CN113699074A - 海藻微杆菌hyy-2及其降解有机污染物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海藻微杆菌HYY‑2及其降解有机污染物的应用，所述的应用是将海藻微杆菌HYY‑2经扩大培养获得的静息细胞加入pH＝6‑8、含有机污染物的无机盐培养液中，在25‑35℃、140‑180rpm条件下进行培养，实现有机污染物的降解。本发明海藻微杆菌HYY‑2能将乙酸丁酯完全降解为无机物和细胞生物质，实现完全矿化，且对于乙酸丁酯的去除浓度可从176.5‑1059mg/L。因此，该海藻微杆菌HYY‑2对于乙酸丁酯具有高效的降解能力，且能承受较高浓度的污染物。

Description

海藻微杆菌HYY-2及其降解有机污染物的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种海藻微杆菌HYY-2及其降解有机污染物的应用。
(二)背景技术
酯是酸(羧酸或无机含氧酸)与醇起反应生成的一类有机化合物。低级的酯是有香气的挥发性液体，高级的酯是蜡状固体或很稠的液体。几种高级的酯是脂肪的主要成分。酯难溶于水，易溶于乙醇等有机溶剂，其中低分子量的酯类是无色、易挥发的气体。低分子量的酯可用作溶剂，分子量较大的酯是良好的增塑剂。如甲基丙烯酸甲酯是制造有机玻璃(聚甲基丙烯酸甲酯)的单体；聚酯树脂主要用于纤维和油漆工业，也可制成压塑粉；许多带有支链的醇形成的酯是优良的润滑油。酯还用于香料、香精、化妆品、肥皂和药品等工业。小分子酯类经排放挥发进入大气环境后，对眼及呼吸道产生刺激作用，高浓度则会产生急性中毒。
乙酸丁酯是优良的有机溶剂，广泛用于硝化纤维清漆中，在人造革、织物及塑料加工过程中用作溶剂，在各种石油加工和制药过程中用作萃取剂，也用于香料复配及杏、香蕉、梨、菠萝等各种香味剂的成分。但乙酸丁酯对眼及上呼吸道均有强烈的刺激作用，有麻醉作用。吸入高浓度乙酸丁酯会出现流泪、咽痛、咳嗽、胸闷、气短等症状，严重者会出现心血管和神经系统的疾病，可引起结膜炎、角膜炎、角膜上皮有空泡形成。皮肤接触可引起皮肤干燥。
因此研究环境中乙酸丁酯的高效降解对人类健康很有必要，国内成卓韦等人利用霉菌研究过乙酸丁酯的生物降解，国外Duquesne等人研究的乙酸丁酯降解都取得了较好的成果，说明利用微生物降解乙酸丁酯是可行的研究方向。但之前的报道都利用真菌降解酯类化合物，存在降解速率慢、生物量增长慢等弊端。相反，利用细菌降解污染物无论是降解效果还是降解速率都优于真菌降解。本发明从环境中筛选到一株以乙酸丁酯为唯一碳源的高效降解细菌菌株，为处理含该类污染物的生物净化工程提供了有力支持。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种海藻微杆菌及其降解有机污染物的应用，有机污染物去除能力强，效率高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株降解有机污染物(特别是乙酸丁酯)的新菌株-海藻微杆菌(Microbacterium maritypicum)HYY-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:M 2021801，保藏日期：2021年06月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
本发明海藻微杆菌HYY-2的基本特征为：菌落浅黄色，边缘整齐，不透光，光滑湿润，易挑取。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌，无鞭毛，革兰氏染色阳性。
本发明还提供一种海藻微杆菌HYY-2在降解有机污染物中的应用，具体所述的应用是将海藻微杆菌HYY-2经扩大培养获得的静息细胞加入pH＝6-8、含有机污染物的无机盐培养液中，在25-35℃、140-180rpm(优选30℃、160rpm)条件下进行培养，实现有机污染物的降解。
进一步，所述有机污染物为乙酸丁酯或叔丁醇。
进一步，所述无机盐培养液中静息细胞加入量以菌体干重计为10-100mg/L，优选50mg/L。
进一步，所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为150-1500mg/L，优选176.5-1059mg/L。
进一步，所述无机盐培养液组成为：K2HPO4 0.942g/L、KH2PO4 0.234g/L、NaNO31.7g/L、NH4Cl 0.98g/L、MgCl2·6H2O 0.2033g/L、CaCl2·2H2O 0.0111g/L、FeCl3 0.0162g/L、微量元素5ml/L，溶剂为去离子水，pH 6-8；所述微量元素组成为：ZnCl2 0.088g/L、MnCl2·4H2O 0.060g/L、KI 0.01g/L、Na2MoO4·2H2O 0.1g/L、H3BO3 0.05g/L，溶剂为去离子水。
进一步，所述海藻微杆菌HYY-2静息细胞按如下步骤制备：
(1)斜面培养：
将海藻微杆菌HYY-2接种至LB固体培养基，在30℃培养箱培养，获得斜面菌体；LB固体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/LNaCl，10g/L蛋白胨，15-20g/L琼脂，pH自然，溶剂为去离子水；
(2)扩大培养
将步骤(1)斜面菌体接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养24h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得海藻微杆菌HYY-2静息细胞；LB液体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH自然，溶剂为去离子水。
与现有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明提供的海藻微杆菌(Microbacterium maritypicum)HYY-2取自污水厂污泥，对于乙酸丁酯具有较好地降解效果，可以较为完全地把污染物转化为CO2、H2O等无害物质。
本发明所述的海藻微杆菌HYY-2能将乙酸丁酯完全降解为无机物(CO2、H2O)和细胞生物质，实现完全矿化，且对于乙酸丁酯的去除浓度可从176.5-1059mg/L。因此，该海藻微杆菌HYY-2对于乙酸丁酯具有高效的降解能力，且能承受较高浓度的污染物。
与已有研究报道的真菌相比，海藻微杆菌为细菌，无论是降解效率还是降解速率，都优于真菌。
(四)附图说明
图1为菌株HYY-2在LB培养基上菌落形态照片。
图2为菌株HYY-2的透射电子显微镜照片。
图3为菌株HYY-2的系统发育树图。
图4为菌株HYY-2在24h内对不同乙酸丁酯的降解率。
图5为菌株HYY-2在18h内不同pH下对乙酸丁酯的降解率。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例所用培养基组成如下：
无机盐培养液组成为：K2HPO4 0.942g/L、KH2PO4 0.234g/L、NaNO3 1.7g/L、NH4Cl0.98g/L、MgCl2·6H2O 0.2033g/L、CaCl2·2H2O 0.0111g/L、FeCl3 0.0162g/L、微量元素5ml/L、pH 7，溶剂为去离子水；所述微量元素组成为：ZnCl2 0.088g/L、MnCl2·4H2O0.060g/L、KI 0.01g/L、Na2MoO4·2H2O 0.1g/L、H3BO3 0.05g/L，溶剂为去离子水。
LB固体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，18g/L琼脂，pH自然，溶剂为去离子水。
LB液体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH自然，溶剂为去离子水。
实施例1：海藻微杆菌(Microbacterium maritypicum)HYY-2的分离、纯化及其鉴定
1、菌株HYY-2的分离及纯化
菌株HYY-2是从活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阳性菌，具体步骤如下：
初筛：在300mL摇瓶中加入50mL无机盐培养液，并加入10mL杭州某污水处理厂的活性污泥和终浓度1059mg/L的乙酸丁酯，30℃进行富集培养，待乙酸丁酯浓度为初始浓度50％时，从中取出5mL富集液于50mL新鲜无机盐培养液中，加入相同量的乙酸丁酯(使其终浓度为1059mg/L)，重复上述富集过程5次。
复筛：将最后一次富集液梯度稀释涂布LB固体培养基，30℃培养2天，选择单菌落划线至分离平板，30℃培养2天进行纯化(图1)，将分离平板上的单菌落接种至新的分离平板，，30℃培养2-3天，得到目的菌株HYY-2，通过透射电子显微镜确定其形态(图2)。所述分离平板是在无机盐培养液中加入18g/L琼脂和终浓度1059mg/L的乙酸丁酯。
菌株HYY-2特征：菌落浅黄色，边缘整齐，不透光，光滑湿润，易挑取。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌，无鞭毛，大小为550×1067nm，革兰氏染色阳性。
2、菌株HYY-2的鉴定
通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定该菌株为Microbacteriummaritypicum，具体步骤如下：
采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取和菌株HYY-2的DNA，4℃保存。用细菌的通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)对纯化的DNA进行PCR扩增，PCR反应程序设定为94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30个周期，最后72℃修复延伸10min。将PCR产物纯化回收后进行测序(浙江天科高新技术发展有限公司)，16S rRNA测序结果(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)上传至NCBI，获得登录号MZ619079，同时将该序列同NCBI数据库中的基因序列进行Blast对比。发现其属于Microbacterium属，与Microbacterium phyllosphaerae strain P369 06、Microbacterium ginsengiterrae strain DCY37和Microbacterium luteolum strainDSM 20143具有99％的同源性。从结果中选取10株Microbacterium具有代表性的菌株，以16S rRNA基因序列同源性为基础，采用MEGA7.0软件构建系统发育树，如图3。
SEQ ID NO.1：
tcccttcgaggctcctcccaagggttaggccaccggcttcaggtgttaccgactttcatg 60
acttgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcagcgttgctgatctgc 120
gattactagcgactccgacttcatgaggtcgagttgcagacctcaatccgaactgggacc 180
ggctttttgggattcgctccacctcacggtattgcagccctttgtaccggccattgtagc 240
atgcgtgaagcccaagacataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccg 300
agttgaccccggcagtatcccatgagttcccaccattacgtgctggcaacatagaacgag 360
ggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatg 420
caccacctgtttacgagtgtccaaagagttgaccatttctggcccgttctcgtatatgtc 480
aagccttggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtgc 540
gggtccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggaact 600
taatgcgttagctgcgtcacggaatccgtggaatggaccccacaactagttcccaacgtt 660
tacggggtggactaccagggtatctaagcctgtttgctccccaccctttcgctcctcagc 720
gtcagttacggcccagagatctgccttcgccatcggtgttcctcctgatatctgcgcatt 780
ccaccgctacaccaggaattccaatctcccctaccgcactctagtctgcccgtacccact 840
gcaggccggaggttgagcctccggatttcacagcagacgcgacaaaccgcctacgagctc 900
tttacgcccaataattccggataacgcttgcgccctacgtattaccgcggctgctggcac 960
gtagttagccggcgctttttctgcaggtaccgtcactttcgcttcttccctgctaaaaga 1020
ggtttacaacccgaaggccgtcgtccctcacgcggcgttgctgcatcaggcttgcgccca 1080
ttgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagt 1140
gtggccggtcaccctctcaggccggctacccgtcgacgccttggtgagccattacctcac 1200
caacaagctgataggccgcgagcccatccccaaccgaaattctttccagacgcagaccat 1260
gcgatcacgtcacatatccagtattagacgccgtttccagcgcttatcccagagtcaggg 1320
gcaggttgctcacgtgttactcacccgttcgccactgatcccacagagcaagctccgtgt 1380
gcaccgttcgactg 1394。
菌株HYY-2对梅里埃CBC卡上41种碳源的利用能力：利用梅里埃全自动鉴定仪考察菌株对41中不同碳源的代谢情况(委托给浙江天科高新技术发展有限公司(原浙江省微生物研究所))。鉴定结果如表1所示。经梅里埃全自动鉴定仪VITEK生化反应，菌株HYY-2可较强利用23种碳源，对其他18种碳源不能利用。
表1菌株HYY-2梅里埃全自动鉴定仪VITEK生化反应结果(CBC卡)
Figure BDA0003242531840000061
表注：+，阳性反应；-：阴性反应
通过生理生化特征，遗传距离及16S rRNA序列对比，将菌株HYY-2鉴定为海藻微杆菌(Microbacterium maritypicum)，命名为海藻微杆菌(Microbacteriummaritypicum)HYY-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2021801，保藏日期2021年6月29日，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。
实施例2、海藻微杆菌HYY-2静息细胞的获得
1、斜面培养：
将海藻微杆菌CCTCC NO:M 2021801接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养2d，再将活化的细菌画线于固体LB平板，30℃培养箱培养24h，取单菌落继续平板画线以检测细菌的纯度，进行LB试管斜面常规(4℃)保存。
2、扩大培养
将步骤1斜面菌体接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养24h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得海藻微杆菌CCTCC M:2021801静息细胞。
实施例3：海藻微杆菌CCTCC NO:M 2021801对不同浓度乙酸丁酯的降解性能检测。
将无机盐培养液分装于体积均为330mL的摇瓶中，每瓶50mL，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到50mg/L(以细胞干重记)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入乙酸丁酯作为唯一碳源使其终浓度分别为176.5、353、529.5、706、882.5、1059mg/L，摇瓶密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。定时取摇瓶上方空气用气相色谱(GC)测定摇瓶中残留的乙酸丁酯浓度，绘制菌株24hh对于不同初始浓度乙酸丁酯的去除率曲线，结果见图4所示。结果表明，当乙酸丁酯浓度低于706mg/L时，海藻微杆菌CCTCC NO:M 2021801可以快速的降解所添加的底物。
利用Agilent 6890气相色谱仪(Agilent，美国)，配置HP-Innowax型毛细管柱(30m×0.32mm×0.5μm)，其余色谱条件设置如下：进样口的温度210℃；柱温90℃；检测器的温度(FID)200℃；氮气作为载气；气流流量1mL/min，分流比15:1；气体进样量0.8mL。
实施例4：海藻微杆菌CCTCC NO:M 2021801降解底物的广谱性
在实际应用中，不仅仅存在乙酸丁酯这一种有机污染物，工业废气中一般包含多种挥发性有机废气(如乙酸乙酯、叔丁醇、石油醚等)。因此，研究海藻微杆菌CCTCC NO:M2021801对其他底物的降解效果很有必要，同实施例3方法，将碳源改为初始浓度为50mg/L的乙酸乙酯、叔丁醇、丙烯酸甲酯、石油醚、甲基叔丁基醚、丙酮，其他操作同实施例3，降解效果如表2所示。
表2海藻微杆菌CCTCC NO:M 2021801对不同碳源的降解效果
Figure BDA0003242531840000071
Figure BDA0003242531840000081
表注：+，有降解效果；-：无降解效果
如表2所示：海藻微杆菌CCTCC NO:M 2021801对乙酸乙酯、叔丁醇具有降解效果；乙酸乙酯和叔丁醇溶于水，且溶解度相对较大，所以降解效果好。而对丙烯酸甲酯、石油醚、甲基叔丁基醚和丙酮无降解效果。
实施例5：海藻微杆菌CCTCC NO:M 2021801在不同pH下对乙酸丁酯的降解性能检测。
将pH分别为4、5、6、7、7.5、8.5、9.5的无机盐培养液分装于体积均为330mL的摇瓶中，每瓶50mL，110℃灭菌40min。灭菌结束后室温放置2d，确定无杂菌生长。加入终浓度达到30mg/L(以细胞干重记)实施例2方法获得的静息细胞，然后加入浓度为706mg/L的乙酸丁酯作为唯一碳源，摇瓶密封后，30℃，160rpm摇床培养，并做不加细菌的空白对照。同实施例3方法定时测定摇瓶中残留的乙酸丁酯浓度，绘制菌株不同pH下18h内对乙酸丁酯的去除率曲线，结果见图5所示。表明海藻微杆菌CCTCC NO:M 2021801降解乙酸丁酯最佳pH为8.5。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更改与润饰，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 海藻微杆菌HYY-2及其降解有机污染物的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> 海藻微杆菌(Microbacterium maritypicum)
<400> 1
tcccttcgag gctcctccca agggttaggc caccggcttc aggtgttacc gactttcatg 60
acttgacggg cggtgtgtac aagacccggg aacgtattca ccgcagcgtt gctgatctgc 120
gattactagc gactccgact tcatgaggtc gagttgcaga cctcaatccg aactgggacc 180
ggctttttgg gattcgctcc acctcacggt attgcagccc tttgtaccgg ccattgtagc 240
atgcgtgaag cccaagacat aaggggcatg atgatttgac gtcatcccca ccttcctccg 300
agttgacccc ggcagtatcc catgagttcc caccattacg tgctggcaac atagaacgag 360
ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg 420
caccacctgt ttacgagtgt ccaaagagtt gaccatttct ggcccgttct cgtatatgtc 480
aagccttggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaatcc gcatgctccg ccgcttgtgc 540
gggtccccgt caattccttt gagttttagc cttgcggccg tactccccag gcggggaact 600
taatgcgtta gctgcgtcac ggaatccgtg gaatggaccc cacaactagt tcccaacgtt 660
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gcaggccgga ggttgagcct ccggatttca cagcagacgc gacaaaccgc ctacgagctc 900
tttacgccca ataattccgg ataacgcttg cgccctacgt attaccgcgg ctgctggcac 960
gtagttagcc ggcgcttttt ctgcaggtac cgtcactttc gcttcttccc tgctaaaaga 1020
ggtttacaac ccgaaggccg tcgtccctca cgcggcgttg ctgcatcagg cttgcgccca 1080
ttgtgcaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt 1140
gtggccggtc accctctcag gccggctacc cgtcgacgcc ttggtgagcc attacctcac 1200
caacaagctg ataggccgcg agcccatccc caaccgaaat tctttccaga cgcagaccat 1260
gcgatcacgt cacatatcca gtattagacg ccgtttccag cgcttatccc agagtcaggg 1320
gcaggttgct cacgtgttac tcacccgttc gccactgatc ccacagagca agctccgtgt 1380
gcaccgttcg actg 1394

Claims (8)

1.海藻微杆菌(Microbacterium maritypicum)HYY-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2021801，保藏日期：2021年06月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
2.一种权利要求1所述海藻微杆菌HYY-2在降解有机污染物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是将海藻微杆菌HYY-2经扩大培养获得的静息细胞加入pH＝6-8、含有机污染物的无机盐培养液中，在25-35℃、140-180rpm条件下进行培养，实现有机污染物的降解。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述有机污染物为乙酸丁酯或叔丁醇。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无机盐培养液中静息细胞加入量以菌体干重计为10-100mg/L。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无机盐培养液中有机污染物的初始浓度为150-1500mg/L。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述无机盐培养液组成为：K2HPO4 0.942g/L、KH2PO4 0.234g/L、NaNO3 1.7g/L、NH4Cl 0.98g/L、MgCl2·6H2O 0.2033g/L、CaCl2·2H2O0.0111g/L、FeCl3 0.0162g/L、微量元素5ml/L，溶剂为去离子水，pH 6-8；所述微量元素组成为：ZnCl2 0.088g/L、MnCl2·4H2O 0.060g/L、KI 0.01g/L、Na2MoO4·2H2O 0.1g/L、H3BO30.05g/L，溶剂为去离子水。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述海藻微杆菌HYY-2静息细胞按如下步骤制备：
(1)斜面培养：
将海藻微杆菌HYY-2接种至LB固体培养基，在30℃培养箱培养，获得斜面菌体；LB固体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，15-20g/L琼脂，pH自然，溶剂为去离子水；
(2)扩大培养
将步骤(1)斜面菌体接种至LB液体培养基中，在30℃，160rpm下培养24h，获得扩大培养液，离心，收集湿菌体，无机盐培养液洗涤，获得海藻微杆菌HYY-2静息细胞；LB液体培养基组成：5g/L酵母膏，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH自然，溶剂为去离子水。
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