CN115976141A - 一种发酵制备Didemnin B的培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，公开了一种利用运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)发酵制备Didemnin B的培养基及其制备方法，可用于工业化规模生产Didemnin B。具体地，本发明公开了一种发酵制备Didemnin B的培养基，通过优化培养基的配方及组成，在其中加入L‑异亮氨酸，可使50L发酵罐效价水平提升到332mg/L；通过进一步优化制备工艺，分阶段控制溶氧，开发补料工艺，可使50L发酵罐发酵水平提升到544mg/L，工业放大生产4吨罐规模，发酵水平可达489mg/L。此方法有望打破Didemnin B效价水平较低的现状，为实现工业化生产提供方法支持。

Description

一种发酵制备Didemnin B的培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体地，涉及一种发酵制备膜海鞘素B(Didemnin B)的培养基及其制备方法。

背景技术

Didemnins为一类海洋微生物来源的天然产物，最早是从地中海海鞘中(Aplidiumalbicans)发现，具有复杂的环状缩肽结构。目前已发现的didemnins包括didemnin B，dehydrodidemnin B，nordidemnin B，didemnin X/Y等20多种结构，它们由α～变形杆菌门的Tistrella mobilis(运动替斯崔纳菌)与Tistrella bauzanensis等细菌产生，具有抗肿瘤、抗病毒以及免疫抑制等活性。其中Didemnin B是第一个进入临床试验的海洋天然产物，它可以通过抑制肿瘤细胞RNA和DNA的复制以及肿瘤细胞蛋白质的合成起到抗肿瘤作用，因此对胃癌、食管癌和结肠癌等恶性肿瘤均具有良好的治疗作用。不过，Didemnin B的毒副作用较大，因此在临床上使用的不多。近年来,为了提高Didemnin B的使用率,临床上对其进行了改造得到了Didemnin B的衍生物Dehydrodidemnin B，其抗癌作用要远远大于Didemnin B，而且毒性较小。

JP2012240974A报道了运动型Citrella mobilis YIT12409(FERMAP～22080)的菌株，该菌株具有生产Didemnin B的能力，其效价通过计算得出约为20mg/L。

US9644005B2提供了保藏号NRRL B～50531的新型运动Tistrella mobilis菌株，其使用简单的培养基可以从Tistrella mobilis的发酵中收获超过10mg/L的didemnin B和nordidemnin B。

文献Bacterial Production of the Tunicate～Derived Antitumor CyclicDepsipeptide Didemnin B中报道的α～proteobacterium Tistrella mobilis产didemninB的效价约为3.2mg/L；文献Bacterial Biosynthesis and Maturation of the DidemninAnti～cancer Agents也报道了通过微生物T.mobilis KA081020～065发酵得到0.2mg/L的didemnin B，但产量都较低。

综上所述，现有技术中发酵获得膜海鞘素B(Didemnin B)存在发酵产量低、成本高，不适于工业方法生产的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种发酵制备膜海鞘素B(Didemnin B)的培养基及其制备方法，可用于工业化生产Didemnin B。

一方面本发明提供了一种发酵制备Didemnin B的培养基，其特征在于，所述培养基中包含L-异亮氨酸，所述L-异亮氨酸的含量不低于0.05％，优选为0.05～0.3％，更优选为0.15％。

具体地，所述培养基包含碳源，所述碳源选自甘油、糊精、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇中的一种或任意几种的组合，优选为甘油、糊精、淀粉、乳糖或任意几种的组合。

所述培养基包含氮源，所述氮源选自酵母类氮源、蛋白胨、酪蛋白、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豌豆蛋白、棉籽饼粉或任意几种的组合；优选为酵母类氮源、蛋白胨、棉籽饼粉或任意几种的组合。

所述培养基还包含无机盐，所述无机盐选自海水晶、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐或钠、镁、钴、锌、(亚)铁、锰、铜、钼酸根离子或任意几种的组合；优选为盐酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐以及钠、镁、钴、锌离子或任意几种的组合；更优选为氯化钠、柠檬酸钠、硫酸镁、硫酸锌、氯化钴或任意几种的组合。

优选地，所述培养基包含或由其组成：玉米淀粉0～2％，麦芽糊精0～4％，甘油0～4％，酵母粉0～3％，棉籽饼粉0～4％，L-异亮氨酸0.05～0.3％，氯化钠0～3％，七水硫酸镁0～0.3％，柠檬酸钠0～0.2％，氯化钴0～0.0002％，硫酸锌0～0.0004％，消泡剂0.05％。

更优选地，所述培养基组成为玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.15％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

另一方面，本发明提供了一种发酵制备Didemnin B的方法，其特征在于，发酵使用了上述所述的培养基，发酵培养时，分三个阶段控制溶氧，和/或补加氨水、麦芽糊精。

具体地，在发酵培养阶段的0～24h，控制溶氧水平不低于30％；发酵培养阶段的24～48h，控制溶氧水平在15～30％；发酵培养阶段的48h～放罐前，控制溶氧水平在5～20％。

具体地，在发酵培养24h后，开始流加碳源和氮源，优选补加麦芽糊精和氨水；进一步优选地，每日补加的氨水体积为发酵液培养基体积的0.05％～0.4％，直至发酵结束；补加麦芽糊精控总糖浓度为：开始补料～96h左右，控总糖浓度在1～2％；96h左右～放罐前，控总糖浓度在0.5～1.5％。

具体地，所述制备方法包括将种子液按照10％的比例接种到优化的发酵罐中，发酵液在28～32℃培养，发酵培养阶段的pH控制在6.5～8.0，罐压0.05Mpa。

具体地，发酵使用的菌株为Tistrella mobilis或其诱变菌株。

优选地，本发明提供了一种使用Tistrella mobilis或其诱变菌株发酵制备Didemnin B的方法，其特征在于，发酵培养基组成包含玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.15％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％；制备方法包括，发酵培养24h后，开始流加氨水，每日补加的氨水体积为发酵液培养基体积的0.05％～0.4％，直至发酵结束；还包括将种子液接种至发酵罐，发酵培养阶段的0～24h，控制溶氧水平不低于30％；24～48h，控制溶氧水平在15～30％；48h～放罐前，控制溶氧水平在5～20％。整个发酵过程中控制发酵培养温度在28～32℃，发酵培养阶段的pH控制在6.5～8.0，罐压0.05Mpa。

本发明还提供了一种制备Dehydrodidemnin B的方法，其特征在于，制备方法包含上述所述的制备Didemnin B的方法，再由Didemnin B制备得到Dehydrodidemnin B。

有益效果：

本发明公开了一种利用运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)发酵制备DidemninB的培养基及其制备方法，具体地，本发明公开了一种发酵制备Didemnin B的培养基，通过优化培养基的配方及组成，在其中加入L-异亮氨酸，可使50L发酵罐水平达到332mg/L；通过进一步优化发酵方法，控制发酵阶段溶氧水平和补料工艺，可使发酵水平提升到544mg/L，进行工业化生产放大到4吨罐规模，发酵水平可达489mg/L。本发明打破了Didemnin B效价水平较低的现状，稳定、显著地提升了Didemnin B的效价水平，为实现工业化生产提供了方法支持。

具体实施方式

以下将结合具体实施方式详细说明本发明内容，但本发明的范围不限于此。

以下具体实施例中，如无具体说明，使用的试剂和仪器都是本领域常用试剂和仪器，可以通过商购的方式获得；所使用的方法为本领域常规方法，本领域技术人员根据实施例内容可以知道如何具体实施所述方法，并获得相应的结果。

下述实施例采用保藏编号为CGMCC NO.22003的膜海鞘素B菌株进行举例说明，该菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并在CN113174344A中公开。下述实施例中进行发酵培养前的种子制备过程方法均相同，具体如下：

1、斜面制备：

取分离纯化后的CGMCC NO.22003菌株工作菌种甘油管，解冻后用无菌生理盐水(稀释液)梯度稀释至10^～2，吸取0.1mL稀释液接种到改良的斜面培养基涂布均匀，置于28℃、70％相对湿度条件下避光培养3d，获得斜面菌苔。

2、一级种子制备：

取培养成熟的斜面，加入10mL无菌生理盐水，将菌苔刮下，打散，获得菌悬液。吸取菌悬液10mL，接种到含有500mL一级摇瓶种子培养基中，包扎好后置于30℃，220rpm的摇床上振荡培养2天。

一级摇瓶种子培养基配方组成为：乳糖1.2％，葡萄糖0.4％，酵母抽提粉0.6％，蛋白胨1％，氯化钠2％；培养基消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。

3、二级种子制备：

一级种子培养成熟后，取种子培养液50mL，接种到含有10L二级种子培养基的种子罐中，培养温度28～30℃，溶氧控制≥30％，培养周期2天。

二级种子培养基配方组成为：葡萄糖2％，酵母抽提粉1％，蛋白胨0.5％，氯化钠2％，消泡剂0.05％；培养基消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。

4、发酵培养

将二级种液按照10％的比例接种到优化的50L(或工业放大4T规模)发酵罐发酵培养基中，按下述不同实施例条件进行发酵培养，测定发酵液中产物Didemnin B的效价水平。

测定前，样品处理过程：发酵结束后，取发酵液1mL，加入3mL无水乙醇，混匀后超声处理2h，再次混匀后14000rpm离心10min，用0.45μm滤膜过滤后进行液相色谱分析。

样品液相分析方法：

色谱柱：C18，50×4.6mm，1.8μm

波长：210nm

柱温：40℃

流速：1mL/min

进样量：5μL

运行：5min

流动相：59％乙腈。

此外，本发明中，所有培养基组分的含量除特殊说明外，均基于总发酵液的体积比来计算，如1.2％乳糖是指每100mL发酵液中含1.2g乳糖。

具体实施例如下：

实施例1.

发酵配方为：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。

将二级种液按照10％的比例接种到50L的发酵罐发酵培养基中，发酵温度28～32℃，起始搅拌200rpm，初始空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，溶氧控制在5％～15％，过程中pH控制在6.5～8.0之间，发酵培养5～7天结束。

按前述高效液相检测方法，确认该实施方案所得发酵液中Didemnin B含量为242mg/L。

实施例2.

发酵配方为：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-赖氨酸0.1％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。

将二级种液按照10％的比例接种到优化的50L发酵罐发酵培养基中，发酵温度28～32℃，起始搅拌200rpm，初始空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，溶氧水平控制在5％～15％，过程中pH控制在6.5～8.0，发酵培养5～7天结束。

按前述高效液相检测方法，确认该实施方案所得发酵液中Didemnin B含量为251mg/L。

实施例3.

发酵配方为：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.05％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。

将二级种液按照10％的比例接种到优化的50L发酵罐发酵培养基中，发酵温度28～32℃，起始搅拌200rpm，初始空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，溶氧控制在5～15％，过程中pH控制在6.5～8.0，发酵培养5～7天结束。

按前述高效液相检测方法，确认该实施方案所得发酵液中Didemnin B含量为322mg/L。

实施例4.

发酵配方为：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.3％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

消毒前调pH至7.0，消毒条件为121～123℃、30min。

将二级种液按照10％的比例接种到优化的50L发酵罐发酵培养基中，发酵温度28～32℃，起始搅拌200rpm，初始空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，溶氧水平控制在5～15％，过程中pH控制在6.5～8.0，发酵培养5～7天结束。

按前述高效液相检测方法，确认该实施方案所得发酵液中Didemnin B含量为327mg/L。

实施例5.

发酵配方为：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.15％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

培养基消毒前调pH至6.8，消毒条件为121～123℃、30min。

将二级种液按照10％的比例接种到优化的50L发酵罐发酵培养基中，发酵温度28～32℃，起始搅拌200rpm，初始空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，溶氧控制策略如下，过程中pH控制在6.5～8.0，发酵培养5～7天结束。

溶氧控制策略：

移种后校正溶氧100％，发酵过程中通过调节空气流量、搅拌转速及罐压，控制溶氧水平在以下范围：

①恒定范围：全程控制溶氧水平≥30％；

②恒定范围：全程控氧在5％～15％之间；

③分阶段控制：发酵0～24h，控制溶氧水平不低于30％；发酵24～48h，控制溶氧在15％～30％；发酵48h～放罐前，控制溶氧水平在5％～20％之间。

试验条件及结果如下：

序号	溶氧控制方案	放罐效价mg/L	放罐体积L
				1	①	301	35.5
2	②	332	35.6
				3	③	428	35.7

通过对比可知，试验③中分三个阶段控制溶氧的实施方案所得发酵液中DidemninB的含量最高，为428mg/L。

实施例6.

发酵配方为：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.15％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

培养基消毒前调pH至6.8，消毒条件为121～123℃、30min。

将二级种液按照10％的比例接种到优化的50L发酵罐发酵培养基中，发酵温度28～32℃，起始搅拌200rpm，初始空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，溶氧控制在5～15％，过程中pH控制在6.5～8.0，

发酵培养24h后，开始流加补料，补加麦芽糊精控总糖浓度为：开始补料～96h左右，控总糖浓度在1～2％；96h左右～放罐前，控总糖浓度在0.5～1.5％；补加氨水，日均补料量为配方体积的0.05～0.4％，控溶铵值在200～400ppm，发酵培养5～7天结束。

按前述高效液相检测方法，确认该实施方案所得发酵液中Didemnin B含量为477mg/L。

实施例7.

发酵配方为：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.15％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

培养基消毒前调pH至6.8，消毒条件为121～123℃、30min。

将二级种液按照10％的比例接种到优化的50L发酵罐发酵培养基中，发酵温度28～32℃，起始搅拌200rpm，初始空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，溶氧控5～15％，过程中pH控6.5～8.0，

发酵培养24h后，开始流加补料，补加麦芽糊精控总糖浓度为：开始补料～96h左右，1～2％；96h左右～放罐前，0.5～1.5％；补加氨水：日均补料量为配方体积的0.05～0.4％，控溶铵值在400～600ppm，发酵培养5～7天结束。

按前述高效液相检测方法，确认该实施方案所得发酵液中Didemnin B含量为468mg/L。

实施例8.

发酵配方为：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.15％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

培养基消毒前调pH至6.8，消毒条件为121～123℃、30min。

将二级种液按照10％的比例接种到优化的50L发酵罐发酵培养基中，发酵温度控制28～32℃，起始搅拌200rpm，初始空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，溶氧及补料控制如下。

(1)分阶段溶氧控制：

移种后校正溶氧100％，发酵过程中通过调节空气流量、搅拌转速及罐压，控溶氧在以下范围：发酵0～24h，不低于30％；发酵24～48h，15～30％；发酵48h～放罐前，5～20％。

(2)补料控制：

发酵培养24h后，开始流加补料，补加麦芽糊精控总糖浓度为：开始补料～96h左右，1～2％；96h左右～放罐前，0.5～1.5％；补加氨水：日均补料量为配方体积的0.05～0.4％，控溶铵值在200～600ppm，发酵培养5～7天结束。

按前述高效液相检测方法，确认该实施方案所得发酵液中Didemnin B含量为544mg/L。

实施例9.

4T罐规模进行发酵工艺放大

将二级种液按照10％的比例接种到4T发酵罐发酵培养基中，优化的罐发酵培养基配方组成为：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.15％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

培养基消毒前调pH至6.8，消毒条件为121～123℃、30min。

发酵温度控制28～32℃，起始搅拌200rpm，初始空气流量0.5vvm，罐压0.05MPa，溶氧及补料控制如下。

(1)分阶段溶氧控制：

移种后校正溶氧100％，发酵过程中通过调节空气流量、搅拌转速及罐压，控溶氧在以下范围：发酵0～24h，不低于30％；发酵24～48h，15～30％；发酵48h～放罐前，5～20％。

(2)补料控制：

发酵培养24h后，开始流加补料，补加麦芽糊精控总糖浓度为：开始补料～96h左右，1～2％；96h左右～放罐前，0.5～1.5％；补加氨水：日均补料量为配方体积的0.05～0.4％，控溶铵值在200～600ppm，发酵培养5～7天结束。

按前述高效液相检测方法，确认该实施方案所得发酵液中Didemnin B含量为489mg/L。

在4T的工业化规模，共重复开展了三批试验，另两批效价分别是477mg/L、485mg/L，工艺的稳定性良好，表明该工艺适合工业化稳定生产。

尽管本发明已经对上述各实施案例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施案例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims (12)

1.一种用于发酵制备Didemnin B的发酵培养基，其特征在于包含L-异亮氨酸。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述L-异亮氨酸的含量为不低于0.05％，优选为0.05％～0.3％，更优选为0.15％。

3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基还包含碳源、氮源和无机盐；

所述碳源选自甘油、糊精、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇中的一种或任意几种的组合，优选为甘油、糊精、淀粉、乳糖或任意几种的组合；

所述氮源选自酵母类氮源、蛋白胨、酪蛋白、大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、豌豆蛋白、棉籽饼粉或任意几种的组合；优选为酵母类氮源、蛋白胨、棉籽饼粉或任意几种的组合；

所述无机盐选自海水晶、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐或钠、镁、钴、锌、(亚)铁、锰、铜、钼酸根离子或任意几种的组合；优选为盐酸盐、柠檬酸盐、硫酸盐以及钠、镁、钴、锌离子或任意几种的组合；更优选为氯化钠、柠檬酸钠、硫酸镁、硫酸锌、氯化钴或任意几种的组合。

4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包含或由其组成：玉米淀粉0～2％，麦芽糊精0～4％，甘油0～4％，酵母粉0～3％，棉籽饼粉0～4％，L-异亮氨酸0.05～0.3％，氯化钠0～3％，七水硫酸镁0～0.3％，柠檬酸钠0～0.2％，氯化钴0～0.0002％，硫酸锌0～0.0004％，消泡剂0.05％；

优选培养基组成为玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.15％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％。

5.一种发酵制备Didemnin B的方法，其特征在于，发酵使用了权利要求1～4任一项所述的培养基。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，发酵培养分三个阶段控制溶氧。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，发酵培养阶段的0～24h，控制溶氧水平不低于30％；发酵阶段的24～48h，控制溶氧水平在15～30％；发酵阶段的48h～放罐前，控制溶氧水平在5～20％。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于发酵培养24h后，开始流加碳源和氮源，优选麦芽糊精和氨水；

优选每日补加的氨水体积为发酵液培养基体积的0.05％～0.4％，直至发酵结束；

优选补加麦芽糊精控总糖浓度为：开始补料～96h左右，控总糖浓度在1～2％；96h左右～放罐前，控总糖浓度在0.5～1.5％。

9.如权利要求6或8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括控制发酵温度在28～32℃，控制发酵培养阶段的pH在6.5～8.0。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于发酵使用的菌株为Tistrella mobilis或其诱变菌株。

11.一种使用Tistrella mobilis或其诱变菌株发酵制备Didemnin B的方法，其特征在于，发酵培养基：玉米淀粉1％，麦芽糊精1.5％，甘油2％，酵母粉1％，棉籽饼粉2％，L-异亮氨酸0.15％，氯化钠1.8％，七水硫酸镁0.2％，柠檬酸钠0.2％，氯化钴0.0002％，硫酸锌0.0004％，消泡剂0.05％；

制备方法包括：发酵培养24h后，开始流加氨水和麦芽糊精，每日补加的氨水体积为发酵液培养基体积的0.05％～0.4％，直至发酵结束；补加麦芽糊精控总糖浓度为，开始补料～96h左右，控总糖浓度在1～2％；96h左右～放罐前，控总糖浓度在0.5～1.5％。还包括将种子液接种至发酵罐，发酵培养阶段的0～24h，控制溶氧水平不低于30％；24～48h，控制溶氧水平在15～30％；48h～放罐前，控制溶氧水平在5～20％；

发酵培养温度控制在28～32℃，发酵培养阶段的pH控制在6.5～8.0，罐压0.05Mpa。

12.一种制备Dehydrodidemnin B的方法，其特征在于，制备方法包括权利要求5～11中任意一项所述制备Didemnin B的方法。