CN105018390A - 一种红平红球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效解烃的红平红球菌HL-6及其用途。本发明红球菌是由新疆油田石油污染土壤中分离得到，生长温度10-37℃，最适15-25℃，生长pH范围5-10，氯化钠耐受性0-5％；可以烷烃或柴油为唯一碳源生长。该菌具有很高的降解石油烃的能力，可降解C11-C36的正构烷烃和柴油。对柴油具有很好的耐受度，在30％的高柴油浓度下仍然可以生长，OD600可以达到1.25，乳化活性为44％。对加入0.5％的柴油，72h后降解率达到78.5％。菌株在亲水性和疏水性基质中均能产生生物表面活性剂，并且对饱和烷烃和芳香族化合物都具有很好的乳化效果。

Description

一种红平红球菌及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一种红平红球菌及其应用。

背景技术

随着海上石油开发和油轮事故的频发，海上石油污染日益严重，直接影响了海洋养殖和捕捞业的发展。溢油事故发生后，经物理方法(如机械回收等)可清除部分表面溢油，剩余的溢油在风、浪、流的作用下，会漂移至滩涂。石油中难降解的芳烃组分(致癌物质)长期滞留在滩涂土壤环境中，对滩涂生态系统及人体健康造成巨大的持久性损害。微生物治理技术是国际上公认的高效修复石油污染的新技术，基于微生物能适应各种复杂的生态环境(如海洋滩涂)，其繁殖代谢能力极强，能快速降解石油中各种有毒物质，而且具有价格低廉、自然环保、对人畜无害等诸多优势。

自然界中微生物降解原油的过程十分复杂，受到很多种因素的影响，例如原油的不同成分被微生物降解的难易程度不同，还有原油风化程度、温度、环境含氧水平、营养物质、pH和盐度等都是影响石油生物降解的重要条件。没有一种微生物有能力降解原油里的所有成分，环境中众多微生物的共代谢作用导致了原油的降解。对环境微生物生存与代谢机理的研究是生物修复技术的基础，是目前各国都面临的技术方法之外更深层次的问题。

在优化现有技术方面针对生物添加法的研究有两个有价值的发展趋势：一是针对微生物降解能力不足的生态系统，加入外源微生物做补充；二是针对土著微生物不能降解的原油类型或重要的石油成分，选择或改造优良性能的降解微生物，其中又以后者更具技术潜力，尤其面对一些特殊环境，如海洋滩涂高盐、海浪冲刷频繁、菌体难以附着的问题，筛选高效耐盐烃降解菌株、微生物降解机理研究、缓释营养剂和更多疏水固定化载体的研究，有利于海洋滩涂溢油生物修复技术的发展和工业化应用。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种红平红球菌及其应用，以解决现有技术微生物石油烃类降解能力较低的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是提升微生物耐高盐环境的能力。

本发明解决的再一技术问题是提供上述微生物在海洋石油污染中的应用。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)，其保藏编号为CGMCCNO.10975。

上述红平红球菌用于降解石油的应用。

优选的，所述石油是柴油。

优选的，所述石油是正烷烃化合物。

优选的，所述石油是芳香族化合物。

优选的，所述降解是在15～25℃条件下进行的。

优选的，所述降解是在pH为5～10的环境中进行的。

优选的，所述降解是在NaCl质量浓度不超过5％的环境中进行的。

优选的，所述应用是将红平红球菌制备成为固化吸附菌剂后利用所述固化吸附菌剂降解石油，所述固化吸附菌剂是利用以下方法制备的：

1)取红平红球菌，培养获得菌体浓度为10⁸～10¹⁰个/mL的菌液；

2)取步骤1)所述菌液，向其中添加100～1000g/L沸石，充分混合，静置0.5～24h，即得到所述固化吸附菌剂。

优选的，步骤1)用于培养红平红球菌的培养基，每升该培养基包括以下成分：KH₂PO₄3.5g，Na₂HPO₄1.5g，MgSO₄0.7g，(NH4)₂SO₄4g，酵母粉0.01g。

本发明提供的红平红球菌，又可称之为HL-6菌株，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC NO.10975，建议分类命名为红球菌(Rhodococcus erythoropolis)。

本发明提供的红平红球菌HL-6菌株，是从新疆油田石油污染土样中分离得到。以柴油为唯一碳源的无机盐培养基中在25℃反复驯化培养十代而获得。

红平红球菌HL-6的菌落特征：在LB平板上培养菌落大小直径3-5mm，菌落圆形，较粘稠，不透明，凸起，有光泽，橙色。细胞形态特征：革兰氏染色阳性，菌体呈短杆状，不运动，具有典型的八字型排列特征，细胞大小为0.8-1.0μm×2-3μm。

红平红球菌HL-6的生理生化特征：生长温度10-37℃，最适15-25℃，生长pH范围5-10，NaCl耐受性0-5％。接触酶，硝酸盐还原，脲酶，七叶灵水解，吲哚，2,3-丁二醇，天冬氨酸实验均为阳性，氧化酶，M.R.，V-P，亚硝酸盐还原，反硝化，明胶液化，淀粉水解，腺嘌呤水解实验均为阴性，能够利用甘露醇，肌醇产酸。降解烷烃和柴油，产生生物乳化剂。

红平红球菌HL-6的16s rRNA基因序列特征：菌株接种于LB培养基，25℃摇床培养(200rpm)12小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正向引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，用这对引物对其16s rRNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送北京三博公司进行测序。PCR条件为：94℃,10min；94℃，45s，55℃,45s，72℃，90s，30个循环；72℃，10min，4℃保存。16s rRNA基因序列长度为1513bp，在GenBank中的登录号为JQ839141，与Rhodococcuserythoropolis(GenBank accession No.AY822047)序列相似性为99.6％。其16srRNA的基因序列如序列表所示。

参照《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》(9th Edition,1994)的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rDNA基因序列在GenBank中的搜索结果，经多项分类鉴定HL-6为红平红球菌。

红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)HL-6可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以烷烃或柴油为碳源生长。菌株在10～37℃之间均可生长。

该菌具有很高的降解石油烃的能力，可降解C11～C36的正构烷烃和柴油。用HL-6生长细胞进行降解实验结果表明，该菌在25℃温度条件下，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入的lg/L的烷烃或5g/L的柴油，其基础培养基pH7.0-7.2。往复摇床200rpm转速培养72h，降解率均可达70％以上，对不同碳数的烷烃降解率有较好的降解效果，如图1,2所示。

本发明同时提供了一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修复固化吸附菌剂制备方法，具体过程是：

第1、选取适合降解污染区域原油的微生物菌种；

第2、经斜面培养、摇瓶种子发酵获得菌浓为10⁸～10¹⁰个/mL的发酵菌液；

第3、向第2步的发酵菌液中添加100-1000g/L多孔介质沸石，充分混合，静置0.5-24h，制得菌体吸附率≥90％的固化吸附菌剂。

本发明固化吸附菌剂在室内模拟中表现出很好的应用潜力，使用沸石作为固体吸附材料有利于长期持菌，并降解石油烃，因此可用于滩涂和海底现场石油污染的生物修复领域。

本发明的优点和积极效果：

本发明涉及的一种红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)HL-6可产生一种新型的糖脂类的生物表面活性剂，对柴油、饱和烷烃和芳香族化合物都具有很好的乳化效果，能够提高烷烃和柴油在水中的溶解度，明显促进活性菌株对烷烃和柴油的降解；同时提供了一种利用沸石作为载体吸附石油烃高效降解菌剂及其营养剂的方法，能延长石油烃高效降解菌的滞留时间，明显提高目标菌的存活率，扩大了修复菌剂的应用范围，因此具有海洋滩涂石油污染生物修复的潜力。

附图说明

图1是红平红球菌HL-6(CGMCC NO.10975)对各链长单烷烃的降解效果；

图2是红平红球菌HL-6(CGMCC NO.10975)对柴油降解的气相色谱图(作用前)；

图3是红平红球菌HL-6(CGMCC NO.10975)对柴油降解的气相色谱图(作用后)；

图4是红平红球菌HL-6(CGMCC NO.10975)所产乳化剂对柴油的乳化指数EI-24(A:HL-6培养液；B:大肠杆菌K12培养液)

图5是红平红球菌HL-6(CGMCC NO.10975)所产乳化剂对不同底物的乳化指数EI-24

图6是柴油浓度对生物量和乳化活性的影响

图7是NaCl浓度对生物量、降解率和乳化活性的影响

图8是pH对生物量和乳化活性的影响

图9是温度对乳化活性的影响

图10是HL-6菌株在不同底物中生长的扫描电镜照片(A:LB；B:柴油)

图11是不同基质对生物量和乳化活性的影响

图12是不同基质对表面张力的影响

图13是固体菌剂的SEM照片

图14是固体菌剂与液体接种对比实验

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例l：本发明提供的红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)HL-6菌株的筛选。

取新疆油田被石油污染的土壤1g于100mL以0.5％柴油为唯一碳源的无机盐培养基中，置于200r/min恒温摇床25℃富集培养72h。取2mL富集菌液移至新的100mL无机盐培养基中，培养方法同上。经过三个周期富集后最终得到主体菌HL-6。将HL-6取一环接入装有5mL LB培养液的试管内，25℃震荡培养48h，作为种子液。按2％接种量接入装有30mL无机盐培养基的100mL三角瓶中，25℃震荡培养72h，用正己烷萃取，气相色谱(GC)检测对柴油的降解情况。并通过测量乳化指数(EI-24)来验证对柴油乳化能力的强弱，最终得到一株乳化及降解柴油效果最好的菌株红平红球菌(Rhodococcus erythoropolis)HL-6。

其中无机盐培养基组成g/L：KH₂PO₄3.5，Na₂H PO₄1.5，MgSO₄0.7，(NH₄)₂SO₄4，酵母粉

0.01，pH 7.2。蒸馏水，1000ml，121℃灭菌30min。在25℃条件下，培养3天。

乳化指数(EI-24)的测定方法如下：取4个刻度试管，分别及加入柴油、原油、二甲苯和甲苯各4ml，每个试管中再加入6ml的发酵液，剧烈振荡1分钟，室温静置24小时后测量，以乳化层的高度除以有机相的总高度，再乘100％，即EI-24，如果EI-24>50％，则认为该乳状液是稳定的。

实施例2：本发明提供的红平红球菌Rhodococcus erythoropolis HL-6菌株的形态特征和生理生化特征。

参照《Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology》(Vol.Ⅷ)的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，生长pH范围，NaCI耐受性。触酶，硝酸盐还原，脲酶，七叶灵水解，2,3-丁二醇，天冬氨酸，氧化酶，M.R.，V-P，吲哚，亚硝酸盐逐原，反硝化，明胶液化，淀粉水解，腺嘌呤水解实验以及利用甘露醇，肌醇实验。

结果表明，该菌株革兰氏染色阳性，菌体呈短杆状，无鞭毛，不运动，好氧，不产生芽孢，细胞大小2.0-3.0μm(长)×0.8-1μm(宽)，具有典型的八字形排列。生长温度10-37℃，生长pH范围5-10，NaCI耐受性0-5％。接触酶，硝酸盐还原，脲酶，七叶灵水解，2,3-丁二醇，天冬氨酸实验均为阳性，氧化酶，M.R.，V-P，吲哚，亚硝酸盐还原，反硝化，明胶液化，淀粉水解，腺嘌呤水解实验皆为阴性，能够利用甘露醇，肌醇产酸。

实施例3：本发明提供的红平红球菌Rhodococcus erythoropolis HL-6菌株的16SrRNA基因的PCR扩增和序列测定。

将该菌株接种于LB培养基，25℃摇床培养(200rpm)10小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用正相引物27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，用这对引物对其16S rDNA墓因进行PCR扩增，将扩增引物送北京奥科公司进行测序。PCR条件为：94℃，10min；94℃，45s，55℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃10min，4℃保存。16S rRNA基因序列长度为1470bp，在GenBank中的登录号为JQ839141，Rhodococcuserythropolis EPWF 16S rDNA(GenBank accession No.AY822047)的相似值最高，为99.6％。其16S rRNA基因的序列如序列表所示。

实施例4:本发明提供的Rhodococcus erythoropolis HL-6菌株在25℃对烷烃和柴油的降解。

将菌株在LB平板上进行活化，取单菌落接入30ml以乙醇为唯一碳源的无机盐液体培养基中，25℃振荡培养24h至对数生长期，以2％接种量接种至装有30ml含有不同烷烃或柴油为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)的三角瓶中，25℃培养3天，用气相色谱法分析，该菌株对不同碳数烷烃及柴油的降解率，结果如图1，图2和图3所示。该菌株对C11～C36烷烃的降解率均有一定程度的降解，对柴油(0.5％)的降解率可达78.5％。

气相色谱法使用角鲨烷作为内标。具体方法如下：

将菌株培养后的培养液或者对照样品，加入适量正己烷，完全密闭条件下充分振荡混匀萃取，静置分层后取出大部分有机相，再向混合体系中加入正己烷进行二次萃取，重复萃取3次，萃取的有机相合并在一起加入角鲨烷至终浓度为0.006％(w/v)作内标，定溶至所需体积后用Agilent6820气相色谱仪系统进行分析，色谱柱为SPB^TM-5capillary column(30m×0.53mm i.d.，1.5μm thickness)(Supelco)。色谱程序如下：

进样口：280℃；

柱温：150℃，5min，15℃/min程序升温至280℃，停留30min；

检测器(FID)温度：350℃；

载气(N₂)：35mL/min；

空气：400mL/min；

氢气(H₂)：30mL/min；

尾吹(N₂)：20mL/min。

根据未接菌对照和降解后残余峰面积与加入的角鲨烷内标峰面积的比值来表征底物的降解情况，

实施例5：本发明提供的Rhodococcus erythoropolis HL-6菌株发酵液在25℃条件下对不同链长烷烃和芳香烃的乳化能力。

Rhodococcus erythoropolis HL-6菌株在以乙醇为碳源的培养基中(同实施例4)生长，25℃振荡培养3天，用其发酵液对柴油和不同底物进行乳化活性分析，如图4所示，以乙醇为碳源生长，该菌发酵液能很好的乳化柴油，EI-24为100％。如图5所示，该菌在以包括正己烷、正十四烷、正十六烷、苯、甲苯及二甲苯作为底物进行乳化性能实验，结果显示乳化剂对低碳数烷烃和芳香烃的乳化效果比中长键烷烃效果好。对正构烷烃和芳香烃均有良好的乳化效果。

实施例6：Rhodococcus erythoropolis HL-6对烃类的乳化效果。

考察菌株对于柴油的耐受性,当柴油浓度为5％-30％(V/V)时,菌株HL-6均生长良好,在30％的高柴油浓度下培养72h,选取OD600进行生物量测定,测定值为1.25,乳化活性达到44％(图6)。说明菌株对柴油的耐受能力较强,可以应用于较重污染的海洋滩涂土壤的生物治理。在培养基中添加NaCl来考察菌株的耐受性,当浓度为0-5％(W/V)时,菌株HL-6对柴油均表现出较好的乳化活性,在2％NaCl浓度时乳化活性最高,达到91.82％,在5％的NaCl浓度时仍然有超过40％的乳化活性；柴油降解率也在2％NaCl浓度时最高,达到82.39％,在5％的NaCl浓度时仍然有超过50％的柴油降解率,说明菌株适宜应用于海洋滩涂的高盐环境(图7)。调节培养基pH来考察菌株对酸碱的耐受性,菌株HL-6在pH 6-9环境下均具有较好的生物量和乳化性能,随着pH的升高,生物量和乳化活性稍有一定增高。但是在pH为5的条件下没有生物量和乳化活性,实验结果如图8所示。说明菌株对偏碱性土壤比较适应。据相关报道,天津滨海滩涂土壤pH在7.92-8.24之间,属于偏碱性的土壤。所以HL-6菌株能够很好地适应沿海滩涂土壤的酸碱度。将HL-6菌株培养液与柴油混合,分别置于4℃、15℃、25℃、37℃、55℃和100℃处理24h,取出将混合液涡旋振荡2min后再分别置于各自恒温温度,静置24h后测定不同温度下乳化液的乳化活性。结果如图9所示,在4℃、15℃、25℃、37℃、55℃温度下,菌株HL-6培养液均显示出良好的乳化性能,乳化活性均能达到100％；而当处理温度为100℃时,乳化活性只有35％。因为海洋滩涂土壤温度不会超过55℃,所以说明菌株HL-6可以应用于海洋滩涂土壤石油污染的生物修复。

实施例7：菌体细胞SEM检测。

分别将LB和柴油为唯一基质培养的培养液离心取菌体,用无菌水洗掉残留的培养基成分,进行扫描电镜观察,结果见图4,结果显示,在LB培养基中生长的菌体表面比较干净,未发现太多的分泌物(图10A)；在烃降解培养基中生长的菌体表面则分泌了很多的粘性物质,成丝状粘附在细胞表面(图10B),这可能是疏水性底物所诱导产生、分泌的胞外产物,即表面活性剂类物质。电镜结果再次证明菌株HL-6可以通过分泌胞外产物来乳化烃类物质。

实施例8：不同基质对菌体生长和产表面活性剂的影响。

产表面活性剂的微生物大致可分为3类:一类是严格以烷烃作为基质的微生物,如Corynebacterium sp.；一类是利用水溶性基质的微生物,如Bacillus sp.；另一类可以利用烷烃和水溶性基质两者的微生物,如Pesudomonas sp.。选择亲水和疏水的不同种基质进行实验,考察菌株HL-6在不同种基质中生长情况和产表活剂情况。结果见表1,图11、12所示,可以看出在疏水性基质液蜡或者柴油中,培养液表面张力降低幅度明显大于亲水性基质,由初始的62.487mN/m降到30mN/m左右,说明菌体在疏水性基质中为了能够更好的接触到底物会分泌表活剂降低培养液表面张力；菌体细胞粘附性也体现出了相似的规律性,在疏水性基质中明显优于亲水性基质；生物量则在一些易于被细菌利用的亲水性糖类基质中更高；而乳化活性则在疏水性和某些亲水性基质中都有较好的效果。说明烃降解菌HL-6在亲水性和疏水性基质中都能产生生物表面活性剂。

表1不同基质对菌体细胞粘附性的影响

实施例9：固体微生物菌剂SEM检测。

对空白沸石和HL-6吸附后的固体微生物菌剂样品进行了SEM的检测，如图13所示，可以明显看到吸附在沸石上的HL-6菌体，并且菌体密度较大，说明使用沸石作为载体进行菌体吸附制备固体微生物菌剂是可行的。

实施例10：固体菌剂与液体接种降解柴油效果对比实验

取同等菌浓的乙醇培养种子液与沸石吸附的固体微生物菌剂进行柴油降解效果对比实验，通过无机盐培养基中培养7d，定时取样，使用M-22A红外测油仪测定柴油降解率。实验结果见图14，可见使用液体种子液接种，在前三天降解率就达到70％以上，继续培养降解率增长缓慢，到7d时降解率达到82.8％；使用固体微生物菌剂进行柴油降解实验，可以看到在前三天降解率很低，这可能是由于固体沸石影响了菌体与培养基中柴油的接触，但是三天之后降解率开始较快上升，培养7d后降解率可以达到74.6％。说明固体微生物菌剂虽然降解时间较液体接种要长，但是培养7d后降解效果也比较理想，这也证明了使用固体微生物菌剂进行石油污染的生物修复具有较好的应用价值。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种红平红球菌，其保藏编号为CGMCC NO.10975。

2.权利要求1所述红平红球菌用于降解石油的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述石油是柴油。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述石油是正烷烃化合物。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述石油是芳香族化合物。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解，是在15～25℃条件下进行的。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解，是在pH为5～10的环境中进行的。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解，是在NaCl质量浓度不超过5％的环境中进行的。

9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于是将红平红球菌制备成为固化吸附菌剂后利用所述固化吸附菌剂降解石油，所述固化吸附菌剂是利用以下方法制备的：

1)取红平红球菌，培养获得菌体浓度为10⁸～10¹⁰个/mL的菌液；

2)取步骤1)所述菌液，向其中添加100～1000g/L沸石，充分混合，静置0.5～24h，即得到所述固化吸附菌剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于步骤1)用于培养红平红球菌的培养基，每升该培养基包括以下成分：KH₂PO₄ 3.5g，Na₂HPO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.7g，(NH4)₂SO₄ 4g，酵母粉0.01g。