CN105567604A - 复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合微生物菌剂及其制备方法，所述微生物菌剂是由经过发酵的真菌菌剂和经过发酵的细菌菌剂按照菌数比35-85:15-65的比例混合后形成。本发明具有变废为宝、原料价廉、操作简便、菌株配比灵活等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
目前，应用于污水处理和污染土壤修复的微生物菌剂的发酵方法己有多种专利和文献报道。环保微生物菌剂的发酵工艺大体上可分为固体发酵和液体发酵（从培养基形态上）、单菌发酵和混菌发酵（从菌株数量上）等几种类型。上述发酵技术存在如下一些缺点,如：1)液体发酵对设备及其控制要求较高；2)单菌发酵效率低下；3)混菌发酵不易调控各菌株比例等。
发明内容
针对现有问题，本发明公开了一种复合微生物菌剂及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种复合微生物菌剂，所述微生物菌剂是由经过发酵的真菌菌剂和经过发酵的细菌菌剂按照菌数比35-85:15-65的比例混合后形成。
优选的，其中，发酵前的所述真菌种类包括假丝酵母菌、白腐菌和褐腐菌；发酵前的所述细菌种类包括假单胞菌、芽孢杆菌、微球菌、黄杆菌、不动杆菌、脱硫弧菌、腊状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、屈挠杆菌、欧文氏菌、黄单胞菌、气单胞菌、以及邻单胞菌。
一种权利要求1中所述的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
A：制作细菌培养基和真菌培养基；所述细菌培养基由米糠、麸皮、玉米粉、大豆粉、醪液蛋白、石灰粉和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为35-60%、15-25%、5-10%、3-10%、7-15%、2-5%、0.05-0.5%；所述真菌培养基由由米糠、麸皮、醪液蛋白、古龙酸母液和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为35-50%、15-35%、5-10%、5-20%、0.05-0.5%；
B：细菌和真菌发酵前培养；
将各个细菌菌株分别依次作一组斜面培养、30-37℃条件下二级液体震荡培养、30-37℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到0.1-5.0×108个；
将真菌分别依次作一组斜面培养、25-30℃条件下二级液体震荡培养、25-30℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到0.1-5.0×106个；
C：发酵；在细菌菌剂发酵时，先调节细菌培养基中的水份至40-50%、pH至6.5-7.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物按单一菌株的菌数范围比5-30%的比例进行搅拌混合，再以3-20%的接种量接种于细菌培养基，经3-10天的室温下固态发酵后获得细菌菌剂。
在真菌菌剂发酵时，调节真菌培养基中的水份至40-50%、pH至4.5-6.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物在室温下按单一菌株的菌数范围比20-50%的比例进行搅拌混合，再以5-25%的接种量接种于真菌培养基，经3-15天室温下固态发酵后获得真菌菌剂。
D：将真菌菌剂和细菌菌剂按照菌数比35-85:15-65混合形成所述复合微生物菌剂。
优选的，包括以下步骤：
A：制作细菌培养基和真菌培养基；所述细菌培养基由米糠、麸皮、玉米粉、大豆粉、醪液蛋白、石灰粉和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为40-50%、20-23%、7-9%、5-8%、9-11%、2-5%、0.1-0.3%；所述真菌培养基由由米糠、麸皮、醪液蛋白、古龙酸母液和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为40-50%、20-30%、6-8%、11-17%、0.2-0.4%；
B：细菌和真菌发酵前培养；
将各个细菌菌株分别依次作一组斜面培养、30-37℃条件下二级液体震荡培养、30-37℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×108个；
将真菌分别依次作一组斜面培养、25-30℃条件下二级液体震荡培养、25-30℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×106个；
C：发酵；在细菌菌剂发酵时，先调节细菌培养基中的水份至40-50%、pH至6.5-7.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物按单一菌株的菌数范围比15-25%的比例进行搅拌混合，再以9-16%的接种量接种于细菌培养基，经3-10天的室温下固态发酵后获得细菌菌剂。
在真菌菌剂发酵时，调节真菌培养基中的水份至40-50%、pH至4.5-6.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物在室温下按单一菌株的菌数范围比30-40%的比例进行搅拌混合，再以5-25%的接种量接种于真菌培养基，经3-15天室温下固态发酵后获得真菌菌剂。
D：将真菌菌剂和细菌菌剂按照菌数比50-60:30-50混合形成所述复合微生物菌剂。
优选的，包括以下步骤：A：制作细菌培养基和真菌培养基；所述细菌培养基由米糠、麸皮、玉米粉、大豆粉、醪液蛋白、石灰粉和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为45%、22%、8%、7%、10%、4%、0.2%；所述真菌培养基由由米糠、麸皮、醪液蛋白、古龙酸母液和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为44%、25%、7%、16%、0.3%；
B：细菌和真菌发酵前培养；
将各个细菌菌株分别依次作一组斜面培养、30-37℃条件下二级液体震荡培养、30-37℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×108个；
将真菌分别依次作一组斜面培养、25-30℃条件下二级液体震荡培养、25-30℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×106个；
C：发酵；在细菌菌剂发酵时，先调节细菌培养基中的水份至40-50%、pH至6.5-7.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物按单一菌株的菌数范围比15-25%的比例进行搅拌混合，再以9-16%的接种量接种于细菌培养基，经5天的室温下固态发酵后获得细菌菌剂。
在真菌菌剂发酵时，调节真菌培养基中的水份至40-50%、pH至4.5-6.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物在室温下按单一菌株的菌数范围比30-40%的比例进行搅拌混合，再以5-25%的接种量接种于真菌培养基，经5天室温下固态发酵后获得真菌菌剂。
D：将真菌菌剂和细菌菌剂按照菌数比55:35混合形成所述复合微生物菌剂。
本技术采用了一种细菌与真菌分别培养、并添加全新营养组分的混菌固体发酵方法。首先，在本方法中，曾被视为废弃物的维生素C发酵醪液和古龙酸母液作为新营养组分添加到固体培养基中，形成了全新的细菌和真菌培养基。因此，本技术既把废弃物进行了资源化再利用，又为复合菌剂提供更多、更丰富的培养基养分。其次，因为细菌和真菌的生长条件（如底物、温度、pH值等）均不同，本技术通过分别调控细菌和真菌培养基的组分和pH值，使细菌和真菌的发酵效率获得显著提高。再次，本技术采用纯菌液体培养物接种固体培养基的方法，通过调节不同菌株的接种比例来调控混菌发酵中的各菌株比例，并再通过细菌和真菌固体培养物的配比来调控复合菌剂中细菌与真菌的比例。因此，本技术具有变废为宝、原料价廉、操作简便、菌株配比灵活等特点。
本技术所获得菌剂可用于好氧及兼氧的污水处理系统，如生活污水、屠宰废水、焦化废水、印染废水、制革废水、造纸废水、制药废水、含油污水等，以及石油污染土壤生物修复中。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1：该复合微生物菌剂由细菌和真菌菌株组成，其中包括假单胞菌、芽孢杆菌、微球菌、黄杆菌、不动杆菌、腊状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、屈挠杆菌、欧文氏菌、黄单胞菌、气单胞菌、邻单胞菌等细菌、以及假丝酵母菌、白腐菌、褐腐菌等真菌组成。上述菌株分别保存于冻干管中，在使用前予以转接、活化。
细菌固体培养基由米糠、麸皮、玉米粉、大豆粉、醪液蛋白、石灰粉和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为45%、20%、7%、5%、10%、3%、0.2%。真菌固体培养基由米糠、麸皮、醪液蛋白、古龙酸母液和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为40%、15%、10%、8%、0.2%。
首先，将活化后的各个细菌菌株分别依次作斜面培养、30-37℃条件下二级液体震荡培养、30-37℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到0.1-5.0×108个。
其次，将活化后的各个真菌菌株分别依次作斜面培养、25-30℃条件下二级液体震荡培养、25-30℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到0.1-5.0×106个。
在细菌菌剂发酵时，先调节细菌培养基中的水份至45%、pH至7.0，121-122℃湿热灭菌30分钟，冷却至室温后，将各细菌菌株纯培养物按单一菌株的菌数范围比20的比例进行搅拌混合，再以10%的接种量接种于细菌培养基，经5天的室温下固态发酵后获得细菌菌剂。
在真菌菌剂发酵时，调节真菌培养基中的水份至45%、pH至5.5，121-122℃湿热灭菌40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物在室温下按单一菌株的菌数范围比30%的比例进行搅拌混合，再以20%的接种量接种于真菌培养基，经7天室温下固态发酵后获得真菌菌剂。
上述发酵结束后，把细菌菌剂与真菌菌剂按60：40的比例混合，即成为复合微生物菌剂。该复合微生物菌剂中有效活菌数为1-20亿个,杂菌数小于5%,含水量小于25%。
实施例2：该复合微生物菌剂由细菌和真菌菌株组成，其中包括假单胞菌、芽孢杆菌、微球菌、黄杆菌、不动杆菌、腊状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、屈挠杆菌、欧文氏菌、黄单胞菌、气单胞菌、邻单胞菌等细菌、以及假丝酵母菌、白腐菌、褐腐菌等真菌组成。上述菌株分别保存于冻干管中，在使用前予以转接、活化。
细菌固体培养基由米糠、麸皮、玉米粉、大豆粉、醪液蛋白、石灰粉和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为45%、22%、8%、7%、10%、4%、0.2%。真菌固体培养基由米糠、麸皮、醪液蛋白、古龙酸母液和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为44%、25%、7%、16%、0.3%。
首先，将活化后的各个细菌菌株分别依次作斜面培养、30-37℃条件下二级液体震荡培养、30-37℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×108个。
其次，将活化后的各个真菌菌株分别依次作斜面培养、25-30℃条件下二级液体震荡培养、25-30℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×106个。
在细菌菌剂发酵时，先调节细菌培养基中的水份至45%、pH至7.0，121-122℃湿热灭菌30分钟，冷却至室温后，将各细菌菌株纯培养物按单一菌株的菌数范围比5-30%的比例进行搅拌混合，再以10%的接种量接种于细菌培养基，经5天的室温下固态发酵后获得细菌菌剂。
在真菌菌剂发酵时，调节真菌培养基中的水份至45%、pH至5.5，121-122℃湿热灭菌40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物在室温下按单一菌株的菌数范围比20-50%的比例进行搅拌混合，再以20%的接种量接种于真菌培养基，经7天室温下固态发酵后获得真菌菌剂。
上述发酵结束后，把细菌菌剂与真菌菌剂按60：40的比例混合，即成为复合微生物菌剂。该复合微生物菌剂中有效活菌数为2-20亿个,杂菌数小于5%,含水量小于25%。
对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
Claims (5)
1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂是由经过发酵的真菌菌剂和经过发酵的细菌菌剂按照菌数比35-85:15-65的比例混合后形成。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，其中，发酵前的所述真菌种类包括假丝酵母菌、白腐菌和褐腐菌；发酵前的所述细菌种类包括假单胞菌、芽孢杆菌、微球菌、黄杆菌、不动杆菌、脱硫弧菌、腊状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、屈挠杆菌、欧文氏菌、黄单胞菌、气单胞菌、以及邻单胞菌。
3.一种权利要求1中所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A：制作细菌培养基和真菌培养基；所述细菌培养基由米糠、麸皮、玉米粉、大豆粉、醪液蛋白、石灰粉和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为35-60%、15-25%、5-10%、3-10%、7-15%、2-5%、0.05-0.5%；所述真菌培养基由由米糠、麸皮、醪液蛋白、古龙酸母液和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为35-50%、15-35%、5-10%、5-20%、0.05-0.5%；
B：细菌和真菌发酵前培养；
将各个细菌菌株分别依次作一组斜面培养、30-37℃条件下二级液体震荡培养、30-37℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到0.1-5.0×108个；
将真菌分别依次作一组斜面培养、25-30℃条件下二级液体震荡培养、25-30℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到0.1-5.0×106个；
C：发酵；在细菌菌剂发酵时，先调节细菌培养基中的水份至40-50%、pH至6.5-7.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物按单一菌株的菌数范围比5-30%的比例进行搅拌混合，再以3-20%的接种量接种于细菌培养基，经3-10天的室温下固态发酵后获得细菌菌剂;在真菌菌剂发酵时，调节真菌培养基中的水份至40-50%、pH至4.5-6.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物在室温下按单一菌株的菌数范围比20-50%的比例进行搅拌混合，再以5-25%的接种量接种于真菌培养基，经3-15天室温下固态发酵后获得真菌菌剂;D：将真菌菌剂和细菌菌剂按照菌数比35-85:15-65混合形成所述复合微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A：制作细菌培养基和真菌培养基；所述细菌培养基由米糠、麸皮、玉米粉、大豆粉、醪液蛋白、石灰粉和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为40-50%、20-23%、7-9%、5-8%、9-11%、2-5%、0.1-0.3%；所述真菌培养基由由米糠、麸皮、醪液蛋白、古龙酸母液和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为40-50%、20-30%、6-8%、11-17%、0.2-0.4%；
B：细菌和真菌发酵前培养；
将各个细菌菌株分别依次作一组斜面培养、30-37℃条件下二级液体震荡培养、30-37℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×108个；
将真菌分别依次作一组斜面培养、25-30℃条件下二级液体震荡培养、25-30℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×106个；
C：发酵；在细菌菌剂发酵时，先调节细菌培养基中的水份至40-50%、pH至6.5-7.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物按单一菌株的菌数范围比15-25%的比例进行搅拌混合，再以9-16%的接种量接种于细菌培养基，经3-10天的室温下固态发酵后获得细菌菌剂;在真菌菌剂发酵时，调节真菌培养基中的水份至40-50%、pH至4.5-6.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物在室温下按单一菌株的菌数范围比30-40%的比例进行搅拌混合，再以5-25%的接种量接种于真菌培养基，经3-15天室温下固态发酵后获得真菌菌剂;D：将真菌菌剂和细菌菌剂按照菌数比50-60:30-50混合形成所述复合微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A：制作细菌培养基和真菌培养基；所述细菌培养基由米糠、麸皮、玉米粉、大豆粉、醪液蛋白、石灰粉和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为45%、22%、8%、7%、10%、4%、0.2%；所述真菌培养基由由米糠、麸皮、醪液蛋白、古龙酸母液和硫酸铵组成，它们的重量百分数范围依次分别为44%、25%、7%、16%、0.3%；
B：细菌和真菌发酵前培养；
将各个细菌菌株分别依次作一组斜面培养、30-37℃条件下二级液体震荡培养、30-37℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×108个；
将真菌分别依次作一组斜面培养、25-30℃条件下二级液体震荡培养、25-30℃条件下三级液体震荡培养，至每ml液体培养基中的菌数分别达到3.0×106个；
C：发酵；在细菌菌剂发酵时，先调节细菌培养基中的水份至40-50%、pH至6.5-7.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物按单一菌株的菌数范围比15-25%的比例进行搅拌混合，再以9-16%的接种量接种于细菌培养基，经5天的室温下固态发酵后获得细菌菌剂;在真菌菌剂发酵时，调节真菌培养基中的水份至40-50%、pH至4.5-6.5，121-122度湿热灭菌30-40分钟，冷却至室温后，将各菌株纯培养物在室温下按单一菌株的菌数范围比30-40%的比例进行搅拌混合，再以5-25%的接种量接种于真菌培养基，经5天室温下固态发酵后获得真菌菌剂;D：将真菌菌剂和细菌菌剂按照菌数比55:35混合形成所述复合微生物菌剂。
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