CN108823142A - 一种以含萘雨水为底物的降解菌的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开来了一种以含萘雨水为底物的降解菌的筛选方法：(1)采用逐步提高萘浓度的方法对以含萘雨水为底物的活性污泥进行梯度驯化：(2)取驯化的活性污泥稀释102～105倍，涂布于固体培养基上，置于恒温培养箱中培养1～4天，挑取数量最多的菌落，划线分离纯化；(3)挑取直径为4mm范围内纯化优势菌落或单菌落置于250mL液体培养基中富集培养3天，得到以含萘雨水为唯一碳源的降解菌株。本发明根据污水处理厂剩余污泥中富含降解菌的特点，以驯化替代初期富集培养，既节省了分筛培养的过程，简化了筛选流程，同时也显著降低了降解菌的筛选成本，为开发多环芳烃污染处理用微生物资源提供了新途径。

Description

一种以含萘雨水为底物的降解菌的筛选方法
技术领域
本发明是关于城区雨水处理的，尤其涉及一种从活性污泥中筛选含萘雨水为底物的一种降解菌的方法。
背景技术
城区雨水污染主要是由于屋面径流、路面径流、城市绿地、以及降雨时冲刷大气中的污染物引起的。雨水中以多环芳烃以为主，其含量往往高于国家规定的安全标准，因而在一些缺水地区，雨水中多环芳烃的去除对于雨水的回用尤为必要。多环芳烃被吸入人体后，可以致癌、致畸和致突变性。如果水体中含有大量的多环芳烃，会造成水域生物中毒死亡，会破坏水域生态系统。多环芳烃的摄入还与艾滋病及其它癌症的发病机制有着紧密的联系。多环芳烃不仅在外界环境中存在，还可以迁移、转化进入植物体内并大量富集，严重影响农产品质量，从而危害人类健康。多环芳烃在水中的溶度解与多环芳烃的苯环数成反比，因此城区雨水中低环萘的含量较高，萘在250C下溶解度为30mg/L，易溶于乙醇、醚和苯，具有半挥发性，高浓度会导致人体溶血性贫血及肝、肾损害。美国环保局在20世纪80年代已将16种不带分支的PAHs(多环芳烃)列入优先污染物名单中，我国也将其列入环境污染物的黑名单中。可见，国内外学者对雨水中多环芳烃的关注，逐渐成为研究的热点。
目前对于萘的降解有物理法，化学法、植物法和生物法，但最常用的是生物法，微生物修复技术能有效的去除污染土壤中的含苯环少的PAHs，具有环保高效廉价的特点。微生物降解萘主要有两种方式，一是以萘为唯一碳源，二是萘与其他有机质进行共代谢。许多研究都是从受多环芳烃污染的土壤中筛选萘的降解菌，迄今为止，学者们已经分离出几种典型可以降解萘的细菌，主要有反硝化产碱菌(Alcaligenes denitrificans)、分支杆菌(Mycobacterium sp.)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、黄杆菌、泡馕假单胞菌(Pseudomonas vesicularis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、红球菌(Rhodococcus sp.)和莫拉氏菌(Moraxella sp.)等。。本发明为从活性污泥中快速筛选含萘雨水降解菌，为开发多环芳烃污染处理用微生物资源提供新途径，促进雨水的高质量回用
发明内容
本发明的目的，是在现有技术的基础上，为开发多环芳烃污染处理用微生物资源提供新的途径，提供一种从活性污泥中快速筛选含萘雨水降解菌的筛选方法，以利于城区雨水的高质量回用。
本发明通过如下技术方案予以实现。
一种以含萘雨水为底物的降解菌的筛选方法，具有如下步骤：
(1)梯度驯化
采用逐步提高萘浓度的方法对以含萘雨水为底物的活性污泥进行梯度驯化：
将沉降比为20％的活性污泥与取自沥青路面的地表径流雨水按质量比1:2混合，驯化期内，在雨水中首次加入萘的量为5mg/L，再将雨水与营养物质按体积比1:1混合；采用每隔2天排水1次，每次排100mL，同时进100mL含萘雨水，而后营养物质每天减少10％，10天后降为0，不再加营养物质，再每隔6天增加雨水中萘的浓度，每次增加的梯度为5mg/L，30天后增加到30mg/L为止；
(2)分离纯化
取驯化的活性污泥稀释102～105倍，将其涂布于固体培养基上，置于20-30℃恒温培养箱中倒置平板培养1～4天，挑取数量最多的菌落，划线分离纯化；
(3)富集培养
挑取直径为4mm范围内纯化优势菌落或单菌落置于250mL液体培养基中富集培养3天，得到以含萘雨水为唯一碳源的降解菌株。
所述步骤(1)的营养物质为：葡萄糖0.2g，(NH4)2SO4 0.3g，K2HPO4 0.1g，KH2PO40.1g，NaCl 0.5g，MgSO4 30mg，CuSO4.5H2O 50mg，CaCl2 20mg，FeCl3 10mg，用蒸馏水定容至1000mL。
所述步骤(3)的液体培养基的组成为：酵母膏5.0g、胰蛋白胨10.0g、氯化钠10.0g、蒸馏水1000mL。
所述步骤(2)的固体培养基是在步骤(3)的液体培养基里面加入琼脂粉20g、蒸馏水1000mL。
本发明提供了一种以含萘雨水为底物的降解菌的筛选方法，根据污水处理厂的剩余污泥中富含降解菌的特点，以驯化替代初期富集培养，既节省了分筛培养的过程，简化了筛选流程，同时也显著降低了降解菌的筛选成本。为开发多环芳烃污染处理用微生物资源提供了新途径。
附图说明
图1是实施例2的降解菌在显微镜下的形态图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细地描述。
从天津市某污水厂取得活性污泥，取回的活性污泥静置沉降12h，污泥沉降比为20％，于冰箱内4℃保存。
实施例1
(1)采用逐步提高萘浓度的方法对以含萘雨水为底物的活性污泥进行梯度驯化：
将沉降比为20％的活性污泥与取自沥青路面的地表径流雨水按质量比1:2混合，驯化期内，在雨水中首次加入萘的量为5mg/L，再将雨水与营养物质按体积比1:1混合；采用每隔2天排水1次，每次排100mL，同时进100mL含萘雨水，而后营养物质每天减少10％，10天后降为0，不再加营养物质，再每隔6天增加雨水中萘的浓度，每次增加的梯度为5mg/L，30天后增加到30mg/L为止；
所述的营养物质为：葡萄糖0.2g，(NH4)2SO4 0.3g，K2HPO4 0.1g，KH2PO4 0.1g，NaCl0.5g，MgSO4 30mg，CuSO4.5H2O 50mg，CaCl2 20mg，FeCl3 10mg，用蒸馏水定容至1000mL。
(2)将上述驯化污泥在无菌条件下用无菌水进行梯度稀释至102倍，取0.5mL涂布于固体培养基上，置于30℃恒温培养箱中倒置平板培养4天，挑取数量最多的菌落，反复划线分离纯化，得到优势菌。在培养基中菌落大多为黄色，圆形，凸起状，边缘较为规则，分布较多,少数是呈白色的菌落，近似圆形，凸起状，边缘整齐。由于菌生长速度的不同，菌落的最大直径约是最小直径的3倍；
所述的固体培养基是在步骤(3)的液体培养基里面加入琼脂粉20g、蒸馏水1000mL。
(3)富集培养：
挑取直径为4mm范围内纯化后优势菌落置于250mL液体培养基中富集培养3天，得到以含萘雨水为唯一碳源的降解菌株；
所述液体培养基的组成为：酵母膏5.0g、胰蛋白胨10.0g、氯化钠10.0g、蒸馏水1000mL。
(4)对水中污染物的降解：
分别取富集培养的菌液10mL，依次接种到200mL雨水、200mL浓度为25mg/L的萘溶液及200mL含萘雨水中，经过72h的处理，采用重铬酸钾法分别测定处理水的COD值(见表1)。
表1
项目 雨水 萘溶液 含萘雨水
COD去除率(％) 53.8 51.2 45.3
实施例2
(1)采用逐步提高萘浓度的方法对以含萘雨水为底物的活性污泥进行梯度驯化：
将沉降比为20％的活性污泥与取自沥青路面的地表径流雨水按质量比1:2混合，驯化期内，在雨水中首次加入萘的量为5mg/L，再将雨水与营养物质按体积比1:1混合；采用每隔2天排水1次，每次排100mL，同时进100mL含萘雨水，而后营养物质每天减少10％，10天后降为0，不再加营养物质，再每隔6天增加雨水中萘的浓度，每次增加的梯度为5mg/L，30天后增加到30mg/L为止；
所述的营养物质为：葡萄糖0.2g，(NH4)2SO4 0.3g，K2HPO4 0.1g，KH2PO4 0.1g，NaCl0.5g，MgSO4 30mg，CuSO4.5H2O 50mg，CaCl2 20mg，FeCl3 10mg，用蒸馏水定容至1000mL。
(2)将上述驯化污泥在无菌条件下用无菌水进行梯度稀释至103倍，取0.5mL涂布于固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中倒置平板培养3天，挑取数量最多的菌落，反复划线分离纯化，得到优势菌。在培养基中菌落在培养基中菌落全部为黄色，圆形，凸起状，边缘较为规则，零星分布，菌落的直径均匀。
所述的固体培养基是在步骤(3)的液体培养基里面加入琼脂粉20g、蒸馏水1000mL。
(3)富集培养：
挑取直径为4mm范围内纯化后单菌落置于250mL液体培养基中富集培养3天，得到以含萘雨水为唯一碳源的降解菌株。
所述液体培养基的组成为：酵母膏5.0g、胰蛋白胨10.0g、氯化钠10.0g、蒸馏水1000mL。
图1是实施例2的降解菌在显微镜下的形态图。驯化的污泥委托上海生物公司进行高通量宏基因测序，得出本发明所筛选的含萘雨水为底物的降解菌为Ferruginibacter(见图1)。该菌种性质为革兰氏阴性、好氧、非能动的杆状细菌，属于拟杆菌门。
(4)对水中污染物的降解：
分别取富集培养的菌液10mL，依次接种到200mL雨水、200mL浓度为25mg/L的萘溶液及200mL含萘雨水中，经过72h的处理，采用重铬酸钾法分别测定处理水的COD值(见表2)。
表2
项目 雨水 萘溶液 含萘雨水
COD去除率(％) 69.6 66.2 60.1
实施例3
(1)采用逐步提高萘浓度的方法对以含萘雨水为底物的活性污泥进行梯度驯化：
将沉降比为20％的活性污泥与取自沥青路面的地表径流雨水按质量比1:2混合，驯化期内，在雨水中首次加入萘的量为5mg/L，再将雨水与营养物质按体积比1:1混合；采用每隔2天排水1次，每次排100mL，同时进100mL含萘雨水，而后营养物质每天减少10％，10天后降为0，不再加营养物质，再每隔6天增加雨水中萘的浓度，每次增加的梯度为5mg/L，30天后增加到30mg/L为止；
所述的营养物质为：葡萄糖0.2g，(NH4)2SO4 0.3g，K2HPO4 0.1g，KH2PO4 0.1g，NaCl0.5g，MgSO4 30mg，CuSO4.5H2O 50mg，CaCl2 20mg，FeCl3 10mg，用蒸馏水定容至1000mL。
(2)将上述驯化污泥在无菌条件下用无菌水进行梯度稀释至105倍，取0.5mL涂布于固体培养基上，置于20℃恒温培养箱中倒置平板培养1天，挑取数量最多的菌落，反复划线分离纯化，得到优势菌。在培养基中仅存1个黄色菌落，圆形，凸起状，边缘较为规则。
所述的固体培养基是在步骤(3)的液体培养基里面加入琼脂粉20g、蒸馏水1000mL。
(3)富集培养：
挑取直径为4mm范围内纯化后单菌落置于250mL液体培养基中富集培养3天，得到以含萘雨水为唯一碳源的降解菌株。
所述液体培养基的组成为：酵母膏5.0g、胰蛋白胨10.0g、氯化钠10.0g、蒸馏水1000mL。
(4)对水中污染物的降解：
分别取富集培养的菌液10mL，依次接种到200mL雨水、200mL浓度为25mg/L的萘溶液及200mL含萘雨水中，经过72h的处理，采用重铬酸钾法分别测定处理水的COD值(见表3)。
表3
项目 雨水 萘溶液 含萘雨水
COD去除率(％) 47.2 43.5 37.4

Claims (4)

1.一种以含萘雨水为底物的降解菌的筛选方法，具有如下步骤：
(1)梯度驯化
采用逐步提高萘浓度的方法对以含萘雨水为底物的活性污泥进行梯度驯化：
将沉降比为20％的活性污泥与取自沥青路面的地表径流雨水按质量比1:2混合，驯化期内，在雨水中首次加入萘的量为5mg/L，再将雨水与营养物质按体积比1:1混合；采用每隔2天排水1次，每次排100mL，同时进100mL含萘雨水，而后营养物质每天减少10％，10天后降为0，不再加营养物质，再每隔6天增加雨水中萘的浓度，每次增加的梯度为5mg/L，30天后增加到30mg/L为止；
(2)分离纯化
取驯化的活性污泥稀释102～105倍，将其涂布于固体培养基上，置于20-30℃恒温培养箱中倒置平板培养1～4天，挑取数量最多的菌落，划线分离纯化；
(3)富集培养
挑取直径为4mm范围内纯化优势菌落置于250mL液体培养基中富集培养3天，得到以含萘雨水为唯一碳源的降解菌株。
2.根据权利要求1所述的一种以含萘雨水为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)的营养物质为：葡萄糖0.2g，(NH4)2SO4 0.3g，K2HPO4 0.1g，KH2PO4 0.1g，NaCl0.5g，MgSO4 30mg，CuSO4.5H2O 50mg，CaCl2 20mg，FeCl3 10mg，用蒸馏水定容至1000mL。
3.根据权利要求1所述的一种以含萘雨水为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)的液体培养基的组成为：酵母膏5.0g、胰蛋白胨10.0g、氯化钠10.0g、蒸馏水1000mL。
4.根据权利要求1所述的一种以含萘雨水为底物的降解菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)的固体培养基是在步骤(3)的液体培养基里面加入琼脂粉20g、蒸馏水1000mL。
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