CN106591420A - 一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法 - Google Patents

一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法。该方法包括以下步骤：将经高通量初筛获得的具有石油降解能力的菌株进行细胞破碎制备粗酶液，将粗酶液加入石油降解率检测体系中，以石油降解率作为筛选指标，筛选菌株即为高效石油降解菌株。本发明所提供的生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法能够在短时间实现高效胞内石油降解酶产生菌株的规模化筛选，靶向性强，对不同环境样品来源的石油降解菌株具有普适性，适合于石油污染环境治理与修复领域的产业化应用，同时可以避免石油降解菌筛选过程中由于特殊原因导致漏筛的技术难题。

Description

一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法
技术领域
本发明涉及一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法，属于环境生物技术领域。
背景技术
目前，石油工业中油气田开发过程所造成的土壤、水体等环境污染问题日益突出，及时、有效地治理与修复石油污染环境，保护生态系统，对人类健康和社会、经济可持续发展至关重要。微生物修复因其无二次污染、易于实现原位修复、低耗和纯生态过程的显著优点，是公认的治理水土污染的一种环保而有效的手段。然而，由于不同石油污染场地在石油组成、污染程度等方面具有差异性，针对不同场地进行修复时，高效降解菌种资源的快速筛选是缩短修复周期、实现有效修复的关键步骤。
石油降解微生物的筛选步骤分为初筛和复筛。初筛是将经过富集的微生物在盛有一定浓度的石油瓶中进行降解筛选，将具有一定石油降解率的微生物初步分离出来。然后将分离出的微生物进行土壤中石油烃降解能力的测定筛选。从初筛到复筛至少需要3个月的时间。
石油污染土壤修复时，参与其中的微生物有降解微生物和辅助微生物。降解微生物体内包含石油烃降解所需要的高活性降解酶，辅助微生物不具有或兼具石油降解能力，其主要作用包括表面活性剂的分泌，解磷菌对土壤中固定态磷的释放以促进微生物的生长繁殖等不同类型的微生物，这些不同类型的微生物会共同促进石油烃分子表面性质的改变、提供有利于石油降解菌繁殖的营养条件而共同促进石油的高效降解。
然而，在实验室内进行石油降解微生物筛选时，由于一般情况下是对单一菌降解能力的筛选，而导致有些具有高活性石油降解能力的菌株由于其不具备表面活性剂分泌能力等缺陷而致使其最终石油降解率低下而漏选。
利用生物酶高效、快速反应的特点，对其产生菌株进行规模化筛选，能够极大地缩短筛选周期，提高筛选效率，满足石油污染场地快速高效修复的需要。而且能有效避免由于石油烃分子的疏水性、氮磷营养缺乏等造成的降解能力的限制。目前关于生物酶应用于石油降解菌株筛选方面的研究尚未见报道。建立生物酶筛选高效石油降解菌株的方法，对石油降解胞内酶产生菌株的规模化筛选具有普适性，在石油污染环境治理、生态修复方面具有重要的应用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法。
本发明技术方案如下：
一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法，包括以下步骤：
将经高通量初筛获得的具有石油降解能力的菌株进行细胞破碎制备粗酶液，将粗酶液按体积比1：(90～110)的比例加入石油降解率检测体系中，反应1～24h，以石油降解率作为筛选指标，当石油降解率满足≥30％条件时，筛选菌株即为高效石油降解菌株。
根据本发明优选的，所述高通量初筛的步骤为：在364微孔板上加入含有石油的无机盐培养基，随机接入预先分离的石油降解菌株，在温度为30～37℃的条件下于含有石油的无机盐培养基中培养6～8天，当OD600达到0.5以上时，初步筛选获得石油降解菌株。
根据本发明优选的，所述含有石油的无机盐培养基组分如下：磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸铵1.0g/L，蛋白胨2g/L，石油1～10g/L，pH 7.0。
根据本发明优选的，所述细胞破碎制备粗酶液的步骤如下：
将菌株培养液经离心，收集菌体；用菌体3～20倍体积的pH 6.0的PBS缓冲液重悬；在功率为190～500W的条件下超声破碎5～20min；在4℃条件下，经3000～10000rpm离心2～10min，取上清，制得粗酶液。
根据本发明优选的，所述粗酶液的蛋白浓度为0.5～20mg/mL。
根据本发明优选的，石油降解率检测体系为由PBS缓冲液配制的石油浓度为1g/L～10g/L的溶液体系。
有益效果
本发明所提供的生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法能够在短时间(24h)实现高效胞内石油降解酶产生菌株的规模化筛选，靶向性强，对不同环境样品来源的石油降解菌株具有普适性，适合于石油污染环境治理与修复领域的产业化应用，同时可以避免石油降解菌筛选过程中由于特殊原因导致漏筛的技术难题。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。
实施例1
一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法，包括以下步骤：
(1)在364微孔板上加入含有石油的无机盐培养基，随机接入预先分离的胞内功能酶产生菌株，在35～37℃培养7天，当OD600达到0.5以上时，初步筛选获得石油降解菌株；
所述培养液为含有浓度为1～10g/L石油的无机盐培养基，无机盐培养基组分如下：
磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸铵1.0g/L，蛋白胨2g/L，石油1～10g/L，pH 7.0；
(2)将步骤(1)获得的石油降解菌株的培养液经离心，收集菌体；用3～20倍体积的pH 6.0的PBS缓冲液重悬；超声破碎10min，超声功率为300W；在4℃条件下，经7000rpm离心6min，取上清，制得粗酶液；经检测，粗酶液的蛋白浓度为10mg/mL。
(3)将粗酶液按体积比1：10的比例加入石油降解率检测体系中，反应12h，以石油降解率作为筛选指标，当石油降解率满足≥30％条件时，筛选菌株即为高效石油降解菌株。
所述石油降解率检测体系为由PBS缓冲液配制的石油浓度为1g/L～10g/L的溶液体系。
实施例2
本实施例用于说明本发明所提供生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法。
选取石油降解菌株醋酸钙不动杆菌(来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号：CGMCC No.3915)接种至含有5g/L石油的50mL无机盐培养基中，在30℃下恒温培养1d，收集培养液，经3000rpm离心10min，收集菌体，各自加入3倍体积pH6.0的PBS缓冲液，在190W功率下超声破碎20min，经4℃、3000rpm离心10min，取上清液1mL，分别添加至含有5g/L石油的40mL PBS缓冲液中，在30℃下分别反应1h、3h、5h，采用紫外分光光度法检测不同体系中的石油降解率，降解结果见表1。
表1
反应时间 石油降解率/％
1h 22.3
3h 34.7
5h 49.0
实施例3
初筛
将取自胜利油田孤岛采油厂的土壤样品自然风干后粉碎过100目筛。取5g加入到45mL以原油为唯一碳源的原油培养基中，置于30℃恒温摇床上富集培养1周左右，摇床转速为180r/min。
所述原油培养基，组分如下：
NH4NO32.0g，KH2PO43.0g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，无水CaCl20.01g，Na2EDTA·H2O 0.01g，原油5g，H2O 1000mL；
用接种环挑取第一次富集培养液，在油平板(原油培养基中加入1.5％～2.0％的琼脂，制成油平板)上划线分离，同时移取少量菌液进行稀释涂平板分离，将其置于30℃培养箱内培养观察。然后将菌液按照10％的比例接入以原油培养基中，相同条件下进行第二次富集培养，每次富集培养液都经过划线分离和稀释涂平板分离。经过三次富集培养后，观察在平板上得到的优势菌落，选取形态特征一致的单菌落，在肉胨培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10g，NaCl 5.0g，琼脂10g，H2O 1000mL)上多次划线分离，以纯化得到的单菌落，分别编号，保藏于肉胨斜面培养基上。
经过三代富集分离，得到9株优势菌株，分别编号BC1，BC2，BC3，BC4，BC5，BC6，BC7，BC8，BC9。
粗酶液复筛
将筛获得的9株石油降解菌株分别接种至30mL含有石油的无机盐培养基中，含有石油的无机盐培养基组分如下：磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸铵1.0g/L，蛋白胨2g/L，石油5g/L，pH 7.0；
在摇床中30℃、150rpm恒温培养1d，分别收集培养液，经8000rpm离心3min，收集菌体，各自加入15倍体积pH 6.0的PBS缓冲液，在260W功率下超声破碎15min，经4℃、8000rpm离心3min，取上清液，测定蛋白含量后，分别取含2mg粗蛋白的酶液添加至含有5g/L石油的40mL PBS缓冲液中，在30℃下反应5h，采用紫外分光光度法检测石油降解率，根据粗酶液降解能力，筛选石油降解率较高的菌株，结果如表2所示。
泡沫箱石油降解验证实验。在泡沫箱中装入含原油2％的土壤1Kg，按修复土样质量的5％加入菌液50g，混匀，保持20％～30％的含水量，土壤松散，室温15～35℃放置60天，测定土壤中石油降解率，结果如表2所示。
表2筛选菌株的粗酶降解石油及泡沫箱内石油降解结果对比
对比例1
将实施例3初筛得到的9株菌株分别进行摇瓶石油降解实验以及泡沫箱石油降解实验。
摇瓶石油降解实验：
将LB培养基中培养24h的上述9株筛选到的菌株，取5mL加入到45mL以原油为唯一碳源的灭菌原油培养基中，置于30℃恒温摇床上富集培养1周左右，摇床转速为180r/min，测定石油降解率，结果见表3。
所述原油培养基，组分如下：
NH4NO32.0g，KH2PO43.0g，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，无水CaCl20.01g，Na2EDTA·H2O 0.01g，原油5g，H2O 1000mL；
泡沫箱石油降解验证实验：
在泡沫箱中装入含原油2％的土壤1Kg，按修复土样的5％加入菌液50g，混匀，保持20％～30％的含水量，土壤松散，室温15～35℃放置60天，测定土壤中石油降解率，结果见表3。
表3.筛选菌株的摇瓶及泡沫箱内石油降解结果对比
结果分析
由表2的结果可以看出，泡沫箱内石油降解率顺序为BC3＞BC8＞BC6＞BC7＞BC1＞BC2＞BC5＞BC4＞BC9，粗酶对石油的降解率大小顺序为BC3＞BC8＞BC7＞BC6＞BC1＞BC2＞BC5＞BC4＞BC9，两者顺序基本一致。
由表3的结果可以看出，摇瓶石油降解实验中，菌株对石油降解率的大小顺序为BC4＞BC6＞BC8＞BC5＞BC7＞BC2＞BC3＞BC9＞BC1，泡沫箱内石油降解率顺序为BC3＞BC8＞BC6＞BC7＞BC1＞BC2＞BC5＞BC4＞BC9。
如果用摇瓶石油降解数据来筛选高效降解菌株，可能会漏选BC3、BC7等高效降解菌，因此用粗酶来筛选高效石油降解菌可以得到和实际应用过程中基本一致的结果。

Claims (6)

1.一种生物酶快速筛选高效石油降解菌株的方法，包括以下步骤：
将经高通量初筛获得的具有石油降解能力的菌株进行细胞破碎制备粗酶液，将粗酶液按体积比1：(90～110)的比例加入石油降解率检测体系中，反应1～24h，以石油降解率作为筛选指标，当石油降解率满足≥30％条件时，筛选菌株即为高效石油降解菌株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量初筛的步骤为：在364微孔板上加入含有石油的无机盐培养基，随机接入预先分离的石油降解菌株，在温度为30～37℃的条件下于含有石油的无机盐培养基中培养6～8天，当OD600达到0.5以上时，初步筛选获得石油降解菌株。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有石油的无机盐培养基组分如下：
磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钠0.2g/L，硫酸铵1.0g/L，蛋白胨2g/L，石油1～10g/L，pH 7.0。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞破碎制备粗酶液的步骤如下：
将菌株培养液经离心，收集菌体；用菌体3～20倍体积的pH 6.0的PBS缓冲液重悬；在功率为190～500W的条件下超声破碎5～20min；在4℃条件下，经3000～10000rpm离心2～10min，取上清，制得粗酶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粗酶液的蛋白浓度为0.5～20mg/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，石油降解率检测体系为由PBS缓冲液配制的石油浓度为1g/L～10g/L的溶液体系。
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