产黄青霉的一种转运蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种转运蛋白及其编码基因与应用,特别是涉及产黄青霉的一种转运蛋白及其编码基因与在β-内酰胺类抗生素生产中的应用。
背景技术
β-内酰胺类抗生素是目前已知的抗生素中毒性最低、品种最多、临床应用最广的一类。其中最重要的为青霉素和头孢菌素C,以它们为原料经过化学或酶反应得到中间体,可得到一系列半合成青霉素和半合成头孢菌素,这些中间体主要包括6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基去乙酰头孢烷酸(7-ADCA)和氯甲基头孢苄酯(GCLE)、7-氨基头孢烯酸(7-ACA)。6-APA、7-ADCA、GCLE都由青霉素制得,7-ACA由头孢菌素C制得。这些中间体的获得使得半合成抗生素,特别是半合成头孢菌素的品种不断增加。目前,全世界临床应用的半合成青霉素和半合成头孢菌素品种已经超过了120种,占世界抗感染药物市场65%以上。
在工业生产中,青霉素和头孢菌素C分别由产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和产黄顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)产生。目前,它们的生物合成途径已经清楚:由三个前体氨基酸(α-氨基己二酸、半胱氨酸、缬氨酸)开始,经过缩合、环化反应后形成异青霉素N,这一过程在两种微生物中是一致,然后由此分叉,再经一系列反应,最终分别得到青霉素和头孢菌素C。与青霉素和头孢菌素C生物合成相关的关键基因都已被克隆(Ingolia&Queener,Med.Res.Rev.9:245-264,1989;Aharonowitz,et al.,Ann.Rev.Microbiol.46:461-495,1992;Ullán,et al.,J.Biol.Chem.277:46216-46225,2002)。
发酵过程中,青霉素和头孢菌素C都分泌到培养基中。在对发酵菌种进行改良中发现,β-内酰胺类抗生素的分泌是一个主动过程,需要转运蛋白的参与,但目前对其机制还知之甚少。WO01/32904提供了通过增强“ATP结合性盒型”转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC transporter)的活性来提高β-内酰胺抗生素分泌的方法,同时提供了相应的ABC转运蛋白基因的编码序列。在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中,Andrade等(Mol.Gen.Genet.,263:966-977,2000)报道了atrD基因编码的ABC转运蛋白在青霉素分泌中的作用。Ullán等(Mol.Gen.Genet.,267:673-683,2002)利用转录分析的方法,在产黄顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum)头孢菌素“早期”生物合成基因簇中发现了一个编码多药外排泵(multidrug efflux pump)蛋白的基因cefT,通过增加产黄顶头孢霉C10菌株中该基因的拷贝数,提高了宿主头孢菌素C的产量。
发明内容
本发明的目的是提供产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的一种与β-内酰胺类抗生素相关的转运蛋白及其编码基因。
本发明所提供的产黄青霉(Penicillium chrysogenum)转运蛋白的编码基因,来源于产黄青霉菌,名称为pctA,是下列核苷酸序列之一:
1)序列表中的SEQ ID №:1
2)编码序列表中SEQ ID №:2蛋白质序列的多核苷酸;
3)与序列表中SEQ ID №:1限定的cDNA序列具有90%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的cDNA序列;
4)序列表中的SEQ ID №:3。
序列表中的SEQ ID №:1的cDNA序列长度为1842bp,读码框是自5’端第67位核苷酸到第1761位核苷酸。
序列表中的SEQ ID №:3的DNA序列长度为3655bp,读码框是自5’端第1459位核苷酸到第3153位核苷酸,该序列中还包含有pctA基因的启动子、终止子等调控序列。
产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的一种转运蛋白,名称为PctA,是具有序列表中SEQ ID №:2的氨基酸残基序列的蛋白质或将SEQ ID №:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №:2相同活性的由SEQ ID №:2衍生的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №:2是由564个氨基酸残基组成的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围,利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体,如pPEPCT(物理图谱如图1),pPCT(物理图谱如图2)等。
本发明的另一个目的是提供pctA基因在β-内酰胺抗生素生产上的应用。
实验证明,利用含有序列表中序列1的核苷酸序列以及相应的调控元件,构建转基因载体,并用其转化β-内酰胺抗生素生产菌,可以提高β-内酰胺抗生素的分泌,从而最终提高其产量。调控元件包括启动子与终止子,这些元件可以是该基因自身的,也可以是已经证实在丝状真菌有效的其他序列,比如,构巢曲霉(Aspergillus nidulans)色氨酸合成酶基因trpC启动子与终止子,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因gpdA的启动子,粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)交叉途径控制基因cpc-1启动子,酵母cycl基因的终止序列(cyclTT),以及产黄青霉青霉素生物合成关键酶ACVS、IPNS、AT基因的启动子与终止子等。
本发明提供了产黄青霉(Penicillium chrysogenum)中与β-内酰胺抗生素相关的一种转运蛋白及其编码基因,并构建了增加该基因拷贝数的工程菌,可以提高β-内酰胺抗生素的产量,降低β-内酰胺抗生素的生产成本。
附图说明
图1为pPEPCT载体的物理图谱
图2为pPCT载体的物理图谱
图3为PCR产物的电泳图
图4为TMHMM服务器对转运蛋白的跨膜区分析结果
图5为pPEPCT和pPCE9载体转基因菌株细胞内外7-ADCA含量比较图
具体实施方式
除有特别说明外,本发明中所用的试剂均为市售分析纯试剂,购自天津试剂公司。
实施例1、pctA基因的克隆
将产黄青霉菌ATCC10003(X-1612)在YPD(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖)培养基中培养24h,过滤收菌丝,取0.1g湿菌丝液N2研磨,加1ml Trizol试剂(Invitrogen公司,15596-026)抽提产黄青霉总RNA,将所得产黄青霉总RNA溶解于DEPC水中,-70℃下保存备用。
为去除可能的DNA污染,取产黄青霉总RNA 5μg,在100μl反应体系内,加入5μlRQ1 RNase-Free DNase(Promega公司,M6101),10μl RQ1 RNase-Free DNase反应缓冲液(10×),37℃保温30分,用酚:氯仿抽提,乙醇沉淀,溶于10μl DEPC水。取5μl去除DNA的RNA样品,用随机引物(Random Hexamers,Promega公司,C1181)进行反转录,得到cDNA,所用反转录酶为SuperScriptTM II RNase H-(Invitrogen公司,18064-022)。
以5’-ATCTGGCAGACCATTCTAATACTC-3’和5’-ATCAACCGATCTTATGCTC-3’为引物,分别以cDNA和经RQ1 RNase-Free DNase处理的RNA为模板进行PCR扩增,PCR条件为:94℃,5分;94℃1分,60℃1分,72℃1.5分-40循环;72℃7分;4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖电泳,结果如图3所示,只有cDNA扩增出了相应长度的片段,RNA模板则没有扩增条带。M道为DNA分子量标准,1道为RT-PCR产物,2道为RNA-PCR产物。将RT-PCR产物按常规方法克隆测序,测序结果表明该RT-PCR产物具有序列表中序列1的核苷酸序列,长度为1842bp。通过序列分析和GenBank数据库检索,表明该序列的开放阅读框架(Open Reading Frame,ORF)为自5’端的第67到第1761位碱基,长度为1695bp,没有内含子,将其命名为pctA。在序列分析时还发现在ORF起始密码子ATG前21bp处,同相位有终止密码子TAG,由此说明我们得到了该基因的全长序列。
该基因ORF片段的读码框编码564个氨基酸,如序列表中序列2所示。该氨基酸序列与主要易化超家族(major facilitator superfamily,MFS)的转运蛋白氨基酸序列有很高的相似性:与啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)多胺转运蛋白Tpo3p、Tpo2p(NP_015482、NP_011654)氨基酸序列的一致性最高,皆为55%;与产黄顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)多药抗性蛋白(CefT,CAD32176)氨基酸序列的一致性为44%;与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)多药抗性蛋白(CAD29613)氨基酸序列的一致性为39%。
用TMHMM服务器(http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对该蛋白质序列进行了跨膜区分析,结果如图4所示,显示该蛋白存在12个跨膜区,分别位于130-152位、167-189位、201-223位、227-249位、256-278位、293-315位、364-386位、396-418位、438-460位、464-486位、499-521位、531-553位氨基酸残基处,具有典型的转运蛋白特征。(图4中标注1为跨膜区,2为膜外区,3为膜内区)
实施例2、产黄青霉基因转化载体(pPIPKA和pPCE9)的构建
酵母表达载体pPICZA和克隆载体pCR4Blunt-TOPO均购自Invitrogen公司。
将产黄青霉菌ATCC10003(X-1612)培养在YPD(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖)培养基中24h,菌丝过滤后,加液N2磨碎,用Easy-DNA kit(Invitrogen公司,K1800-01)提取得到产黄青霉基因组DNA。
本发明选用腐草霉素抗性的编码基因作为筛选标记,腐草霉素抗性的编码基因Shble来自于酵母表达载体pPICZA。在该载体中,Sh ble基因受酵母的TEF1(Transcriptionelongation factor 1)启动子和原核启动子EM7的双重调控,3’端则为酵母CYC1基因的终止序列(cyclTT)。为了在产黄青霉中应用该抗性,需引入能被丝状真菌产黄青霉RNA聚合酶识别的启动子,本发明选用产黄青霉中异青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的启动子Pipns。
根据文献(Carr et al.,Gene 48:257~266,1986),设计引物pip1:5’-TCGCGGATCCTGTCCCTAGTGCTGGGCTTGAAGTATG-3’和pip2:5’-TGGAAGCCATGGTGTCTAGAAAAATAATGGTGAAAACT-3’,以产黄青霉ATCC10003(x-1612)菌株基因组DNA为模板,进行PCR扩增,PCR条件为:94℃,5分;94℃1分,62℃1分,72℃1分-30循环;72℃7分;4℃保存,得到1.16kb的Pipns序列。对PCR产物克隆测序,结果表明该PCR产物长度为1168bp,和文献报道基本一致,只在589位由G变为A。在所得PCR产物的5’和3’端分别引入BamH I和Nco I酶切位点,用T4DNA连接酶(Promega公司,M1801)与pGEM-T载体(Promega公司,A1360)在16℃连接12小时,得到质粒pGEM-T/Pipns。
利用引物:pk1 5’-TGAAGCTTGTCAGCTACTGGGCTATCAGGAC-3’、pk25’-ACA GATCTAAAGTGCCACCTGTATGCGGTGTG-3’,以pCR4Blunt-TOPO质粒为模板,PCR扩增得到卡那霉素的抗性基因(kanr),并在其5’端和3’端分别引入Hind III、Bgl II酶切位点。
pPICZA质粒用Hind III/Bgl II双酶切后回收2.46kb片段,与经过同样酶切的kanr片段在16℃连接12小时,得到pPICZA/kan质粒,然后采用CaCl2转化法转化大肠杆菌DH5α,筛选同时具有卡那霉素和腐草霉素抗性的阳性克隆,从中提取pPICZA/kan质粒。
pPICZA/kan质粒经BamH I/NcoI部分消化,回收3.1kb片段。pGEM-T/Pipns同样用BamH I/NcoI酶切,回收1.16kb片段。将两片段在16℃连接12小时,得到产黄青霉的转化载体,定名为pPIPKA。
根据文献中公开的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的青霉素N扩环酶基因(cefE)(Kovacevic et al.J Bacteriol.171:754-760,1989)序列,设计引物:
CEF1:5’-GTGAGAGTCCATGGACACGACGGTGCCCACCTTCAGCCTG-3’
CEF2:5’-TTAGATAAGCTTCGCCTTGACCGCGGTGAGGTCGACTC-3’
用棒状链霉菌染色体DNA为模板,以CEF1、CEF2为引物进行PCR扩增,得到0.9kb的PCR产物,该PCR产物为cefE开放阅读框,其5’端引入了Nco I内切酶位点,3’端引入了Hind III内切酶位点。
将克隆的棒状链霉菌的扩环酶基因cefE(包括ORF及其本身的终止序列)与IPNS基因的启动子Pipns连接,得到表达盒pcef。将此表达盒pcef克隆于pPIPKA的BamHI/Hind III位点,所得质粒定名为pPCE9。该质粒含有IPNS基因启动子Pipns启动的棒状链霉菌的扩环酶基因,用该质粒转化产黄青霉,其阳性克隆菌株可直接发酵得到半合抗中间体7-ADCA。
实施例3、利用pctA基因提高7-ADCA产量
1、构建载体pPEPCT
以5’-TTTATCACAGTTTGCAGCCTATTT-3’和5’-TGATTTACACCGTCTCCCAGTT-3’为引物,以产黄青霉ATCC10003基因组DNA为模板进行PCR扩增,PCR产物纯化后按常规方法进行测序,结果为序列表中序列3的核苷酸序列,长度为3655bp。该序列除含有pctA基因的编码区(自5’端第1459bp到3153bp)外,还包含有启动子、终止子等调控序列。将pPCE9载体用Hind III酶切、Klenow酶(Promega公司,M220A)补平,然后用T4DNA连接酶与PCR产物在16℃连接12小时,得到载体pPEPCT,其物理图谱如图1所示。
2、产黄青霉转化与阳性克隆筛选
采用Ca-PEG介导的原生质体转化法来转化细胞。具体操作按Cantoral的方法(Bio/Technol.5:494-497,1987)进行,分别用pPEPCT载体和pPCE9载体转化产黄青霉ATCC10003。阳性克隆在含有腐草霉素的YPD选择性培养基筛选,各得到阳性克隆330个、282个。
3、转基因菌株分泌7-ADCA检测
将所得阳性菌株按2×106分生孢子/ml接种到种子培养基,在26℃下培养48小时,种子培养基配方为(g/l):葡萄糖,30;乳糖,10;棉籽饼粉,10;酵母粉,10;玉米浆,10;(NH4)2SO4,2;KH2PO4,1;CaCO3,5;pH5.8。然后将种子培养物以5%接种量接种到发酵培养基,26℃下培养144小时。发酵培养基为(g/l):乳糖,120;棉籽饼粉,30;玉米浆,20;(NH4)2SO4,5;KH2PO4,1;K2SO4,5;CaCO3,10;pH6.5。
发酵结束后,以8000g离心力离心发酵液15分钟除去菌丝体,得到发酵上清液。上清液进行HPLC分析,分析条件见表1。
表1目的产物HPLC分析条件
时间 |
%甲醇 |
%乙酸水(pH3.0) |
|
2 |
98 |
6 |
2 |
98 |
21 |
55 |
45 |
27 |
55 |
45 |
28 |
2 |
98 |
分析柱:Kromasil KR100-10C18(250×4.6mm)检测波长:260nm流速:1ml/min检测器:Waters 2487目的峰保留时间:16.8分钟 |
按照峰面积计算7-ADCA的产量,以pPCE9载体282个转基因菌株的平均产量为100%,pPEPCT转基因菌株7-ADCA的平均产量提高了26.5%。两种载体的转基因菌株7-ADCA产量的比较如表2所示。
表2两种载体的转基因菌株7-ADCA产量的比较
转化载体 |
阳性克隆数 |
7-ADCA平均产量 |
pPCE9(c) |
282 |
100% |
pPEPCT(ct) |
330 |
126.5% |
4、转基因菌株细胞内外7-ADCA含量比较
各取60株两种载体的阳性克隆株,按照步骤3的培养方法进行接种和发酵培养。10ml 144小时的发酵液8000g离心力离心15分钟,上清液用HPLC测定7-ADCA含量。沉淀菌丝加入10m175%乙醇重悬,静置60分钟,萃取出细胞中的7-ADCA。离心上清用于HPLC分析。按峰面积计算产量,换算成每毫升菌液的7-ADCA含量。结果表明,pPCE9转基因菌株中,胞内7-ADCA的含量占63%,胞外占37%,而pPEPCT转基因菌株细胞内外的含量分别为43%、 57%。这种差异体现了pPEPCT载体中所含编码转运蛋白的基因序列转化进细胞后,促进了7-ADCA的分泌,从而导致产量的增加。
实施例4、利用pctA基因提高青霉素的产量
将载体pPIPKA用Hind III和BamH I酶切后,用Klenow酶补平,回收大片段,与实施例3中得到的PCR产物在16℃温度下连接12小时,得到载体pPCT,其功能图谱如图2所示。
按实施例3所述方法用载体pPCT转化产黄青霉菌株ATCC10003,筛选得到157株阳性菌株。按照标准方法(Brownlee et al,J Gen Microbio1,3:347-352,1949)检测青霉素产量,并参照Lein的方法(Overproduction of microbial metabolites,Z.Vanek and ZHostalek eds,pp105-139,1986)对筛选到的高单位菌株利用摇瓶发酵进行复试。结果表明,工程菌与出发菌株相比,其青霉素产量明显提高,最高提高幅度超过了20%。
序列表
<160>3
<210>1
<211>1842
<212>cDNA
<213>产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
<400>1
atctggcaga ccattctaat actcccaaaa atccttccac tgccataggc tctcatattt 60
attattatgt cttcgacgat accagaagaa ggctcggaga ccccggagcc cttgcatgcc 120
cagcacctat ctatggccga aacgcaagag agcctccgca accggggcat cgcagaaact 180
cctcaagcat tggattacaa ctacccggct attggacatg acaaagaccc tgtatttccc 240
gaggagtaca ccgttgagac gagtactggt cttgttcccc aaagaaccct ggagcagatc 300
cgatctcatg gttctatctc atcgacgaag atcggaacac caacaaacga ggtcaacgcc 360
gacatcgaaa aaggaggaaa gggccctacg gagttcgtga cattcaccat cggcgatcct 420
gaacacccct acaattggtc ccgtgcttat cgctggtata tcactcttgt cgcctcggca 480
cttgtggtat gtgtcgcatt cgggtcctcc attgtcaccg gaggattggg tttgattgaa 540
gaacaataca acgtctctct cgaagttgca atcctaacat gttcaatcat ggtctgcgga 600
ttcgcagttg gccctctact ctggtctccc ctctctgaga tcatcggtcg aaggcctgta 660
tacatcatct ctctcgtttt atatgtgatt ttcaacatcc catgcgctct atccccaaac 720
atcggtggct tgctcgtctg ccgattccta tgcggtgtct tctctagttc aggcctttcc 780
ctcgctggtg gcaccattgc cgatatttgg agcattgagg agcgcgggat ggccattgca 840
tactttgctg ctgcaccata ctgcggccct gtactcggcc ctatcgtgac aggttggatc 900
aatgttggaa cgggccgcct cgacctcttc ttctgggtga acctagcttt cgccggtgcc 960
atcatggtca tgatcggcct tgtcccggag acatatgctc cagtgatcct gaagcggcgt 1020
gccgcaaaac tccgcaaaga aaccggaaaa aacatcatca ccgagcaaga aaaaacgaag 1080
ctcacattcc gagaaatcgc tcgcacaagc ctgatcagac ccatcactat gattatgaca 1140
gagcccgtcc tcgaccttat gtgcatgtat attgttctga tctatgcaat gctctacgcc 1200
ttcttcttcg catacccggt catcttcacc aagctctatg gctacaacga cggccagatc 1260
gggctcatgt ttattcccat tctgatcggc gccggtttcg cccttgttgt cacacccgcc 1320
atcgagggca agttccggaa aatctgtagc acgaggtctc caacaccaga ggaccgactc 1380
cacgctgcac tgattggtgc accttttatc ccaatcgcct tcttcatcct gggcgctacc 1440
tcctacaagc atattatctg ggttggacct gcttcgtcgg ggattgcctt tggcttcggc 1500
atggtgttgt gctactatgc agtgaataac tatatcatcg actcgtacca gaagtacgct 1560
gcgtcggctt tggcggccaa ggtcttcctc cgctctggtg gtggcgcggc tttcccgctg 1620
ttcactacgc agatgtatga tcgtcttggg ttgcagtggg cttcttggct gcttgctttc 1680
attggcgttg ccatggtctt cattccatat atcttctact tctttggggc gggcctgcgc 1740
gcaagactta cccgggatta ggagaattgc tgctcctgct gtttctttct tttttcttca 1800
tggaaaaagg ttagaacgtt cgggagcata agatcggttg at 1842
<210>2
<211>564
<212>PRT
<213>产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
<400>2
Met Ser Ser Thr Ile Pro Glu Glu Gly Ser Glu Thr Pro Glu Pro Leu
1 5 10 15
His Ala Gln His Leu Ser Met Ala Glu Thr Gln Glu Ser Leu Arg Asn
20 25 30
Arg Gly Ile Ala Glu Thr Pro Gln Ala Leu Asp Tyr Asn Tyr Pro Ala
35 40 45
Ile Gly His Asp Lys Asp Pro Val Phe Pro Glu Glu Tyr Thr Val Glu
50 55 60
Thr Ser Thr Gly Leu Val Pro Gln Arg Thr Leu Glu Gln Ile Arg Ser
65 70 75 80
His Gly Ser Ile Ser Ser Thr Lys Ile Gly Thr Pro Thr Asn Glu Val
85 90 95
Asn Ala Asp Ile Glu Lys Gly Gly Lys Gly Pro Thr Glu Phe Val Thr
100 105 110
Phe Thr Ile Gly Asp Pro Glu His Pro Tyr Asn Trp Ser Arg Ala Tyr
115 120 125
Arg Trp Tyr Ile Thr Leu Val Ala Ser Ala Leu Val Val Cys Val Ala
130 135 140
Phe Gly Ser Ser Ile Val Thr Gly Gly Leu Gly Leu Ile Glu Glu Gln
145 150 155 160
Tyr Asn Val Ser Leu Glu Val Ala Ile Leu Thr Cys Ser Ile Met Val
165 170 175
Cys Gly Phe Ala Val Gly Pro Leu Leu Trp Ser Pro Leu Ser Glu Ile
180 185 190
Ile Gly Arg Arg Pro Val Tyr Ile Ile Ser Leu Val Leu Tyr Val Ile
195 200 205
Phe Asn Ile Pro Cys Ala Leu Ser Pro Asn Ile Gly Gly Leu Leu Val
210 215 220
Cys Arg Phe Leu Cys Gly Val Phe Ser Ser Ser Gly Leu Ser Leu Ala
225 230 235 240
Gly Gly Thr Ile Ala Asp Ile Trp Ser Ile Glu Glu Arg Gly Met Ala
245 250 255
Ile Ala Tyr Phe Ala Ala Ala Pro Tyr Cys Gly Pro Val Leu Gly Pro
260 265 270
Ile Val Thr Gly Trp Ile Asn Val Gly Thr Gly Arg Leu Asp Leu Phe
275 280 285
Phe Trp Val Asn Leu Ala Phe Ala Gly Ala Ile Met Val Met Ile Gly
290 295 300
Leu Val Pro Glu Thr Tyr Ala Pro Val Ile Leu Lys Arg Arg Ala Ala
305 310 315 320
Lys Leu Arg Lys Glu Thr Gly Lys Asn Ile Ile Thr Glu Gln Glu Lys
325 330 335
Thr Lys Leu Thr Phe Arg Glu Ile Ala Arg Thr Set Leu Ile Arg Pro
340 345 350
Ile Thr Met Ile Met Thr Glu Pro Val Leu Asp Leu Met Cys Met Tyr
355 360 365
Ile Val Leu Ile Tyr Ala Met Leu Tyr Ala Phe Phe Phe Ala Tyr Pro
370 375 380
Val Ile Phe Thr Lys Leu Tyr Gly Tyr Asn Asp Gly Gln Ile Gly Leu
385 390 395 400
Met Phe Ile Pro Ile Leu Ile Gly Ala Gly Phe Ala Leu Val Val Thr
405 410 415
Pro Ala Ile Glu Gly Lys Phe Arg Lys Ile Cys Ser Thr Arg Ser Pro
420 425 430
Thr Pro Glu Asp Arg Leu His Ala Ala Leu Ile Gly Ala Pro Phe Ile
435 440 445
Pro Ile Ala Phe Phe Ile Leu Gly Ala Thr Ser Tyr Lys His Ile Ile
450 455 460
Trp Val Gly Pro Ala Ser Ser Gly Ile Ala Phe Gly Phe Gly Met Val
465 470 475 480
Leu Cys Tyr Tyr Ala Val Asn Asn Tyr Ile Ile Asp Ser Tyr Gln Lys
485 490 495
Tyr Ala Ala Ser Ala Leu Ala Ala Lys Val Phe Leu Arg Ser Gly Gly
500 505 510
Gly Ala Ala Phe Pro Leu Phe Thr Thr Gln Met Tyr Asp Arg Leu Gly
515 520 525
Leu Gln Trp Ala Ser Trp Leu Leu Ala Phe Ile Gly Val Ala Met Val
530 535 540
Phe Ile Pro Tyr Ile Phe Tyr Phe Phe Gly Ala Gly Leu Arg Ala Arg
545 550 555 560
Leu Thr Arg Asp
<210>3
<211>3655
<212>DNA
<213>产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
<400>3
tttatcacag tttgcagcct atttaggccg ggagggaaag tgtcgagttg aggacaccga 60
aaagggcttg gtcatagcgt ggattgataa cagtccagac acacttcgcc gccgggaggc 120
catcttaaag aaagaacgcc aggagaaggg agacgaagag cgagagcaac gcttgattca 180
agaccagatt aagcgcgccc agcaaacggc gctggctggc agcactacga cagaaccgga 240
acccgaggca agattgttgc agaggaagga aggagaaaag atgaagttga atcttggact 300
tggctcgaag aaggcagatg caaagcctgc atcgcctcct acggcaacaa cgacagcgga 360
gtcgccggaa gaaaaagatg cacaaaagga tgcaccgaca ggaaacagcg actctcccgc 420
tccgtctgcg cctaccgcac ccgtcaaaat atcgatgtca atgggtacac agaagccgaa 480
aaatgtgttt gcagcagcag ctaagaagaa ccccttggct gggaaaaagg gttctatatt 540
cacggctcct aagaaaatga ctgagcagga aaggattatg agagctgaaa tggaggcaat 600
ggagcgcaaa cgggcccgtc cggactcggg attcacgaac aaacgaccga agatcacttg 660
aattgacatg atttacatag agaaaacaca tacccagcta cccggcccat gcggttgagc 720
ctatcgccct gcacaaacct tatgggagga tttgggccgg gtaagtcgtt tcttcaaatt 780
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