CN104694450A

CN104694450A - 产生物乳化剂的嗜热地芽孢杆菌及其在高凝油开采中的应用

Info

Publication number: CN104694450A
Application number: CN201510080353.1A
Authority: CN
Inventors: 马挺; 周洁芳; 史忠; 李国强; 刘云; 高配科; 石慧
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Tianjin linkson Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-02-15
Filing date: 2015-02-15
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2035-02-15
Also published as: CN104694450B

Abstract

产生物乳化剂的嗜热地芽孢杆菌及其在高凝油开采中的应用。本发明涉及一株嗜热地芽孢杆菌基因工程菌A-2，保藏号CGMCC No.10151。该菌株是由嗜热地芽孢杆菌DM-2通过表达载体pUCG18导入自身的糖基转移酶基因构建而成的基因工程菌。菌株A-2在45-70℃条件下以葡萄糖、乙酸钠、乙醇、十六烷、橄榄油为碳源条件下乳化剂产量可达3-4g/L，较初始菌株DM-2提高了6倍左右。产生的乳化剂能够耐高温、耐盐、耐酸碱，对正己烷、柴油、二甲苯，十六烷，橄榄油和原油石油烃有显著的乳化作用，对高凝油有显著的乳化、降粘和降凝作用，现场试验亦证实菌株A-2及其产生的生物乳化剂可用于高凝油油藏的开采。

Description

产生物乳化剂的嗜热地芽孢杆菌及其在高凝油开采中的应用

技术领域

本发明涉及生物化工和能源开采技术领域，具体来说，涉及到一种高产生物乳化剂的基因工程菌及其在高凝油开采中的应用。

背景技术

生物表面活性剂是一类由动物、植物、微生物产生，具有疏水基团和亲水基团的两亲性物质。生物表面活性剂按照分子量的大小可以分为两类：一类是低分子量的表面活性剂，如糖脂、磷脂、脂肪酸、短链肽等，它们的活性作用主要是降低油-水的界面张力；另一类多为生物大分子，又称为乳化剂，它们一般不会使油水界面张力降的很低，但对油-水界面具有很强的亲和力，能吸附在分散的油滴表面，防止油滴聚集，从而使这种乳状液稳定。目前研究较多的乳化剂主要有Emulsan、Liposan、Alasan。

随着人们环保和可持续发展意识的增强，相对于化学合成的表面活性剂，由活细胞产生的自然表面活性剂受到了越来越多的关注。在自然表面活性剂中，这些由微生物产生的表活剂表面活性高，具有很好的亲水亲油性能，较为适合工业化大规模生产。由各类微生物产生的生物表活剂具有结构多样性、可降解性、低毒、耐高温等优良特性，使其在工业、农业、纺织行业、医疗各领域都有广泛的应用。

近年来，常温菌株生产表活剂的研究越来越多，例如关于生产鼠李糖脂的菌株生产温度均在30-37℃，而对于嗜热菌产表活剂的探索却相对匮乏，但是嗜热菌株产表活剂的优势不容忽视。由于他们的生长环境需要高温条件，使得生产乳化剂的过程有着更快的反应速度，可以降低发酵液的粘度便于菌种呼吸，降低污染杂菌的危险等。

南开大学的专利200710056753.4公开了一株嗜热地芽孢杆菌DM-2及其对重质烷烃的降解效果和乳化原油效果；专利200710061323.1公开了菌株DM-2生产生物乳化剂的方法及其应用，相比这两个专利公开的菌株DM-2，其乳化剂产量低，仅为0.4-0.6g/L，从一定意义上制约了其使用效果和成本，所以利用基因工程改造的方法提高生物乳化剂的产量和菌株的乳化效果具有重要的意义。此外，利用廉价碳源进行生物乳化剂的发酵以进一步降低生物乳化剂的成本也具有很高的应用价值。

高凝油是一种特种油资源，具有凝固点高(>40℃)、含蜡高(>36％)的特点，且胶质和沥青质的含量也比较高(最高可达13％)。凝固点和含蜡量呈一定的相关性，T＝30.879+0.508f(T＝凝固点，℃；f＝含蜡量，％)。高凝油的这些特性使得它具有独特的流变性表征：1、当所处环境的温度在析蜡点以上时，高凝油处于溶解状态，其流动性与一般原油一致；2、当所处温度降到析蜡点温度以下反常点温度以上时，就会有分子聚集现象的发生，并伴有蜡晶析出，高凝油呈悬浮状，近似流体；3、当所处温度继续下降到反常点温度以下时，蜡晶析出量会增多，此时高凝油为假塑性流体；4、当所处温度下降到凝固点以下时，此时液态烃就会失去流动性，成为塑性流体。

高凝油油藏在世界分布较广，中国是高凝油资源最为丰富的国家之一，已知中国高凝油资源量可达50×10⁸吨以上，占世界高凝油资源的30～40％，其中辽河盆地的资源最为丰富。从目前高凝油油藏开发效果看，存在着诸多的问题：含水上升较快，析蜡温度较高(接近地层温度)，采出程度不高，原油地层粘度低，水驱效率较低，热采成本较高等。针对高凝原油油藏地质特点和油藏流体特性，传统的采油方式主要原理是动力加热开采，使高凝油不能达到它的凝固点，从而以液体形式开采，以期降低开采难度。但这种技术也存在一定缺陷或制约，有些开采技术的成本相对较高，经济效益从而受损，如水利活塞泵采油技术，它的井管复杂，成本高，密封度很难达标，限制了发展。目前，除了热采技术外，微生物采油技术是高凝油开采经济上可行的三采技术之一，但是开采效果不稳定，急需进一步深入研究，找出稳定的菌种体系和开采方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产生物乳化剂的嗜热脂肪地芽孢杆菌基因工程菌和该菌株的发酵液在高凝油开采中的应用。

本发明提供的嗜热地芽孢杆菌A-2，该菌种已于2014年12月10日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.10151，建议分类命名：嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)。

本发明提供的嗜热地芽孢杆菌A-2，是利用芽孢杆菌表达载体pUCG18，将嗜热地芽孢杆菌DM-2(见2007100567534号专利)的糖基转移酶orf05703在自身多拷贝表达而制成的基因工程菌。

本发明同时提供了一种生物乳化剂，该生物乳化剂是一种糖蛋白类生物乳化剂，由菌株A-2在45-70℃条件下利用葡萄糖、乙酸钠、乙醇、十六烷或橄榄油这5种不同类型的碳源中的一种发酵产生，产量可达3-4g/L。具体发酵条件如下：将保藏于甘油管中的菌株A-2活化，涂布LB平板，60℃培养过夜。挑取单菌落，接种到5mL的LB试管，60℃，200rpm，培养12h。再以1％的接种量接种到LB三角瓶中作为种子液，培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，即处于对数期内，5％接种到产乳化剂的发酵培养基中，60℃，200rpm，培养48h。

所述产乳化剂的发酵培养基配方以g/L计为：K₂HPO₄·3H₂O 4.8；KH₂PO₄1.5；(NH₄)₂SO₄1；柠檬酸三钠0.5；MgSO₄·7H₂O 0.2；酵母提取物0.1；CaCl₂·2H₂O 0.002；MnCl₂·4H₂O0.0004；NiCl₂·6H₂O 0.0004；ZnSO₄·7H₂O 0.0004；FeCl₃·6H₂O 0.0002；NaMoO₄·2H₂O 0.0002；蒸馏水1000ml，其中碳源为葡萄糖、乙酸钠、乙醇、十六烷或橄榄油5类中的一种，各碳源的添加量分别为5g/L。

所述生物乳化剂的组成按质量比计为72％多糖和28％蛋白，该生物乳化剂对正己烷、柴油、二甲苯、十六烷、橄榄油和原油均有显著的乳化效果，乳化指数达到100％，是一种耐高温、耐盐和耐酸碱的高效乳化剂。

本发明提供的菌株A-2发酵液对高凝油有显著的乳化作用，能够将高凝油乳状液的凝固点由42℃降低到4℃，粘度由57mPa·s^-1降低到1.3mPa·s^-1；降粘率达到97.72％，降凝率达到90.48％。

本发明提供的菌株A-2发酵液(生物乳化剂)可应用于高凝油井的增产中，每口油井注入菌株A-2的发酵液2-4吨和乳化剂发酵培养基90方，具体应用方法如下：

方法一：反替菌株A-2的乳化剂发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，关闭油管阀门，注入2吨菌株A-2的发酵液，反挤菌株A-2的乳化剂发酵培养基75方，挤入排量0.5方/分钟，用15方清水顶替，顶替排量0.5方/分钟，关井7天后开井生产。或者，

方法二：反替菌株A-2的乳化剂发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，关闭油管阀门，注入2吨菌株A-2的发酵液，反挤菌株A-2的发酵培养基30方，挤入排量0.5方/分钟，用15方清水顶替，顶替排量0.5方/分钟，关井7天，反替菌株A-2的发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，再注入菌株A-2的发酵液2吨，排量1方/分钟，反挤菌株A-2的发酵培养基30方，挤入排量0.5方/分钟，关井7天后开井生产。其中A井生产时间为90天，与注入微生物发酵液前1个月数据对比，每天增油0.7吨，90天累计增油61.6吨，产量基本稳定；B井生产时间为90天，与注入微生物发酵液前1个月数据对比，每天增油1吨，90天累计增油100吨，效果显著。

本发明的优点和积极效果：

1、本发明提供的菌株A-2属于嗜热菌，又属于基因工程菌，可以有效利用乙酸钠、乙醇等廉价碳源来生产乳化剂，极大降低了生产成本，产量达3-4g/L，较原始菌株DM-2提高了6倍左右。

2、本发明提供的菌株A-2发酵液具有较好的乳化性能，可以广泛乳化各种烃类，耐受高温、高盐和广泛pH的极端环境，能够很好的应用在采油、生态修复等领域。

3、本发明提供的菌株A-2发酵液对高凝油有显著的乳化作用，最高可以将凝固点由42℃降低到4℃，将粘度由57mPa·s^-1降低到1.3mPa·s^-1，降粘率为97.72％。

4、本发明提供的菌株A-2发酵液对某高凝油区块A和B两口油井在100天增油达到160吨，显示出它对高凝油的开采有很大的潜力。

附图说明

图1是菌株A-2构建的过程。

图2是菌株A-2利用葡萄糖、乙酸钠、乙醇、十六烷、橄榄油分别为碳源发酵生物乳化剂的产量及乳化活性EI24情况。

图3是新型乳化剂酸水解后高效液相色谱的结果。A：单糖标准品1甘露糖，2鼠李糖，3葡萄糖，4半乳糖，5葡萄糖醛酸；B：乳化剂样品1甘露糖，2葡萄糖，3半乳糖，4葡萄糖醛酸。

图4是生物乳化剂对不同烃类的乳化活性。

图5是不同浓度下生物乳化剂的乳化活性。

图6是不同温度下生物乳化剂的乳化活性。

图7是不同盐度下生物乳化剂的乳化活性。

图8是不同pH条件下生物乳化剂在的乳化活性。

图9是生物乳化剂对高凝油的乳化效果。A：无乳化剂体系；B：乳化剂体系。

图10是乳化高凝油形成的乳状液的稳定性曲线。

图11是菌株A-2发酵液注入A油井前后增油效果分阶段解析图。

图12是菌株A-2发酵液注入A油井前后高凝油性质变化图。

图13是菌株A-2发酵液注入A油井前后微生物数量变化图。

图14是菌株A-2发酵液注入B油井前后增油效果分阶段解析图。

图15是菌株A-2发酵液注入B油井前后高凝油性质变化图。

图16是菌株A-2发酵液注入B油井前后微生物数量变化图。

具体实施方式

实施例1

本发明提供的菌株A-2的构建过程与效果验证。

1、表达载体的构建

根据嗜热地芽孢杆菌DM-2的糖基转移酶orf 5703完整基因簇序列，利用6.0软件设计上下游引物(见表1)，由北京华大基因合成引物并经PAGE纯化。利用表2所列的PCR反应体系和方法克隆1359bp目的基因片段，按照表3的反应体系和方法经SacI和PstI双酶切后，连接到同样经双酶切的来源于芽孢杆菌遗传物质保藏中心(BGSC)的pUCG18载体上，构建大小约为7663bp的表达载体pUCG18-GT，电转化至大肠杆菌DH5α中，提取质粒。

表1 实验所用引物

表2 PCR反应体系

注：X代表不同的温度，可进行温度梯度PCR，也可按照引物和模板的特异性设定；Y代表延伸时间。

表3 酶切体系及条件

2、菌株DM-2感受态细胞的制备

将-80℃冰箱保存的甘油管菌株DM-2在LB培养基平板上划线培养，待长出单菌落后，挑一个单菌落接入一支装有5mL LB培养基的试管中，60℃恒温摇床过夜，按照1％接种量转接至含有100mL感受态制备培养基的500mL三角瓶中，培养至OD₆₀₀为0.5左右。将菌液分装至预冷的50mL离心管，冰浴10分钟，7000r/分钟，4℃离心5分钟，收集菌体。加入适量的电转缓冲液，洗涤菌体细胞，7000rpm，4℃离心5分钟，收集菌体，重复该步骤2次。将菌体用2mL含14％PEG6000的电转缓冲液重悬，分装100μL/管，制成感受态细胞，-80℃冰箱保存备用。

3、质粒pUCG18-GT电转化菌株DM-2的方法

将表达质粒pUCG18-GT加入到新制备的DM-2感受态细胞中，每管加入1μL，冰上放置20分钟，在不同电压下进行电转实验后，加入800mL复苏培养基，60℃振荡培养3小时，复苏细胞。4℃，5000rpm离心3分钟，收集菌体，去除部分上清，将剩余菌液重悬菌体涂布加入含50μg/mL卡那抗生素的LB固体培养基，60℃培养2天。

4、工程菌株的验证方法

挑取在上述抗性平板上生长的单菌落到含50μg/mL卡那抗性的LB液体培养基中，60℃培养过夜，利用大肠杆菌的经典方法提取质粒DNA，按照表3的反应体系和方法经SacI和PstI双酶切后产生1359bp和6300bp两个DNA片段。此外，利用表1中的引物GtS1和GtS2和表2中的PCR条件进行PCR扩增，产生1359bp的目的产物。经验证正确的转化子命名为嗜热地芽孢杆菌A-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC No.10151)。

实施例2

本发明提供的菌株A-2利用5种不同碳源生产乳化剂的情况。

将保藏于甘油管中的菌株A-2活化，涂布LB平板，60℃培养过夜。挑取单菌落，接种到5mL的LB试管，60℃，200rpm，培养12h。再以1％的接种量接种到LB三角瓶中作为种子液，培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，即处于对数期内，5％接种到产乳化剂的发酵培养基中，60℃，200rpm，培养48h。

将发酵液于4℃，11000rpm，离心20分钟，收集沉淀，然后在上清液中添加3倍体积的预冷丙酮，冰箱放置过夜。再将其9000rpm，4℃，离心10分钟，收集沉淀，即粗乳化剂，用适量的蒸馏水溶解，4℃透析72h，冷冻干燥。称重。

所述发酵培养基组成为(g/L)：K₂HPO₄·3H₂O 4.8；KH₂PO₄1.5；(NH₄)₂SO₄1；柠檬酸三钠0.5；MgSO₄·7H₂O 0.2；酵母提取物0.1；CaCl₂·2H₂O 0.002；MnCl₂·4H₂O 0.0004；NiCl₂·6H₂O 0.0004；ZnSO₄·7H₂O 0.0004；FeCl₃·6H₂O 0.0002；NaMoO₄·2H₂O 0.0002；蒸馏水1000ml，其中碳源分别为葡萄糖、乙酸钠、乙醇、十六烷或橄榄油5类中的一种，各碳源添加量分别为0.5g/L。

由图2可知，菌株A-2可以利用廉价的碳源来进行乳化剂的生产，在乙酸钠为碳源时，产生的乳化剂产量可以达到4g/L，具有较好的乳化活性，该结果大大降低了乳化剂的生产成本。

将原始菌株DM-2用同样的方法进行发酵，其产生的生物乳化剂的产量仅为0.6-0.8g/L，由此可见，工程菌A-2的生物乳化剂产量提高了6倍左右。

实施例3

本发明提供的菌株A-2产生的生物乳化剂的组分分析。

1、糖组分定性

对实施例2中提取的乳化剂样品进行糖定性分析，检测样品中是否含有糖，具体实验如下：毛细管在硅胶板上点样，自然风干。在硅胶板上均匀展铺一薄层硫酸-蒽酮溶液，自然风干，放入105℃烘箱加热2分钟，显色。进一步采用苯酚-硫酸法检测样品中的总糖含量，用葡萄糖作为标准品制备标准曲线。称取样品10mg，蒸馏水定容至100mL，配制成0.1mg/mL的待测液，多次测定，计算糖含量平均值。接着将样品进行酸水解，进行糖组分的高效液相色谱分析，单糖衍生物的制备：称取10mg由实施例2提取的乳化剂样品冻干粉，2mol/L三氟乙酸，110℃水解4h，冷却至室温，反应混合物1000r/分钟离心5分钟，取上清液用0.3mol/L NaOH溶液中和，使其pH约为7.0。2mmol/L单糖标准品各50μL和水解液样品100μL，加入50μL 0.5mol/L的PMP甲醇溶液和0.3mol/L NaOH溶液，混匀；70℃水浴反应30分钟，取出，冷却10分钟，用50μL 0.3mol/L HCl中和；加入1mL氯仿萃取，充分震荡、离心，取上清，重复3次。取10μL进样。

色谱条件：柱温为室温；流速1.0mL/分钟；检测波长为250nm。

流动相包括溶剂A和溶剂B，其中溶剂A的组成如下：15％(V/V)乙腈+0.05mol/L磷酸缓冲液(KH₂PO₄-NaOH，pH6.9)。溶剂B的组成如下：40％(V/V)乙腈+0.05mol/L磷酸缓冲液(KH₂PO₄-NaOH，pH 6.9)。按照时间梯度为0→10分钟→30分钟，相应浓度梯度为0→8％→20％溶剂B的方式进行。

结果表明，实施例2提取的乳化剂样品含有总糖量为72.25％，单糖组分为葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。用面积归一法计算样品液相色谱图中各峰的面积比例，即得到各糖组分占总糖含量的质量百分比分别为31.9％、37.8％、28.0％和2.3％，见图3。

2、蛋白组分定性

首先利用考马斯亮蓝染色确定样品中蛋白的含量，以结晶牛血清白蛋白(BSA)作为标准品制备标准曲线。称取10mg实施例2提取的乳化剂样品，蒸馏水定容至10mL，制成1.0mg/mL的待测液，多次测定，计算蛋白质含量的平均值。结果表明，实施例2提取的乳化剂样品的蛋白含量为27.75％。

实施例4

本发明所述的菌株A-2所产生物乳化剂的乳化活性测定。

以0号柴油为乳化对象，在刻度试管中，将实施例2提取的乳化剂样品与柴油以1:1体积比混合，剧烈震荡2分钟，静置24h。乳化指数(Emusification index，EI-24)用乳化层的高度与测试烃的总高度之比，乘以100％来计算。如果EI-24大于等于50％，则说明乳状液是稳定的。结果表明该乳化剂对正己烷、柴油、二甲苯，十六烷，橄榄油和原油等都有很好的乳化作用，如图4所示。

实施例5

本发明所述的菌株A-2所产生物乳化剂的乳化稳定性检测。

将实施例2提取的乳化剂样品冻干粉制备成不同浓度的溶液，再分别按照实施例4的方法测定乳化指数，检测该乳化剂的稀释性能。结果如图5所示，该乳化剂浓度为0.25mg/mL时，对0#柴油的乳化能力可达78％，说明乳化剂有较强的乳化能力。

将在常温下形成的EI24为100％的乳状液，在不同温度4℃，30℃，60℃，80℃，100℃下放置24h后，计算乳化层的高度，测定乳化剂的温度敏感性。结果如图6所示，在不同温度4℃，30℃，60℃，80℃，100℃下放置24h后，EI24值分别为100％，100％，100％，87％，70％，均大于50％，表明该乳化剂的耐热性能良好。

将实施例2提取的乳化剂样品冻干粉制备成质量体积百分比浓度分别为5％，10％，15％，20％，25％，30％的NaCl溶液，使乳化剂浓度均为1.0mg/mL，测定EI24，判定乳化剂的耐盐度。结果如图7所示，在不同的NaCl浓度中，A2乳化活性物质可以耐受的最高盐浓度为25％，EI-24值为85％。

将实施例2提取的乳化剂样品冻干粉制成浓度为1.0mg/mL的溶液，分别用1M HCl和1M NaOH调节，使其pH从1至14，分别测定EI24。此外将pH1-14的测试管于常温下放置一段时间后，测定EI24值。结果如图8所示，在pH1-14范围内，该乳化剂的活性均可以达到100％，并且在常温条件下可以长时间的保持乳化活性，表明该乳化剂可以适应极端的酸性或者碱性环境。

实施例6

本发明所述的菌株A-2及其产生的生物乳化剂对高凝油的乳化作用。

按照实施例2的培养和发酵方法，将菌株A-2接种到乳化剂发酵培养基，60℃，105rpm/分钟，培养11h。冷却至常温，根据原油的状态，判定乳化剂发酵液对高凝油的乳化作用。用NDJ-79型旋转式粘度计测量高凝油的粘度，其中对照组的粘度值在50℃下测定，乳化后的粘度值在常温下测定。参照GB/T 510测定高凝油的凝点。

结果如图9所示，其中A是无乳化剂体系；B是乳化剂体系。可见在乳化剂体系中高凝油成分散的小块或小颗粒状，水相颜色比对照组的颜色加深，说明含有乳化剂的发酵液对高凝油有很好的乳化作用。

高凝油经发酵液乳化前后的粘度和凝固点的变化如表4所示。说明高凝油经菌株A-2发酵液作用后，其乳状液的凝固点和黏度大大降低，降凝率和降黏率分别达到90％和97％以上。

表4 高凝油经乳化剂乳化后粘度和凝固点的变化

实施例7

乳化剂对高凝油乳化作用的稳定性。

生物乳化剂与测试烃(0#柴油)作用形成乳状液，它在热力学上是不稳定的体系，有较大的自由能。乳化剂在乳状液中的作用是结合在小液滴表面，保护液体微粒，使液体微粒在布朗运动下发生碰撞时不易聚结，从而实现乳状液的稳定。通过分光光度计测定一种乳状液在不同时间中的OD值的变化情况，可以反映出该乳状液的稳定性，即可判断乳化活性物质的稳定性。

测定实施例6所得乳状液稳定性随时间的变化曲线(图10)，根据曲线可得时间和OD₅₅₀值的关系式y＝0.0021x+0.6844。根据曲线斜率的绝对值可判定乳状液的稳定性，斜率的绝对值越小乳状液稳定性越好。乳化剂的发酵液作用于高凝油形成的乳状液，所得的稳定性曲线斜率的绝对值为0.0021，可知该乳状液有很好的稳定性。

实施例8

本发明所述的菌株A-2及其产生的生物乳化剂在高凝油藏A油井的单井吞吐采油现场试验。

利用实施例2所述的方法得到菌株A-2的发酵液4吨，运输到采油井周围，打开A井油管和套管阀门，反替菌株A-2的发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，关闭油管阀门，注入2吨菌株A-2的发酵液，反挤菌株A-2的发酵培养基30方，挤入排量0.5方/分钟，用15方清水顶替，顶替排量0.5方/分钟，关井7天，反替菌株A-2的发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，再注入菌株A-2的发酵液2吨，排量1方/分钟，反挤菌株A-2的发酵培养基30方，挤入排量0.5方/分钟，关井7天后开井生产。

在一年内检测菌株A-2发酵液在注入油井前后油产量的变化。由图11可知A油井与注入菌株A-2前1个月对比，每天增油1吨，90天累计增油100吨，效果显著。

在一年内检测采出高凝油的性质变化。结果如图12所示，可见A井的粘度不断降低，但是凝固点没有变化。

在一年内检测采出液中菌株A-2和其它油藏微生物的生长情况，具体做法是：将采出液稀释10⁰、10²、10⁴和10⁵，分别取1mL均匀涂布在LB平板和含25μg/mL卡那霉素的LB平板上，选择长出10-100个菌落的平板进行计数，再乘以稀释倍数即得到菌浓度。LB平板上长出的是所有的微生物，含25μg/mL卡那霉素的LB平板上长出的是目的菌株。微生物跟踪监测结果见图13，开井后菌株A-2的浓度不高，经过15天的排液期后，菌株浓度不断升高，目前已经接近10⁷个/ml，证明已适应地层环境。

实施例9

本发明所述的菌株A-2及其产生的生物乳化剂在高凝油藏B油井的单井吞吐采油现场试验。

利用实施例2所述的方法得到菌株A-2的发酵液2吨，运输到采油井周围，打开B井油管和套管阀门，反替菌株A-2的发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，关闭油管阀门，注入2吨菌株A-2的发酵液，反挤菌株A-2的发酵培养基75方，挤入排量0.5方/分钟，用15方清水顶替，顶替排量0.5方/分钟，关井7天后开井生产。

在一年内检测菌株A-2发酵液在注入油井前后油产量的变化。结果如图14所示，注入后生产时间为90天，与注入微生物前1个月数据对比，每天增油0.7吨，90天累增油61.6吨，产量基本稳定。

在一年内检测采出高凝油的性质变化。结果如图15所示，B井的凝固点始终在下降，目前比注前已经下降4℃，粘度也随之发生较大变化。

在一年内检测采出液中菌株A-2和其它油藏微生物的生长情况，具体做法是：将采出液稀释10⁰、10²、10⁴和10⁵，分别取1mL均匀涂布在LB平板和含25μg/mL卡那霉素的LB平板上，选择长出10-100个菌落的平板进行计数，再乘以稀释倍数即得到菌浓度。LB平板上长出的是所有的微生物，含25μg/mL卡那霉素的LB平板上长出的是目的菌株。微生物跟踪监测结果见图16，B井注入菌浓度很快上升并保持在较高浓度，证明微生物已经在地层繁殖。

Claims

1.一株嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)A-2菌株，保藏号为CGMCC No.10151。

2.根据权利要求1所述的A-2菌株，其特征在于：是利用芽孢杆菌表达载体pUCG18，将嗜热地芽孢杆菌DM-2的糖基转移酶orf 5703在自身多拷贝表达而制成的基因工程菌。

3.一种生物乳化剂，其特征在于：该生物乳化剂由菌株A-2在45-70℃条件下利用葡萄糖、乙酸钠、乙醇、十六烷或橄榄油这5种不同类型的碳源中的一种发酵产生，产量可达3-4g/L；具体发酵条件如下：将保藏于甘油管中的菌株A-2活化，涂布LB平板，60℃培养过夜；挑取单菌落，接种到5mL的LB试管，60℃，200rpm，培养12h；再以1％的接种量接种到LB三角瓶中作为种子液，培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，即处于对数期内，5％接种到产乳化剂的发酵培养基中，60℃，200rpm，培养48h；

所述产乳化剂的发酵培养基配方以g/L计为：K₂HPO₄·3H₂O 4.8；KH₂PO₄1.5；(NH₄)₂SO₄1；柠檬酸三钠0.5；MgSO₄·7H₂O 0.2；酵母提取物0.1；CaCl₂·2H₂O 0.002；MnCl₂·4H₂O0.0004；NiCl₂·6H₂O 0.0004；ZnSO₄·7H₂O 0.0004；FeCl₃·6H₂O 0.0002；NaMoO₄·2H₂O 0.0002；蒸馏水1000ml，其中碳源分别为葡萄糖、乙酸钠、乙醇、十六烷或橄榄油5类中的一种，各碳源的添加量分别为5g/L。

4.根据权利要求3所述的生物乳化剂，其特征在于：所述的生物乳化剂的组成按质量比计为多糖72％和蛋白28％，对正己烷、柴油、二甲苯、十六烷、橄榄油和原油均有显著的乳化效果，乳化指数达到100％，是一种耐高温、耐盐和耐酸碱的高效乳化剂。

5.根据权利要求3所述的生物乳化剂，其特征在于：该生物乳化剂对高凝油有显著的乳化作用，能够将高凝油乳状液的凝固点由42℃降低到4℃，粘度由57mPa·s^-1降低到1.3mPa·s^-1；降粘率达到97.72％，降凝率达到90.48％。

6.一种权利要求3所述的生物乳化剂在高凝油井增产中的应用，其特征在于所述的应用方法包括；

方法一：反替菌株A-2的乳化剂发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，关闭油管阀门，注入2吨菌株A-2的发酵液，反挤菌株A-2的乳化剂发酵培养基75方，挤入排量0.5方/分钟，用15方清水顶替，顶替排量0.5方/分钟，关井7天后开井生产；或者，

方法二：反替菌株A‐2的乳化剂发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，关闭油管阀门，注入2吨菌株A‐2的发酵液，反挤菌株A‐2的发酵培养基30方，挤入排量0.5方/分钟，用15方清水顶替，顶替排量0.5方/分钟，关井7天，反替菌株A‐2的发酵培养基15方，排量0.5方/分钟，再注入菌株A‐2的发酵液2吨，排量1方/分钟，反挤菌株A‐2的发酵培养基30方，挤入排量0.5方/分钟，关井7天后开井生产。