CN102115768A - 微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二元酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用微生物同步发酵正十六烷烃高产十六碳二元酸的方法。所用微生物为一株新培育出来的热带假丝酵母(candida tropicalis)优良生产突变株ly-6。其特点是：在微生物菌种ly-6突变株接入含有C₁₀-C₁₈各种正烷烃为基质的培养基后，28小时以内，pH控制在7.1以下，以菌体生长为主，产生一定量的二元酸；28-60小时，pH控制在7.5以内，以产酸为主，也增长一定量的菌体；pH控制在8.0以下，迅速生产二元酸；120小时以后，pH控制在8.5以下，连续生产二元酸、当本方法用于nC₁₆发酵生产DC₁₆时，在30m³发酵罐内，发酵165小时，DC₁₆产量达到170.5g/l。

Description

微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二元酸的方法

技术领域：

本发明是利用微生物发酵正烷烃生产长链α，ω-二羧酸的方法，特别是高产十六碳二羧酸的方法。

背景技术：

长链二羧酸是一类重要的化工原料，可用来制造高性能尼龙工程塑料，高档热熔胶，长效降糖药，树脂，涂料以及香料等。特别是十六碳二羧酸，是制造环十五酮的重要原料，前者具有纯麝香香味，是一种高级麝香香料；后者可以代替人工合成胰岛素，治疗糖尿病。

从上世纪七十年代起，各国利用微生物氧化正烷烃生产长链二元羧酸的研究取得突破性进展，1972年日本的内尾良铺等人在《农业·生物化学》杂志(Agr.biol.chem.Vol.36)“微生物利用正烷烃产生长链二羧酸”的文章中，报道了他们用一株阴沟假丝酵母MR-12菌株在1立升发酵罐中，用醋酸钠作生长碳源，加入15％(v/v)的正十六烷发酵72小时，得到63.3克/升的十六碳二羧酸，正十六烷的转化率为54％。1978年内尾又在《石油和微生物》杂志报道了扩大试验的结果，在300立升罐里，醋酸作为生长碳源，正十六烷作为发酵碳源发酵68小时，得到54克/升的十六碳二羧酸，正十六烷转化率70％。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的微生物菌种，以及利用该微生物菌种同步发酵正烷烃生产C₁₀-C₁₈长链α，ω-二元酸的方法，尤其是同步发酵正十六烷烃，高产α，ω-十六碳二元酸的方法。

本发明所用的微生物菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6，是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1)：88-93，1980)为出发菌株，经过硝基胍和N⁺注入诱变，选育出来生产DC₁₆的优良菌株。

将出发菌株经过一次硝基胍和2次N⁺注入方法处理两变的微生物菌种液，用生理盐水分别稀释为10^-2-10^-4，吸取0.1ml稀释好的菌液，涂布于10波林糖度的麦芽汁琼脂培养平板上，每个稀释度涂布5个平板，用黑纸包好，置于30℃的培养箱中培养46小时，统计致死率。

菌种筛选：以出发菌株为对照，对诱变后的菌株进行发酵产酸试验及产酸量检测，筛选培育出来的一株ω-氧化能力更强，同化正烷烃能力和β-氧化能力更弱，并能高产α，ω-十六碳二羧酸的菌株，即为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6，该菌种能以C₁₀-C₁₈的各种单一正烷烃和混合正烷烃，尤其是正十六烷为基质原料，发酵生产出相应的长链二羧酸。

本发明热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6已于2009年10月14日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCC NO：M 209224。

热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6的生理特性如下：

糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。

同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松三糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。生长素的需要：生物素++，维生素B₁++，维生素B₂+，维生素B₆+，维生素B₁₂+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。其他：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。

热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6形态特征：奶油白他，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。

培养特征：

在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基中培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆细胞。

本发明所述同步发酵生产长链二羧酸，特别是十六碳二羧酸的方法是以热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6为发酵菌种，在以正十六烷为发酵基质的培养基中同步发酵，生产α，ω-十六碳二元酸。

同步发酵生产二元酸过程中所使用的热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6的种子培养方法如下：

种子培养基：

(1).10个巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；

(2).10个巴林的麦芽汁液体培养基；

(3).液体种子培养基包含KH₂PO₄ 6-8克/升，蔗糖20-40克/升，酵母膏24克/升，玉米浆2-4克/升，尿素2-4克/升，消泡剂400PPM，自来水配置，PH值5左右。

培养种子的过程为：取一接种环ly-6酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上，于28-30℃培养两天。取一支上述斜面菌种，接入30ml/250ml三角瓶的麦芽汁液体培养基或25ml/500ml三角瓶的液体种子培养基，于28-30℃在200转/分的旋转摇床上培养36-48小时，菌株生长光密度OD达到0.6，作为发酵种子。

同步发酵生产二元酸的方法如下：

发酵培养基的主要组分为：碱金属磷酸盐4-10克/升，氯化钠0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，丙烯酸0.5-2.0毫升/升，表面活性剂吐温60 0.1-2.0克/升以及一些其他公知的营养源。其中碱金属磷酸盐可从KH₂PO₄、NaH₂PO₄、K₂HPO₄和Na₂HPO₄中选一种。

发酵基质正烷烃和发酵培养基在混合发酵液中的用量比例为：含有10-40％(v/v)的正烷烃和90-60％(v/v)发酵培养基，最好为15-25％(v/v)的正烷烃和75-85％(V/V)发酵培养基。

具体发酵过程如下：

将前述制备的发酵种子，按发酵培养基量的15-25％(V/V)的用量，按入PH值为6.5-8.5含有10-40％(v/v)，最好为15-25％(v/v)10-18个碳原子的正烷烃和90-60％(v/v)，最好为85-75％(v/v)发酵培养基的混合液中在24-34℃，最好是26-32℃下通气发酵48-164小时。发酵28小时以前，PH控制在7.1以下，28-60小时PH控制在7.5以下，60-120小时，PH控制在8.0以下，120小时后PH控制在8.5以下，在60、90、120小时，分别补加正十六烷，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5％(V/V)。

发酵结束后的液体加热至75-80℃，加入NaOH把PH调至10-12，用膜分离方法除去菌体，收集含有残烃的清液，静置分离，在20℃以下静置过夜，残存nC₁₆回收再用，大量大颗粒的十六碳二羧酸钠盐结晶沉于底部，收集钠盐结晶，清液直接加硫酸酸化结晶，把十六碳二羧酸钠盐溶解于80-90℃热水中，加入浓 硫酸，调节PH2-3，静置冷却结晶过夜，最后收集白色二羧酸结晶固体，在60℃烘烤至干。

用本发明的ly-6菌株和方法，可生产10-18个碳原子的αω-二元羧酸。特别是十六碳二羧酸。在3000升发酵罐中，正十六烷投入量为20％，在适宜条件下发酵65小时，产酸最高达到78.5克/升，补加正十六烷和混合营养液延长发酵时间到165小时，产酸量高达170.5克/升，转化率为88.1％，明显优于日本用阴沟假丝酵母突变株MR-12产生的十六碳二羧酸产量。而且在发酵规模和产酸水平上也高于陈远童自己在专利号为87105545.0专利中所达到的水平的100多倍和1.4倍。在陈远童1987年的专利中，发酵罐体积只有16升，产DC16只达到123g/l。

具体实施方式：

实施例1

(1)取一接种环ly-6菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，共16支，在28℃培养2天。

(2)取上述菌种一支，接入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中，于29℃在220转/分的旋转摇床上培养48小时，烷烃种子培养基含KH₂PO₄ 8g/l，酵母膏5g/l，玉米浆4g/l，蔗糖25g/l，尿素3.5g/l，重蜡20ml/l，自来水配置，PH5.0。

(3)、在装有15ml发酵培养基的500mL三角瓶中，接入3ml上述种子液，于29℃，在220转/分的旋转摇床上发酵4天，每24小时用NaOH调一次PH值至7.5-8.0。发酵培养基的组成为：KH₂PO₄ 8g/l，NaCl 1g/l，酵母膏3g/l，玉米浆2.5g/l，尿素1.2g/l，氯化钠1g/l，KNO3 7g/l，青霉素130单位/ml，泡敌0.6g/l，以及正十六烷200ml/l，自来水配置，PH7.2，110℃灭菌30分钟。发酵结束后，用6mol的HCl调节PH至3，用100ml乙醚抽提，除去乙醚得白色结晶。用标准NaOH滴定，计算二元羧酸含量。结果DC16产量为90.3g/l，气相色谱分析，DC16纯度为98.2。

实施例2

按照实施例1的方法，只是发酵基质正烷烃用nC₁₁结果DC₁₁产量为43.5g/l，纯度为95.8％。

实施例3

按照实施例1的方法，只是发酵基质正烷烃用nC₁₃，结果DC₁₃产量为55g/l，纯度96.5％。

实施例4

按照实施例1的方法，只是发酵基质正烷烃用nC₁₈，结果DC₁₈产量为65g/l，纯度为91.5％。

实施例5

(1)、取一接种环ly-6菌体，涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上，共8支，在28℃培养2天，作为三角瓶种子。

(2)、把(1)中培养好的2支斜面种子，全部刮入装有500ml麦芽汁液体培养基的5L三角瓶中，2支/瓶，共4瓶，于28℃在220转/分的旋转摇床上培养2天，作为一级种子罐的种子。

(3)、把(2)中的培养好的麦芽汁种子，共2L，接入一个装有40L烷烃种子培养基的70L种子罐中。于29±1℃，搅拌速度500转/分，罐压1Kg，通气量1∶1，培养36小时，作为二级种子罐的种子。

烷烃种子培养基含有(％)：KH₂PO₄ 0.8，酵母膏0.5，玉米浆0.4，蔗糖3.0，尿素0.35g，消泡剂0.06，自来水配置，自然PH。在121℃下灭菌40分钟。

(4)把(3)中培养好的40L种子液，接入装有3.5m³烷烃种子培养基(成分同(3)的5m³种子罐中，于29±1℃，搅拌速度250转/分，罐压为1Kg，通气量1∶1，培养48小时，OD 0.72-0.8，镜检无杂菌，作为发酵罐种子。

(5)把(4)培养好的3.5m³种子液，接入装有20m³发酵培养基的30m³发酵罐中，调节PH到7.1，29±1℃，搅拌速度170转/分，罐压1Kg，通气量1∶0.8，开始发酵。发酵培养基中含有(％)：KH₂PO₄ 0.8，NaCl 0.1，青霉素GNa160单位/ml，吐温60 0.04，正十六烷15.0(v/v)，121℃灭菌40分钟。发酵28小时以前，PH控制在7.1以下，28-60小时PH控制在7.5以下，60-120小时，PH控制在8.0以下，120小时后，PH控制在8.5以下，在60、90、120小时，分别补加正十六烷，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5％(V/V)，发酵165小时，产DC₁₆达到170.5g/l，转化率为90.1％。

(6)、发酵结束以后，加热加减至80-90℃，PH10以上，破乳分层，降温，同收残存nC₁₆，用甩干机收集二元酸盐。母液中含DC₁₆ 18g/l，直接加热、酸化、结晶过滤、收集粗品DC₁₆二元酸盐和粗品二元酸加水加碱，达到70-80℃，PH9-10后，加入适量活性炭，脱色，压滤，脱色清液加热至60-70℃后，加浓硫酸酸化结晶，PH调至3.5左右。冷却结晶，压滤、洗涤、吹干烘干，得到DC₁₆精制品。后处理总收率为88.4％，DC₁₆纯度为97.5％。

Claims (7)

1.一种微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二羧酸方法，其特征在于所用的微生物为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6，该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M209224。

2.如权利要求1所述微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二羧酸方法，其特征在于以热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6为发酵种子，在以正十六烷为基质的培养基中同步发酵，生产α，ω-十六碳二元酸。

3.如权利要求2所述微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二羧酸方法，其特征在于所说的发酵种子是由热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-6菌株经斜面培养、液体种子培养基培养，获得一级种子罐的种子；所使用的固体斜面培养基为10个巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成；麦芽汁液体培养基为10个巴林的麦芽汁；液体种子培养基包含：KH₂PO₄6-8克/升，蔗糖20-40克/升，酵母膏2-4克/升，玉米浆2-4克/升，尿素2-4克/升，消泡剂400PPM，自来水配置，PH值5左右。

4.如权利要求2所述微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二羧酸方法，其特征在于所说的同步发酵过程如下：

发酵培养基的主要组分为：碱金属磷酸盐4-10克/升，氯化钠0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，丙烯酸0.5-2.0毫升/升，表面活性剂吐温600.1-2.0克/升；其中碱金属磷酸盐可从KH₂PO₄、NaH₂PO₄、K₂HPO₄和Na₂HPO₄中选一种；

发酵基质正烷烃和发酵培养基在混合发酵液中的用量比例为：含有10-40％(v/v)的正烷烃和90-60％(v/v)发酵培养基。

具体发酵过程如下：

将前述制备的发酵种子，按发酵培养基量的15-25％(V/V)的用量，接入PH值为6.5-8.5含有10-40％(v/v)的正烷烃和90-60％(v/v)发酵培养基的混合液中，在24-34℃下通气发酵48-164小时；发酵28小时以前，PH控制在7.1以下，28-60小时PH控制在7.5以下，60-120小时，PH控制在8.0以下，120小时后PH控制在8.5以下，在60、90、120小时，分别补加正十六烷，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5％(V/V)。

5.如权利要求2所述微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二羧酸方法，其特征在于所说的同步发酵过程如下：

发酵培养基的主要组分为：碱金属磷酸盐4-10克/升，氯化钠0.5-2.0克/升，尿素0.5-2.0克/升，丙烯酸0.5-2.0毫升/升，表面活性剂吐温600.1-2.0克/升以及一些其他公知的营养源；其中碱金属磷酸盐可从KH₂PO₄、NaH₂PO₄、K₂HPO₄和Na₂HPO₄中选一种；

发酵基质正烷烃和发酵培养基在混合发酵液中的用量比例为：15-25％(v/v)的正烷烃和75-85％(V/V)发酵培养基。

具体发酵过程如下：

将前述制备的发酵种子，按发酵培养基量的15-25％(V/V)的用量，接入PH值为6.5-8.5含有15-25％(v/v)的正烷烃和85-75％(v/v)发酵培养基的混合液中，26-32℃下通气发酵48-164小时；发酵28小时以前，PH控制在7.1以下，28-60小时PH控制在7.5以下，60-120小时，PH控制在8.0以下，120小时后PH控制在8.5以下，在60、90、120小时，分别补加正十六烷，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5％(V/V)。

6.如权利要求2所述微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二羧酸方法，其特征在于发酵结束后的液体加热至75-80℃，加入NaOH把PH调至10-12，用膜分离方法除去菌体，收集含有残烃的清液，静置分离，在20℃以下静置过夜，残存nC₁₆回收再用，大量大颗粒的十六碳二羧酸钠盐结晶沉于底部，收集钠盐结晶，清液直接加硫酸酸化结晶，把十六碳二羧酸钠盐溶解于80-90℃热水中，加入浓硫酸，调节PH2-3，静置冷却结晶过夜，最后收集白色二羧酸结晶固体，在60℃烘烤至干。

7.应用权利要求2～6所述微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法，其特征在于在以C₁₀-C₁₈的单一或混合正烷烃为基质的培养基中同步发酵，生产相应的C₁₀-C₁₈α，ω-二元酸。