CN102911902A - 嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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本发明公开嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌及其菌剂和应用。本发明从高热油井水样中分离获得一株嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174，其微生物保藏编号为：CGMCC No.6570。本发明还公开了由所述嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌菌株和营养培养基组成的微生物菌剂。本发明进一步公开了它们在石油开采中的应用。本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌或其菌剂能够降解、乳化石油原油或柴油，能有效降低石油原油粘度和其凝固点，增加石油原油的流动性。作为微生物驱油剂，本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌或其菌剂能显著提高石油的采收率。

Description

嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株应用于石油开采工程领域的菌株，特别涉及一株提高石油稠油采收率的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌。本发明进一步还涉及了该菌在原油开采中的应用，属于微生物驱油技术领域。
背景技术
石油是工业的血液，是现代文明的神经动脉，在人类社会的发展进程中起着极其重要的作用。同时石油作为一种不可再生资源，随着石油资源的日益短缺和勘探费用的不断增加，二次注水采油技术效率变低，已不能满足人们对石油资源有增无减的需求。为了有效的利用石油资源，世界各国正在努力寻找提高石油采收率的办法，以开采那些滞留在地层岩心中用常规方法难以开采的石油。
近年来以微生物提高原油采收率(Microbial Enhanced OilRecovery，MEOR)为代表的三次采油方法正逐渐受到广泛的重视。该技术是继热力驱、化学驱、混相驱等传统“三采”方法之后的一项综合性技术。微生物采油技术是指将地面分离培养的微生物菌液和营养液注入油层或单纯注入营养液激活油藏内源微生物，使注入微生物或油层内微生物生长繁殖，产生有利于提高采收率的代谢产物或者微生物的生命活动直接作用于原油，改善原油的某些物化特性，从而改善原油的流动性以提高原油采收率的采油方法。该方法具有工艺简单、成本低、环境友好、可循环使用等优点，是目前最具发展前景的一项采油技术。
历史上，美国科学家Beckman于1926年最早提出微生物采油的设想，到1946年，Zobell获得了第一项微生物采油专利，该项技术研究取得了明显进展。苏联于1954年在Lisbon油田开始了第一次微生物提高采收率矿场实验，美国BAc公司和NPC公司于1986年联合开发出了油田专用系列的微生物产品，促进了微生物采油技术的进一步发展。中国的微生物采油技术开始于“七五”和“八五”期间，大庆油田是中国最早开始该项技术研究的单位，在此期间取得一些进展。20世纪90年代以后微生物采油技术发展日趋成熟，已从单纯的微生物采油实验研究发展到建立系统的数学模型和数值模拟模型，微生物采油技术正在形成一整套系统的研究方法。
在油藏的轻质油和中质油是较容易被采出的，随着这些油逐渐被采尽，油井的产油量也逐渐下降，而油藏中的重油、稠油、高凝油和沥青质较难采出，但是逐渐成为已知可采原油资源中的最大潜能部分。目前在中国已探明石油储量中，重油、稠油接近40亿t，而世界范围内约有1000x108t重油和沥青质资源。重油、稠油、高凝油中含有丰富的蜡质、胶质和沥青质，具有高凝固点、难流动等特点，因此难开采并且开采高成本。利用微生物作用于稠油可以从两个方面改善稠油物性：1、通过降解作用减少稠油中的大分子组分，降低其平均分子量，从而使原油凝固点得到降低；2、微生物产生的生物表面活性物质、酸、气等代谢产物能够大幅度降低原油粘度。通过上述两个方面的作用，微生物可以使原油流动性增加，进而使残余稠油的洗油效率得到提高，从而达到提高采收率的作用。
尽管如此，到目前为止，中国乃至世界范围内仍未形成一套专门用于重油开采的微生物体系，主要是因为油藏中的环境条件如：温度、盐度、pH、压力、可利用的营养物质等比较复杂，要求采油功能微生物具有较强的适应能力。利用微生物采收重质高凝原油的成功与否，关键取决于微生物能否适应诸如温度、压力和盐度等油层环境条件并很好的生长。特别是在一些高温油藏进行微生物采油，采油功能菌种的嗜热性就显得十分重要。采油功能菌种需要在高温、缺氧的环境条件下利用原油为碳源和能源物质，进行生长繁殖和有效代谢。上世纪末辽河油田率先在中国国内开展稠油、高凝油微生物开采技术的室内研究和现场试验，取得一定成果。长江大学2001-2004年在大港孔店油田(稠油胶质沥青质含量27％，59℃粘度73mPa.S)进行了本源微生物开采稠油技术的实验研究和现场应用，增油16000余吨。Singer等人从含稠油、沥青的土壤中富集培养分离出产表活剂的菌株，对委内瑞拉Monagas稠油(粘度>25000m Pa.S)降粘率达到98％。Potter等人对Cerro Negro稠油沥青质进行微生物降解，降解率达到40％。张廷山于2001分离选育出能降解沥青质(降解率为69.6％)、降低稠油粘度(降粘率为30.41％)，耐高温的高效稠油采油功能菌，并成功应用于稠油开采。因此利用微生物进行稠油、高凝油开采是一项技术上可行，成本上节约，环境上友好的方法。
筛选出能够耐受高温，可适应厌氧环境，降低原油凝固点和粘度的微生物菌种，是目前微生物采油技术应用于高温稠油、高凝油难作用区块帮助提高石油采收率的关键。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株能应用于石油开采的微生物菌株；
本发明的目的之二是提供一种含有上述微生物菌株的菌剂或由该微生物菌株制备的发酵液；
本发明的目的之三是将所述的微生物菌株、其菌剂或发酵液应用于石油开采或改善原油的理化性能。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了一株嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174菌株，该菌株是从高热油井水样中分离，以原油为唯一碳源的情况下65℃反复驯化培养四个轮次(每轮次为一周)而获得。本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174菌株已经提交专利认可机构保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.6570；保藏时间为：2012年9月13日；其分类命名为：Anoxybacillus sp；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570的菌落形态特征为：在LB平板上培养一天菌落直径大小为2-3mm，菌落呈圆形边缘整齐为波状半透明，表面湿润，土黄色，隆起呈凸透镜状。
本发明提供的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCC NO.6570的细胞形态特征为：菌体经革兰氏染色呈阳性，显微镜下，细胞呈直杆状，如图1，大小在0.6～0.9μm×3.5～4.5μm，端生芽孢，呈短杆状，未见鞭毛。该菌生长温度范围45-75℃，最适合生长温度为65℃，生长pH范围为6-11，NaCl耐受性0-10％，穿刺实验表明JD-174为兼性厌氧菌；
本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570的部分生理生化特征如表1所示：
表1
试验项目 结果 试验项目 结果
革兰氏 + 淀粉水解-
运动性- 脓青素-
甲基红- 明胶液化-
接触酶 + H2S +
V-P- 纤维素水解 +
葡萄糖产酸- 吲哚降解-
氧化酶抗性- 酪蛋白水解-
苯丙氨酸脱氨- MR +
溶菌酶抗性- 脲酶-
注：″+”表示反应阳性″-″表示反应阴性
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及参照该菌16S rDNA基因序列在GenBnk中的比对结果构建系统发育树(图2)进行分析，鉴定本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCC NO.6570为一新菌，属于厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus sp.)。
本发明提供的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCC NO.6570可在营养培养基，如：普通牛肉膏-蛋白胨、LB营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或糖蜜的无机盐培养基中生长，同时也可以植物油、液蜡或原油为碳源生长。本发明提供的菌株可适宜45-75℃温度，兼性厌氧生长。
由此，本发明提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCC NO.6570和营养培养基；其中，所述的营养培养基可以是普通牛肉膏-蛋白胨、LB营养琼脂或者是添加有葡萄糖或糖蜜的无机盐培养基，还可以以植物油、液蜡或原油为碳源的无机盐培养基。
本发明提供的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCC NO.6570对原油具有较好的降解能力，可以对原油中长碳链烃组分进行降解。用JD-174菌株处理辽河高凝油，实验结果表明，该菌在65℃厌氧或好氧条件下，生长在无机盐降解基础培养基中能降解加入到其中的原油。培养96h后对原油的降解率分别可达55％和60％，经原油饱和烃组分分析发现使原油中轻质组分含量相对增加，重质组分含量相对减少。经该菌在65℃厌氧和好氧条件下作用后的原油粘度分别降低72％和77.5％，凝固点分别降低凝固点5℃和8℃。
本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570对原油亦具有极强的乳化能力，可以有效的降低原油的粘度和油水表面张力。用JD-174菌株处理辽河高凝油，实验结果表明，该菌在65℃厌氧或好氧条件下，通过无机盐乳化基础培养基生长繁殖过程中能乳化加入的原油。
本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570在65℃厌氧和好氧条件下，能够以原油为碳源和能源生长，能够利用C30以上的正构烷烃和蜡质，将其降解为C10-C30的短链烷烃，对原油的降解率可以达到55％-60％以上，使原油凝固点下降5-8℃，降低固体石蜡及原油粘度达到72％-77.5％；本发明菌株在高温条件下产生的生物表面活性剂，能很好的乳化烷烃和原油，降低培养液表面张力为原来的50％。本发明菌株及其发酵液应用于微生物采油模拟试验，在65℃条件下，与单纯依靠水驱的对照相比，本发明菌株可以帮助提高辽河高凝油采收率7.12％。
附图说明
图1、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570的油镜图片；
图2、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570的系统发育树；
图3、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570的耐温曲线；
图4、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570的耐盐曲线；
图5、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570作用原油前和作用原油后的气相色谱图，a为作用前，b为好氧降解后，c为厌氧降解后；
图6、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570分别在好氧情况下作用原油前后正烷烃碳数的分布情况；
图7、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570分别在厌氧情况下作用原油前后正烷烃碳数的分布情况；
图8、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570对各类正构烷烃的降解率；
图9、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570作用前后原油凝固点变化；
图10、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCC NO.6570的发酵液在好氧情况下对原油的乳化指数EI-24及发酵液自身表面张力随时间的变化；
图11、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCC NO.6570的发酵液在厌氧情况下对原油的乳化指数EI-24及发酵液自身表面张力随时间的变化；
图12、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCC NO.6570对原油作用后原油的粘度随剪切速率的变化曲线；
图13、本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCC NO.6570的发酵液用于采油物理模拟试验中的产量变化曲线。
具体实施方式
实施例1 嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570菌株的筛选
取辽河油田某区块油井的油水混合样，振荡混匀后，开始第一轮培养：用移液枪取10ml，无菌接种至100ml无机盐降解基础培养基(培养基组成：液体石蜡2％、NaNO3 4％、MgSO4·7H2O 0.05％、KH2PO4 1％，K2HPO4 2.0％、NaCl 1％、FeSO4·7H2O 0.01％、CaCl2 0.01％、酵母粉0.1％，余量为水，pH=7.2；121℃灭菌30min)，加入原油5g，使原油在无机盐降解基础培养基中的浓度为5％g/ml，60℃下摇床转速180rpm，往复振荡培养7天。开始第二轮培养：取7天后的培养液10ml，接入100ml新的无机盐基础培养基(原油6％，其它组分含量不变)，65℃摇床转速180rpm，往复振荡培养7天。按前面第一轮或第二轮的培养步骤，每轮增加原油1％的量，其它培养条件不变，取上一轮的培养液接入用于下一轮培养的新的无机盐培养基。共进行四轮(包含第一轮和第二轮)、28天的驯化富集培养。最后将取100μl第四轮的富集培养液充分混匀，涂布于LB琼脂平板上，65℃恒温培养箱中培养一天，观察平板上菌体生长情况。用灭菌牙签挑取单菌落，在新的LB琼脂平板上进行二次划线分离，得到生长状况一致的耐高温菌，然后用显微镜检验其纯度。
将高温下分离、生长良好的各个菌落，接种到LB液体培养基中，培养12小时，至OD600为0.7左右，作为种子液以10％(v/v)比例接入100ml无机盐原油或石蜡培养基中，65℃往复振荡培养4天，然后以此发酵液作为种子液，接种至新鲜的无机盐培养集中，反复上述步骤3次，最后通过测量乳化指数(EI-24)，发酵液表面张力来筛选对原油乳化能力强的菌株，最终得到一株乳化原油效果最好的菌株嗜热耐盐兼性厌氧孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174。
无机盐乳化基础培养基：糖蜜0.3％，磷酸氢二铵0.2％，硝酸钠0.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 0.01％，CaCl2·2H2O 0.02％，原油10％，余量为水；pH 7.2，115℃灭菌20min。
乳化指数测定方法：取两个刻度试管，分别加入柴油和原油，各3ml，每个试管中加入7ml发酵液，剧烈振荡1分钟，室温静置24小时后测量，以乳化层的高度除以有机相的总高度，再乘以100％，即EI-24；如果EI-24>50％，则认为乳化液是稳定的。
表面张力测定方法：取2ml发酵液，12000rpm离心5分钟，取上清液1ml，用表面张力仪测定发酵液表面张力。
实验例1 嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570菌株的形态特征、生理生化特征、耐高温和耐盐特征实验
1、供试菌株
本发明实施例1所分离的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174 CGMCC NO.6570菌株。
2、实验方法
参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，生长温度，生长pH范围，NaCl耐受性。进行甲基红、脓青素、接触酶、淀粉水解、纤维素水解、氧化酶、V-P、H2S、MR、苯丙氨酸脱氨、脲酶、葡萄糖产酸、溶菌酶抗性、吲哚降解、明胶液化和酪蛋白水解实验。
3、试验结果
形态学特征：菌体经革兰氏染色呈阳性，显微镜下，细胞呈直杆状如图1，大小在0.6～0.9μm×3.5～4.5μm，端生芽孢，呈短杆状，未见鞭毛。
生理生化特征：生长温度45-75℃，最适合生长温度为65℃，生长pH范围为6-11，NaCl耐受性0-10％，而接触酶、H2S实验、淀粉水解、纤维素水解和MR实验均为阳性；甲基红、脓青素、苯丙氨酸脱氨、脲酶实验、氧化酶、溶菌酶抗性实验、吲哚实验、明胶液化、酪蛋白水解和V-P实验都为阴性；穿刺实验表明JD-174为兼性厌氧菌。
耐温与耐盐性测定：
研究菌株在好氧和厌氧条件下耐温性与耐盐性，分别将菌株JD-174置于不同温度、不同盐浓度条件下进行培养。培养所用的培养基为LB培养基。在最适生长温度的测定中，将供试菌株以相同接种量接种到培养基中，分别置于20℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃等温度下，120rpm下培养2天。在盐浓度对菌株生长影响的研究中，调节LB培养基中的NaCl度分别为(g·L-1)：1％、3％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％，并接入相同菌液量，65℃、120rpm下培养2天。以不加菌LB培养基为空白，生长检测指标用紫外光分光光度计UV-9100于波长600nm处测量培养液的OD值，最终得到该菌耐温与耐盐性曲线如图3和图4所示。
实验例2 本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174 CGMCC NO.6570的菌株在好氧和厌氧两种条件下对原油的降解性能实验
1、供试菌株
本发明实施例1所分离的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174，菌种保藏号为CGMCC NO.6570。
2、实验方法
将供试菌株在LB平板上活化，挑取单菌落接入50ml LB液体培养基中65℃过夜培养至对数生长期。以10％的接种量接种培养好的菌液至装有100ml以原油(5％)为碳源的无机盐降解基础培养基(成分与实施例1相同)的三角瓶中。好氧条件是将摇瓶至于65℃摇床(120rpm)培养4天，厌氧条件是将摇瓶通入无菌氮气，并同时加热排除培养基中的氧气，将接菌后的摇瓶置于65℃摇床(80rpm)缓慢摇动培养4天。
最终收集油样，使用高压气相色谱法对供试菌株作用后的原油进行气相色谱组分检测和分析，测定该菌对不同碳素烷烃和原油的降解率，实验中所有对照为不接菌处理的原始油样。
检测原油降解率的方法如下：将种子液以10％(v/v)的比例接入到100ml 5％的原油培养基中，65℃振荡培养20天后测定原油降解率。油类测定方法根据中华人民共和国石油天然气行业标准SY/T 5119-2008《岩石中可溶有机物及原油族组分分析》对微生物作用前后原油族组分(饱和烃、芳香烃、胶质、沥青质)的变化进行测定，即：降解率(％)=(1-剩余原油量)/加入原油量X100％，并采用高压气相色谱方法检测原油降解情况。
3、实验结果
实验结果如图5、图6和表2所示。姥鲛烷(Pr)/nC17、植烷(Ph)/nC18是衡量生物降解原油的参数，两个比值越小，原油中正构烷烃转变成异构烷烃的量越多，原油被降解为小分子短链烷烃越多，流动性增加。w(nC21-)/w(nC22+)和(C21+C22)/(C28+C29)，也是描述油气运移重要参数。当w(nC21-)/w(nC22+)和w(C21+C22)/w(C28+C29)增加时，代表原油重质组分含量相对减少，轻质组分含量相对增加。
表2
Figure BDA00002313640600141
由图6及表2可以看出，供试菌株在好氧条件下作用原油后，C23+和C8-C10的原油组分含量下降，从作用前的41.41％和1.65％分别降至36.87％和1.2％；C11-C22组分总含量从55.72％增至59.90％；C40、C41几乎降解完全，降解后烃组分主峰从C23移至C19。同时如图7及表2所示，供试菌株在厌氧条件下作用原油后，C8-C10短链烷烃和C23+长链烷烃的含量从作用前的1.65％和41.41％分别降至1％和34.94％，C11-C22组分总含量从55.72％增加至61.60％，C40和C41降解完全，主峰从C23移至C20。供试菌株在好氧和厌氧条件下对原油均具有降解作用，均使分子量较大的组分降解为分子量相对小的组分，增加原油的流动性。
供试菌株在65℃好氧与厌氧条件下培养20天对辽河高凝油油样的降解率分别为60％和55％。测定供试菌株对不同碳素烷烃的降解情况，如图8所示，降解率也均在40％以上，最高可达63％。
分析经供试菌株作用前后原油族组成的变化，如表3所示，原油非烃、胶质、沥青质含量相对降低明显，饱和烃含量相对增加：
表3 供试菌株作用前后原油族组成的变化情况
实验例3 本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570菌株降低原油凝固点性能实验
1、供试菌株
本发明实施例1所分离的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174，菌种保藏号为CGMCC NO.6570。
2、实验方法
将供试菌株在LB平板上活化，挑取单菌落接入50ml LB液体培养基中65℃过夜培养至对数生长期。以10％(v/v)的接种量接种培养好的菌液至装有100ml以原油(5％)为碳源的无机盐降解基础培养(成分与实施例1相同)的三角瓶中，厌氧条件下的培养基必须提前除去氧气(方法与实验例2相同)，用密封塞密封。于65℃摇床培养，摇床转速好氧为120rpm，厌氧为80rpm。培养20天后，将原油12000rpm离心分离并脱水，测定原油凝固点。对照为不加菌处理的原始油样。
凝固点测定方法根据中华人民共和国凝固点测定标准GB510-83。
3、实验结果
测定结果如图9所示。经供试菌株在好氧条件下处理后，原油凝固点从53℃降低至45℃，厌氧条件下原油凝固点从从53℃降至48℃。因为经供试菌株作用后原油的轻组分增加，所以相应地经该菌种作用后原油的凝固点也会降低，流动性增加，这与前面得到的结果一致。
实验例4 本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174CGMCC NO.6570菌株在厌氧及好氧条件下降低原油粘度性能实验
1、供试菌株
本发明实施例1所分离的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174，菌种保藏号为CGMCC NO.6570。
2、实验方法
将供试菌株在LB平板上活化，挑取单菌落接入50ml LB液体培养基中65℃过夜培养至对数生长期。以10％接的接种量接种培养好的菌液至装有100ml以原油(10％(w/v))为碳源的无机盐乳化基础培养基，培养供试菌株。分别于65℃好氧与厌氧两种条件下培养20天(过程同实验例2)后，将原油于12000rpm离心分离脱水处理，最后在65℃用BROOKFIELD-DV-III UTRA测粘仪，按照石油天然气行业标准SY/T 0520-2008测量检测仪检测该菌作用前后原油粘度和变化。平行检测3次。
3、实验结果
实验结果见图12；根据剪切速率与粘度曲线可以看出，供试菌株作用前原油的流动性能和粘度是随着剪切速率增加而显著降低，而供试菌株作用后原油粘度变化曲线趋于直线，这个结果表明供试菌株作用前原始油样的表观粘度表现为假塑性流体的特性，经过供试菌株处理后改变了原油的流体性质，原油的表观粘度则趋于牛顿流体特性。
原油经供试菌株作用后，原油粘度降低72-77.5％，这个结果进一步表明供试菌株在应用于原油开采改变原油物性，帮助提高采收率方面具有巨大的应用潜力。
实验例5 本发明嗜脲芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174 CGMCCNO.6570菌株好氧条件下乳化原油的性能实验
1、供试菌株
本发明实施例1所分离的嗜脲芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)J D-174，菌种保藏号为CGMCC NO.6570。
2、实验方法
供试菌株在以糖蜜为碳源的无机盐乳化培养基中生长(成分与实施例1相同)，65℃振荡(120rpm)培养5天。按不同时间点取发酵液，于12000rpm离心分离，取离心液上清液对原油进行乳化，并测定乳化指数，同时使用表面张力仪测定发酵液表面张力，观察其对原油乳化情况。
乳化指数测定方法：取两个刻度试管，分别加入柴油和原油，各3ml，每个试管中加入7ml发酵液，剧烈振荡1分钟，室温静置24小时后测量，以乳化层的高度除以有机相的总高度，再乘以100％，即EI-24；如果EI-24>50％，则认为乳化也是稳定的。
表面张力测定方法：取2ml发酵液，12000rpm/min离心5分钟，取上清液1ml，用表面张力仪测定发酵液表面张力。
3、实验结果
实验结果表明，供试菌株可以很好的乳化原油，使原油颗粒变细小并充分的分散与水中，如墨汁状与水互溶。
供试菌株在以糖蜜为碳源的无机盐乳化培养基中可产生表面活性剂，显著降低发酵液的表面张力，使发酵液的表面张力从72.12mN/m降至27.06mN/m，降幅超过50％，从而很好的促进了对原油乳化，乳化指数EI-24最高可达83％(图10)。
供试菌株在65℃好氧条件下，仅需50小时就能对原油起到很好的乳化效果。
实验例6 本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174 CGMCC NO.6570菌株在厌氧条件下乳化原油的性能实验
1、供试菌株
本发明实施例1所分离的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174，菌种保藏号为CGMCC NO.6570。
2、实验方法
供试菌株在以糖蜜为碳源的无机盐乳化培养基中生长(成分与实施例1相同)，培养基必须提前除去氧气(方法与实验例2相同)，用密封塞密封。将供试菌株于65℃摇床缓慢摇动，培养5天。按不同时间点取含有供试菌株的发酵液，于12000rpm离心分离，取离心液上清液对原油进行乳化，并测定乳化指数，同时使用表面张力仪测定发酵液表面张力，观察其对原油的乳化情况。
乳化指数测定方法：取两个刻度试管，分别加入柴油和原油，各3ml，每个试管中加入7ml发酵液，剧烈振荡1分钟，室温静置24小时后测量，以乳化层的高度除以有机相的总高度，再乘以100％，即EI-24；如果EI-24>50％，则认为乳化也是稳定的。
表面张力测定方法：取2ml发酵液，12000rpm离心5分钟，取上清液1ml，用表面张力仪测定发酵液表面张力。
3、实验结果
实验结果表明供试菌株同好氧条件下一样，可以很好的乳化原油，使原油颗粒变细小并充分的分散与水中，如墨汁状于水互溶。
供试菌株在以糖蜜为碳源的无机盐乳化培养基中可产生表面活性剂，显著降低发酵液的表面张力，使发酵液的表面张力从72.12mN/m降至29.14mN/m，降幅超过50％，从而很好的促进了对原油乳化，乳化指数EI-24最高可达82％(图11)。
供试菌株在65℃厌氧条件下，仅需72小时就能对原油起到很好的乳化效果。
实验例7 本发明嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174 CGMCC NO.6570菌株在65℃条件下进行驱油模拟试验
1、供试菌株
本发明实施例1所分离的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174，菌种保藏号为CGMCC NO.6570。
2、实验方法
具体过程为：石英砂装填模型，氮气测渗透率→岩心抽真空饱和地层水→水测渗透率→注入高凝油至饱和→水驱至含水率达98％→注入供试菌株菌液，浓度为106-107个/ml，注入量为0.5PV→65℃恒温培养7天→水驱至含水达98％结束实验。
培养供试菌株的种子培养基使用LB培养基，稀释种子液使用无机盐乳化培养基(同实施例1)。
3、实验结果
实验表明通过供试菌株细胞或其发酵液能帮助提高高凝油采收率。从表4及图13可以看出，通过注入供试菌株于人工岩心，可以有效地帮助驱油，降低产出液中的含水率，使岩心压力稳定在较低的水平，与水驱相比可使采收率提高7.12％。
表4 微生物模拟驱油实验数据汇总表
Figure BDA00002313640600211
实验结果表明通过本发明所分离的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)J D-17 4CGMCC NO.6570菌株细胞或其发酵液能帮助提高高凝油采收率。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一株嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174，其特征在于，其微生物保藏号是：CGMCC NO.6570。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，包含：权利要求1所述的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillus sp.)JD-174和营养培养基。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述营养培养基选自普通牛肉膏-蛋白胨培养基，LB营养琼脂培养基或者是添加了葡萄糖或糖蜜的无机盐乳化培养基中的任意一种；或者是以植物油、液蜡或原油为碳源的无机盐降解培养基；
所述无机盐乳化培养基的组分包含：糖蜜0.3％，磷酸氢二铵0.2％，硝酸钠0.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 0.01％，CaCl2·2H2O 0.02％，石油原油10％，余量为水；pH为7.0-7.2；
所述无机盐降解培养基的组分包含：液蜡2％、NaNO3 4％、MgSO4·7H2O 0.05％、KH2PO4 1％、K2HPO4 2.0％、NaCl 1％、FeSO4·7H2O 0.01％、CaCl2 0.01％、酵母粉0.1％和原油5％，余量为水；pH为7.0-7.2。
4.如权利要求1所述的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174或权利要求2至3任一项所述的微生物菌剂在降解石油原油中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述降解石油原油包括将大分子量的组分降解为小分子量的组分或/和增加石油原油的流动性。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述降解石油原油包括降低原油非烃、胶质、沥青质含量，增加饱和烃含量。
7.权利要求1所述的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174或权利要求2至3任一项所述的微生物菌剂在降低石油原油凝固点或石油原油粘度中的应用。
8.权利要求1所述的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174或权利要求2至3任一项所述的微生物菌剂在乳化石油原油中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的乳化石油原油包括降低石油原油的表面张力。
10.权利要求1所述的嗜热耐盐兼性厌氧芽孢杆菌(Anoxybacillussp.)JD-174或权利要求2至3任一项所述的微生物菌剂在石油开采中作为微生物驱油剂的应用。
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