CN110195032B - 生丝微菌lxl-pq-409及其应用 - Google Patents

Abstract

生丝微菌LXL‑PQ‑409及其应用，属于生物工程技术领域。本发明一方面提供了一种新的生丝微菌LXL‑PQ‑409，保藏号为：CCTCC NO：M 2019284；另一方面提供了该生丝微菌LXL‑PQ‑409在发酵生产吡咯喹啉醌中的应用。本发明单位体积发酵液中得到的吡咯喹啉醌产率高，采用LC/MS进行定量分析，单位体积发酵液中吡咯喹啉醌产率达870 mg/L。采用葡聚糖凝胶柱层析和高速逆流色谱技术提炼，吡咯喹啉醌收率53%，纯度为93.7%。

Description

生丝微菌LXL-PQ-409及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具有涉及生丝微菌LXL-PQ-409及其应用。

背景技术

吡咯喹啉醌的生理功能及应用领域阐述。吡咯喹啉醌（Pyrroloquinolinequinone，PQQ）是一种具有较高的可溶性，热稳定性，含有3个羧基基团的红褐色醌类化合物，见光易分解。PQQ为多种脱氢酶（如葡萄糖脱氢酶，乙醇脱氢酶，乙醛脱氢酶和甲醇脱氢酶等）的辅助因子。PQQ对鱼藤酮引起的线粒体氧化应激，线粒体功能障碍等起保护作用，可以减少年龄相关的氧化应激和高脂血症；此外，它还通过刺激线粒体生物合成和代谢来恢复健康的线粒体。PQQ可以消除人体的自由基，避免因自由基过多引发的各种胃肠疾病、心脑血管疾病、癌症、抗衰老等作用，具有很高的应用价值。因此，PQQ被认为是继核黄素和烟酰胺之后第三类氧化还原酶的辅酶，也被归类为B族维生素的新成员，是一种新型的健康营养因子，在医药、食品、化妆品等领域具有广泛价值。

吡咯喹啉醌现有的生产方式描述。目前吡咯喹啉醌主要有两种来源：一是化学合成法，二是微生物发酵。化学合成法异构体多而重复、收率低，并且所用试剂易氧化造成风险较大。目前微生物发酵主要是以甲基单胞菌属（Methylomonas），甲基杆菌属（Methylobacterium），甲基菌属（Methylobacillus）及生丝微菌属（Hyphomicrobium）菌种为主要产生者。李慧芝等采用常压室温等离子体对Methylomonas extorquens AM1进行诱变，得到正突变菌株，其吡咯喹啉醌产量为54.0 mg/L；杨诗颖筛选得到的Hyphomicrobiumdenitrificans FJNU-6 能够发酵产生吡咯喹啉醌，经过紫外诱变后其产量为326 mg/L，可见生丝微菌是吡咯喹啉醌高产的潜力菌株。

作为一种新型的维生素、食品和化妆品活性成分，吡咯喹啉醌既能满足人们对安全性的要求，又具有巨大的应用价值。但目前对于吡咯喹啉醌高密度发酵生产及葡聚糖凝胶、高速逆流色谱高效提炼未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种生丝微菌LXL-PQ-409及其应用的技术方案。

所述的一种生丝微菌LXL-PQ-409，保藏号为：CCTCC NO：M 2019284。

所述的生丝微菌LXL-PQ-409在发酵生产吡咯喹啉醌中的应用。

所述的利用生丝微菌LXL-PQ-409发酵生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将所述的生丝微菌LXL-PQ-409点种于固体培养基表面进行活化培养；

2）将固体培养得到的菌苔接种至液体培养基进行液体培养，得到摇瓶种子液，并可按1～5%（v/v）接种量进行扩大培养，得到种子液；

3）将种子液接种至发酵培养基中进行高密度发酵生产，并从生丝微菌LXL-PQ-409发酵液中提炼制得吡咯喹啉醌。

所述的方法，其特征在于所述步骤1）中固体培养基由以下重量百分比的组分：甲醇 1～3%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3～1.0%、KH₂PO₄ 0.1～0.3%、Na₂HPO₄ 0.1～0.3%、MgSO₄·7H₂O0.1%～0.2%、微量元素液0.05～0.09%、琼脂1～2%、余量为水，pH=6.5～7.5。

所述的方法，其特征在于所述步骤1）中活化培养条件为：培养温度为28～35℃，培养时间为3～9天。

所述的方法，其特征在于所述步骤2）中液体培养基由以下重量百分比的组分：甲醇 1～3%、乙醇0.1～0.3%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3～1.0%、KH₂PO₄ 0.1～0.3%、Na₂HPO₄ 0.1～0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.1%～0.2%、微量元素液0.05～0.09%、余量为水，pH=6.5～7.5。

所述的方法，其特征在于所述步骤2）中液体培养条件为：培养温度为30～35℃，转速为200～250 rpm，培养至对数期获得种子液，发酵液菌浓达到OD值为10～25。

所述的方法，其特征在于所述步骤3）中发酵培养基含有以下重量百分比的组分：甲醇5～9%、乙醇0.1～0.3%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3～0.5%、KH₂PO₄ 0.1～0.3%、Na₂HPO₄ 0.1～0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.2%、微量元素液0.05～0.09%，硫胺素0.1～0.3%、蛋氨酸0.05～0.09%、消泡剂0.1%、余量为水，甲醇采用流加方式。

所述的方法，其特征在于所述步骤3）中发酵条件为：培养温度为30～35℃，搅拌转速为300～1000 转/分，发酵时间为6～9天；采用pH-stat或pO₂-stat方式进行底物实时反馈流加调控，pH为6.8～7.2，pO₂为20～35%，实现高密度培养发酵，细胞湿重达30～85克/升。

所述的方法，其特征在于所述步骤3）中发酵液中提炼吡咯喹啉醌具体为：发酵液经过滤，获得含有吡咯喹啉醌的澄清液；澄清液经DEAE Sephadex A-25吸附纯化，得到吡咯喹啉醌粗制品；吡咯喹啉醌粗制品经高速逆流色谱分离精制提炼，获得吡咯喹啉醌精品；

其中发酵液过滤具体为：发酵结束时向发酵液中加入0.01～0.05%（v/v）硅藻土等助滤剂，板框压滤机或离心机过滤除去菌体，得到含有吡咯喹啉醌的澄清液；

DEAE Sephadex A-25吸附纯化具体为：澄清液经DEAE Sephadex A-25吸附吡咯喹啉醌，用蒸馏水洗脱2～6个柱体积，后用0～2 M氯化钾洗脱，洗脱3～8个柱体积，真空浓缩得到吡咯喹啉醌至1/3体积，得到吡咯喹啉醌粗制品；

高速逆流色谱分离精制提炼具体为：采用高速逆流色谱分离精制，获得吡咯喹啉醌精品。溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为1～3：5～7：2～4：3～6，上相中加入5～10 mmol/L TFA作为固定相，下相中加入10～15 mmol/L NaOH作为流动相。

本发明中微量元素液为市购产品，其中含有FeSO₄·7H₂O、ZnSO₄·7H₂O、MnSO₄·4～5H₂O、CuSO₄•5H₂O、NaCl、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、KI、CoCl₂·6H₂O、H₃BO₃、CaCl₂·2H₂O。乙醇为食用级，甲醇为分析纯，蛋氨酸及硫胺素为食用级。

本发明一方面提供了一种新的生丝微菌LXL-PQ-409；另一方面提供了该新的生丝微菌LXL-PQ-409在发酵生产吡咯喹啉醌中的应用。本发明单位体积发酵液中得到的吡咯喹啉醌产率高，采用LC/MS进行定量分析，单位体积发酵液中吡咯喹啉醌产率达870 mg/L。采用葡聚糖凝胶柱层析和高速逆流色谱技术提炼，吡咯喹啉醌收率53%，纯度为93.7%。

附图说明

图1为生丝微菌LXL-PQ-409系统发育树；

图2为生丝微菌LXL-PQ-409菌落形态及革兰氏染色图；

图3为吡咯喹啉醌液相色谱串联质谱图及质谱扫描图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：

从浙江黄酒酒醅中分离产吡咯喹啉醌的细菌。取发酵酒醅，用无菌生物理盐水适当稀释后涂布于甲醇固体培养基。固体培养基含有甲醇2%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3%、KH₂PO₄0.14%、Na₂HPO₄ 0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.1%、微量元素液0.07%、琼脂2%、余量为水，培养基pH为7，培养温度为30℃，培养时间为7天。然后挑出长势较好的菌落接种于液体培养基（除不含琼脂外，与固体培养基相同）进行培养7天，LC/MS分析检测后，获得产吡咯喹啉醌菌种。

取斜面菌种，加入10 mL生理盐水，制成细胞悬液，以300 Gy的辐照剂量进行¹³⁷Csγ射线辐照，辐照2小时。辐照完成后将悬浮液稀释后涂布于筛选培养基上，筛选培养基含有甲醇7%、0.3%乙醇、(NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3%、KH₂PO₄ 0.14%、Na₂HPO₄ 0.3%、MgSO₄.7H₂O 0.1%、10mmol/L乙硫氨酸、微量元素液0.07%、琼脂2%，所述微量元素液含有FeSO₄·7H₂O 0.75%、ZnSO₄·7H₂O 22.5%、MnSO₄·4～5H₂O 0.45%、CuSO₄•5H₂O 0.075%、NaCl 0.15%、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.03%、KI 0.03%、CoCl₂·6H₂O 0.03%、H₃BO₃ 0.03%、CaCl₂·2H₂O 3%，培养基pH为7.0，培养温度为30℃，培养时间为9天，挑选大菌落以及吡咯喹啉醌正突变株。上述诱变-定向育种过程反复多次进行。最后，分离得到本发明的吡咯喹啉醌高产菌株LXL-PQ-409，质谱检测LXL-PQ-409可以甲醇为碳源高效发酵产生吡咯喹啉醌。

提取菌株LXL-PQ-409的基因组并测定16S rDNA基因序列，其16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，采用邻位相连算法进行系统基因分析结果（图1），与生丝微菌同源性大于97%。形态观察表明，细胞呈卵圆形，无芽孢，一端具有膨大的较短菌丝，具有侧生单鞭毛，能运动，革兰氏阴性。在28～35^oC，pH中性偏酸条件下生长良好。在以甲醇为唯一碳源的固体培养基中表面生长5天，菌落由乳白色逐渐变为浅褐色，菌落光泽度下降，表面褶皱，菌落形态如图2所示。

根据菌株LXL-PQ-409的形态及其16S rDNA序列同源，其初步被鉴定为生丝微菌属。

将上述的生丝微菌LXL-PQ-409进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日：2019年4月22日，保藏号：CCTCC NO：M 2019284，建议分类命名为Hyphomicrobium sp.LXL-PQ-409。

实施例2：

将生丝微菌LXL-PQ-409接种于种子培养基中（液体培养基），质量百分比为甲醇1%、乙醇0.3%、(NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.5%、KH₂PO₄ 0.1%、Na₂HPO₄ 0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.2%、微量元素液0.05%，余量为水，体积为1L，pH 6.5。温度35℃，200转/分振荡培养32小时，种子液OD值为10。将种子液按3%的体积接种转接到装有发酵培养基发酵罐中。甲醇7%（甲醇采用间歇式流加）、乙醇0.3%、(NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3%、KH₂PO₄ 0.1%、Na₂HPO₄ 0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.2%、微量元素液0.05%，硫胺素0.1%、蛋氨酸0.05%，消泡剂0.1%。培养温度为30℃，搅拌转速为350转/分。采用pH-stat联动氨水调控pH6.8,通气量0.08 vvm。发酵时间为6天，细胞湿重达30克/升。LC/MS检测吡咯喹啉醌单位体积产率300 mg/L。

实施例3：

将生丝微菌LXL-PQ-409接种于种子液培养基中（液体培养基），质量百分比为甲醇3%、乙醇0.2%、(NH₄)₃C₆H₈O₄ 1.0%、KH₂PO₄ 0.3%、Na₂HPO₄ 0.1%、MgSO₄.7H₂O 0.1%%、微量元素液0.09%，pH 7.0。温度32℃，250转/分振荡培养36小时，种子液OD值为25。将种子液按3%的体积接种转接到装有发酵培养基的50 L发酵罐中。甲醇9%（甲醇采用流加）、乙醇0.1%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.5%、KH₂PO₄ 0.3%、Na₂HPO₄ 0.1%、MgSO₄·7H₂O 0.1%、微量元素液0.07%，硫胺素0.3%、蛋氨酸0.09%，消泡剂0.1%。培养温度为30℃，搅拌转速为800转/分。采用pH-stat联动氨水调控pH7.0并pO₂-stat方式甲醇实时反馈流加，溶氧水平35%。发酵时间为9天，细胞湿重达85克/升。LC/MS检测吡咯喹啉醌单位体积产率860 mg/L,如图3所示。

实施例4：

将生丝微菌LXL-PQ-409接种于种子液培养基中（液体培养基），质量百分比为甲醇3%、乙醇0.2%、(NH₄)₃C₆H₈O₄ 1.0%、KH₂PO₄ 0.3%、Na₂HPO₄ 0.1%、MgSO₄.7H₂O 0.1%%、微量元素液0.09%，pH 7.0。温度32℃，250转/分振荡培养36小时，种子液OD值为25。将种子液按3%的体积接种转接到装有发酵培养基的50 L发酵罐中。甲醇9%（甲醇采用流加）、乙醇0.1%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.5%、KH₂PO₄ 0.3%、Na₂HPO₄ 0.1%、MgSO₄·7H₂O 0.1%、微量元素液0.07%，硫胺素0.3%、蛋氨酸0.09%，消泡剂0.1%。培养温度为30℃，搅拌转速为800转/分。采用pH-stat联动氨水调控pH7.0并pO₂-stat方式甲醇实时反馈流加，溶氧水平35%。发酵时间为9天，得到LXL-PQ-409发酵液。向发酵液中加入0.02%（v/v）硅藻土等助滤剂，板框压滤机或离心机过滤除去菌体，获得含有吡咯喹啉醌的澄清液。澄清液经DEAE Sephadex A-25吸附吡咯喹啉醌，用蒸馏水洗脱3个柱体积，后用1M氯化钾溶液洗脱6个柱体积，真空浓缩至1/3体积，采用高速逆流色谱分离精制，溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为1：4：3：4，上相中加入5 mmol/L TFA作为固定相，下相中加入12 mmol/L NaOH作为流动相。经LC/MS检测吡咯喹啉醌收率为31%，纯度为64.2%。

实施例5：

将生丝微菌LXL-PQ-409接种于种子液培养基中（液体培养基），质量百分比为甲醇3%、乙醇0.2%、(NH₄)₃C₆H₈O₄ 1.0%、KH₂PO₄ 0.3%、Na₂HPO₄ 0.1%、MgSO₄.7H₂O 0.1%%、微量元素液0.09%，pH 7.0。温度32℃，250转/分振荡培养36小时，种子液OD值为25。将种子液按3%的体积接种转接到装有发酵培养基的50 L发酵罐中。甲醇9%（甲醇采用流加）、乙醇0.1%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.5%、KH₂PO₄ 0.3%、Na₂HPO₄ 0.1%、MgSO₄·7H₂O 0.1%、微量元素液0.07%，硫胺素0.3%、蛋氨酸0.09%，消泡剂0.1%。培养温度为30℃，搅拌转速为800转/分。采用pH-stat联动氨水调控pH7.0并pO₂-stat方式甲醇实时反馈流加，溶氧水平35%。发酵时间为9天，得到LXL-PQ-409发酵液。向发酵液中加入0.03%（v/v）硅藻土等助滤剂，板框压滤机或离心机过滤除去菌体，获得含有吡咯喹啉醌的澄清液。澄清液经DEAE Sephadex A-25吸附吡咯喹啉醌，用蒸馏水洗脱3个柱体积，后用2M氯化钾溶液洗脱6个柱体积，真空浓缩至1/3体积，采用高速逆流色谱分离精制，溶剂体系中石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水体积比为3：4：3：6，上相中加入8 mmol/L TFA作为固定相，下相中加入12 mmol/L NaOH作为流动相。经LC/MS检测吡咯喹啉醌收率为53%，纯度为93.7%。

序列表

<110> 浙江工商大学

<120> 生丝微菌LXL-PQ-409及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> 生丝微菌(Hyphomicrobium sp)

<400> 1

caagtagggg gcaggtctac acatgcagtc gaacgccccg caaggggagt ggcagacggg 60

tgagtaacac gtgggaacct tccctatagt acggaatagc ccagggaaac ttggagtaat 120

accgtatacg cccgaaaggg gaaagaattt cgctatagga tgggcccgcg taggattagc 180

tagttggtga ggtaatggct caccaaggcg acgatcctta gctggtttga gagaacgacc 240

agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt 300

ggacaatggg cgcaagcctg atccagccat gccgcgtgag tgatgaaggc cttagggttg 360

taaagctctt ttggcgggga cgataatgac ggtacccgca gaataagtcc cggctaactt 420

cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggg actagcgttg ttcggaatca ctgggcgtaa 480

agcgcacgta ggcggatatg ccagtcaggg gtgaaatccc ggggctcaac ctcggaactg 540

cccttgatac agcatgtctt gagtccgata gaggtgggtg gaattcctag tgtagaggtg 600

aaattcgtag atattaggaa gaacaccggt ggcgaaggcg gcccactgga tcggtactga 660

cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 720

aaacgatgga tgctagccgt cggatagctt gctattcggt ggcgcagcta acgcattaag 780

catcccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 840

acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga cgcaacgcga agaaccttac cagctcttga 900

cattcactga ttgccggtag agatgccgga gttccagcaa tggacagtgg gacaggtgct 960

gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1020

cctcgccatt agttgccatc attcagttgg gcactctagt gggactgccg gtgataagcc 1080

ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cgggctgggc tacacacgtg 1140

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tctcagttca gattgaggtc tgcaactcga cctcatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc 1260

gcatcagcat ggcgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1320

gggagttggt cttaccctaa aacggtgcgc taaccgcaag gaggcagccg gccacgtaac 1380

ttacggtgg 1389

Claims (10)

1.一种生丝微菌LXL-PQ-409，保藏号为：CCTCC NO：M 2019284。

2.如权利要求1所述的生丝微菌LXL-PQ-409在发酵生产吡咯喹啉醌中的应用。

3.利用权利要求1所述的生丝微菌LXL-PQ-409发酵生产吡咯喹啉醌的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将所述的生丝微菌LXL-PQ-409点种于固体培养基表面进行活化培养；

2）将固体培养得到的菌苔接种至液体培养基进行液体培养，得到摇瓶种子液，并可按1～5%（v/v）接种量进行扩大培养，得到种子液；

3）将种子液接种至发酵培养基中进行高密度发酵生产，并从生丝微菌LXL-PQ-409发酵液中提炼制得吡咯喹啉醌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤1）中固体培养基由以下重量百分比的组分：甲醇 1～3%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3～1.0%、KH₂PO₄ 0.1～0.3%、Na₂HPO₄ 0.1～0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.1%～0.2%、微量元素液0.05～0.09%、琼脂1～2%、余量为水，pH=6.5～7.5。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤1）中活化培养条件为：培养温度为28～35℃，培养时间为3～9天。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤2）中液体培养基由以下重量百分比的组分：甲醇 1～3%、乙醇0.1～0.3%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3～1.0%、KH₂PO₄ 0.1～0.3%、Na₂HPO₄0.1～0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.1%～0.2%、微量元素液0.05～0.09%、余量为水，pH=6.5～7.5。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤2）中液体培养条件为：培养温度为30～35℃，转速为200～250 rpm，培养至对数期获得种子液，发酵液菌浓达到OD值为10～25。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤3）中发酵培养基含有以下重量百分比的组分：甲醇5～9%、乙醇0.1～0.3%、（NH₄)₃C₆H₈O₄ 0.3～0.5%、KH₂PO₄ 0.1～0.3%、Na₂HPO₄0.1～0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.1～0.2%、微量元素液0.05～0.09%，硫胺素0.1～0.3%、蛋氨酸0.05～0.09%、消泡剂0.1%、余量为水，甲醇采用流加方式。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤3）中发酵条件为：培养温度为30～35℃，搅拌转速为300～1000 转/分，发酵时间为6～9天；采用pH-stat或pO₂-stat方式进行底物实时反馈流加调控，pH为6.8～7.2，pO₂为20～35%，实现高密度培养发酵，细胞湿重达30～85克/升。

10.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤3）中发酵液中提炼吡咯喹啉醌具体为：发酵液经过滤，获得含有吡咯喹啉醌的澄清液；澄清液经DEAE Sephadex A-25吸附纯化，得到吡咯喹啉醌粗制品；吡咯喹啉醌粗制品经高速逆流色谱分离精制提炼，获得吡咯喹啉醌精品。

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