CN115449499A - 一种脱氮生丝微菌及其发酵制备吡咯喹啉醌的方法 - Google Patents

一种脱氮生丝微菌及其发酵制备吡咯喹啉醌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脱氮生丝微菌MQ004‑2（Hyphomicrobium denitrificns MQ004‑2），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221066，保藏日期为2022年7月8号。解决了PQQ发酵产量不高，脱氮生丝微菌本身代谢过程不稳定，从而导致难以实现规模化生产的问题。本发明提供的菌种效价水平高；使用本发明提供的菌种，批次间的效价水平稳定、甲醇消耗量差距小，菌株代谢的稳定性好，容易规模化生产。

Description

一种脱氮生丝微菌及其发酵制备吡咯喹啉醌的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种脱氮生丝微菌及其发酵制备吡咯喹啉醌的方法。
背景技术
吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone，PQQ)是一种不同于烟酰胺核苷酸(NAD十和NADP+)和黄素核苷酸(FAD和FMN) 的新有机氧化还原辅酶,迄今为止，PQQ催化氧化还原反应的能力远超过已知的生物活性分子。PQQ目前合成的方法分为化学合成法和生物合成法两种，生物合成法具有天然、环保、成本低廉、工艺步骤少、分离更为容易、成品不含有毒有害杂质的特点。目前为止，仅发现微生物具有合成PQQ的能力，且广泛存在于革兰氏阴性菌中。甲基营养菌是以甲醇等一碳甲基化合物（甲烷除外）为唯一碳源的革兰氏阴性菌，需要通过甲醇脱氢酶将甲醇氧化为甲醛，然后同化为亚甲基四氢叶酸进入丝氨酸循环。因此，甲基营养菌必须合成PQQ以激活甲醇脱氢酶的活性，满足自身正常的生理代谢需求。甲基营养菌在生长过程中能够合成大量的PQQ，主要是由于其是以甲醇或甲胺等一碳化合物作为唯一碳源和能源进行生长，作为一碳化合物脱氢酶的辅因子PQQ必须在生长代谢过程中随脱氢酶的生成而大量诱导合成。生丝微菌属于甲基营养菌，其不能利用甲烷，但可以利用甲醇等其他的一碳化合物进行生长。
现有技术中，已经公开了多种方式来提高生丝微菌发酵PQQ的产量。在2015年申请的CN106282044A公开了一种诱变后得到的菌株，其在80m3的发酵罐中的效价为1783mg/L，属于目前菌种中效价高的水平，但是该菌株的发酵体积从15m3罐上的发酵放大到80m3罐时，累计补入甲醇分别是20％和27%，批次间的甲醇消耗差异大，不利于调控发酵过程。2016年申请的CN105624084A公开了一种定向驯化脱氮生丝微菌的方法，其得到的菌株最高不超过23 mg/L。2017年申请的CN107384984A公开一种特殊的培养基，将效价从0.57g/L提高到1.3g/L。2018年申请的CN108949846A公开了一种通过高密度发酵将效价从0.5-1.0g/L提高到2.0-2.5g/L。2019年申请的CN110195032A其公开的菌种效价为870 mg/L。2020年申请的CN112375792A公开了一种特殊的发酵工艺将效价从320.5μg/mL提高到340.5μg/mL。2021年申请的CN113699194A公开了通过氧化还原电位控制将效价从1420.29mg/L提高到2070.41mg/L。由此可见，在现有技术中，一般通过加入特殊的培养基或改善发酵方法来改善脱氮生丝微菌的发酵水平，而具有高效价的诱变菌种却鲜有报道。另外，PQQ是脱氮生丝微菌代谢过程的副产物，其主要作用是激活甲醇脱氢酶的活性，将甲醇氧化为甲醛，而甲醇虽然是脱氮生丝微菌的碳源和能源，但过高的甲醇浓度会对其细胞造成损伤直至死亡。因此如何提升脱氮生丝微菌本身产PQQ的能力（尤其是需求甲醇更少、产量更高的菌株）是一个巨大的挑战。
基于现有技术的情况，在工业化放大生产中，除了需要提升菌种本身的效价，如何有效降低成本和方便调控发酵也是急需克服的主要问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种脱氮生丝微菌MQ004-2（Hyphomicrobium denitrificns MQ004-2），分类学命名为脱氮生丝微菌MQ004-2（Hyphomicrobium denitrificns MQ004-2），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M20221066，保藏日期为2022年7月8号，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
本发明提供的脱氮生丝微菌，在不采用特殊提升发酵水平的方法的情况下，在50L发酵罐中，经168~200h发酵，PQQ的效价为1982~2349ug/ml，并且在20m3发酵罐中经200h发酵也能达到2137ug/ml的发酵放罐效价。上述菌种的发酵水平已经超出目前现有脱氮生丝微菌的发酵水平，并且发酵时间较短，不超过200h。因此本发明提供的菌种不仅发酵所需时间短、发酵水平也高。
甲醇是脱氮生丝微菌生产PQQ必须的碳源，然而从发酵的前期到发酵后期，甲醇的补入并不会明显地增加发酵体积。此外，经申请人测算，如果以10吨发酵液，累计流加甲醇量20%计算，甲醇的成本在生产总成本中占据了25%左右，因此在保证发酵水平的前提下，进一步降低甲醇使用量有利于降低成本。而本发明提供的菌种在甲醇消耗方面也做到了有效降低，在发酵结束后，累计流加甲醇量最高为16%。按照发酵液体积10m3计算，如果将累计流加甲醇量从20%降低到16%，那么甲醇的使用量将减少400L。如果再综合考虑到发酵所需时间，在得到同等效价的前提下，所用发酵时间越短，成本越低。因此本申请提供的菌种相比于现有技术，成本更低，更适合于产业化放大。而从菌种本身的特点而言，相比于现有技术，本发明提供的脱氮生丝微菌可以在甲醇使用量更少的情况下，在更短的时间内，获得了更高的效价，也就是在更短的时间，更少的甲醇用量下，诱导出了更多的PQQ。
本发明提供的脱氮生丝微菌代谢过程稳定，以50L发酵罐为例，累计流加甲醇量为14%~16%，批次间的甲醇消耗量差异小，并且放大到20m3发酵罐后，累计流加甲醇量为15%，未发生显著改变。由于批次间的甲醇消耗量差异小，该菌种的代谢稳定，最终有利于调控发酵过程，在工业化放大生产中更具优势。
本发明还提供了一种所述脱氮生丝微菌的用途，用于制备吡咯喹啉醌；或者，用于制备含吡咯喹啉醌的人药、兽药、保健品、食品、饮品、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
本发明还提供了一种含有所述脱氮生丝微菌的发酵液。
本发明还提供了一种所述发酵液的用途，用于制备吡咯喹啉醌；或者，用于制备含吡咯喹啉醌的人药、兽药、保健品、食品、饮品、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
本发明还提供了一种用所述脱氮生丝微菌生产吡咯喹啉醌的发酵方法。
优选地，包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行发酵。
优选地，所述可同化的碳源为甲醇，或者甲胺，或者除了甲醇外还包括其它碳源，其它碳源至少选自甲胺、乙醇、甘油、甲酸、乙酸、甘露醇、淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、豆油、山梨醇之一或者任意几种的组合。
优选地，所述可同化的氮源至少选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐、硝酸盐之一或者任意几种的组合。
优选地，所述发酵培养基还包括无机盐，所述无机盐至少选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或任意几种的组合。
优选地，发酵过程中包括甲醇补加控制。
优选地，待底料中甲醇消耗至3g/L以下，开始流补甲醇，并控制甲醇残留在2g/L以下；
有益效果：
1、本发明提供的菌种，其菌种本身发酵水平明显高于现有水平，并且所需发酵时间短；
2、 与现有技术相比，本发明提供的菌种在发酵水平高的前提下，甲醇使用量进一步降低；
3、使用本发明提供的菌种，批次间的效价水平稳定、甲醇消耗量差距小，菌株代谢的稳定性好，从而方便调控发酵，使得规模化生产容易。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
下述实施例中试剂的百分比浓度，除特殊说明外，为质量百分数。
实施例1
菌种的分离筛选
从甲醇污水处理池中取新鲜活性污泥，离心去上清，用生理盐水洗涤两次，并用生理盐水重悬至原体积，按照1%的接种量接种至富集培养基1中摇床培养6d得到富集发酵液1。随后按照1%的转种量进行转接至富集培养基2中，摇床培养6d得到富集发酵液2。再按照1%的转种量进行转接至富集培养基3中，摇床培养6d得到富集发酵液3。每次转接用HPLC法进行PQQ含量定量测定，通过三次富集培养获得富集微生物菌群。其中，富集发酵液3的效价最高。
取富集发酵液3梯度稀释，逐次涂布在筛选平板上，挑选生长良好，形态饱满的单菌落，依次接种到种子培养基中，30-32℃培养箱中培养至菌液变浑浊，然后按照0.05OD的接种量接种至发酵培养基中培养8天，第三天补加1.2%的甲醇，从第四天开始时用HPLC法检测效价，每隔两天检测一次，选取效价最高的MQ-C-03单菌落作为诱变菌株。
培养基基础配方为：硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾 0.14%，磷酸氢二钠 0.3%，七水硫酸镁0.1%，谷氨酸钠0.15% ，矿物水1ml/L，维生素辅液1ml/L，pH6.8-7.0。
矿物水配制：
称取FeSO4・7H2O 3.75g 溶于10ml母液A，称取CaCl2・2H2O 6g溶于50ml纯水中，与母液A混合，在加入20ml母液B，用纯水定容至100ml容量瓶中。
母液A：称取ZnSO4・7H2O 22.5g、MnSO4・5H2O 3.3g、CuSO4・5H2O 0.75g、NaCl 1.5g溶于纯水中，定容至 100ml；
母液B：称取(NH4)6Mo7O24・4H2O 0.3g、KI 0.3g、CoCl2・6H2O 0.3g、H3BO3 0.3g溶于纯水中，定容至 100ml；
维生素辅液：
肌醇2g、烟酸8g、泛酸钙4g、盐酸硫胺素2g、生物素0.05g、叶酸0.02g。
富集培养基1是在基础配方的基础上，加入2%甲醇；富集培养基2是在基础配方的基础上，加入4%甲醇；富集培养基3是在基础配方的基础上，加入6%甲醇。
筛选平板：基础培养基+2%的琼脂+3%甲醇
种子培养基：基础培养基+1%甲醇
发酵培养基：基础培养基+2.5%甲醇+0.2%甘油
实施例2
诱变筛选
采用ARTP对MQ-C-03进行诱变处理，将MQ-C-03菌种在种子培养基中培养至OD≈5，取5ml菌悬液离心去上清，用PBS缓冲液洗涤两次重悬，取100μl菌悬液涂布于无菌筛选平板上，放置于诱变系统的载台上，设置入射功率100W，氦气流量为10SLM条件下，照射60s，用2ml 20%甘油洗脱下来混匀。
将洗脱下来的菌悬液按照5mg/ml的添加量加入NTG。30℃避光培养60min，离心10min,弃去上清，用PBS洗涤两次，重悬。
将NTG诱变后的菌悬液涂布于筛选平板中，30℃培养8d，挑选其中菌落饱满的单菌落进行效价鉴定，选取摇瓶发酵高的一株诱变菌MQ004-2。
该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20221066，保藏日期为2022.07.08。
实施例3
菌种鉴定
MQ004-2菌株形态特征，属于革兰氏阴性菌，菌落形态较小，表面呈带光泽的乳白色，菌落形状呈圆形且边缘光滑；光学显微镜下，该菌呈纺锤梭形，形态细小，两极有丝状菌丝。
MQ004-2菌株生理生化特征，属于有机化能好氧菌，能利用甲醇、甲酸、乙酸、阿拉伯糖、塔格糖、海藻糖、甘露醇，不能利用葡萄糖、麦芽糖；氧化酶和接触酶接触阳性，磷酸酶、酯酶、甲基红及V-P实验阴性；能够还原硝酸盐，不能产吲哚及硫化氢；对四环素敏感，对氨苄青霉素、链霉素、卡那霉素、氯霉素不敏感。
MQ004-2菌株经16srDNA测序鉴定，得到测序序列，与ncbi的nt数据库进行比对，并检索ncbi taxonomy数据库，该菌株与Hyphomicrobium denitrificns strain ATCC 51888同源性最高，达到99%，因此判定该菌株为脱氮生丝微菌（Hyphomicrobium denitrificns）。
实施例4
50L发酵罐发酵
摇瓶种子
取MQ004-2菌株甘油管种子液100ul接种至种子培养基摇瓶(500ml三角瓶装量100ml）中培养，控制摇床温度30℃、摇床转速180rpm/min,培养24h，当检测OD600在3.0-5.0时。以1.0%的接种量接种到种子罐中。
种子罐发酵
配置10L种子培养基，装到20L种子罐中，121℃灭菌25min，降温，接种，设置种子罐培养温度28-32℃，搅拌转速150-400rpm/min,通过搅拌联动控制溶氧≥30%，空气流量0.5-1.0VVM，培养周期32-60h，当检测OD600在3.0-5.0时，可以移种至发酵培养，移种量10%。
发酵培养
按照下述配方配置30L发酵培养基，装到50L发酵罐中，121℃灭菌25min，降温，移种，设置种子罐培养温度28-32℃，搅拌转速150-500rpm/min,通过搅拌联动控制溶氧≥10%，空气流量0.5-1.5VVM，培养周期168h。
发酵补料控制
待底料中甲醇消耗至3g/L以下，开始流补甲醇，并控制甲醇残留在2g/L以下，其中快速检测甲醇方法为停补甲醇，当溶氧没有在15min以内回升，视为积累超过2g/L，此时应当减少甲醇的补加量，过程中累计流加甲醇量（补加甲醇量/初始发酵体积百分比）14%。
发酵溶氧控制：在0-40h，发酵溶氧应控制在30-40%之间，40-80h发酵溶氧应该控制在10-20%之间，80h-放罐，溶氧应控制在20-40%之间。
发酵过程中对OD600、pH、甲醇含量和效价进行检测，发酵放罐效价2032 ug/ml。
种子罐培养基配方：
甲醇2.0%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾 0.14%，磷酸氢二钠 0.3%，七水硫酸镁0.1%，谷氨酸钠0.15% ，矿物水0.7ml/L，pH6.8-7.0。
发酵培养基配方：
甲醇2.0%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾 0.14%，磷酸氢二钠 0.3%，七水硫酸镁0.1%，谷氨酸钠0.15% ，天冬氨酸钠0.5%，矿物水0.7ml/L，维生素辅液1ml/L，pH6.8-7.0。
实施例5
50L发酵罐发酵
实施步骤同实施例4，不同之处在于发酵培养中，改变培养周期为184h。发酵过程中对OD600、pH、甲醇含量和效价进行检测，发酵放罐效价1982ug/ml，过程中累计流加甲醇量16%。
实施例6
50L发酵罐发酵
实施步骤同实施例4，不同之处在于发酵培养中，改变培养周期为200h。发酵过程中对OD600、pH、甲醇含量和效价进行检测，发酵放罐效价2349ug/ml，过程中累计流加甲醇量16%。
实施例7
20m3发酵罐发酵
摇瓶种子
取MQ004-2菌株甘油管种子液100ul接种至种子培养基摇瓶(500ml三角瓶装量100ml）中培养，控制摇床温度30℃、摇床转速180rpm/min,培养24h，当检测OD600在3.0-5.0时。以1.0%的接种量接种到种子罐中。
一级种子罐
配置10L种子培养基，装到20L种子罐中，121℃灭菌25min，降温，接种，设置种子罐培养温度28-32℃，搅拌转速150-400rpm/min,通过搅拌联动控制溶氧≥30%，空气流量0.5-1.0VVM，培养周期32-60h，当检测OD600在3.0-5.0时，可以移种至二级种子罐培养，移种量1%。
一级种子罐培养基配方：甲醇2.0%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾 0.14%，磷酸氢二钠0.3%，七水硫酸镁0.1%，谷氨酸钠0.15% ，矿物水0.7ml/L，氨水控pH6.8-7.0。
二级种子罐
配置1000L种子培养基，装到2000L发酵罐中，121℃灭菌25min,移种量1%，设置种子罐培养温度28-32℃，搅拌转速150-400rpm/min,溶氧≥30%，空气流量0.5-1.0VVM，培养周期32-60h。当检测OD600在3.0-5.0时，可以移种至发酵罐培养，移种量10%。
二级种子罐培养基配方：甲醇2.0%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾 0.14%，磷酸氢二钠0.3%，七水硫酸镁0.1%，谷氨酸钠0.15% ，矿物水0.7ml/L，氨水控pH 6.8-7.0。
发酵培养
配置发酵培养基10m3，装到20m3发酵罐中, 设置发酵罐培养温度28-32℃，搅拌转速80-150rpm/min,通过搅拌联动溶氧≥10%，空气流量0.5-1.5VVM，培养周期200h。
发酵培养基配方：甲醇2.0%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾 0.14%，磷酸氢二钠 0.3%，七水硫酸镁0.1%，谷氨酸钠0.15%，天冬氨酸钠0.5%，矿物水0.7ml/L，维生素辅液1ml/L，氨水控pH6.8-7.0。
发酵补料控制：待底料中甲醇消耗至3g/L以下，开始流补甲醇，并控制甲醇残留在2g/L以下，其中快速检测甲醇方法为停补甲醇，当溶氧没有在15min以内回升，视为积累超过2g/L，此时应当减少甲醇的补加量，过程中累计流加甲醇量15%。
发酵溶氧控制：在0-40h，发酵溶氧应控制在30-40%之间，40-80h发酵溶氧应该控制在10-20%之间，80h-放罐，溶氧应控制在20-40%之间。
发酵过程中对OD600、pH、甲醇含量和效价进行检测，发酵放罐效价2137ug/ml。
对比例1~3
取原始菌种（MQ-C-03菌株未诱变前）进行甘油管保藏，按照实施例4、实施例5、实施例6的操作步骤，分别培养168h、184h、200h，放罐效价如下：
Figure 412864DEST_PATH_IMAGE001
诱变后的MQ004-2菌株与原始菌种相比，MQ004-2菌株的效价为1982ug/ml~2349ug/ml，原始菌株的效价为697ug/ml~1345ug/ml，MQ004-2菌株的罐上产效价水平更加稳定。在甲醇消耗发面，MQ004-2菌株的累计流加甲醇量为14%~16%，原始菌株的累计流加甲醇量为17%~22%，MQ004-2菌株每批的甲醇消耗量差异小，表明本申请的菌株代谢的稳定性好，从而方便调控发酵，使得规模化生产更加容易，并且甲醇消耗量也明显下降。

Claims (10)

1.一种脱氮生丝微菌MQ004-2（Hyphomicrobium denitrificns MQ004-2），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 20221066，保藏日期为2022年7月8号。
2.一种如权利要求1所述脱氮生丝微菌的用途，其特征在于：
用于制备吡咯喹啉醌；或者，用于制备含吡咯喹啉醌的人药、兽药、保健品、食品、饮品、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
3.一种含有如权利要求1所述脱氮生丝微菌的发酵液。
4.一种如权利要求3所述发酵液的用途，其特征在于：
用于制备吡咯喹啉醌；或者，用于制备含吡咯喹啉醌的人药、兽药、保健品、食品、饮品、化妆品、添加剂、饲料中的一个或多个。
5.一种用如权利要求1所述脱氮生丝微菌生产吡咯喹啉醌的发酵方法。
6.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于：
包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行发酵。
7.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
所述可同化的碳源为甲醇，或者甲胺，或者除了甲醇外还包括其它碳源，其它碳源至少选自甲胺、乙醇、甘油、甲酸、乙酸、甘露醇、淀粉、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、工业糖蜜、豆油、山梨醇之一或者任意几种的组合。
8.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
所述可同化的氮源至少选自酵母抽提粉、酵母粉、酵母膏、大豆卵磷脂、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、豆粕、蛋白胨、尿素、铵盐、硝酸盐之一或者任意几种的组合。
9.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
所述发酵培养基还包括无机盐，所述无机盐至少选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锰之一或任意几种的组合。
10.如权利要求5~9任意一项所述的发酵方法，其特征在于：
发酵过程中包括甲醇补加控制。
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