CN105358702B - 细菌叶绿素a的生产方法 - Google Patents

细菌叶绿素a的生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105358702B
CN105358702B CN201480026085.9A CN201480026085A CN105358702B CN 105358702 B CN105358702 B CN 105358702B CN 201480026085 A CN201480026085 A CN 201480026085A CN 105358702 B CN105358702 B CN 105358702B
Authority
CN
China
Prior art keywords
aqueous solution
fermentation
solution
medium
hpo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480026085.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105358702A (zh
Inventor
D·艾伦
N·马泽尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tookad Ip
Tookadip Co ltd
Original Assignee
Tookadip Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tookadip Co ltd filed Critical Tookadip Co ltd
Publication of CN105358702A publication Critical patent/CN105358702A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105358702B publication Critical patent/CN105358702B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/165—Heterorings having nitrogen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin

Abstract

提供从嗜硫小红卵菌生产细菌叶绿素a(Bchla)的分批补料式发酵方法，其中生长培养基包含无机氮化合物作为氮源，并且在发酵期间，用琥珀酸盐碳源、无机化合物氮源和磷源从连接至发酵罐容器的外部贮存器补充生长培养基，并且在发酵完成后从分离的细胞中回收Bchla。

Description

细菌叶绿素A的生产方法
技术领域
本发明通常涉及由微生物生产细菌叶绿素的方法，且特别地，涉及由紫色细菌(purple bacteria)生产细菌叶绿素a的改进的发酵方法。
背景技术
光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)被用作肿瘤的非手术治疗。其结合了本身均为无害试剂的无毒药物和无害光敏照射(non-hazardous photosensitizingillumination)来在分子氧的存在下在原位(in situ)生成可杀死或失活细胞的细胞毒素反应性氧类(cytotoxic reactive oxygen species)(ROS)。当与常用的化学疗法或放射疗法相比，作为二元治疗模式，PDT允许更强的特异性并具有选择性更多但破坏性更小的潜力。
临床上卟啉类已被用作第一代光敏剂。世界上第一个被批准的光动力治疗剂(photodynamic therapy agent)为卟吩姆钠(
Figure BDA0000841222250000011
Axcan Pharma Inc.的商标)，其通过用酸处理血卟啉-IX来获得，并且获得FDA批准来治疗食道和支气管非小细胞肺癌，卟吩姆钠为单体、二聚物和高级低聚物的复合体和不可分割的混合物。
已付出了大量工作来合成在短波长下吸收、具有良好确立的结构并且在肿瘤细胞中的滞留(retention)与在皮肤或其它正常组织中的滞留之间显示更好区分的单一的纯化合物，即，所谓的"第二代"敏化剂(sensitizers)。为了优化卟啉药物在治疗和诊断中的性能，已提出几种卟啉衍生物，其中例如，将中心金属原子(并非Mg)配合至四个吡咯环、和/或修饰吡咯环的外围取代基、和/或将大环(macrocycle)二氢化(dihydrogenated)为叶绿素衍生物(二氢卟酚(chlorins))或四氢化为细菌叶绿素衍生物(细菌二氢卟酚(bacteriochlorins))。
由于在有利的光谱区(650-850nm)其吸收强且治疗后其容易消除，叶绿素(Chl)和细菌叶绿素(Bchl)衍生物已被鉴定为用于肿瘤PDT的优异的敏化剂，与卟啉相比具有优异的性质。与叶绿素相比细菌叶绿素具有潜在的优势，这是因为它们显示出强近红外条带，即比叶绿素衍生物长得多的波长。
细菌叶绿素为在各种光养菌中产生的光合色素。它们与作为植物、藻类和蓝藻细菌中的主要色素的叶绿素相关。含细菌叶绿素(Bchl)的细菌进行光合作用，但不产生氧。它们使用不被植物或蓝藻细菌吸收的光的波长。不同组的细菌产生不同种类的细菌叶绿素：
Figure BDA0000841222250000021
在化学上，细菌叶绿素a、b和g为细菌二氢卟酚，指它们的分子具有含两个还原的吡咯环(B和D)的细菌二氢卟酚大环。细菌叶绿素a(本文中Bchla)为下式的化合物：
Figure BDA0000841222250000022
细菌叶绿素c、d和e为二氢卟酚，指它们的分子具有仅含一个还原的吡咯环(D)的二氢卟酚大环。
紫色光合细菌
紫色光合细菌能够根据化学和物理环境由光、有机化合物或无机化合物来取得其细胞能量。该显著的多功能性通常意味着每次利用新陈代谢的一种模式从而避免不必要的可选能量系统的生物合成。因此，在受限的条件组合下仅发生光合代谢并由此生物合成色素。
关于它们产生细菌叶绿素的能力，在紫色细菌中似乎有两个主要的组。第一组包括类球红细菌(Rhodobacter(Rba.)spheroidedes)、荚膜红细菌(Rba.Capsulatus)和深红红螺菌(Rhodospirilum rubrum)，它们在光下光合作用并因此厌氧产生细菌叶绿素；它们还可在黑暗中合成大量的色素，但是仅在低通气条件下。这说明参与这些色素的合成的酶的编码基因依赖于氧和光的控制。第二组包括嗜硫小红卵菌物种(Rhodovulumsulfidophilum，sp.)和胶状红长命菌(Rubrivivax(Rvi.)gelatinosus)，能够在黑暗中合成色素并能够在无氧和有氧二者的条件下进行光合。
在兼性需氧细菌嗜硫小红卵菌(以前已知为嗜硫红细菌Rhodobactersulfidophilus)中Bchla的生物合成由Porra et al.,1998(Porra,RJ,M.Urzinger,J.Winkler,C.Bubenzer,and H.Scheer,Eur.J.Biochem.257,185-191)描述。
如在例如US 6,147,195、EP 863903、US 6,333,319、US 6,569,846、WO 2004/045492和US 8,207,154中所公开的，从嗜硫小红卵菌获得的Bchla用作进一步衍生和修饰的基础，从而产生用于肿瘤的PDT和血管定向PDT(VTP)以及其它病理症状的改进的Bchla衍生物。
Bchla衍生物在PDT和PDT研究的用途正在增加，因此，通过发酵生产更大量的Bchla的需求在增强。
发明内容
本发明提供由光敏性紫色细菌嗜硫小红卵菌生产细菌叶绿素a(Bchla)的发酵方法，其包括在生物反应器中生长细菌，并从收获的细菌中提取产生的Bchla的步骤。
特别地，本发明涉及由嗜硫小红卵菌生产细菌叶绿素a(Bchla)的分批补料式(fed-batch)发酵方法，所述方法包括：
(i)在发酵罐容器内在生长培养基中培养嗜硫小红卵菌，其中生长培养基包含作为氮源的无机氮化合物、碳源、磷源、铁源、镁源、酵母提取物和NaCl；
(ii)将琥珀酸盐碳源、无机化合物氮源和磷源从连接至发酵罐容器的外部贮存器(external reservoir)进给至培养基并保持氧水平为10％或低于10％，与此同时使培养物(culture)进行分批补料式发酵；
(iii)从培养基中除去细胞；和
(iv)从来自步骤(iii)的细胞中分离并回收Bchla。
具体实施方式
在文献记载的方法中，从在培养基中生长的细菌中获得Bchla，其中培养基含有有机氮源如胨、聚胨或通过酪蛋白的酸水解获得的氨基酸与小分子肽的混合物(已知为酪蛋白氨基酸)(Shioi,Yuzo,Plant Cell Phisiol.27(3):567-572,1986；Porra et al.,Eur.J.Biochem.257,185-191,1998)。
现已发现，根据本发明，用于生长紫色细菌嗜硫小红卵菌的发酵工艺的一些改变导致Bchla体积产率改进增加12倍并且大幅度减少生产成本。
因此，在主要方面，本发明提供以显著超出使用已知发酵工艺生产的量由培养的嗜硫小红卵菌来生产Bchla的发酵方法。
本文中使用的术语"发酵罐"、"发酵罐容器"和"生物反应器"可交换使用来表示根据本发明发生嗜硫小红卵菌的生长和发酵的容器。
本文中使用的术语"生长培养基"和"发酵培养基"可交换使用来表示在发酵罐内生长嗜硫小红卵菌细菌的培养基。
本发明的方法涉及细菌生长培养基和发酵工艺二者中的改进。
根据本发明与生长培养基有关的改进在于昂贵的动物来源的氮源胨用无机氮源替换。
根据本发明的发酵方法的改进包括从包含氮源和碳源和磷源的供给溶液的外部贮存器连续供给至新鲜营养素的生物反应器，与此同时在线监测发酵培养基中必需营养素的水平并且必要时供给它们。根据该技术(已知为"分批补料式发酵”)，以发酵工艺期间这些营养素在生物反应器中被细菌消耗的速度所决定的量和给予速度将营养素连续供给至生物反应器中的生长细菌。
尽管无机氮源有时用于细菌的生长培养基中，但是本发明人意外地发现使用氯化铵作为唯一氮源，本发明的分批补料式发酵方法每公升细胞干重产量增加350％，并且细胞中Bchla浓度增加335％，即：每公升为600mg Bchla，几乎比已知的工业化工艺高12倍。另外，这导致通常用于生长嗜硫小红卵菌的培养基成本降低约15％。
因此，本发明涉及由嗜硫小红卵菌生产细菌叶绿素a(Bchla)的分批补料式发酵方法，所述方法包括：
(i)在发酵罐容器内在生长培养基中培养嗜硫小红卵菌，其中生长培养基包含作为氮源的无机氮化合物、碳源、磷源、铁源、镁源、酵母提取物和NaCl；
(ii)将琥珀酸盐碳源、无机化合物氮源和磷源从连接至发酵罐容器的外部贮存器进给至培养基并保持氧水平为10％或低于10％，与此同时使培养物进行分批补料式发酵；
(iii)从培养基中除去细胞；和
(iv)从来自步骤(iii)的细胞中分离并回收Bchla。
生长培养基中的无机氮化合物可为用于细菌生长培养基中的任何无机氮化合物，例如但不限于氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢铵、硝酸钾和硝酸钠，或其任何组合。一些实施方案中，优选的无机氮化合物为氯化铵(NH4Cl)。分批补料式发酵期间必要时还可通过补充发酵培养基来将无机氮源供给至生长细菌。
生长培养基中的碳源可为例如，单糖或二糖，蔗糖，二羧酸类如苹果酸、琥珀酸和琥珀酸钠，甘油，柠檬酸，或其任何组合。另外，分批补料式发酵期间必要时通过补充发酵培养基来将包含琥珀酸和琥珀酸钠的碳源供给至生长细菌。
生长培养基中的磷源可包括磷酸氢盐和磷酸二氢盐如钠、钾和铵的磷酸氢盐和磷酸二氢盐，以及焦磷酸盐的一种或多种水溶性盐。一些实施方案中，磷源包括磷酸盐K2HPO4*3H2O和KH2PO4的混合物。另外，分批补料式发酵期间必要时通过补充发酵培养基来将包含这两种磷酸盐的磷源供给至生长细菌。
发酵培养基中的铁源可为一种或多种水溶性铁盐或亚铁盐如柠檬酸铁铵、氯化亚铁、醋酸亚铁和硫酸亚铁。一些实施方案中，铁源为柠檬酸铁铵(FeNH4citrate)。
发酵培养基中的镁源可为一种或多种水溶性镁盐如氯化镁、葡萄糖酸镁、硝酸镁、硫酸镁、柠檬酸镁、醋酸镁或琥珀酸镁。一些实施方案中，镁源为硫酸镁(MgSO4*7H2O)。
根据本发明，嗜硫小红卵菌的发酵培养基可包括，30-45g/L的量的碳源、0.4-0.7g/L的量的磷源、1.5-3.0g/L的量的氮源、1.5-2.5g/L的量的酵母提取物、0.5-1.0g/L的量的铁源、0.15-0.3g/L的量的镁源、10-30g/L的量的NaCl和微量成分(trace element)。
一些实施方案中，发酵培养基包括下述成分的混合物：柠檬酸、CaCl2*2H2O、MgSO4*7H2O、柠檬酸铁铵、琥珀酸、琥珀酸二钠*6H2O、Na2SO4、K2CO3、酵母提取物、NH4Cl、KH2PO4、K2HPO4 *3H2O、NaCl、NaOH、KOH、消泡剂和微量成分。微量成分可为CoCl2*6H2O、NiCl2*6H2O、CuCl2*2H2O、MnCl2*4H2O、ZnSO4*7H2O、Na2MoO4*2H2O、H3BO3和KI，和消泡剂可为用于发酵方法的任何消泡剂如Y-30或Biospumex。
一些实施方案中，发酵培养基包括下述量的下述成分：30.0-40.0g/L琥珀酸；2.0-4.0g/L Na2SO4；0.5-1.0g/L CaCl2；0.2-0.5g/L K2CO3；0.5-1.0g/L柠檬酸铁铵；1.5-2.5g/L酵母提取物；3.0-6.0g/L柠檬酸；0.15-0.3g/L MgSO4；10-30g/L NaCl；1.5-3.0g/L NH4Cl；0.2-0.4g/L KH2PO4；和2.0-3.0g/L K2HPO4。
分批补料式发酵方法期间，本文中有时还提及称作"进料"的碳源、氮源和磷源的溶液各自放在连接至发酵罐容器的外部贮存器中。碳源，本文中称作"琥珀酸盐碳源"，为琥珀酸和琥珀酸二钠的水溶液；无机化合物氮源优选NH4Cl的水溶液；和磷源为KH2PO4和K2HPO4 *3H2O的水溶液。
整个发酵过程中监测碳水平，并且每当培养基中琥珀酸的水平达到一定的阈值水平例如1-2g/L时，将琥珀酸从外部贮存器添加(泵送)至发酵罐。
整个发酵过程中监测磷水平，并且必要时添加新鲜的磷源。一些实施方案中，在发酵开始后16小时的早期将新鲜的磷酸盐溶液从外部贮存器泵送至发酵罐，然后每24小时周期进一步添加。
整个发酵过程中监测氨水平，并且必要时添加新鲜的氮源。一些实施方案中，在发酵开始后16小时的早期将新鲜的氨溶液(NH4Cl 5N)从外部贮存器泵送至发酵罐，然后每24小时周期进一步添加。
必要时，进料的体积应当尽可能地最小化，从而可添加琥珀酸盐溶液以延长发酵过程。发酵开始时，由于pH升高至8.6，所以使用硫酸来维持pH＝7。发酵期间，添加NaOH溶液以维持pH＝7。此时，核查琥珀酸的量，并且当其达到1-2g/L的量时，应当从外部贮存器添加琥珀酸(代替硫酸)。
发酵罐中的发酵培养基如下制备：通过向柠檬酸、CaCl2*2H2O,MgSO4*7H2O和柠檬酸铁铵的水溶液(下文中"溶液1")添加琥珀酸、Na2SO4、K2CO3和酵母提取物的水溶液(下文中"溶液2")，接着添加NaCl，混合，并添加NH4Cl的溶液(下文中"溶液3")来制备溶液(下文中"溶液4")，并使用10N NaOH调整pH至5，接着将消泡剂的水溶液添加至溶液4，关闭发酵罐并通过高压灭菌法(121℃，20分钟)灭菌，并进一步向无菌培养基添加微量成分CoCl2*6H2O、NiCl2*6H2O、CuCl2*2H2O、MnCl2*4H2O、ZnSO4*7H2O、Na2MoO4*2H2O、H3BO3和KI的水溶液，接着添加磷酸盐KH2PO4、K2HPO4 *3H2O的水溶液，由此在发酵罐容器中形成初始发酵培养基。将嗜硫小红卵菌的接种物(inoculum)添加至发酵罐中的该初始发酵培养基，并且在发酵期间，必要时将新鲜量的琥珀酸盐碳源、氯化铵氮源和磷酸盐源添加至发酵培养基。
添加嗜硫小红卵菌的接种物之前发酵罐中的温度应当为约28℃并且pH＝7(需要时用NaOH和琥珀酸盐溶液调整)。
发酵期间，应当维持良好的搅拌和通气，并且应当监测温度、pH、氧水平、以及氮、碳和磷的供给。温度应当维持在最低25℃和最高31℃并且pH的控制上下限为6.8和7.3。
非常重要的是，发酵约10-20小时后保持氧为10％或低于10％。高浓度的氧加速细菌的生长，但是它们不产生细菌叶绿素a，然而10％浓度的氧加速细菌叶绿素a的产生。
继续发酵直至容器内发酵培养基的体积增加至约其全部容积。
一旦发酵完成，离心汤液(broth)，丢弃上清液，冻干细胞并从干燥细胞中提取Bchla。可纯化Bchla并用于所需细菌叶绿素衍生物的化学衍生。
现将通过下述非限制性实施例说明本发明。
实施例
材料和方法
嗜硫小红卵菌(DSM Strain 1374)从Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen(DSMZ),Braunschweig,Germany获得。
BioFlo IV 20L发酵罐来自New Brunswick Scientific(USA)。
琥珀酸、琥珀酸二钠*6H2O、NH4Cl、FeNH4柠檬酸盐/柠檬酸、K2HPO4、MgCl2CoCl2*6H2O、NiCl2*6H2O、CuCl2*2H2O、MnCl2*4H2O、ZnSO4*7H2O和KI购自Acros Organics(Geel,Belgium)；KH2PO4、Na2SO4、KCl、CaCl2*2H2O、K2CO3、NaHCO3MgSO4*7H2O和NaCl购自Fisher(Fisher Scientific,Loughborough,UK)；酪蛋白胨和酪蛋白水解物购自Difco(Lawrence,KS,USA)；酵母提取物购自Difco and Bio Springer(Montreal,Quebec,Canada)；NH4Cl购自Fluka(Sigma-Aldrich,Rehovot,Israel)；KH2PO4购自Merck(Merck KGaA,DarmstadtGermany)；KOH、H3BO3、Y-30消泡剂和Na2MoO4*2H2O购自Sigma(Sigma-Aldrich,Rehovot,Israel)。
实施例1.嗜硫小红卵菌细菌的工作细胞库的制备
将嗜硫小红卵菌细菌(DSM Strain 1374)播种在预铺有生长基质的皮氏培养皿(Petri dishes)，生长基质包含与由下述成分制备的水性培养基混合的琼脂：琥珀酸(9g)、Na2SO4(3g)、KCl(750mg)、CaCl2(750mg)、NaHCO3(300mg)、FeNH4citrate(150mg)、酵母提取物(3g)、酪蛋白胨(1.5g)、酪蛋白水解物(1.5g)、MgCl2(7.5g)、NaCl(30g)、去离子水(1500ml)。
使用NaOH 10N和HCl 1M将培养基的pH调整为7。将琼脂添加至培养基(每500ml培养基7.5g琼脂)以获得生长基质。通过高压灭菌法(121℃，30分钟)将铺有生长基质的皮氏培养皿灭菌并在上面播种细菌。
在30℃下孵化三天后，将细菌的接种物转移至250ml的锥形瓶并在将有机氮源酪蛋白胨(用于皮氏培养皿的细菌生长)替换为无机源氯化铵的接种培养基中生长。使细菌生长直至培养基液的光密度(OD 540nm)达到10以上的值。将8ml的小份接种物源转移至15ml无菌低温冷冻管(sterile cryogenic freezing tubes)，添加2ml的50％无菌甘油溶液并将管保存在-80℃直至使用。
实施例2.用于发酵培养基的溶液及其制备
制备下述溶液：
溶液1。在发酵罐容器中如下述顺序添加下述成分并溶解在4.5L去离子水：
成分 量(g)
柠檬酸 30
CaCl<sub>2</sub>*2H<sub>2</sub>O 5
MgSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O 15
柠檬酸铁铵 0.5
溶液2。如下述顺序添加下述成分并溶解在400ml温水中，并添加去离子水以达到0.5L：
成分 量
琥珀酸 30g
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 15g
K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 2.5g
酵母提取物 30g
溶液3。将氯化铵5N-NH4Cl(约268g)溶解在900ml水中并使体积达到1L。将80ml的样品转移至100ml瓶以作为溶液3添加至发酵罐并将剩余物转移至标记为溶液3的1L瓶中以用作发酵期间的氮源储备。两个瓶均在高压灭菌器(121℃，20分钟)中灭菌。
在发酵罐中通过将450ml的溶液2添加至已经在发酵罐容器内的4.5L的溶液1中，接着添加170g NaCl并混合，然后添加溶液3(公升培养基中NH4Cl5N，1g NH4 +)以形成溶液4。使用10N NaOH将pH调整为5。
溶液5，微量成分溶液(TES)，在0.5L水中包含下述成分：CoCl2*6H2O(约50mg)、NiCl2*6H2O(约50mg)、CuCl2*2H2O(约100mg)、MnCl2*4H2O(约150mg)、ZnSO4*7H2O(约200mg)、H3BO3(约1000mg)、Na2MoO4*2H2O(约50mg)和KI(约500mg)。将35ml溶液5的小份转移至100ml瓶中并通过高压灭菌法(121℃，20分钟)灭菌。
溶液6，磷酸盐溶液，通过在250ml去离子水中溶解30g KH2PO4和5g K2HPO4来制备。使用10N KOH溶液将pH调整为7。将55ml的小份转移至100ml瓶并标记为溶液6添加至发酵罐。将剩余物转移至500ml瓶并标记为溶液6来用作发酵期间的磷源储备。两个瓶均在高压灭菌器(121℃，20分钟)中灭菌。
溶液7，消泡溶液，通过将约25mg的硅类消泡剂Y-30添加至去离子水以使最终体积为250ml、接着在高压灭菌器(121℃，20分钟)中灭菌，或添加消泡剂Biospumex以使其浓度在基本发酵培养基中为0.2至0.5mL/L的范围来制备。通常，引入至发酵罐的消泡剂的量由培养基中形成的泡汤的量来决定。
溶液8，用作碳源以及pH适配剂(adaptor)的琥珀酸盐溶液，通过在4L去离子水中溶解250g琥珀酸二钠、添加450g琥珀酸、加温以使其溶解然后添加去离子水以使最终体积为5L，接着通过高压灭菌法(121℃，20分钟)灭菌溶液来制备。
溶液9，NaOH 10N，通过将250ml去离子水放入500ml瓶，通过高压灭菌法(121℃，20分钟)灭菌，添加100g NaOH至冷却的瓶中并混合来制备。
实施例3.用于生产Bchla的分批补料式发酵
校准pH电极并连接至发酵罐容器。将DO(溶解氧)电极连接至容器。在发酵罐容器关闭之前在发酵罐容器中在pH 5下将2ml的消泡剂添加至溶液4，并将灭菌设定为25分钟的周期。
初始发酵培养基包含下述成分：
成分 浓度
柠檬酸 3.0-6.5g/L
CaCl<sub>2</sub>*2H<sub>2</sub>O 0.5-1.2g/L
MgSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O 1.5-3.5g/L
柠檬酸铁铵 50-100mg/L
琥珀酸 30.0-60.0g/L
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 2.0-4.0g/L
K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub> 0.2-0.5g/L
酵母提取物 3.0-6.5g/L
NH<sub>4</sub>Cl 1.5-4.0g/L
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1.5.0-3.0g/L
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.2-0.5g/L
NaCl 25.0-45.0g/L
微量成分溶液 4.0-7.5mL/L
消泡剂 必要时
在若干步骤中制备该培养基，其中首先在生物反应器中制备初始发酵培养基，并在发酵过程引发时从连接至生物反应器的外部贮存器中的进给溶液添加其它成分，然后在发酵期间，连续地，随后在线监测生长培养基中营养素水平。磷供给溶液包含KH2PO4(12.0-14.5g/L)和K2HPO4(1.0-3.0g/L)，碳供给溶液包含琥珀酸(80.0-100.0g/L)和琥珀酸二钠(40.0-60.0g/L)，氮供给溶液包含200-300g/L的NH4Cl。将上述全部溶液的pH调整为7.0。
为了引发发酵，将35ml无菌TES溶液(溶液5)添加至已包含已灭菌的溶液4的发酵罐。然后，在搅拌(500rpm)和1VVM(8公升/分钟)通气下添加55ml无菌磷酸盐溶液(溶液6)并且使发酵罐中的温度确立在28℃。
将碳供给溶液(琥珀酸盐溶液8)连接至进给泵，接着将溶液7(消泡溶液)连接至进给泵。需要时用无菌NaOH 10N(溶液9)和无菌琥珀酸盐溶液将生长培养基的pH调整为pH 7。校准DO(溶解氧)电极。
使用进给泵将细菌接种物添加至发酵罐。细胞浓度为2.3-3.2OD/L。最后，将磷酸盐溶液(溶液6)和氯化铵溶液(溶液3)连接至进给泵。
分批补料式发酵期间，将温度保持在最低25℃和最高31℃之间，将氧水平保持为10％或低于10％。pH控制在最低6.8和最高7.3之间。每当pH高于7.1时添加琥珀酸盐溶液。每当pH低于6.8时添加NaOH 10N(溶液9)。
发酵16小时后，通过经由蠕动泵(泵速1ml/分钟)泵送80ml溶液3(NH4Cl5N)和20ml溶液6(磷酸盐溶液)至发酵罐来更新生长培养基的氮供给和磷供给。然后，每12小时的时间添加90ml的NH4Cl，并且每24小时的时间添加(泵送)20ml磷酸盐。发酵期间监测氨和磷的水平并根据该监测的分析结果添加溶液3和溶液6。
每当生长培养基中琥珀酸的水平降低至1-2g/L时，通过添加琥珀酸(溶液8)来更新碳供给。发酵约10-20小时后将氧水平保持为10％或低于10％。该氧水平加速细菌叶绿素的产生。
生长培养基的初始体积约为生物反应器的体积的一半。继续发酵长达120小时，并且体积增加至约生物反应器的全容积。
实施例4.细菌叶绿素a的提取
发酵结束后，通过在4500rpm下离心15分钟来除去细菌，并丢弃培养上清液。冻干浸渍的细胞。使用甲醇从干燥(冻干的)细胞中提取Bchla。Bchla的产率为0.15-0.3gr/公升。

Claims (6)

1.一种从嗜硫小红卵菌生产细菌叶绿素a(Bchla)的分批补料式发酵的方法，所述方法包括：
(i)在发酵罐容器内在生长培养基中培养嗜硫小红卵菌细胞，所述生长培养基包含柠檬酸、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、柠檬酸铁铵、琥珀酸、琥珀酸二钠·6H2O、Na2SO4、K2CO3、酵母提取物、NH4Cl、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、NaCl、NaOH、KOH、消泡剂和微量成分；
(ii)将琥珀酸和琥珀酸二钠的水溶液作为碳源、NH4Cl的水溶液作为氮源、以及KH2PO4和K2HPO4·3H2O的水溶液作为磷源从连接至所述发酵罐容器的外部贮存器进给至所述培养基并保持氧水平为10％或低于10％，与此同时使培养物进行分批补料式发酵；
(iii)从所述培养基中除去细胞；和
(iv)从来自步骤(iii)的细胞中分离并回收Bchla。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生长培养基如下制备：
(a)通过向柠檬酸、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O和柠檬酸铁铵的水溶液添加琥珀酸、Na2SO4、K2CO3和酵母提取物的水溶液，接着添加NaCl，混合，并添加NH4Cl的溶液来制备培养溶液，并使用10N NaOH调整pH至5，接着向培养溶液添加消泡剂的水溶液，关闭发酵罐并通过高压灭菌法灭菌，并进一步向无菌培养基添加所述微量成分CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、H3BO3和KI的水溶液，接着添加磷酸盐KH2PO4和K2HPO4·3H2O的水溶液，由此在发酵罐容器中形成初始发酵培养基；
(b)在将嗜硫小红卵菌的接种物添加至(a)中所述初始发酵培养基之后，在发酵期间将琥珀酸和琥珀酸二钠的水溶液作为碳源、NH4Cl的水溶液作为氮源、以及KH2PO4和K2HPO4·3H2O的水溶液作为磷源进一步提供至所述发酵培养基。
3.根据权利要求2所述的方法，其包括以下步骤：
(i)在所述发酵罐容器中形成培养溶液，并使用NaOH调整pH为5；
(ii)校准pH电极并将所述pH电极和DO电极连接至所述发酵罐容器；
(iii)将消泡剂的水溶液添加至培养溶液；
(iv)关闭发酵罐并通过高压灭菌法灭菌所述培养基；
(v)向所述无菌培养基添加所述微量成分CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、H3BO3和KI的水溶液，接着添加所述磷酸盐KH2PO4和K2HPO4·3H2O的水溶液；
(vi)在搅拌和通气下将所述琥珀酸和琥珀酸二钠的水溶液和所述消泡剂的水溶液连接至进给泵；
(vii)在所述发酵罐内确立28℃的温度并且使用NaOH和琥珀酸和琥珀酸二钠的水溶液调整pH为7；
(viii)将嗜硫小红卵菌的接种物添加至所述发酵罐；
(ix)将所述磷酸盐KH2PO4和K2HPO4·3H2O的水溶液和所述氯化铵溶液连接至所述进给泵；
(x)监测温度、pH、氧水平以及氮、碳和磷的供给的同时继续发酵；和
(xi)继续发酵直至所述容器中的所述发酵培养基的体积增加至约其全容积。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(x)中所述温度维持在最低25℃和最高31℃；pH的控制上下限为6.8和7.3；发酵10-20小时后氧水平为10％以下；根据所述培养基的分析结果从外部贮存器添加琥珀酸和琥珀酸二钠的水溶液、氯化铵，和KH2PO4和K2HPO4·3H2O的水溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在发酵16小时后和之后每12小时泵送所述氯化铵溶液，且在发酵16小时后和之后每24小时泵送所述KH2PO4和K2HPO4·3H2O的水溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，所述微量成分为选自由CoCl2·6H2O、NiCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、KI及其组合组成的组。
CN201480026085.9A 2013-03-11 2014-03-11 细菌叶绿素a的生产方法 Active CN105358702B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361776314P 2013-03-11 2013-03-11
US61/776,314 2013-03-11
PCT/IB2014/000468 WO2014140786A1 (en) 2013-03-11 2014-03-11 Method for producing bacteriochlorophyll a

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105358702A CN105358702A (zh) 2016-02-24
CN105358702B true CN105358702B (zh) 2020-12-29

Family

ID=50543252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480026085.9A Active CN105358702B (zh) 2013-03-11 2014-03-11 细菌叶绿素a的生产方法

Country Status (17)

Country Link
US (1) US10087474B2 (zh)
EP (1) EP2971026B1 (zh)
JP (1) JP6517158B2 (zh)
CN (1) CN105358702B (zh)
AU (1) AU2014229637B2 (zh)
BR (1) BR112015022454B1 (zh)
CA (1) CA2905109C (zh)
DK (1) DK2971026T3 (zh)
ES (1) ES2849427T3 (zh)
HK (1) HK1220231A1 (zh)
HU (1) HUE053222T2 (zh)
IL (1) IL241480B (zh)
MX (1) MX360151B (zh)
PL (1) PL2971026T3 (zh)
PT (1) PT2971026T (zh)
RU (1) RU2671158C2 (zh)
WO (1) WO2014140786A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019511459A (ja) * 2016-02-01 2019-04-25 ノーレックス インコーポレイテッド ジピロリジンペプチド化合物の合成プロセス
GB2581999B (en) 2019-03-07 2023-01-04 Bpr Medical Ltd Gas flow alarm
CN113832082A (zh) * 2021-11-11 2021-12-24 天津科技大学 一种快速分离纯化光合细菌的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5935808A (en) * 1997-07-29 1999-08-10 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Carotenoid-producing bacterial species and process for production of carotenoids using same

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61192297A (ja) * 1985-02-19 1986-08-26 Mitsubishi Gas Chem Co Inc バクテリオクロロフイルの製造法
US6147195A (en) 1993-07-26 2000-11-14 Yeda Research And Development Co., Ltd. Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them
IL116126A0 (en) 1995-11-24 1996-01-31 Yeda Res & Dev Process for the preparation of bacteriochlorophyllis some novel compounds of this type and pharmaceutical compositions comprising them
RU2144085C1 (ru) * 1996-07-12 2000-01-10 Московская государственная академия тонкой химической технологии им.М.В.Ломоносова Способ получения бактериохлорофилла а
HU228208B1 (en) 1998-12-09 2013-01-28 Yeda Res & Dev Palladium-substituted bacteriochlorophyll derivatives and use thereof
IL152900A0 (en) 2002-11-17 2003-06-24 Yeda Res & Dev Water-soluble bacteriochlorophyll derivatives and their pharmaceutical uses
PT1753457T (pt) 2004-06-07 2016-11-10 Yeda Res & Dev Derivados catiónicos de bacterioclorofilas e utilizações dos mesmos
JP5101894B2 (ja) * 2007-01-15 2012-12-19 サントリーホールディングス株式会社 高度不飽和脂肪酸及びこれを含有する脂質の製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5935808A (en) * 1997-07-29 1999-08-10 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Carotenoid-producing bacterial species and process for production of carotenoids using same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Production of ubiquinone and bacteriochlorophyll a by Rhodobacter sphaeroides and Rhodobacter sulfidophilus;TEIZI URAKAMV 等;《JOURNAl OF FERMENTATION AND BIOENGINEERING》;19931231;第76卷(第3期);第191页，表3 *

Also Published As

Publication number Publication date
DK2971026T3 (da) 2021-02-15
US20160024542A1 (en) 2016-01-28
JP6517158B2 (ja) 2019-05-22
AU2014229637A1 (en) 2015-11-05
RU2671158C2 (ru) 2018-10-29
BR112015022454B1 (pt) 2021-09-08
US10087474B2 (en) 2018-10-02
MX2015012331A (es) 2016-05-31
CA2905109A1 (en) 2014-09-18
BR112015022454A2 (pt) 2017-07-18
WO2014140786A1 (en) 2014-09-18
IL241480B (en) 2020-01-30
EP2971026B1 (en) 2020-11-18
PT2971026T (pt) 2021-02-09
AU2014229637B2 (en) 2017-05-04
JP2016509860A (ja) 2016-04-04
CA2905109C (en) 2021-03-16
RU2015142886A (ru) 2017-04-17
EP2971026A1 (en) 2016-01-20
IL241480A0 (en) 2015-11-30
HK1220231A1 (zh) 2017-04-28
CN105358702A (zh) 2016-02-24
ES2849427T3 (es) 2021-08-18
PL2971026T3 (pl) 2021-06-14
HUE053222T2 (hu) 2021-06-28
MX360151B (es) 2018-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020177390A1 (zh) 一种猴头菌发酵制备含麦角硫因的化妆品原液的方法
CN112342151B (zh) 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的厌氧培养方法
CN105358702B (zh) 细菌叶绿素a的生产方法
CN106566795A (zh) 用于大肠杆菌工程菌高效表达质粒dna的培养基及培养方法
CN106929548B (zh) 一种采用米曲霉发酵产苹果酸的工艺
CN105861587A (zh) 微生物发酵法高效生产l-色氨酸的方法
CN110760446A (zh) 一种卵囊藻培养工艺
CN110129225A (zh) γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法
CN103045662A (zh) 一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基
CN108265096A (zh) 一种微生物发酵制备纽莫康定b0的方法
KR100821266B1 (ko) 침지막 생물반응기를 이용한 고농도 유산균의 생산 방법
CN113981021B (zh) 一种通过嗜氨副球菌发酵合成pqq的方法
CN103667107B (zh) 一种产l-乳酸的屎肠球菌菌株
CN104651263A (zh) 一种提高质粒dna含量在大肠杆菌中菌比含量的培养基
CN104498552B (zh) 一种低pH值胁迫提高ε‑聚赖氨酸产量的方法
CN105969709A (zh) 一种重组大肠杆菌菌株及用其制备番茄红素的方法
CN101870964A (zh) 一种提高sam合成酶表达量的方法
CN105950538B (zh) 一种促进酪酸菌发酵生长的方法
CN113717919B (zh) 一种促进微藻积累β-葡聚糖的方法
KR102496755B1 (ko) 사일리지 발효용 유산균과 섬유소 분해균의 공배양 방법
JP3176433B2 (ja) ゼアキサンチンの製造法及びこれに用いる新規フレキシバクター属微生物
CN111454997B (zh) 一种提高竹红菌甲素产率的生物学方法
CN116254196A (zh) 一种沼泽红假单胞菌、培养基、发酵液及发酵方法
KR20230008578A (ko) 고함량 아스타잔틴이 함유된 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양 방법
CN115820528A (zh) 一种大肠杆菌表达重组尿酸氧化酶的发酵方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant