CN103881949A - 厌氧芽孢杆菌ha及其降解氮氧化合物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株新菌株--厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillus contaminans）HA及其降解氮氧化合物的应用，所述厌氧芽孢杆菌HA保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC NO：M2013678，保藏日期2013年12月20日；本发明提供了一种高效、耐热能力强的具有FeII(EDTA)-NO还原性能的厌氧芽孢杆菌HA及其降解氮氧化合物的应用，该菌株在1d内能对初始浓度为5mmol·L-1的FeII(EDTA)-NO还原率达到95.3%，该降解菌的发现对工业废气中氮氧化物的高效净化具有重要意义。

Description

厌氧芽孢杆菌HA及其降解氮氧化合物的应用
（一）技术领域
本发明涉及一株具有FeII(EDTA)-NO还原性能的厌氧芽孢杆菌HA，及其在生物处理氮氧化物中的应用。
（二）背景技术
氮氧化物（NOx)是矿物燃料燃烧排放的主要污染物之一，其中有95%以上是NO，其余的主要是NO2。大量排放具备局部、区域、全球性污染物性质的氮氧化物会引发各种环境问题，比如造成光化学烟雾、产生酸雨和破坏臭氧层等。同时氮氧化物还会给人类的健康带来极大的威胁，是细颗粒物（PM2.5)的重要组成成分；而且已经有很多研究团队证实NO和帕金森病等神经系统变性疾病直接相关。
随着我国国民经济的快速发展，对能源尤其是化石燃料的需求愈发强烈，从而导致氮氧化物的排放量几近指数式的增长。2011年9月环境保护部颁布了《火电厂大气污染物排放标准》，氮氧化物的排放浓度限值被统一确定为100mg·m-3。
现有烟气脱硝技术中，选择性催化还原（SCR)和选择性非催化还原（SNCR)干法脱硝得到一定程度的工业应用，但存在投资运行费用高、催化剂易失活、氨泄漏等缺点；其它脱硝技术如等离子体法、氧化法（次氯酸钠、过氧化氧等）、吸收法等的可行性和经济性还有待进一步研究。生物净化法处理烟气中的氮氧化物相较于传统的脱硝工艺具有处理效果好、经济成本低、无二次污染等优势，比如利用微生物的硝化和反硝化过程以及藻类、真菌本身特有的功能等，目前已引起国内外众多研究者的重视。
但是利用生物法处理烟气中的氮氧化物首先解决的是NO的气液传质问题，否则生物处理法难以获得较高的处理效率。由于络合吸收法利用有机络合吸收剂（常使用有机螯合铁-乙二胺四乙酸亚铁，FeII(EDTA)可以快速地实现将NO从气相转移到液相，并且具有吸收速率快、吸收容量大和价廉易得等优点，自从上世纪80年代以来这项技术已经取得了极大的发展。然而，络合脱硝过程产生的吸收产物不再具备相应的络合吸收NO能力，因此脱硝溶液需再生才能循环使用。为了实现吸收液再生，可通过添加SO3 2-、Na2S2O4等还原剂，但是成本高且再生速率低而且，还原过程只是针对因为烟气中氧气存在而形成的具备络合吸收NO能力的FeIII(EDTA)，对另外一种吸收产物FeII(EDTA)-NO似乎没有良好的对策。
络合吸收结合生物转化去除NO技术（chemical absorption combinedwith biological reduction,CABR-DeNOx或者BioDeNOx)因为可以克服上述缺点，而且工艺已被证实具有流程短、投资少、处理效果好、运行管理简单等优点，目前已经成为研究热点。简单地讲，这一工艺是利用FeII(EDTA)作为化学吸收剂进行络合吸收形成络合吸收产物（FeII(EDTA)-NO)，进而利用微生物的反硝化机能将吸收产物转换为环境友好的氮气（N2)。
（三）发明内容
本发明目的是提供一株高效、耐热能力强的具有FeII(EDTA)-NO还原性能的厌氧芽孢杆菌及其用途。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillus contaminans）HA，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC NO：M2013678，保藏日期2013年12月20日。
本发明所述厌氧芽孢杆菌HA菌株的特征为：菌落颜色为白色，菌落呈小型单个菌落，有芽孢，不透明，表面光滑，边缘整齐。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌，具有鞭毛，革兰氏染色阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性。它生长最适pH值为7.0，最适温度为55℃。该菌株16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供所述厌氧芽孢杆菌HA在生物降解氮氧化物中的应用。氮氧化物指的是由氮和氧两种元素组成的化合物。常见的氮氧化物有一氧化氮（NO，无色）、二氧化氮（NO2，红棕色）、笑气（N2O）、五氧化二氮（N2O5）等，其中除五氧化二氮常态下呈固体外，其他氮氧化物常态下都呈气态。作为空气污染物的氮氧化物（NOx）常指NO和NO2，本发明中亦是指NO和NO2。具体的，所述菌株用于处理废气中氮氧化物以FeII(EDTA)-NO形式存在的废液。
进一步，所述的应用为：将厌氧芽孢杆菌HA经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液接种至FeII(EDTA)-NO液体选择培养基中，以FeII(EDTA)-NO为唯一氮源，在55～60℃、120～160rpm条件下培养，实现将FeII(EDTA)-NO中NO还原为N2，即实现氮氧化物的降解；所述FeII(EDTA)-NO液体选择培养基的终浓度组成为：氮源4～6mmol·L-1，碳源1500～3500mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值5.0～9.0。
进一步，优选所述含菌细胞悬液的OD600值为0.4～0.6，所述含菌悬液的体积接种量为1%～4%。
进一步，优选所述碳源为乙酸、碳酸氢钠、乙醇、葡萄糖或乙酸钠中一种或两种及以上以任意比例的混合，更优选所述碳源为下列之一：①乙酸、②碳酸氢钠、③乙醇、④葡萄糖或⑤乙酸钠。
进一步，优选碳氮质量比为8～18:1，更优选所述碳氮质量比为15:1，碳源为葡萄糖3000mg·L-1。
进一步，优选培养条件为55～60℃、140～160rpm。
本发明所述FeII(EDTA)-NO按如下方法制备：用等摩尔的FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O和Na2EDTA在驱氧去离子水中配置成FeII(EDTA)溶液，再用1mmol/L的NaOH水溶液将制备好的FeII(EDTA)溶液的pH值调至7.0左右，倒入500mL的吸收瓶中，通入NO气体进行吸收形成FeII(EDTA)-NO溶液。用氮氧化物分析仪（型号42i-HL，厂家美国Thermo公司）进行检测，当NO进口浓度与出口浓度相等时，则吸收饱和，得到pH值为7.0左右的FeII(EDTA)-NO饱和吸收液。由于FeII(EDTA)极易被空气中的氧气氧化，因此整个制备过程中需要在无氧的条件下进行（制备和转移的过程中用高纯N2做保护气），制备好的FeII(EDTA)-NO饱和吸收液需驱氧密封保存。
本发明所述含菌悬液按如下步骤制备：
（1）斜面培养：将厌氧芽孢杆菌HA接种至斜面培养基，55℃培养3天，获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖2000mg·L-1，NaNO31000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值7.0，琼脂15～18g·L-1（优选18g·L-1）；
（2）种子培养：从菌体斜面挑取菌落接种至种子培养基，55℃培养1天，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖2000mg·L-1，NaNO3200mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值7.0；
（3）发酵培养：将种子液以体积浓度1～4%的接种量接种至发酵培养基，55℃培养1天，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖2000mg·L-1，NaNO31000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值7.0。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株高效、耐热能力强，且具有FeII(EDTA)-NO还原性能的厌氧芽孢杆菌HA及其降解氮氧化合物的应用，该菌株在1d内能对初始浓度为5mmo1·L-1的FeII(EDTA)-NO还原率达到95.3%，该降解菌对工业废气中氮氧化物的高效净化具有重要意义。
（四）附图说明
图1为菌株HA的透射电镜照片（A）和革兰氏染色照片（B）；
图2为菌株HA的系统发育树图；
图3不同pH下菌株HA的FeII(EDTA)-NO还原性能比较；
图4不同碳源下菌株HA的FeII(EDTA)-NO还原性能比较；
图5不同C/N下菌株HA的FeII(EDTA)-NO还原性能比较；
图6不同接种量下菌株HA的FeII(EDTA)-NO还原性能比较。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：Anoxybacillus contaminans HA的分离、纯化及其鉴定
1.Anoxybacillus contaminans HA的分离及纯化
Anoxybacillus contaminans HA是从本课题组BioDeNOx反应器污泥中筛选，具体步骤如下：
基础培养基，配制方法如下：葡萄糖2000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH7.0，121℃灭菌20min。
FeII(EDTA)-NO溶液的制备方法：用等摩尔的FeSO4·(NH4)2SO4·6H2O和Na2EDTA在驱氧去离子水中配置成FeII(EDTA)溶液，再用1mmol/L的NaOH水溶液将制备好的FeII(EDTA)溶液的pH值调至7.0左右，倒入500mL的吸收瓶中，通入NO气体进行吸收形成FeII(EDTA)-NO溶液。用氮氧化物分析仪（型号42i-HL，厂家美国Thermo公司）进行检测，当NO进口浓度与出口浓度相等时，则吸收饱和，得到pH值为7.0左右的FeII(EDTA)-NO饱和吸收液。由于FeII(EDTA)极易被空气中的氧气氧化，因此整个制备过程中需要在无氧的条件下进行（制备和转移的过程中用高纯N2做保护气），制备好的FeII(EDTA)-NO饱和吸收液需驱氧密封保存。
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基：基础培养基中加入5mmo1·L-1FeII(EDTA)-NO饱和吸收液得到液体选择培养基。由于FeII(EDTA)-NO在空气中容易氧化，且高温灭菌时不稳定，不适合于制备固体培养基，因此，在制备固体选择培养基时加入1000mg·L-1NaNO3为氮源和唯一的电子受体来替代FeII(EDTA)-NO饱和吸收液，同时加入18g·L-1琼脂。
取BioDeNOx反应器中污泥，静置24h后，滤去上清液，取下层污泥10mL接种于含100mL基础培养液250mL培养瓶中，55℃，160rpm振荡培养24h，将菌液离心分离，收集菌体，用无菌水配制成一定浓度的菌液。将所得到的菌液用FeII(EDTA)-NO固体选择培养基经多次平板划线分离纯化，得到单菌落即还原菌种，记为菌株HA。
2.菌株HA的鉴定
a、菌株HA的生理生化特征
菌落颜色为白色，菌落呈小型单个菌落，有芽孢，不透明，表面光滑，边缘整齐。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌（图1中A所示），具有鞭毛，革兰氏染色阴性（图1中B所示），氧化酶阳性，接触酶阳性。它生长最适pH值为7.0，最适温度为55℃。
b、菌株HA的16S rRNA序列分析
通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株HA为Anoxybacillus contaminans。具体步骤如下：
采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒（V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司）提取和纯化菌株HA的DNA，4℃保存。选用细菌的通用引物F27和1492R对纯化的DNA进行PCR扩增，引物序列分别为：
F27：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’
1492R：5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’
PCR反应体系为(50μL)：模板DNA1.75μL，引物F27和引物R1492各1μL，MgCl2(25mmol·L-1)3μL，Taq酶(5U·μL-1)0.25μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTP(2.5mmol·L-1)4μL，重蒸水34μL。
PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序（上海华大基因），测序结果见序列SEQ ID NO：1所示。
将HA的16S rDNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号KF973318，同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Anoxybacillus属，与Anoxybacillus contaminans（NR029006.1）同源性最高，达到95%，图2为该菌株的系统发育树图。为了进一步确定鉴定结果的可靠性，经过生理生化实验，最终确定菌株HA属于Anoxybacilluscontaminans，因此，将该菌株命名为厌氧芽孢杆菌（Anoxybacilluscontaminans）HA。
实施例2厌氧芽孢杆菌HA发酵培养液
（1）斜面培养
将厌氧芽孢杆菌HA接种至斜面培养基，55℃培养3天，获得菌体斜面；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖2000mg·L-1，NaNO31000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值7.0，琼脂18g·L-1。
（2）种子培养
从菌体斜面挑取菌落接种至种子培养基，55℃培养1天，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖2000mg·L-1，NaNO3200mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值7.0。
（3）发酵培养
将种子液以体积浓度1%的接种量接种至发酵培养基，55℃培养1天，获得发酵培养液，即含菌细胞悬液。所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖2000mg·L-1，NaNO31000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值7.0。
实施例3：Anoxybacillus contaminans HA反硝化性能检测
1.考察不同初始pH条件下厌氧芽孢杆菌HA还原FeII(EDTA)-NO的性能
在不同初始pH下实施厌氧芽孢杆菌HA还原Fe(II)EDTA-NO的实验，发现pH在7.0时具有较高的反硝化能力，从实际应用角度看，pH=7.0为最佳pH，此时降解率最高，具体实施步骤如下：
以FeII(EDTA)-NO为唯一氮源（浓度5mmo1·L-1），按体积浓度1%接种量将OD600为0.4的含菌悬液（实施例2方法制备）接种于不同pH值的FeII(EDTA)-NO液体选择培养基（pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），55℃，160rpm振荡培养24h，获得培养液，采用分光光度法测定FeII(EDTA)-NO的浓度，即取3mL培养液作为样品，先将样品通过孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤去除微生物，然后取滤液用紫外分光光度计测出其在420nm波长下的吸光度值。
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基终浓度组成为：FeII(EDTA)-NO5mmol·L-1，葡萄糖2000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值5.0～9.0。
结果如图3所示，菌株HA对弱酸的环境适应性相对较差，但当pH为7.0时，菌株HA的还原率达到87%。
2.考察不同碳源下厌氧芽孢杆菌HA还原FeII(EDTA)-NO的性能
在不同碳源下实施厌氧芽孢杆菌HA还原Fe(II)EDTA-NO的实验，结果表明其最佳碳源为乙酸钠，具体实施方案如下：
分别以FeII(EDTA)-NO为唯一氮源（浓度5mmo1·L-1），按体积浓度1%接种量将OD600为0.4的含菌悬液（实施例2方法制备）分别接种于FeII(EDTA)-NO液体选择培养基A（碳源为乙酸，C/N质量比为10：1）、FeII(EDTA)-NO液体选择培养基B（碳源为碳酸氢钠，C/N质量比为10：1）、FeII(EDTA)-NO液体选择培养基C（碳源为乙醇，C/N质量比为10：1）、FeII(EDTA)-NO液体选择培养基D（碳源为葡萄糖，C/N质量比为10：1）、FeII(EDTA)-NO液体选择培养基E（碳源为乙酸钠，C/N质量比为10：1）5种培养基中，55℃，160rpm振荡培养24h，分别获得培养液，取各个培养基培养后获得的培养液采用分光光度法测定FeII(EDTA)-NO的浓度，即取3mL培养液作为样品，先将培养液通过孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤去除微生物，然后用紫外分光光度计测出其在420nm波长下的吸光度值。
碳源为微生物的生长提供重要的能源，并构成微生物的细胞物质。不同的碳源因其结构和分子量不同，对微生物还原的影响程度也不尽相同。
结果如图4所示。厌氧芽孢杆菌HA对葡萄糖的降解率相对高一些，对乙酸解率最低。研究得出的结论，所用碳源的化学结构和分子量对还原效率的影响是很大的。通常结构越简单，分子量越小的碳源越有利于微生物还原的进行。
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基A终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，乙酸1750mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0；
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基B终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，碳酸氢钠4900mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0；
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基C终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，乙醇1342mg·L-1，葡萄糖2000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1,CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0；
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基D终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，葡萄糖1925mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0；
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基E终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，乙酸钠2100mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0；
3.考察不同C/N质量比下厌氧芽孢杆菌HA还原FeII(EDTA)-NO的性能
在不同C/N质量比下实施厌氧芽孢杆菌HA的反硝化实验，结果表明其最佳C/N质量比为15：1，具体实施方案如下：
分别以FeII(EDTA)-NO为唯一氮源（浓度5mmo1·L-1），按体积浓度1%接种量将OD600为0.4的含菌悬液（实施例2方法制备）分别接种于FeII(EDTA)-NO液体选择培养基A1（C/N质量比为8：1）、FeII(EDTA)-NO液体选择培养基B1（C/N质量比为10：1）、FeII(EDTA)-NO液体选择培养基C1（C/N质量比为13：1）、FeII(EDTA)-NO液体选择培养基D1（C/N质量比为15：1）、FeII(EDTA)-NO液体选择培养基E1（C/N质量比为18：1）5种培养基中，55℃，120rpm振荡培养24h，获得培养液，采用分光光度法测定FeII(EDTA)-NO的浓度，取3mL培养液作为样品，先将培养液通过孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤去除微生物，然后用紫外分光光度计测出其在420nm波长下的吸光度值。
结果如图5所示：当葡萄糖小于3000mg·L-1时，由于碳源对菌体的生长和还原效率起着重要的作用，碳源不足，就没有足够的电子流来提供足够的能源以供菌体生长，所以菌株HA的还原率随着C/N质量比的增加而缓慢的增加，随着碳源量的继续增加，由于提供的碳源远高于菌体需求，碳源已是非限制性因素，菌体的生长和代谢活性处于稳定阶段，但相对来说菌体的生长速率大于代谢速率，更多的氮源被用于生长，代谢活动相对受到抑制，所以菌株HA的还原率减小。
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基A1终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，葡萄糖1500mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0；
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基B1终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，葡萄糖2000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0；
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基C1终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，葡萄糖2500mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0；
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基D1终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，葡萄糖3000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0；
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基E1终浓度组成:FeII(EDTA)-NO饱和吸收液5mmo1·L-1，葡萄糖3500mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0。
4.考察不同接种量下厌氧芽孢杆菌HA还原FeII(EDTA)-NO的性能
在不同接种量下实施厌氧芽孢杆菌HA的还原Fe(II)EDTA-NO的实验，结果表明其最佳接种量为1.5%（v/v），具体实施方案如下：
分别以FeII(EDTA)-NO为唯一氮源（浓度5mmo1·L-1），按（1%、2%、2.5%、3%、4%5个接种量梯度）将OD600为0.4的含菌悬液（实施例2方法制备）接种于FeII(EDTA)-NO液体选择培养基中，55℃，160rpm振荡培养24h，获得培养液，采用分光光度法测定FeII(EDTA)-NO的浓度，取3mL培养液作为样品，先将培养液通过孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤去除微生物，然后用紫外分光光度计测出其在420nm波长下的吸光度值。
FeII(EDTA)-NO液体选择培养基终浓度组成：FeII(EDTA)-NO5mmo1·L-1，葡萄糖2000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值为7.0。
结果如图6所示，数据表明，当接种量大于1%时，由于刚开始时培养基中营养物质充足，接种量多少直接影响到底物降解，还原率率随着接种量的增加而缓慢上升，当接种量为2.5%时，还原率分别达到95.5%，而随着接种量的继续增加，在降解菌之间形成了对营养物质的竞争关系，因此还原率出现减小的现象。由图可知，菌株HA的最佳接种量为2.5%左右。
Figure IDA0000480178110000011

Claims (8)

1.厌氧芽孢杆菌（Anoxybacillus contaminans）HA，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC NO：M2013678，保藏日期2013年12月20日。
2.一种权利要求1所述厌氧芽孢杆菌HA在生物降解氮氧化物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将厌氧芽孢杆菌HA经发酵培养获得的发酵液即含菌悬液接种至FeII(EDTA)-NO液体选择培养基中，以FeII(EDTA)-NO为唯一氮源，在50～60℃、120～160rpm条件下培养，实现将FeII(EDTA)-NO中NO还原为N2；所述FeII(EDTA)-NO液体选择培养基的终浓度组成为：氮源4～6mmol·L-1，碳源1500～3500mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值5.0～9.0。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述含菌细胞悬液的OD600值为0.4～0.6，含菌悬液体积接种量为1%～4%。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述碳源为乙酸、碳酸氢钠、乙醇、葡萄糖或乙酸钠。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述碳氮质量比为8～18:1。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述碳氮质量比为15:1，碳源为葡萄糖3000mg·L-1。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述含菌悬液按如下步骤制备：
（1）斜面培养：将厌氧芽孢杆菌HA接种至斜面培养基，55℃培养3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖2000mg·L-1，NaNO31000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值7.0，琼脂18g·L-1；
（2）种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，55℃培养1天，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖2000mg·L-1，NaNO3200mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值7.0；
（3）发酵培养：将种子液以体积浓度1～4%的接种量接种至发酵培养基，55℃培养1天，获得发酵培养液，即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖2000mg·L-1，NaNO31000mg·L-1，KH2PO4500mg·L-1，K2HPO4500mg·L-1，MgSO4·7H2O100mg·L-1，CaCl2100mg·L-1，CuSO41mg·L-1，FeSO41mg·L-1，MnSO45mg·L-1，Na2MoO41mg·L-1，ZnCl22mg·L-1，溶剂为水，pH值7.0。
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