CN106011011A - 一种空间氧化微杆菌lct-h6 - Google Patents

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Abstract

一种空间氧化微杆菌LCT‑H6，更具体的说是一种太空微生物，运用空间技术从“神舟九号”飞船返回舱内部的冷凝水分离获得。其特征：氧化微杆菌LCT‑H6是好氧的革兰阳性菌，与微杆菌Microbacterium maritypicum亲缘关系最为相近，对环氧树脂、酯类聚氨酯、醚类聚氨酯和硫化天然橡胶4种高分子材料具有腐蚀能力。在基因组学层面对该菌进行阐明，证实LCT‑H6的全基因组序列总长度为4.11Mbp，GC含量为67.75%，其蛋白被分类注释为22类COG家族，包含蛋白数目最多的COG为“能量产生和转化”、“氨基酸转运和代谢”、“糖转运和代谢”、“无机盐离子转运和代谢”、“翻译、核糖体结构和形成”。

Description

一种空间氧化微杆菌LCT-H6
技术领域
本发明属于微生物及生物技术领域，涉及一种新的微生物菌株氧化微杆菌LCT-H6以及其生物学特性、基因组DNA序列，利用生物信息学技术进行了组学分析，获得其在基因组的特性。
背景技术
随着人类空间探索活动的日益频繁，宇宙空间成为了人类活动的一个重要领域。太空密闭舱中存在着特定的微生物群落。虽然每一件物品都经过了严格消毒，微生物仍会随航天员身体、人体分泌物、航空部件等进入太空，并在航天器密闭舱室内形成特定微生物群落，既包括无害微生物，也包括一些致病性和腐蚀性微生物。“和平”号运行十余年来空间站内检测到234种微生物。太空密闭舱内的特殊环境因素，包括微重力、弱磁场和粒子辐射等，使得微生物会产生变异，导致它们对生存环境的要求很低，更加容易生长和繁殖，某些微生物的腐蚀性会增强。太空密闭舱中腐蚀性微生物的大量繁殖，使得各种航天材料逐渐产生腐蚀，加速航天器件的降解耗损，将可能导致空间站内的设备运行失灵，影响航天器的长期正常运行及其在轨使用寿命, 甚至对飞行安全也会造成很大威胁。航天器服役条件恶劣，在轨时间长，而维修条件相对不足，一旦发生微生物腐蚀设备故障，损失不可估量。国外载人航天器在轨经验和国内地面研究的初步结果表明，微生物会严重威胁航天设备安全。开展长期太空密闭舱中微生物对航天器材腐蚀的机理及防控措施研究，深化对载人航天器中微生物风险的认识和加强相关技术储备，探索更加有效的载人航天器微生物综合控制措施，为载人航天器的研制和运营提供技术支撑。
针对空间环境微生物材料腐蚀研究，目前尚无氧化微杆菌的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种空间氧化微杆菌LCT-H6。对空间菌株进行表型检测，然后对其进行全基因组测序，阐明该细菌的特性及用途。
本发明提供的菌株氧化微杆菌LCT-H6，其保藏号为CGMCC No.12574。
所述的氧化微杆菌LCT-H6，革兰阳性菌，与微杆菌Microbacterium maritypicum亲缘关系最为相近。对环氧树脂、酯类聚氨酯、醚类聚氨酯和硫化天然橡胶4种高分子材料具有腐蚀能力。
所述的氧化微杆菌LCT-H6，全基因组序列总长度为4.11Mbp，GC含量为67.75%，
其蛋白被分类注释为22类COG家族，包含蛋白数目最多的COG为“能量产生和转化”、“氨基酸转运和代谢”、“糖转运和代谢”、“无机盐离子转运和代谢”、“翻译、核糖体结构和形成”，以及其他。
附图说明
图1氧化微杆菌LCT-H6的革兰氏染色。
图2氧化微杆菌LCT-H6进化树。
图3氧化微杆菌LCT-H6在环氧树脂唯一碳源培养条件下增长曲线。
图4 氧化微杆菌LCT-H6对环氧树脂腐蚀的SEM观察。
图5氧化微杆菌LCT-H6在酯类聚氨酯唯一碳源培养条件下增长曲线。
图6 氧化微杆菌LCT-H6对酯类聚氨酯腐蚀的SEM观察。
图7氧化微杆菌LCT-H6在醚类聚氨酯唯一碳源培养条件下增长曲线。
图8 氧化微杆菌LCT-H6对醚类聚氨酯腐蚀的SEM观察。
图9氧化微杆菌LCT-H6在硫化天然橡胶唯一碳源培养条件下增长曲线。
图10 氧化微杆菌LCT-H6对硫化天然橡胶腐蚀的SEM观察。
图11氧化微杆菌LCT-H6在聚乙烯醇缩甲醛唯一碳源培养条件下增长曲线。
图12 氧化微杆菌LCT-H6对聚乙烯醇缩甲醛腐蚀的SEM观察。
图13 氧化微杆菌LCT-H6的COG功能分析。
具体实施方式
下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
一、氧化微杆菌LCT-H6的表型
1. 菌株来源：对“神舟九号”飞船返回舱内部的冷凝水进行了微生物的采集，选用细菌培养基对样品进行初筛，然后挑取菌落形态不同的单菌落进行划线培养，纯化到单一菌株后，使用生理盐水加80%甘油保藏菌种。菌株命名为氧化微杆菌LCT-H6，保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为 CGMCC No.12574。
2. 革兰氏染色：取50ul样品离心，弃上清，加入无菌水50ul，吸取20ul于载玻片上进行固定；初染，吸取革兰氏染色Ⅰ（结晶紫）2滴于载玻片样品上进行初染1min，然后用自来水冲洗染液；媒染，吸取革兰氏染色Ⅱ（碘液）2滴覆盖涂面染约1min，然后用自来水冲洗染液，用吸水纸吸取涂面上的水分；脱色，吸取革兰氏染色Ⅲ（酒精）2滴滴在涂面上约30s，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；复染，吸取革兰氏染色Ⅳ（番红）2滴滴在涂面上约1min，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；观察，先用显微镜低倍镜找到目标视野，然后再用油镜（100×）进行观察，判定并记录结果、拍照，见图1。氧化微杆菌LCT-H6为革兰氏阳性杆菌，菌体单个、成双或成串状排列。
3. 氧化微杆菌LCT-H6菌株16s rDNA鉴定：16S rDNA是16S rRNA序列的基因，长约1.5kb。将已分纯的单菌直接经菌液PCR扩增16S rDNA，部分通过菌液PCR较难扩增的单菌经扩大培养后提取基因组后扩增，扩增所用引物序列如下：
SgF： AGAGTTTGATCATGGCTCAG
SgR： TAGGGTTACCTTGTTACGACTT
16S rDNA PCR产物用96孔millpore纯化系统纯化后准确定量，经ABI 3730xl全自动序列分析仪测序，测序结果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析软件，将两向测序结果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的约1350bp（双向测序）即用于同源性分析。所得16SrDNA序列在Eztaxon server 2.1数据库中进行比对，确定菌株大致的分类地位。所有单菌16S序列全部导入seqman，输出single file（fasta）后，经Mega 5.0软件clusterW多重比对，输出meg文件重新导入构建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method为bootstrap参数设置为1000。16s rDNA鉴定结果显示LCT-H6与微杆菌Microbacteriummaritypicum相似性为99%（图2）。
4．腐蚀性实验：选择航天器已采用的5种高分子材料环氧树脂、酯类聚氨酯、醚类聚氨酯、硫化天然橡胶和聚乙烯醇聚缩醛为氧化微杆菌LCT-H6腐蚀特性研究对象。
分别以这5种高分子材料为唯一碳源对菌株LCT-H6进行培养，在不同时间点进行取样并测定培养液在600 nm波长下的吸光度（OD600），以判断细菌利用单一高分子材料作为唯一碳源的生长情况。具体操作如下：向100 mL无菌三角烧瓶中倒入40 mL无机盐基础培养基，每个培养瓶中加入10个高分子材料试样，接种5 mL菌悬液，透气膜封口，放入32℃，相对湿度为75%的恒温培养箱中。每株菌和每个材料准备3个平行样品。设置4个时间点：1、3、6、10周取样。测定各个时间点培养液600 nm波长下的吸光度，判断细菌利用高分子材料作为唯一碳源的生长情况。结果（图3、5、7、9）表明在1至10周内，以环氧树脂、酯类聚氨酯、醚类聚氨酯和硫化天然橡胶4种高分子材料为唯一碳源生长实验中，菌株LCT-H6 的OD600均大于对照菌株，具有明显的增长现象。以聚乙烯醇缩甲醛为唯一碳源生长实验中，菌株LCT-H6 的OD600与对照菌株相差较小，增长效果不明显（图11）。
高分子材料表面微生物膜和腐蚀形态SEM观察：将环氧树脂膜加工成尺寸为10mm（直径）×0.5mm（厚度）圆片；醚类聚氨酯、酯类聚氨酯泡沫和聚乙烯醇缩甲醛泡沫分别加工成10 mm（长）×10 mm（宽）×5mm（厚度）的小方块；硫化橡胶膜加工成尺寸为6mm（直径）×0.5mm（厚度）圆片；所有样品用丙酮浸泡1天，5% 乙醇/水溶液中15min灭菌，无菌水清洗至中性。将培养的菌株LCT-H6分别接种至5种高分子材料膜表面，在不同时间点对高分子材料膜表面用扫描电子显微镜（SEM）进行观察，如图4、6、8、10所示，1至10周内菌株LCT-H6能在环氧树脂、酯类聚氨酯、醚类聚氨酯和硫化天然橡胶4种高分子材料膜表面形成微生物膜，说明菌株LCT-H6具有降解和腐蚀这4种高分子材料的潜力。而在聚乙烯醇缩甲醛表面未形成微生物膜，说明菌株LCT-H6无腐蚀聚乙烯醇缩甲醛的潜力（图12）。
二、空间氧化微杆菌LCT-H6全基因组测序
培养氧化微杆菌LCT-H6并提取基因组DNA，首先采用超声法将检测合格的DNA样品随机打断，得到一系列DNA片段，经T4 DNA聚合酶、Klenow DNA 聚合酶和T4 多聚核苷酸激酶等处理后，回收目的片段，得到测序文库，利用Illumina的Genome Analyzer II测序；测序结束后得到的reads，经过滤处理后进行组装和分析。采用Glimmer3.0软件从组装结果中获得基因序列并将基因的序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。LCT-H6的全基因组序列总长度为4.11Mbp，GC含量为67.75%。其蛋白被分类注释为22类COG家族，包含蛋白数目最多的COG为“能量产生和转化”、“氨基酸转运和代谢”、“糖转运和代谢”、“无机盐离子转运和代谢”、“翻译、核糖体结构和形成”，以及其他（图13）。
本发明的特点和应用价值：本研究是我国第一次利用自己研发的空间技术获得对常用航天高分子材料具有腐蚀性的太空舱定植氧化微杆菌LCT-H6，为研究载人航天器微生物腐蚀提供了宝贵的样本。对该菌的进一步研究，将有助于深化对载人航天器中微生物风险的认识和加强相关技术储备，有助于探索更加有效的载人航天器微生物综合控制措施。
关于保藏的LCT-H6菌株说明
A. 菌种的保藏单位名称和地址
名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所
B. 交机构保藏的日期
2016年6月1日
C. 保藏机构给予的保藏号
CGMCC No.12574
D. 分类命名
氧化微杆菌 Microbacterium oxydans。

Claims (4)

1.一种空间氧化微杆菌LCT-H6，其特征在于：保藏号为CGMCC 12574。
2.根据权利要求1所述的氧化微杆菌LCT-H6，其特征在于：革兰阳性菌，微杆菌Microbacterium maritypicum亲缘关系最为相近；对环氧树脂、酯类聚氨酯、醚类聚氨酯和硫化天然橡胶4种高分子材料具有腐蚀能力。
3.根据权利要求1所述的氧化微杆菌LCT-H6，其特征在于： LCT-H6的全基因组序列总长度为4.11Mbp，GC含量为67.75%。
4.根据权利要求1所述的氧化微杆菌LCT-H6，其特征在于：其蛋白被分类注释为22类COG家族，包含蛋白数目最多的COG为“能量产生和转化”、“氨基酸转运和代谢”、“糖转运和代谢”、“无机盐离子转运和代谢”、“翻译、核糖体结构和形成”。
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