KR100934474B1 - 코엔자임 ｑ１０ 생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈및 이를 이용한 코엔자임 ｑ１０의 제조방법 - Google Patents

코엔자임 ｑ１０ 생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈및 이를 이용한 코엔자임 ｑ１０의 제조방법

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Abstract

본 발명은 코엔자임(coenzyme) Q10 생성능을 가지는 균주 및 상기 균주를 이용한 코엔자임(coenzyme) Q10의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 코엔자임(coenzyme) Q10 고생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids), 그 변이주 및 상기 균주를 이용하여 코엔자임(coenzyme) Q10을 고농도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

코엔자임 Ｑ１０ 생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈 및 이를 이용한 코엔자임 Ｑ１０의 제조방법{Rhodobacter sphaeroids Having High Producing Ability of Coenzyme Ｑ１０ and Method for Preparing Coenzyme Ｑ１０ Using the Same}
본 발명은 코엔자임(coenzyme) Q10 고생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) 및 이를 이용하여 코엔자임(coenzyme) Q10을 고농도로 제조하는 방법에 관한 것이다.
코엔자임 Q는 거의 모든 생물체에 존재하는 지용성 퀴논(quinone) 상태의 천연물질로 환원성이 있는 벤조퀴논(benzoquinone) 구조에 이소프레노이드(isoprenoid) 사슬이 결합되어 있는 형태이며, 이소프레노이드 단량체가 10개일 때, 코엔자임(coenzyme) Q10이라고 지칭한다.
코엔자임(coenzyme) Q10은 1957년 크랜(Crane) 등에 의해서 소 심장 미토콘드리아의 성원으로서 발견되었고, 1958년에 폴커스(Folkers) 등에 의해서 그 화학 구조가 밝혀졌으며, 코큐텐, 비타민 큐텐, 유비퀴논(ubiquinone) 및 유비데카퀴논(ubidecaquinone) 등의 여러 가지 이름으로 지칭된다.
코엔자임 Q10의 가장 기본적인 기능은 미토콘드리아 내막의 전자전달계의 구성원으로서 콤플렉스 Ⅰ(또는 Ⅱ)에서 콤플렉스 Ⅲ로 전자를 전달하는 역할을 하여 세포내 에너지 대사에 관여하는 것에 있다. 또한, 미토콘드리아를 제외한 세포내 다양한 기관에서 세포막에서 지속적으로 일어나는 불포화지질의 산화적 손상을 방지하고, 반응성 산소종을 제거하는 등 DNA, 지질, 단백질 등에 의한 산화적 손상을 막는 항산화 기능을 한다. 이외에도 치주질환, 고혈압, 뇌졸중, 울혈성 심장질환, 협심증, 심근증, 루게릭병, 당뇨, 신장 질환, 파킨슨병 또는 후천성 면역결핍증(AIDS)과 같은 면역계 질환 또는 암의 예방과 치료 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 피부 노화 억제, 미백 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 다양한 생물체에서 TCA 회로의 발현 조절, 이황화물(disulfide) 결합 형성 조절, 열 생성(thermogenesis) 조절 등에 관여한다는 것이 밝혀지고 있다.
코엔자임 Q10은 활동을 많이 하는 기관인 심장, 폐, 간, 잇몸 등에 많이 분포되어 있지만, 체내 합성의 경우, 20대까지는 왕성하게 만들어지다가 40대부터 노화가 시작되면서 점점 체내 합성량이 적어지게 되므로 이러한 코엔자임 Q10을 산업적으로 대량 생산하여 각종 의약품, 건강보조식품, 화장료 등에 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
현재 코엔자임 Q10은 세계적으로 연간 350~400톤 정도 생산되고 있으며, 앞으로 그 생산규모는 더욱 증가될 것으로 보인다. 이와 같이, 코엔자임 Q10 관련 상품은 웰빙시대를 맞아 국내의 수요 창출이 급증할 것으로 보이는, 향후 높은 부가 가치를 창출할 수 있는 아이템이라고 할 수 있다.
그러나, 아직까지 국내에서 코엔자임 Q10 고함량 단일제제는 없는 실정이고,노령화가 서서히 진행되고 있는 상황에서 코엔자임 Q10의 요구량은 증가될 것으로 예측되므로, 향후 국내 수요의 증가를 대비하여 생산 비용을 낮출 수 있는 새로운 균주의 개발, 고함량 대량 생산 기법 등의 기술적 해결방법이 절실하다.
코엔자임 Q10의 생산 방법에는 동식물 조직으로부터 추출하는 방법, 다단계의 유기 화학합성 방법 및 미생물 배양을 통한 발효법이 있다. 동식물 조직으로부터 대용량으로 추출, 생산하는 방법은 많은 비용이 들고, 농도가 지극히 낮기 때문에 비효율적이다. 유기 / 반유기 합성법은 고가의 전구체가 요구되고, 시스(cis) 형태와 트랜스(trans) 형태의 코엔자임 Q10이 동시에 생산된다는 단점을 가지고 있으며,비친환경적이고, 수율이 낮기 때문에 비효율적이다. 그러나 미생물 세포로부터의 직접 추출법은 미생물 세포 및 코엔자임 Q10의 수율에 따라 경제적으로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 화학합성법의 단점을 극복할 수 있는 방안이므로 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
발효법에 의한 코엔자임 Q10의 생산은 크립토코커스 라우렌티(Cryptococcus laurentii) FERM-P4835, 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) FERM-P4835, 스포로보로마이세스 살모니컬러(Sporobolomyces salmonicolor) FERM-P4836, 트리코스포론(Trichosporon) sp. FERM-P4650(ATCC 20566), 아우레오바시디움(Aureobasidium) sp. 등에서 보고되어 왔다.
현재, 코엔자임 Q10의 제조사는 일본의 교와(Kyowa), 니신(Nisshin Flourmilling Co., LTD), 가네카(Kaneka), 아지노모토(Ajinomoto) 및 독일의 머크(Merck)사 등이며, 미생물을 배양한 후, 미생물 세포로부터 추출하는 방법을 사용하고 있으나 그 수율이 매우 낮아 대단히 고가에 판매되고 있는 실정이다.
코엔자임 Q10의 제조방법과 관련된 종래 특허로는 변이주 아그로박테리움 튜메파시언스 비엔큐 0605에 의한 코엔자임 Q10의 발효 제조방법(대한민국 특허 제10-0458818호), 형질전환 아그로박테리움 튜메파시언스 균주를 이용한 코엔자임 Q10의 발효제조방법(대한민국 특허 제10-0578282호) 및 코엔자임 Q10의 생산능이 우수한 변이주 및 코엔자임 Q10의 생산방법(대한민국 특허 제10-0761943호) 등이 있다.
일본에서는 1980년대부터 코엔자임 Q10 생산에 대한 기초 연구가 시작되었고, 2000년대로 들어서면 재조합기술을 이용한 E. coli 균주의 개발(Takahashi et al ., Biochemical Engineering Journal, 16:183, 2003)과 효율적 코엔자임 Q10 생산을 위한 대사공학적 연구(Takahashi et al ., FEBS Letters, 580:955, 2006) 등이 발표되었다.
중국에서는 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter ) 균주를 이용하여 용존산소(DO)가 코엔자임 Q10 생산에 미치는 영향(Wu et al ., World Journal of MIcrobiology and Biotechnology, 19:925, 2003), 아그로박테리움 튜메파시언스(Agrobacterium tumefaciens ) 균주를 이용한 회분 배양(batch production)에 관한 논문(Gu et al ., Process Biochemistry, 41:1908, 2006)이 발표된 바 있으며, 최근에는 유비퀴논-과잉생산 분열 효모(ubiquinone-overproducing fission yeast) 균주를 이용한 유가 배양(fed-batch fermentation)을 통한 유비퀴논(ubiquinone)의 생산방법(Zhang et al., Journal of Biotechnology, 128:120, 2007), 호기, 암 조건과 혐기, 빛 조건에서의 코엔자임 Q10의 생산에 관한 연구(Yen et al., Enzyme and Microbial Technology, 41:600, 2007)가 발표되었다.
현재 국내의 연구와 기술은 개발 단계에 있으며, 코엔자임 Q10의 생물공학적 생산과 응용에 대한 연구(Choi et al., Applied Microbiology and Biotechnology , 68:9, 2005)가 발표된 바 있다.
상기와 같이 코엔자임 Q10의 생산방법은 널리 알려져 있지만 대다수의 생산 방법은 수득률이 낮거나, 배양 중 분비되는 점성물질 발생 및 복잡한 조절 기작으로 인한 균주 선발의 어려움 등의 단점으로 인하여 대량 생산에는 부적합하다.
이에, 본 발명자들은 대량 생산에 적합한 고농도의 코엔자임 Q10 제조방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 코엔자임(coenzyme) Q10 고생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) 및 그 변이주를 선별하고, 이를 이용하여 코엔자임(coenzyme) Q10을 고농도로 제조하는 것이 가능하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 코엔자임(coenzyme) Q10 고생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) 및 그 변이주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) 및 그 변이주를 이용하여 코엔자임(coenzyme) Q10을 고농도로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코엔자임(coenzyme) Q10 고생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) 및 그 변이주를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) 또는 그 변이주를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균체로부터 코엔자임 Q10을 회수하는 단계를 포함하는 코엔자임(coenzyme) Q10을 고농도로 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids)는 KACC 91338P이고, 상기 변이주는 KACC 91339P인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 용존 산소량을 1ppm 미만으로 조절함을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 코엔자임(coenzyme) Q10 고생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids), 그 변이주 및 이를 이용하여 코엔자임(coenzyme) Q10을 고농도로 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 광합성 세균의 동정을 위해 16S rDNA 시퀀싱을 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다(M: 100bp size marker, 1 열: 로도박터 스페어로이즈(R. sphaeroids)의 16S-rRNA 단편(GenBank AM 69671); 2 열: 로도박터 스페어로이즈 (R. sphaeroids) KACC 91338P의 16S-rRNA 단편).
도 2는 1L 반응기(bioreactor)에서 50 lux, 30 ℃, 300 rpm, 5 vvm의 공기 공급 및 pH 7의 조절 상태에서 회분(batch) 배양한 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P의 생육 및 코엔자임 Q10 생산량을 나타낸 그래프이다(용존 산소; -■- ; 세포건조중량: -▲- ; 코엔자임 Q10 생산량 : -○-).
도 3은 1L 반응기(bioreactor)에서 50 lux, 30 ℃, 300 rpm, 5 vvm의 공기 공급 및 pH를 조절하지 않은 상태에서 회분(batch) 배양한 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P의 생육 및 코엔자임 Q10 생산량을 나타낸 그래프이다(pH: -●-; 용존 산소; -■- ; 세포건조중량: -▲- ; 코엔자임 Q10 생산량 : -○-).
도 4는 1L 반응기(bioreactor)에서 50 lux, 30 ℃, 300 rpm, 0.2 vvm의 공기공급 및 pH를 조절하지 않은 상태에서 회분(batch) 배양한 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P의 생육 및 코엔자임 Q10 생산량을 나타낸 그래프이다(pH: -●-; 용존 산소; -■- ; 세포건조중량: -▲- ; 코엔자임 Q10 생산량 : -○-).
도 5는 1L 반응기(bioreactor)에서 50 lux, 30 ℃, 300 rpm, 용존 산소(DO) 조절 및 pH를 조절하지 않은 상태에서 회분(batch) 배양한 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P의 생육 및 코엔자임 Q10 생산량을 나타낸 그래프이다(pH: -●-; 용존 산소; -■- ; 세포건조중량: -▲- ; 코엔자임 Q10 생산량 : -○-).
도 6은 1L 반응기(bioreactor)에서 반응기를 알루미늄 호일로 덮어 씌워 빛을 차단하고, 30 ℃, 300 rpm, 용존 산소(DO) 조절 및 pH를 조절하지 않은 상태에서 회분(batch) 배양한 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P의 생육 및 코엔자임 Q10 생산량을 나타낸 그래프이다(pH: -●-; 용존 산소; -■- ; 세포건조중량: -▲- ; 코엔자임 Q10 생산량 : -○-).
도 7은 1L 반응기(bioreactor)에서 반응기를 알루미늄 호일로 덮어 씌워 빛을 차단하고, 30 ℃, 300 rpm, 용존 산소(DO) 조절 및 pH를 조절하지 않은 상태에서 회분(batch) 배양한 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91339P의 생육 및 코엔자임 Q10 생산량을 나타낸 그래프이다(pH: -●-; 용존 산소; -■- ; 세포건조중량: -▲- ; 코엔자임 Q10 생산량 : -○-).
본 발명은 일 관점에서, 코엔자임(coenzyme) Q10 고생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) 및 그 변이주에 관한 것이다.
본 발명에 따른 코엔자임(coenzyme) Q10 고생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids)는 본 발명자들이 분리한 신균주로 2007년 11월 14일자로 농업생명공학연구원에 KACC 91338P로 기탁되어 있다.
아울러, 상기 변이주는 다음과 같은 방법에 의해 분리하였고, 동일자로 농업생명공학연구원에 KACC 91339P로 기탁되어 있다: 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids)를 배양한 후, 화학제를 첨가하여 변이시키고, 고체 선별배지에 도말하여 단일군락을 선별한 다음, 선별 균주 중에서 코엔자임 Q10을 가장 많이 생산하는 균주를 최종적으로 선별하였다.
본 발명에 있어서, 상기 화학제는 L-에티오닌(ethionine), 다우노마이신(Daunomycin) 및 메나디논(Menadinone)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) 또는 그 변이주를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균체로부터 코엔자임 Q10을 회수하는 단계를 포함하는 코엔자임 Q10의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids)는 KACC 91338P이고, 상기 변이주는 KACC 91339P인 것을 특징으로 할 수 있다.
코엔자임 Q10의 고생성을 위한 최적 배양조건은 다음과 같았다: 빛 차단; 용존 산소량을 1ppm 미만으로 조절; 온도 25~35℃; 교반 200~400 rpm.
아울러, 코엔자임 Q10은 다음과 같은 방법으로 회수할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다: 대수증식기 말기에 회수된 배양액을 원심분리하여 균체(cell pellet)를 메탄올(methanol)로 처리하고, 가열(heating)한 다음, 클로로포름(chloroform)을 첨가하고 반응(stirring)시켜 코엔자임 Q10을 추출하였다. 추출액을 여과한 다음, 여기에 여과액과 0.85% 인산완충용액(saline)이 5:1 비율이 되도록 0.85% 인산완충용액을 여과액에 첨가하고 (시간이 지나면서 2개의 상으로 분리됨), 이중 상층액은 제거하고 하층액을 감압증류장치로 건조시켜 추출용매를 제거하여, 최종적으로 코엔자임 Q10을 수득하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 광합성 세균의 분리, 동정 및 변이
1-1. 광합성 세균의 분리
낙동강 갯벌 및 광합성 세균 생산 공장에서 채취한 시료를 30℃, 180 rpm, 50 lux의 조건으로 하기 표 1의 조성으로 구성된 기초 배지(pH=6.8)에서 72시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 기초 배지에 2% 한천(A-9915, sigma, USA)을 첨가한 고체 배지 위에 스트리킹(streaking)하고 30℃에서 72시간 동안 배양하여 독립된 콜로니(colony)를 얻었으며, 이 중 붉은 색깔을 띄는 콜로니를 선별한 후, 선별된 균주를 새로운 한천배지 위에 2회 더 반복 스트리킹하여 최종적으로 순수 분리해냈다. 순수 분리한 콜로니는 처음에는 붉은 색을 띄다가 3일이 지나면서 짙은 적갈색을 나타내었다. 현미경 관찰 결과, 1~1.5㎛ 길이를 가지는 짧은 간균(rod) 모양의 미생물임을 확인하였다.
성 분 농 도
이인산칼륨(K2HPO4) 0.5g / ℓ
일인산칼륨(KH2PO4) 2.7g / ℓ
DL-말릭 산(malic acid) 0.8g / ℓ
인산 암모늄(ammonium phosphate) 3.76g / ℓ
MSG 1g / ℓ
트립톤(tryptone) 2g / ℓ
효모 엑기스(yeast extract) 2g / ℓ
미량 원소(trace element) 2.1ml / ℓ
1-2. 광합성 세균의 동정
상기 실시예 1-1에서 선별된 균주는 16S rDNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 동정하였다. 균주의 염색체 DNA는 AccuPrep 염색체 DNA 추출 키트(K-3032, 바이오니어, 한국)를 사용하여 분리하였으며, 분리된 DNA를 주형으로 하여 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3': 서열번호 1) 및 1429R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3': 서열번호 2)의 프라이머를 제작하고, 제작된 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭시켜 cDNA를 합성한 후, 합성된 cDNA로부터 DNA 단편을 증폭하였다.
PCR은 다음의 조건에서 수행하였다. 초기 변형은 95℃에서 5분간 실행하였고, 30 싸이클 증폭은 95℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 30초간 이루어졌으며, 최종 신장단계는 72℃에서 10분간 수행하였다. PCR 수행 후, 생성된 PCR 산물은 전기영동법에 따라 아가로오즈 겔 상에서 추출하여 AccuPrep SV 겔 및 PCR Clean-up 시스템(Promega, USA)을 이용하여 DNA를 분석하였다. 상기 DNA를 pGEM T-easy 벡터에 삽입한 후, 이를 E. coli DH5α에 형질전환시킨 다음, 형질전환체를 배양하여 AccPrep 플라스미드 추출키트(K-3030, 바이오니어, 한국)로 플라스미드를 분리하고, M13 프라이머를 이용하여 3'말단과 5'말단의 서열을 결정하였다.
결정된 부분 서열을 대상으로 GenBank의 Advanced BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 상동성 검색을 수행하였다. BioEdit Sequence Alignment Editor(바이오니어, 한국)를 이용하여 그 서열을 확인하였고, PHYLIP(ver. 3.5c)의 DNA dist 프로그램(PHYLIP, version 3.5c; distributed by J. Felsenstein, University of Washington, USA)을 이용하여 거리측정 전에 갭(gap)을 가지는 모든 위치를 제거하였다.
그 결과, 상기 증폭된 서열(1355 bp의 16S-rRNA)은 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids)의 16S-rRNA(GenBank AM 69671)와 100% 유사성을 가지고 있었다 (도 1). 따라서 분리된 균주가 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids)임을 확인할 수 있었고, 이를 2007년 11월 14일자로 농업생명공학연구원에 KACC 91338P로 기탁하였다.
1-3. 광합성 세균의 변이
광합성 세균의 코엔자임 Q10 생산량을 높이기 위하여, 상기 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids ) KACC 91338P를 L-에티오닌(ethionine), 다우노마이신(Daunomycin), 메나디논(Menadinone) + L-에티오닌(ethionine) 및 메나디논(Menadinone) 등의 화학제 처리를 통하여 변이 균주(mutants)들을 만들었다.
108~109/㎖의 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P를 2 mg/ml의 각각의 화학제를 포함하는 0.5M TM 완충용액(Tri-Maleate buffer; pH 6.2)으로 세척(washing)하고 실온에서 20분간 방치한 후, 0.85% 인산완충용액(saline)으로 두 번 세척(washing)한 다음, 세척된 균체(cell pellet)를 0.5M TM 완충용액(Tri-Maleate buffer)으로 희석(resuspending) 시켰다. 희석(Resuspended)된 균체(cell pellet)를 종배지(seed medium)가 들어 있는 튜브에 접종하여 30℃의 진탕 배양기에서 24 시간 종배양한 다음, 배양액을 원심분리하고 0.85% 인산완충 용액(saline)으로 세척(washing)하였다. 세척된 균체(cell pellet)를 X-gal과 10% 글루코즈(glucose)를 함유한 M-배지(1ℓ 당: glucose 100g, (NH4)2SO4 5g, KH2PO4 0.5g, K2HPO4 0.5g, MgSO4 · 7H2O 0.25g, MnCl2 · 4H2O 0.1g, Malt extract 20g, trace element solution 1ml, Vitamin mixture solution 1ml 및 X-gal 20mg; pH 7.0)에 도말하여 30℃에서 72시간 동안 배양한 후, 파란색의 콜로니(colony)의 변이 균주들(mutants)을 얻었다. 상기 미량 원소액(Trace element solution)의 조성은 1ℓ 당 nicotinic acid 0.2g, thiamine-HCl 0.4g, nicotinamide 0.2g 및 biotin 0.008 g 이었고, 비타민 혼합액(vitamin mixture solution)은 1ℓ 당 FeSO4· 7H2O 3g, H3BO3 0.01g, Na2MoO4· 2H2O 0.01g, MnSO4· H2O 0.02g, CuSO4· 5H2O 0.01g, ZnSO4 0.01g 및 ethylenediamine tetra acetic acid 0.5g 이었다.
실시예 2: 코엔자임 Q 10 의 추출 및 생산량 측정
코엔자임 Q10은 대수증식기 말기에 회수된 광합성 세균 배양액을 원심 분리 하여 얻어진 균체(cell pellet)로부터 추출하였다. 5 ml의 배양액으로부터 얻은 균체(cell pellet)에 3.3 ml 메탄올(methanol)을 처리한 후, 55℃에서 5분간 가열(heating)하고 난 다음, 6.6 ml 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 30℃에서 20분간 반응(stirring)시켜 코엔자임 Q10을 추출하였다. 추출 후, 와트만 여과지(Whatman No.1 filter paper)로 여과한 다음, 여과된 액과 0.85% 인산완충용액(saline)이 5:1 비율이 되도록 0.85% 인산완충용액을 여과액에 첨가하면 시간이 지나면서 2개의 상으로 분리되는데, 이중 상층액은 제거하고 아래층의 코엔자임 Q10이 추출된 상을 25℃의 감압증류장치(evaporator)로 건조시켜 추출용매를 제거하는 방식으로 코엔자임 Q10을 최종적으로 추출하였다. 튜브에 남아있는 나머지를 에탄올(ethanol)에 녹인 후, C18 역상컬럼(reverse-phase column) 및 UV 검출기(275nm)가 장착된 HPLC를 이용하여 코엔자임 Q10의 생산량을 측정하였다. 이때, 이동상은 에탄올을 사용하였고, 유속은 1 ml/min이었다.
실시예 3: 배양 조건에 따른 코엔자임 Q 10 생산성 비교 실험
pH, 용존 산소량(DO), 빛 및 변이 균주 등의 배양 조건에 따른 광합성 세균의 코엔자임 Q10 생산량 변화를 알아보기 위해 pH, 용존 산소량(DO) 및 산화환원전위(ORP)를 실시간으로 측정할 수 있는 1 L 반응기(bioreactor; MDL-100, Marubishi, Japan)에서 배양하였다. 상기 표 1의 조성으로 구성된 기초 배지 600 mL가 담긴 반응기에 기초 배지를 사용하여 플라스크(flask)에서 배양한 말기(late-log) 상태의 광합성 세균을 접종한 후, pH, 용존 산소량(DO), 빛 및 변이 균주 등 배양 조건을 달리하여 30℃, 300 rpm에서 회분 배양하였다. pH, 용존 산소량(DO) 및 산화환원전위(ORP)는 실시간으로 측정하였고, 주기적으로 5 mL를 시료 채취(sampling)하여 균체량을 측정하였다. 균체량은 생균수(viable cell count; CFU/mL)와 세포 건조 중량(DCW)으로 측정하였다.
3-1. 화학제 처리 변이 균주에 따른 코엔자임 Q 10 생산성 비교
상기 실시예 1-3에서 수득한 각 화학제 처리에 의한 변이 균주들의 코엔자임 Q10 생산량 변화를 확인하기 위해 10 mL 튜브에서 상기 표 1의 기초 배지를 이용하여 30℃, 180 rpm에서 2일간 회분 배양하였다.
모세포(Parent cell)인 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids ) KACC 91338P의 비증식 속도(specific growth rate)는 0.13 h-1이고, 코엔자임 Q10은 세포 건조 중량 그램 당 1.55 mg을 생산하였다. 기존 논문에 발표된 타 미생물과 비교하면, 코엔자임 Q10 생산량이 적지 않음을 알 수 있었다. 메나디논(Menadinone) 처리에 의한 변이 균주가 가장 높은 코엔자임 Q10 생산량을 보였고, 메나디논(Menadinone) > 메나디논(Menadinone) + L-에티오닌(ethionine) > 다우노마이신(Daunomycin) > L-에티오닌(ethionine) 순으로 그 생산량이 많았다. 모세포(Parent cell)에 비해 메나디논(menadinone) 처리에 의한 변이 균주의 코엔자임 Q10 생산량이 1.4배가량 많았다 (표 2). 상기 메나디논 처리 변이 균주를 2007년 11월 14일자로 농업생명공학연구원에 KACC 91339P로 기탁하였다.
코엔자임 Q10 생산량(mg/g dry cell)
모세포(Parent cell) red color 1.55
각각의 화학제 처리에의한 변이 균주(Mutants by treatment of each reagent) 메나디논(Menadinone) 2.94
L-에티오닌(ethionine) 1.76
다우노마이신(Daunomycin) 1.90
메나디논(Menadinone) + L-에티오닌(ethionine) 2.10
변이 광합성 세균을 이용한 튜브에서의 코엔자임 Q10 생산시, 배양액을 튜브에 1/2 이하로 채워 배양하면 색소의 색깔이 선홍빛 색깔에 가깝게 나타났고, 배양액을 튜브에 가득 채워 배양하면 짙은 녹색을 나타내었다. 이 때, 짙은 녹색을 띄는 변이 광합성 세균의 코엔자임 Q10 생산량이 선홍빛 색깔의 변이 광합성 세균의 코엔자임 Q10 생산량에 비해 1.9배 정도 높았다.
3-2. pH 조절에 따른 코엔자임 Q 10 생산성 비교
pH 조절에 따른 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P의 코엔자임 Q10 생산량 변화를 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 실험하였다. pH의 조절은 수산화나트륨 수용액으로 보정하였다.
1L 반응기(bioreactor)에서 코엔자임 Q10 생산을 50 lux, 30 ℃, 300 rpm, 5 vvm의 공기공급 및 pH 7의 조절 상태에서 회분(batch) 배양하여 도 2와 같은 결과를 얻었다. 반응 6시간 이전에 반응기 내의 용존 산소(DO)가 거의 0.3 ppm까지 떨어졌고, 반응 13시간 후에 80% 이상 회복되었다. 용존 산소(DO)가 급격하게 소모되고 난 후로는 거품이 많이 발생하여 소포제를 사용하여 제거하였다. 세포 건조 중량은 반응 12시간 정도에서 최대값을 가졌고, 이 때, 코엔자임 Q10 생산량은 1.00 mg/g dry cell로 가장 높았다. 이후, 세포 건조 중량의 감소와 함께 코엔자임 Q10의 생산량도 서서히 감소하였다.
상기와 동일한 배양 조건에서 pH만 조절하지 않고 배양하여 도 3과 같은 결과를 얻었다. 반응 6시간 이전에 반응기 내의 용존 산소(DO)가 거의 0.3 ppm까지 떨어졌고, 반응 23시간 후에 거의 회복되는 경향을 보였으며, 용존 산소(DO)가 급격하게 소모되고 난 후로는 거품이 많이 발생하여 소포제를 사용하여 제거하였다. pH는 반응 시작과 함께 9 이상으로 증가하다가 10시간 후부터는 완만한 상승을 나타내었다. 생균수는 반응 약 25시간 정도에서 최대값에 도달하였고, 이 때, 코엔자임 Q10 생산량이 1.69 mg/g dry cell로 가장 높았다. 이후, 세포 건조 중량의 감소와 함께 코엔자임 Q10 생산량도 감소하였다.
결론적으로, pH를 조절하지 않으면 전반적인 균의 성장은 느리지만 코엔자임 Q10 생산량은 1.7배 정도 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
3-3. 용존 산소량( DO ) 조절에 따른 코엔자임 Q 10 생산성 비교
반응기 내의 용존 산소량(DO) 조절에 의한 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P의 코엔자임 Q10 생산량 변화를 확인하기 위해 1L 반응기(bioreactor)에서 하기와 같이 실시한 3가지 실험의 결과를 비교하여 보았다.
pH를 조절하지 않고 50 lux, 30 ℃, 300 rpm 및 5 vvm의 공기 공급 조건에서 회분 배양한 결과는 도 3과 같았으며, 상기 실시예 3-2에서 확인한 바와 같이 최대 코엔자임 Q10 생산량은 1.69 mg/g dry cell이었다.
pH를 조절하지 않고 50 lux, 30 ℃, 300 rpm 및 0.2 vvm의 공기 공급 조건에서 회분 배양하여 도 4의 결과를 얻었다. 반응 4시간 이전에 반응기 내의 용존 산소(DO)가 급격하게 소모되어 약 1 ppm까지 떨어졌고, 반응 10시간 이후에 회복되기 시작하여 반응 23시간 이후에 거의 회복되는 경향을 보였다. pH는 반응 시작과 함께 증가하였고, 세포 건조 중량은 반응 약 25시간 이후에서 최대값에 도달하였다. 코엔자임 Q10 생산량은 반응 12시간에서 2.91 mg/g dry cell로 가장 높았고, 이후에서는 계속적으로 감소하는 경향을 보였다.
상기와 같이 용존 산소량(DO)을 달리하여 동일한 배양 조건 하에서 배양한 결과, 5 vvm의 공기 공급 조건에서 최대 코엔자임 Q10 생산량은 1.69 mg/g dry cell, 0.2 vvm의 공기 공급 조건에서 최대 코엔자임 Q10 생산량은 2.91 mg/g dry cell로서, 코엔자임 Q10 생산량이 약 1.7배 가량 높아짐을 알 수 있었다.
pH를 조절하지 않고 50 lux, 30 ℃, 300 rpm 및 0.2 vvm의 공기공급을 해 주되 광합성 세균의 대수성장기 동안에는 반응기 내의 용존 산소(DO)가 1 ppm을 넘지 못하도록 on-off 형태의 용존 산소(DO) 조절을 통하여 회분 배양하여 도 5의 결과를 얻었다. 반응 4시간 이전에 반응기 내의 용존 산소(DO)가 급격하게 소모되어 약 1 ppm 이하로 떨어졌고, 이후 용존 산소(DO) 조절로 광합성 세균의 대수성장기 동안에서 0.8 ppm 이하에서 줄곧 배양되었다. 반응 약 25시간 이후에는 공기 공급을 하지 않았지만 용존 산소(DO)가 어느 정도 회복되는 경향을 보였다. pH는 반응 시작과 함께 증가하여 반응 10시간 이후에는 pH 9 이하에서 계속적으로 유지되었다. 세포 건조 중량은 반응 약 24시간 이후에서 최대값에 도달하였고, 이때, 최대 코엔자임 Q10 생산량은 3.88 mg/g dry cell이었다.
따라서, 실험에 사용된 광합성 세균의 성장이 대수증식기 말기를 지나 정지기에 들어서면 반응기 내의 용존 산소(DO)가 다시 빠르게 증가하는 배양 특징을 알 수 있었다. 대수증식기에서 반응기 내의 용존 산소(DO)가 0.8 ppm 이하로 유지되면 배양액의 색깔이 선홍빛에서 적갈색으로 변하고, pH가 9 이상으로 증가하지 않으며, 이때의 코엔자임 Q10 생산량은 pH를 조절하지 않는 조건하에서 50 lux, 30 ℃, 300 rpm 및 5 vvm의 공기 공급 조건에서의 최대 코엔자임 Q10 생산량보다 약 2.3배 가량 높음을 알 수 있었다.
결론적으로, 광합성 세균의 대수성장기 동안에는 반응기 내의 용존 산소(DO)가 1 ppm을 넘지 못하도록 on-off 형태의 용존 산소(DO)를 조절함으로써 코엔자임 Q10 생산량을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
3-4. 빛 유무에 따른 코엔자임 Q 10 생산성 비교
반응기 내의 빛의 유무에 의한 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P의 코엔자임 Q10 생산량 변화를 확인하기 위해 1L 반응기(bioreactor)에서 하기와 같이 실시한 2가지 실험의 결과를 비교하여 보았다. 빛의 차단은 반응기를 알루미늄 호일로 덮어 씌워 조절하였다.
pH를 조절하지 않고 30 ℃, 300 rpm, 0.2 vvm의 공기공급을 해 주되 광합성세균의 대수성장기 동안에는 반응기 내의 용존 산소(DO)가 1 ppm을 넘지 못하도록 on-off 형태의 용존 산소(DO) 조절 및 50 lux의 빛을 준 조건에서 회분 배양한 결과는 도 5와 같았으며, 상기 실시예 3-3에서 확인한 바와 같이 최대 코엔자임 Q10 생산량은 3.88 mg/g dry cell이었다.
pH를 조절하지 않고 30 ℃, 300 rpm, 0.2 vvm의 공기공급을 해 주되 광합성 세균의 대수성장기 동안에는 반응기 내의 용존 산소(DO)가 1 ppm을 넘지 못하도록 on-off 형태의 용존 산소(DO) 조절 및 반응기를 알루미늄 호일로 덮어 씌워 빛을 차단한 조건에서 회분 배양한 결과는 도 6과 같았다. 반응 2.5시간 이전에 반응기 내의 용존 산소(DO)가 급격하게 소모되어 약 0.3 ppm 이하로 떨어졌고, 이후 용존 산소(DO) 조절로 광합성 세균의 대수성장기 동안에서 0.3 ppm 이하에서 줄곧 배양되었다. 50 lux의 빛을 준 경우와 마찬가지로, 반응 약 25시간 이후에는 공기공급을 하지 않았지만 용존 산소(DO)가 급격하게 회복되었고, pH는 반응 시작과 함께 증가하여 반응 10시간 이후에는 pH 9 이하에서 계속적으로 유지되는 경향을 보였다. 세포 건조 중량은 반응 약 30시간 이후에서 최대값에 도달하였고, 최대 코엔자임 Q10 생산량은 반응 25시간 이후로 3.85 mg/g dry cell이었다.
따라서, 빛의 유무에 따른 코엔자임 Q10 생산에는 유의적인 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
3-5. 모세포와 변이 균주에 따른 코엔자임 Q 10 생산성 비교
pH를 조절하지 않고 빛을 차단한 배양조건 하에서 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P 및 KACC 91339P의 코엔자임 Q10 생산량 변화를 확인하기 위해 1L 반응기(bioreactor)에서 하기와 같이 실시한 2가지 실험의 결과를 비교하여 보았다.
pH를 조절하지 않고 빛을 차단한 배양조건 하에서 30 ℃, 300 rpm 및 0.2 vvm의 공기공급을 해 주되 광합성 세균의 대수성장기 동안에는 반응기 내의 용존 산소(DO)가 1 ppm을 넘지 못하도록 on-off 형태의 용존 산소(DO) 조절 조건에서 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P를 회분 배양한 결과는 도 6과 같았으며, 상기 실시예 3-4에서 확인한 바와 같이 최대 코엔자임 Q10 생산량은 3.85 mg/g dry cell이었다.
pH를 조절하지 않고 빛을 차단한 배양조건 하에서 30 ℃, 300 rpm 및 0.2 vvm의 공기공급을 해 주되 광합성 세균의 대수성장기 동안에는 반응기 내의 용존 산소(DO)가 1 ppm을 넘지 못하도록 on-off 형태의 용존 산소(DO) 조절 조건에서 메나디논(menadinone) 처리에 의한 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91339P를 회분 배양한 결과는 도 7과 같았다. 반응 2.5시간 이전에 반응기 내의 용존 산소(DO)가 급격하게 소모되어 약 0.8 ppm 이하로 떨어졌고, 이후 용존 산소(DO) 조절로 광합성 세균의 대수성장기 동안에서 0.8 ppm 이하에서 줄곧 배양되었다. 반응 약 21시간 이후에는 공기공급을 하지 않았지만 용존 산소(DO)가 급격하게 회복되었고, pH는 반응 시작과 함께 증가하여 반응 20시간까지는 증가하였으나 pH 9 이하였고, 그 이후에는 조금 감소하는 경향을 보였다. 세포 건조 중량은 반응 약 20시간에 최대값에 도달하였고, 이때, 최대 코엔자임 Q10 생산량은 4.66 mg/g dry cell이었다. 따라서, 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91339P를 이용하여 배양하면 1.2배 정도 높은 코엔자임 Q10 생산량을 얻을 수 있음을 확인하였다.
종합적으로, 상기 실시예 3-1 내지 3-5에서 확인한 결과, 빛을 차단하고, 30 ℃, 300 rpm, 0.2 vvm의 공기공급을 해 주되 광합성 세균의 대수성장기 동안에는 반응기 내의 용존 산소(DO)가 1 ppm을 넘지 못하도록 on-off 형태의 용존 산소(DO) 조절 및 pH를 조절하지 않은 상태에서 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91339P를 배양하는 것이 코엔자임 Q10 생산을 위한 최적배양조건임을 알 수 있었고, 이러한 최적배양조건에서 배양하였을 경우, 코엔자임 Q10을 세포 건조 중량 그램 당 4.66 mg 정도까지 수득할 수 있음을 확인하였다.
상기 실험에서 배양된 광합성 세균은 세포 성장 과정 중 대수증식기 중기(mid-log) 이후에서 대수증식기 말기(late-log) 사이에 가장 높은 균체량을 나타내었으며, 이후의 정지기(stationary)에서는 그 함량이 줄어드는 특징이 있으므로 대수증식기 말기를 넘기지 않도록 그 직전에 광합성 세균을 전량 회수해야 함을 확인하였다. 상기 도 2 내지 7에 나타난 바와 같이, 광합성 세균의 세포 성장 과정에서 대체적으로 최대 균체량을 나타내었을 경우, 코엔자임 Q10 생산 또한 최대량을 나타내므로 상기와 같은 광합성 세균의 특성을 고려하여 고농도의 코엔자임 Q10 생산을 위해서는 대수증식기 말기를 넘기기 전에 광합성 세균을 전량 회수해야 함을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Rhodobacter sphaeroids Having High Producing Ability Coenzyme Q10 and Method for Preparing Coenzyme Q10 Using the Same <130> P07-B239 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

  1. 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91338P.
  2. 코엔자임 Q10 생성능을 가지는 로도박터 스페어로이즈(Rhodobacter sphaeroids) KACC 91339P.
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