc ttcattccat atatcttcta cttctttggg    3120

gcgggcctgc gcgcaagact tacccgggat taggagaatt gctgctcctg ctgtttcttt    3180

cttttttctt catggaaaaa ggttagaacg ttcgggagca taagatcggt tgatggagag    3240

acgaaagtct tgatttgaca ttaatggatg ttgggggtaa tgacatacat aataatacta    3300

atgaaggata gaacacaaca cggagagcat cggtgctcct tcaccggggc gacacatggc    3360

gaatcaatat tttccctggc ctcgattcca agtgccgggg aatacacaga gatatattgc    3420

ctcagccttg gagcgtcatt gagaacgatt atcttatgca taccgtcggt ctcatagagt    3480

ctagcgccgt ctgtattgtg agggcagtct ctgacgtttc ctgggttttt tccacctagg    3540

aggtgtgaaa ctcaatataa ggcatgatct gctggagatg cgaagtgaga agaaagatgt    3600

ggcatcaggc gaaaacttgc ccaaaggaat cccaactggg agacggtgta aatca         3655

Claims (10)

1、产黄青霉的一种转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的cDNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的cDNA序列；

4)序列表中的SEQ ID №：3。

2、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所述产黄青霉转运蛋白的编码基因是序列表中的SEQ ID №：1。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述SEQ ID №：1的读码框是自5’端第67位核苷酸到第1761位核苷酸。

4、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所述产黄青霉转运蛋白的编码基因是序列表中的SEQ ID №：3。

5、产黄青霉的一种转运蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质或将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

6、根据权利要求5所述的产黄青霉转运蛋白，其特征在于：它具有序列表中SEQID №：2的氨基酸残基序列。

7、含有权利要求1所述基因的表达载体和细胞系。

8、根据权利要求7所述的表达载体和细胞系，其特征在于：所述载体为pPEPCT或pPCT。

9、权利要求1所述基因在β-内酰胺类抗生素生产中的应用。

10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述β-内酰胺类抗生素为7-氨基去乙酰头孢烷酸、青霉素。

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