CN1309296C - 作物杂种优势和除草剂 - Google Patents

Abstract

杂种优势定义为杂交所产生的生长增加和其它方面的增长效应，不管杂交以何种方式产生。母本的雄性不育是杂交种子商业化生产的重要生物机制。雄性不育可以通过遗传操作，环境影响，化学诱导和生物工程等产生。就本质而言，雄性不育是一种生理紊乱，完全或彻底的雄性不育或者费用昂贵，或者引发其它方面的生理紊乱。把对无选择除草剂具抗性的基因导入雄性亲本，对由此除草剂抗性父本授粉所产生的杂种群体喷洒这种除草剂，以便保证杂种群体的纯度，降低对完全或彻底雄性不育的严格要求。因而，简单，实用的方法，如环境和化学诱导法则可用来诱导雄性不育，雄性不育与其它生理紊乱的矛盾则可得到很好的平衡。本发明的概念可以应用到所有已经研究其雄性不育，以便利用其杂种优势的作物和植物，例如牧草作物，蔬菜作物和禾谷类粮食作物。

Description

作物杂种优势和除草剂

有关申请的交叉文献

本申请是美国1997年4月28日预防申请系列号60/044,990部分的延续，在此合并为参考文献，本申请要求该美国申请的优先权。本申请也是美国1997年5月9日预防申请系列号60/046,058部分的延续，在此合并为参考文献，本申请要求该美国申请的优先权。本申请还是中国1997年12月5日申请系列号为97107807.6的部分延续，在此合并为参考文献。

发明背景

本发明涉及作物或植物杂种的育种，具遗传差异的父母本植物或作物经杂交育种而产生的杂种拥有增加的优势或其它优良品质。具体而言，本发明涉及作物或植物杂种优势，此杂种的母本为雄性不育，父本为雄性可育并具有除草剂抗性基因。如此父母本而产生的杂交种子，植物和作物对一非选择性除草剂表现抗性，以便杀灭和清除所有非经与此转基因父本杂交而来的假杂种和植株。

除草剂和除草剂抗性作物

除草剂是人类用于杀除不需要植物的植物毒素。这类化合物可能是完全无选择地杀除任何植物，或是有选择性地，仅杀除某些植物。从1940年化学除草剂问世以来，已有数百种有效化学成分作为除草剂发展起来。大多数化合物的作用机理已被阐明，尽管还有很多知识空缺(Pilmoor et al.，1995)。一般认为，大多数除草剂仅对植物的一个分子目标发生直接影响，导致第二个，第三个等分子的连锁效应，最终杀死植物。因为，杂草和作物争夺水分，营养和土地，所以在粮食生产中应用除草剂控制杂草已成为关键技术。另外杂草聚藏昆虫和病害虫，有害的杂草和杂草种子还能大大地降低作物品质。正因为如此，美国的玉米，水稻和大豆几乎100％都要施用除草剂(Gianessi and Puffer，1991)。

生物技术可能从许多方面改变我们的未来。其中之一就是改变作物的物种，使之产生新的特性，这种改变通过常规育种或许十分缓慢或许根本不可能。输入除草剂抗性给正常的对除草剂敏感的作物，使其成为抗除草剂的作物(HRCs)已成为最集中的植物生物技术开发领域。植物的遗传操作和已具有可从任何有机体转移遗传信息的能力方面取得的进展，为新的农产品开辟了令人兴奋的生产领域。进一步观察表明，许多除草剂的抗性表现为显性单基因的遗传特性，使他们十分适合转基因技术(Stalker et al.，1996)。

除草剂抗性这一术语，用于描述一个种或更大的植物类群的群体，或组织培养中的植物细胞群中的群体，具有能忍受某一特殊除草剂一定剂量(这种剂量大于这种植物的野生类型的容忍量)，基本完成正常生活周期的一种能力，性状或品质(Dekker and Duke，1995)。大多数抗除草剂作物的品种都是通过最近发展起来的分子生物学和植物转导技术稳定整合外来基因(转基因，转基因植物)而创造出来的(Dyer等，1993)。这种方法利用了植物细胞的全能性，即每一个植物细胞在接受了外来基因后，都有重新构建成一个完整植物的潜在能力。就除草剂抗性而言，抗性基因可能编码一种内源酶或一种新酶的除草剂抗性形成。这些酶使除草剂产生某些变化而使其失去活性。许多人认为，最可能获得成功的是对非选择性除草剂的HRCs，如草甘膦(Gluphosate)或草丁膦(Glyfosinate)的抗性作物，或位于主要作物如水稻，大豆和玉米与一些小作物之间的中间型除草剂抗性作物(Duke，1996)。

除草剂抗性作物的发展在经济，安全和高效率的作物生产方面，具有很多优越特性(Bright，1992；Dekker and Comstock 1992；Dyer et al.，1993；Goldburg et al.，1990；Miller，1991)。除草剂及匹配的抗性作物的发展减少了环境中残留(例如，除草剂残留于土地中影响轮作中的下一季作物，或在土地及生态环境的其它地方积累起来)，对附近的对象很少危害，例如附近的敏感作物，住所，农场和水面；在环境中不理想的流动降低，例如通过土地割面流动到底层土地或地下，挥发和运动到附近的位置；对人畜的急性和慢性中毒极低。

草甘膦

草甘膦(氮甲基膦酰甘氨酸)[(N-phosphonomethyl)glycine]及其盐类的除草剂活性首先于1971年被描述(Baird et al.，1971)，从那以后草甘膦成为世界上最流行的除草剂。农达(Roundup)是孟山都(Monsanto)公司对草甘膦的注册商标。这个化合物是通过三甲氨基磷酸的常规扫描程序鉴定出的(Franz.，1985)。草甘膦的生理学和生物学特性已被综述(Duke，1988)。并且有一整本书专门写这个化合物(Grossbard and Atkinson，1985)。草甘膦是一种非选择性的出苗后除草剂，它被广泛地用于作物出苗前，常直接喷施，以保证收获。它也被广泛使用在树林和果园中，因为在果园和树林下喷施除草剂可以不与作物叶片直接接触。它还被使用于园林规划和草坪的边缘及分界。草甘膦的毒理学性质及对环境是温和的(Duke，1988)。一经接触土地，就被土壤成分结合固定，很快被土壤微生物降解于土地中，因此，它对哺乳动物，鸟和鱼类几乎是无害的(Malik et al.，1989)。环境保护局(EPA)(environmental protection agency)将草甘膦分类为E类(对人类无致癌作用的证据)(57FR8739)。更重要的是农达除草剂已经推广使用了近二十年，还没有一例杂草自然产生对草甘膦抗性的现象发生。

草甘膦的主要作用机理是抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(EPSPS)(EC 2.5.1.19)。该酶是芳香族氨基酸生物合成(莽草酸)途径中的次末级酶，因而导致植物因缺乏芳香族氨基酸而饥饿死亡。经过二个周期的化学诱变试验，细菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中鉴定出一株抗性系，此抗性突变发生于aroA基因中，该基因编码EPSPS(Comai et al，1983)。DNA测定表明该突变基因发生了二个独立的突变，一个是启动子突变以提高aroA基因的表达，因而产生低度抗性；另一个是编码顺序中的点突变，以引起蛋白质残基101号位置的一个脯氨酸取代一个丝氨酸。EPSPS的过量生产有效地增加了该酶的分子数量，此酶被除草剂抑制以切断碳的流通途径。该酶的过量生产是由于编码EPSPS基因的大量扩增(Shah et al.，1986)。通过筛选发现CP4EPSPS是对草甘膦忍耐力最强的EPSPS。

自1974年草甘膦进入商业生产以来，已被广泛使用。对草甘膦的抗性基因已被转进了烟草，矮牵牛，番茄，油菜，大豆等作物(Dyer，1994)。具有农达抗性基因(Roundup Ready TM)最初的大豆品系是由孟山都公司培育的，编号为40-3-2。已有材料描述这个大豆品系对农达的结构及田间表现(Padgette et al.，1989)。大豆品系40-3-2表现出CP4 EPSPS基因产物。通过该系，Roundup Ready大豆已迅速实现了商业化。

草丁膦(膦丝菌素)

草丁膦[2-氨基-4-(羟甲基氧膦基)丁酸][2-amino-4-(hydroxymethylphosphinyl)butanoic acid]的除草剂特性是由于L-phosphinothricin(PPT)，其是谷氨酰胺的相似物。PPT是商业除草剂名为Herbiace，Basta和Liberty的活性成分。草丁膦是谷氨酸合成酶GS的最强烈的已知抑制剂(Devine et al.，1993)。谷氨酸合成酶的关键作用是同化植物体内的氮，此酶的抑制导致几个中间代谢过程发生功能紊乱。乙醛酸(glyoxylate)的积累使光合作用迅速停止是重要的毒性作用。因为光呼吸需要一定量的氨基酸，在谷氨酸合成酶抑制的植物中，乙醛酸的积累，使乙醛酸的氨基转移作用减弱。草丁膦在环境中根本没有残留，故是毒理学上温和，环境上安全的除草剂。在至少二篇文献综述中都以草丁膦抗性作物为重点(Mullner et al.，1993；Vasil，1994)。通过转移基因手段，编码代谢灭活草丁膦的二个基因已被用来产生抗性植株。来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因和/或来自绿色产色链霉菌(S.viridochromogenes)的pat(膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricine-aceytltransferase))PAT的基因已被转移至二十多种作物，包括小麦(Vasil et al.，1993)，油菜籽(De Block et al.，1989)，水稻(Rathmore et al.，1993)，玉米(Laursen et al.，1994)，高粱(Casas et al.，1993)，大麦(Wan and Lemaux，1994)番茄(De Bleok et al.，1989)等。然而，目前在作物各物种上几乎所有遗传工程草丁膦抗基因的成功转移和有效表达都是以抗性bar基因为基础(Vasil，1996)。

bar基因被导入小麦的胚愈伤组织或幼胚，在含PPT的培养基中再生出了植株，通过分子探针和Basta局部抗性鉴定，证实该功能基因整合进植株的基因中。已经证实，bar基因(及其抗性表现型)不管通过父本，或者母本传递，均按单基因显性孟德尔性状分离(Weeks et al.，1993)。产生抗草丁膦的bar基因已被转化到水稻品种Gulfmont，Koshihikari，Cypress和Bengal。1993至1995的田间试验展示出，这些转基因品种中的bar基因有效地表现出水稻对草丁膦的大田水平抗性(Linscombe et al.，1996)。因而，抗草丁膦(Liberty)的转基因水稻品种对改善稻田主要杂草，包括红稻的控制具有很大潜力(Gravois et al.，1997；Wheeler et al.，1997)。抗此除草剂的bar基因以单基因显性而遗传，田间筛选这种基因是相当容易的。因此，通过常规育种改良这些转基因品种的产量的潜力将会很快获得成功(Ahreus，1994；Gravois et al.，1997)。另一种对PPT抗性的新用法是将它和雄性不育基因连锁，用于油菜的杂交种子生产中(Mariani etal.，1992)。

生物技术的成功和抗除草剂作物的优越性，使得抗除草剂作物迅速向商业化推进。美国1997年大约15％的大豆种植面积是抗除草剂的大豆品种，种子由七十多家种子公司供应(Rominger，1997)。

作物杂种优势及其杂交系统

二个遗传上有差异的亲本杂种F₁，表现出生活力至少超过双亲中值[(P₁+P₂)/₂]的生物现象称为杂种优势。1908年，Shull铸造了这个术语，用于描述增加杂合性而得来的促进作用，并与杂种活力同义来描述杂种的有利效应。孟德尔于1865年和达尔文于1977年都分别在他们的试验中观察到许多杂种的优势效应，达尔文从他的观察中总结出，“一般而言，杂交有利，自交有害。”

1760年代，Josef Gottieb Koelreuter首先系统地研究了杂种优势，继而在过去的两个世纪中，杂种优势已在许多植物中被认识到(Rhodes et al.，1992)。杂种优势是短语“杂和性的促进效应”的缩语。定义为杂交所产生的增加生长或其它增长作用。不管杂交是如何产生的，杂种F₁优于其双亲中较好亲本，在自花授粉作物和异花授粉作物中，都是一个共同的现象。杂合表型中这种优势可以表现生长增加，株高增高，叶面积增大，干物质积累增多，熟期提早，抗逆性和抗病性，虫性增强，从而导致总产提高，以及品种群体的整齐度和农艺自我调节能力增强。因此，杂种优势是商业玉米工业化成功，以及许多其它作物和园艺植物育种成功的主要原因之一(Stuber，1994)。

异花授粉物种的天然杂交有利于繁殖系统确保杂交受精，而自花授粉物种的花器形态则有利于自交繁殖。因此，异花授粉物种中利用杂种优势的难题特别出在为杂种提供恰当亲本的近交育种阶段，而对于自花授粉物种，问题则在于杂种种籽生产的杂交阶段。为了经济地生产杂交种子，由花粉形态引起的异花授粉限制性必须克服，特别是对两性花(雌雄同花)而言。母本应防止自花或品种内的授粉。此外父本的花粉必须有效地传播到母本的花器上，这就要求父本具有自然有效的花粉传播机制，或采用人工授粉。母本自花受精或品种内授粉的剔除需要雄性不育性。不能产生正常功能花粉的植株称谓雄性不育(Virmani，1994)。雄性不育的产生可以通过人工去雄(castration)，化学杀雄，环境影响去雄，遗传操作去雄，以及自交不亲和性。

在“T”型(Texas)雄性不育细胞质遭到流行性病害后，杂交玉米大规模的种子生产都采用对母本去雄的方式。但是，对小麦，水稻，高粱，番茄等二性花自花授粉的作物，物种大规模地去雄在实践上是不可能的。在经济上也是不可行的。通过人工或机械去雄的难易程度，每朵花(授粉单位)结的种子数量，单位面积播种的种子量，和农作物生产成本相关的种子的最高限制价格都是杂交种子生产是否经济的影响因素。自花授粉作物必须利用一种有效的雄性不育体系来培育和生产F₁杂交品种。因此，母本的雄性不育成为了杂种种子生产的重要工具(见图1)。

在植物育种中，目前正在开发或利用的雄性不育有三种主要的类型。即是细胞质雄性不育(CMS)，环境敏感雄不育(PGMS)，包括光敏性不育(PGMS)或温敏雄性不育(TGMS)。化学杀雄剂(gametocide)诱导雄性不育(CIMS)，近来，随着生物技术的成功，转基因雄性不育(TMSS)也在积极研究中。

细胞质雄性不育-三系体系

在那些具有完全花器，每朵花器的种子少，生产种子的成本超过人工去雄的作物中，细胞质雄性不育受到特别的重视。洋葱是第一个作物，对其遗传性雄性不育研究较清楚，并开发利用于杂交品种的生产中。继而是玉米。迄今，这一遗传的雄性不育已被利用于下列作物的杂交种子生产中：工去雄的作物中，细胞质雄性不育受到特别的重视。洋葱是第一个作物，对其遗传性雄性不育研究较清楚，并开发利用于杂交品种的生产中。继而是玉米。迄今，这一遗传的雄性不育已被利用于下列作物的杂交种子生产中：玉米，水稻，高粱，珍珠粟，糖甜菜，苜蓿，小麦，棉花，油菜籽，洋葱，胡罗卜，大豆，大麦，燕麦，番茄，向日葵，矮牵牛，烟草，辣椒等(Frankel and Galum，1977)。自1976年，杂交水稻利用细胞质雄不育体系首次商业化推广以来，其栽培面积已经增至一千七百万公顷(表1)。这些年来，该项技术已经帮助中国多生产了二亿吨稻谷。因此，它对提高中国的粮食生产具有重要的战略意义(Yuna et al.，1992)。中国的杂交水稻一千七百万公顷，每公顷的平均产量达到了6-7吨(表2)。杂交水稻在世界水稻总产量中贡献达到了20％。截止70年代末，在T型雄性不育细胞质T-cms引起的毁灭性叶斑流行病以前，细胞质雄性不育是杂交玉米的主要体系。

细胞质雄性不育体系是通过细胞核和细胞质基因互相作用控制的。细胞核中存在纯合隐性不育基因(S)。细胞质中也存在不育基因(S)。两者相关，形成为雄性不育系(A)；细胞质中没有不育基因，则植株就是雄性可育的，在这样的细胞质中，如果可育恢复核基因是隐性的，则植株将保持住雄性不育系的不育特性。这样的植株称为保持系(B)；如果细胞核中具有雄性育性恢复基因，而且显性，不管细胞质中是否具有不育因子，当其与细胞质雄性不育或A系杂交后，杂种的雄育性即恢复至正常可育，这种植株称为恢复系(R)。因此，细胞质雄性不育体系又称为三系体系。即：

(1)雄性不育系(MS)，或A系，在水稻中它的雄性不育要求达到99.0％以上，并且雌性器官完全正常(表3)。

(2)保持系，或B系：B系保持A系的雄性不育特性，在水稻中A与B杂交后代的雄不育要求达到99.0％以上，用于繁殖A系；

(3)恢复系，或R系：R系恢复杂种的雄性育性至正常，即在水稻中A与R杂交后代的自交结实系要求达到80％以上。这种体系需要两个循环来生产杂种种子(见图解2)：

循环1：A系繁殖                      循环2：杂种种籽生产

雄性不育到可育的转化受细胞核与细胞质基因相互作用的控制。这种雄性不育特性在不同的地点，时间，气候等条件下都是相当稳定。育种中，除了对农艺性状培育外，用于雄性可育转化的A，B和R三系间的遗传契合要求十分严格，甚为关键。即是，A系的细胞核和细胞质都必须同时有完全的雄不育基因，雄性可育基因只能存在于保持系的细胞质中，雄性恢复基因必须存在于恢复系的细胞核中，以便将杂种的育性恢复回到正常。雄不育性的稳定是这一体系能独居舞台的主要原因(Yuan and Fu，1995)。

MS体系中生产杂种种子的两个循环系统使这一体系不仅复杂，成本很高，而且其终极产物-杂交种极易被混杂。在两个循环的任何一步，父母本都有混杂或突变的可能，这种混杂或突变都会积累到最终产品即杂种种子中。这里，我们以水稻为例，因为水稻是自花授粉作物中，利用杂种优势最成功的作物。如果在第一个循环中来自保持系的一个圆锥花序与A系混合收获，则第二个循环中B系的80-100植株混在A系的植株中。每株长10个穗子，每穗长80-100朵颖花，这样来自第一个循环的800-1000B系种子与杂种混合。此外，对于第一轮循环的每一个种子，来自80-100B系颖花的每朵颖花在开花时将产生6个花药，每个花药要产生数以万计的花粉粒，它们给周围的不育系授粉后，可能出现千万株A系株，总计从单一圆锥花序在杂交水稻田间可以产生八百万至一千万亿棵不纯的植株。如果恢复系中还有一些其它类型的杂株，杂交水稻田间的杂株率将会更高。

在杂交水稻田间，杂株和杂交水稻的株高不同，开花期不同，早开花的植株在收获时可能倒伏或落粒，迟熟植株在收获时又还没有开花或成熟，一些雄性不育株根本就不结种子。显然，这些杂株使产量大幅度降低。研究结果表明，杂交种子纯度每降低1个百分点，每公顷杂交水稻产量将减少80-100公斤(Yuan and Fu，1995)。1991年杂交水稻栽培面积已超过1700万公顷，占总的水稻面积的54.1％。因此，杂种纯度问题可能会造成巨大损失。

中国政府制定了杂交水稻种子纯度的标准，规定生产用种的纯度必须达到96％以上，杂交水稻田间杂株率应低于0.2％(表3)：如果一批种子的质量达不到这个标准，这批杂交种子(50000-100000kg)就不能作为种子使用，而只能作饲料，因杂种种子的米粒品质没有市场价值，如果种子公司提供的杂交种子，农民种后田间纯度超过了国家标准，种子公司将负法律责任。为了保证杂交种子的纯度达标，种子公司必须采取以下费时，费钱的步骤(Lou and Mao，1994)。

1).分别提纯A，B和R三系，并相互杂交以测定它们的遗传匹配以作原种生产(图11)。

2).在杂交种子的生产过程中非常严格地操作，包括：

(1)隔离，如距离，花期，屏障(树林，竹林，山等)隔离，

(2)严格地时时去杂，特别是在抽穗期。

(3)分收分打分晒分装分贮。

3).纯度鉴定，当八月下旬或九月份上旬杂交种子收获后，立即对每一批种子抽取标准样，再到海南岛(天然温室)种植鉴定，每个样品至少种植1000株以计算杂株率。例如四川省(中国的30个省之一)，常年种植300多万公顷杂交水稻，每公顷用种量为至少15公斤，全省每年需要4.5-5千万公斤种子，因此需要鉴定5000个样品。

然而，鉴定数据要在第二年三月份抽穗时才能获得，此时离四川播种只有一个月。种子公司必须在年底签定种子销售合同，第二年开始则发放到用户手中。因此，在种子交易和分发时没有种子质量数据，此隐患着今后的法律纠纷。

在此水稻例子中，大量的人力物力投入使种子价格昂贵，种子销售时没有纯度依据酝酿着生产无保障，进而导致法律纠纷。

此外，雄性不育细胞质在育种上很难获得，以满足三系A，B和R的育种要求和遗传契合而配套，这也正是七十年代美国玉米工业上病害流行的主要原因之一。德克萨斯州的玉米雄性不育细胞质(T型)于1944年在金色六月系中发现。虽然在玉米中也发现了其它雄性不育细胞质(如C型胞质，S型胞质)。但T型就杂交种子生产而言最好。因大多数自交系在T型细胞质中都表现完全而稳定的雄性不育，进而将这些雄性不育恢复到正常可育也是更容易的。两个显性核等位基因，RF₁和RF₂联合作用而抑制T型玉米的CMS。RF₂等位基因存在于最广泛应用的一些自交系中，尽管RF₁等位基因很少存在。在1969和1970年美国南方玉米叶斑病流行以前的二十年中，将自交亲本转成T型胞质而产生雄性不育取代了以去雄控制花粉的主要方式。到1970年，美国种植的杂交玉米中85％带有这种细胞质。一种生理上特异的病原品种，适合的气候和细胞质的单一化共同组合，使得1970年南部玉米小斑病成为植物病理史上损害最大，波及面最广的流行病例。美国玉米作物的15％以上被毁灭(Ullstrup，1972)。后来一经断定T型雄性不育细胞质对病菌Bipolaris maydis品种特别敏感，立即废除了在杂交玉米工业中大规模地使用T型雄性不育细胞质(Williams andLevings，1992)。

雄性不育细胞质单一化同样也存在于中国的杂交水稻生产中。尽管发现了许多雄性不育的胞质，但很少能用来培育成理想的雄性不育系用于生产。1994年，用于商业化生产的雄性不育系大约90％是来自于雄性不育野生稻的野败性雄性不育细胞质(Mao，C.X.，1994)。这就意味着野败性雄性不育的胞质覆盖了1700多万公顷的大约90％稻田，尽管已有玉米胞质单一化导致的惨痛教训。

此外，三系的复杂性和它们遗传上的相互作用也限制了杂种优势的利用，例如，产量和品质在杂交水稻中很难统一。同样，细胞质雄性不育也仅仅在细胞染色体组成倍数较低，如二倍体的水稻，玉米中获得了成功的利用，而在染色体组成倍数较高的多倍体作物如异源六倍体的小麦中利用起来就比较困难。

环境遗传雄性不育系(EGMS)-二系体系(见图解3)

环境遗传雄性不育系包括光敏遗传型雄不育系(PGMS)和温敏遗传型雄不育系(TGMS)，其雄性不育特性都受核基因控制，与细胞质无关。在夏天的长日和高温条件下，植株表现雄性不育；而在秋天的短日和低温条件下，它们的雄性变成可育。因此，该体系与CMS三系体系比较有二个优点：一是母本的双重用途，即可在夏天生产杂交的种子，又可在秋天自身繁殖，不再需要保持系，简化了杂交种子生产；二是更能有效地获得强优势杂种。因为几乎所有正常品种对雄性不育都具恢复能力，不考虑恢复基因的问题(不需要特异性恢复基因)，这就增加了根据育种目标选择父本的范围。前者降低了种子生产成本，后者提高了育种效率。据1997年在中国召开的国际二系杂种优势育种学术会议报道，环境遗传雄性不育研究已在水稻，小麦，玉米，高粱，油菜籽，棉花等作物上取得了显著的进展。

然而，从1981年以来，二系的纯度一直处于试验阶段，在粳稻中发现了光敏，温敏和温光互作(光-温敏遗传雄性不育)的雄性不育系。但在环境诱导的遗传雄性不育系籼稻中未发现纯光敏不育系，而大多数发现温敏和温光互作的雄不育系(Cheng et al.，1996)。在自然界，日光的变化是有规律的，抽穗时间可以人为地通过播种时间调节，使之发生在一定条件下。但温度的变化却不是准确有律。因此，仅有光敏不育系才能用其双重用途于生产中，以代替温敏和光温敏不育系。粳稻中的杂种优势并不是很显著。中国和亚洲的水稻主要是籼稻，籼稻中缺乏光敏不育系是EGMS二系体系至今未能在生产上利用的主要原因。研究资料表明，除长日照外，24℃以上的温度是确保雄性不育系完全表达雄性不育的严格界限(Yuan andFu，1995)。例如，1996年湖南省种子公司用Pei-ai 64作为雄性不育系制种600-700公顷。不幸的是，抽穗期间一场降雨使温度下降，一些雄性不育系植株或穗子变成可育或部分可育(朱学东，个人交流)。这个体系又一次地失去了登上商业舞台的机会。

化学诱导雄性不育(CIMS)

在作物植株中，雄性不育还可以通过化学药剂进行生理诱导，称谓雄配子杀灭剂，花粉抑制剂和化学杀雄剂，而这些植株的雌性器官功能正常，以便接受雄性亲本的花粉生产杂交种子(图4)。这一体系比较环境遗传雄不育，即二系体系更简单，效率更高，它不需要特别的育种过程培育不育系，保持系和恢复系，亲本的自身繁殖也很简单(Virmani，1985)。不需育种母本或三系那样的特殊育种过程，则进一步降低杂交种子的生产成本，亲本选择没有限制则更进一步地增强育种的有效性。对此项体系的研究从六十年代后期就开始了。中国已经研究出化学杀雄剂1号(Saxungji 1hao)，杀雄剂2号(Saxungji 2hao)等诱导化学剂。

一个理想的杀配子剂应具备：(1)选择性地诱导花粉不育，而不影响雌性不育；(2)对同一植株上早迟开的花都要系统完全彻底地诱导雄不育；(3)没有突变效果；(4)有相当长的施用时期，以克服不利气候条件变化和作物生产情况变化对施用效果的影响，以便大面积使用；(5)对人或植物无过度危害(Virmani，1994)。

迄今为止，没有任何化学杀配子剂能够满足上述严格要求，因而化学杀雄在商业规模上还不现实。近几十年来，在小麦，水稻，油菜籽，玉米等作物上的大量研究证明，下列这些化合物能诱导雄性不育：链霉素硫酸盐，丝裂霉素C，溴乙锭(Jan and Rutger，1988)及其它如萘乙酸(NAA)，RH 531[1-(对氯苯基)-1，2-二氢-4，6-二甲基-2-氧代尼古丁酸钠]，赤霉素，马来酰肼，FW 450(α，β-二氯异丁酸钠)，乙烯利(2-氯乙基膦酸)及甲基砷酸盐(甲基砷酸锌，甲基砷酸钠)等(Virmani，1985)。化学杀雄成功的主要障碍是难于经济有效地获得高纯度的杂交种子。

化学杀雄的效果取决于：

(a)化学剂的浓度：低浓度不能保证彻底的雄性不育，高浓度又可能导致一些其他的生理紊乱，如部分包颈，开花异常，有些小穗闭颖，稻穗发育不完全，甚或对柱头等雌性器官的损伤等。结果，这些生理紊乱会降低杂交种子的产量，增加种子生产成本。

(b)穗的发育阶段：谷物类作物具有无限分蘖的能力，因此同株内不同穗子之间的发育阶段不同，导致对化学药剂的敏感度也不同。

(c)施药的环境条件，施药期的小范围内的温度和无雨水等对杀雄效果都有影响。

转基因雄性不育体系(TMSS)

Mariani等(1990)报道了通过烟草和油菜(Brassica napus)的基因工程发展的新型可遗传的雄不育体系，这一体系使用了一绒毡层专性基因TA 29，此基因是从烟草的基因组库中分离，克隆的。嵌合核糖核酸酶(RNase)T1和含有烟草TA 29基因起动子的芽孢杆菌RNA酶(Barnase)基因一起能诱导雄性不育，TA 29基因受高度控制，专门在花粉中花粉囊周围的绒毡层细胞中转录。细胞毒性的TA 29-RNase基因的表达，选择性地破坏绒毡细胞层，阻止花粉形成，进而导致雄性不育(Mariani et al.，1990)。TA 29-芽孢杆菌RNA酶基因具有编码细胞外RNase的基因序列，RNase有一个对应的抑制蛋白质叫芽孢杆菌RNA酶抑制剂巴斯塔(barstar)。芽孢杆菌RNA酶抑制剂生产于细胞内，通过与细胞质内的芽孢杆菌RNA酶抑制剂芽孢杆菌RNA酶(巴勒斯)形成一个稳定的复合体保护细菌免受芽孢杆菌RNA酶的致死效应，在植物中作用为雄性可育显性的恢复基因。TA 29芽孢杆菌RNA酶基因作用为显性的雄性不育基因(Mariani et al.，1992)，因此转基因雄性不育母本植株的繁殖必须依靠与其野生型植株的杂交。因而，雄性不育诱导基因连锁于一个选择标志基因bar(巴)，巴基因产生对除草剂草丁膦的抗性，以致产生100％的雄不育母本植株群体。这种杂交的后代分离为50％的雄性不育抗草丁膦植株，和50％的雄可育草丁膦敏感植株(Denis et al.，1993)。这50％的雄可育草丁膦敏感植株通过对杂交种子生产的母本群体喷施草丁膦而清除。先锋种子公司报道了一种改良方法用于杂交玉米种子生产中清除可育株-种子包衣，即用于制种母本的种子以除草剂草丁膦包衣剂处理，使田间的50％可育株不发芽或死于发芽过程中(Songstad et al.，1997)。

总而言之，有必要改善作物，植物或种子的杂种优势，改善杂交体系和程序等等。

发明概述

本发明提供了一改良程序以更有效地生产杂交植物，作物或种子。更具体地说，本发明涉及作物或植物的杂种优势或杂交过程。于此，母本是雄性不育，父本优选是雄性可育且具有抗除草剂的基因，此抗除草剂基因传递至纯合杂种种子，植物或作物中。由这一程序产生的杂交种子，植物或作物用对应除草剂喷施或处理，所有非源于与抗除草剂转基因父本杂交的假杂交种子或植株连同杂草则被杀灭，其余的存活作物，植物及其类似都是真正的纯合杂种。

本发明提供了一种改良的种子，作物或植物杂种优势或杂交过程或系统，具体包括改良的细胞质雄性不育体系，改良的环境遗传雄不育体系，化杀诱导体系，和改良的基本杂种优势。于此，父本是雄性可育，而且有除草剂抗性基因，该基因并能传递到杂种种子。

本发明还有一特殊用途，即杂种种子播种前对特定种子进行杂种纯度鉴定的生产杂种的特殊用途。

杂种优势定义为杂交所产生的生长增加和其他方面的增长效应，不管杂交以何种方式产生，母本的雄性不育是杂交种子商业化生产的重要生物机制，雄性不育可以通过遗传操作，环境影响，化学诱导和生物工程等产生。就本质而言，雄性不育是一种生理紊乱，完全彻底雄性不育的创造或者费用昂贵，或者引发其它方面的生理紊乱。把对无选择除草剂具有抗性的基因导入雄性亲本，对此抗除草剂父本授粉所产生的杂种群体喷施这种除草剂，可以保证杂种群体的纯度，降低对完全彻底雄性不育性的严格要求。因而，简单，实用的方法，如环境和化学诱导法则可用来诱导雄性不育，雄性不育与其它生理紊乱的矛盾则可得到很好的平衡。本发明的概念可以应用到所有已经研究其雄性不育，以便利用其杂种优势的作物和植物，包括水稻(Oryza sativa L.)，小麦(Triticumaestivum L.)，玉米(Zea mays L.)，棉花(Gossypium hirsutum L.)，大豆(Glycine max L.)，高粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]，油菜籽(Brassica napus L.)，大麦(Hordeum vulgare L.)，燕麦(Avenasativa L.)，黑麦(Secale cereale L.)，珍珠粟[Pennisetum typhoides)(Burm)Stspf et Hubb.]，苜蓿(Medicago sativa L.)，番茄(Lycopersicon esculentum L.)，糖甜菜(Beta vulgaris L.)，向日葵(Helianthus annuus L.)，洋葱(Allium cepa L.)，矮牵牛(Petuniahybrida Hort.)和胡罗卜(Daucus carota L.)。

应用无选择除草剂及其抗性基因于杂种种子生产中，以利用杂种优势的方法包括：

(a)将除草剂抗性基因整合入雄性亲本；

(b)用此转基因雄性亲本给雄性不育的母本授粉，不管雄性不育是如何得到的；

(c)喷施对应的除草剂于杂种群体以控制杂种纯度和生产中的除草。

上述的技术路线能应用于下列这些已经研究其雄不育性，以便利用其杂种优势的作物和植物，它们是水稻(Oryza sativa L.)，小麦(Triticum aestivum L.)，玉米(Zea mays L.)，棉花(Gossypiumhirsutum L.)，大豆(Glycine max L.)，高粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]，油菜籽(Brassica napus L.)，大麦(Hordeum vulgare L.)，燕麦(Avena sativa L.)，黑麦(Secale cereale L.)，珍珠粟[Pennisetumtyphoides)(Burm)Stspf et Hubb.]，苜蓿(Medicago sativa L.)，番茄(Lycopersicon esculentum L.)，糖甜菜(Beta vulgaris L.)，向日葵(Helianthus annuus L.)，洋葱(Allium cepa L.)，矮牵牛(Petuniahybrida Hort.)和胡罗卜(Daucus carota L.)。

本发明的主要目的之一是提供一种改良的，简化的，经济的杂种优势或杂交程序，和一种改良的杂种产品，种子，植物，作物及其类似，以具有高纯度的杂种性，高产，高优势及其类似。

本发明的另一目的是提供一种改良的杂种优势程序，包括使用可育的父本，该父本具有除草剂抗性基因，这基因能够传递到杂种种子，植物和作物中。

本发明的另一目的是提供一种改良的细胞质雄性不育体系，环境遗传雄不育体系，化杀诱导体系及其类似，通过利用雄性可育并具有除草剂抗性基因的父本。

本发明的另一目的是提供一种新的，改良的杂交程序，以便产生和改良生产高纯度的杂种种子，作物，植物及其类似，以致于更经济，更有效，产量更高，杂种的纯度更高。

本发明的其他目的和进一步的使用范围将显然于下面的详细描述，配之以附图，附图标有参考号码，或参考标志。

附图简述

图1为杂种优势或杂交的纲要图示。

图2为细胞质雄性不育杂种优势体系或程序的纲要图示。

图3为环境遗传雄性不育杂种优势体系或程序的纲要图示。

图4为化学诱导雄性不育杂种优势体系或程序的纲要图示。

图5为本发明的改良种子，植物或作物杂种优势程序的纲要图示。

图6为本发明的改良细胞质雄性不育，环境遗传雄性不育，化学杀雄诱导雄性不育杂种优势体系或程序的纲要图示。

图7为照片图示，是证明根据本发明，显性的Libetry(自由)抗性基因通过转基因父本授粉，传递到F₁杂种中的结果。

图8为照片图示，根据本发明另一个实施方案，证明显性的Liberty(自由)抗性基因通过转基因父本授粉，传递到F₁杂种中的结果。

图9为中国1983年至1992年杂交水稻面积和产量图示。

图10为杂交水稻育种的技术路线以提高水稻产量的纲要图示。

图11为纯化亲本系的方法的示意流程图。

发明详述

本发明提供了一条改良程序，能够允许母本植株的不完全雄性不育性，然而保障所有作物和植物大田生产的杂种纯合性要求，故能更有效地生产杂交种子，增加细胞质雄性不育体系的遗传多样性(许多败育不完全彻底的雄性不育系可被启用)，简化杂种种子的生产程序(使用环境遗传雄性不育体系和化学杀雄诱导雄性不育体系取代细胞质雄性不育体系)，以致于能更经济有效地利用杂种优势。

根据本发明的一个实施方案，作物，植物或种子杂种优势和杂交程序包括以下几个步骤：

1).用基因转化，基因射击及其它分子遗传技术，程序或杂交方法，将对一种无选择除草剂如Liberty(草丁膦)或农达(草甘膦)的抗性基因整合进入任何作物或植物的一个品种，以此品种作为一种杂种优势程序，体系或项目的父本，并且根据需要繁殖该转基因或杂交父本许多次，满足种子供应。

2).用此转基因或杂交育成的父本授粉给一雄性不育母本群体(不管母本的雄性不育如何产生)，然后从这一母本植物群体上收获杂种种子。

3).播种这些杂种种子以产生杂种植物或作物，然后对这些杂种秧苗喷施与整合抗性基因对应的除草剂如Liberty或农达，杀灭所有的假杂种植株，包括混杂的母本自交得来植株；细胞质雄不育体系中由于遗传原因而败育不彻底，导致母本自交得来的植株；环境遗传雄不育体系中由于环境影响如温度而雄不育性转化不彻底，和来自雄性不育诱导(化学或物理因素)的任何其它原因导致母本自交得来的植株，还包括与母本和父本群体中混杂杂交的假杂种植株都会被除草剂杀灭，因为这些假杂交植株都没有对这种除草剂抗性的基因。相反地，所有真正杂种植株都会免受除草剂伤害，因为它们都具有经真正转基因或杂交育成的父本授粉传递而来的除草剂抗性基因，而且这种除草剂的抗性基因以一个单基因显性等位基因而遗传(Ahrens，1994；Gravcis et al.，1977)。此程序对于育苗移栽的作物或植物如亚洲的水稻，番茄等更经济，因为控制杂种纯度而需要喷施的面积较小。对于大多数作物或植物，尽管直接喷施大田需要较多的除草剂，但大田杂种作物的防杂保纯和杂草控制可以同时兼得。

4).如有必要，在作物生长季节里的任何时候都可喷施选择的除草剂于大田以防草。

参照图5和图6，利用雄性可育并且具有一种或数种除草剂抗性基因的父本，图1至图4所示的传统杂种优势或杂交体系或程序都可得到改良的简化。如图5和图6所示，本发明不仅对基本作物或植物，而且对细胞质雄不育体系，环境遗传雄不育体系，化学诱导雄不育体系以及它们共同联合等有相等的应用性。

根据本发明，母本雄性不育(MS)系不再需要是完全彻底的，纯粹的雄性不育。这样，植物，作物及其类似的雄性不育系就有更广阔的来源范围，而且将会更经济有效地培育雄性不育系，因为不再顾及绝对纯度，环境和气候变化或条件对育性转化的影响。进而，促进更广泛范围的植物或作物用作雄性不育系，而它们在传统的细胞质雄性不育，环境遗传雄性不育，或化学诱导雄性不育体系条件不能用作不育系。再则，因为降低了对雄性不育系100％纯粹雄性不育性或纯度的要求，雄性不育系的其它农艺性状和特性将会得到改进和提高。

又如图6所示，本发明提供了一种子生产体系或程序。据此，一批种子的杂种纯度可在播种前鉴定并标明，使这些种子的价值或价格更准确地预测，并且也降低生产上和法律上的危险性。

根据本发明，对大田或苗圃的作物或植物初次和再次喷施除草剂，真正杂种种子和植株对除草剂是抗性的。这样不但防杂，而且防草。再则就一定的作物而言，过去要求直接喷施选择性的除草剂，例如非除草剂抗性的玉米，棉花等等，在本发明的作物或植物杂交优势或程序中，这些作物或植物能够用选定的广谱除草剂抗性基因，直接施用一种除草剂即能防治所有杂草还能够降低成本，增加效率，提高生产。

A.实验证据

已进行了一个或数个实验证实本发明的有效性。Ce-64是一杂交水稻商业化上普遍使用的亲本，将其人工去雄，分别人工授与抗除草剂Liberty(草丁膦)转基因水稻品种Cypress PB和Gulfmont的花粉，从母本Ce-64植株上收获杂交种子，然后播种这些杂交种子于塑料盘(20×16×3英寸)中。播种后一个月，对盘中杂种秧苗喷施每英亩1磅活性物质的除草剂自由(草丁膦)。下面是除草剂处理后第九天的统计数据，在Ce-64与转基因Gulfmont的杂交中，70株母本Ce-64全部死亡，相反58株父本Gulfmont和35株F₁杂种全部成活(图7)。在Ce-64株与转基因CypressPB-6的杂交中，63株母本Ce-64全部死亡，而83株父本Cypress PB-6和46株F₁杂种全部成活，生长正常(图8)。本实验示范了本发明的可行性，即显性除草剂Liberty的抗性基因通过授粉的方式，转移到了F₁杂种植株中。因此，F₁杂种群体中任何不是经转基因父本授粉而来的植株(包括母本或母株)都被除草剂杀灭。

应用领域

1)父本繁殖：无选择除草剂喷施于父本繁殖田，该父本已被转化进对此除草剂的抗性基因，父本群体中所有的混杂植株包括水稻和杂草都被杀灭。

2)改良的三系体系：抗性基因整合到用于制杂种的父本中。这样，杂种苗圃地喷施除草剂后，所有假杂种植株都会被杀灭，包括母本雄性不育群体中混杂或变性株自交而来的或母本群体中的株间系内互交，和与父本群体的混杂杂交而来的等等。除草剂施用后下来的植物全是与转基因父本杂交而来的纯粹的真杂种。

中国政府要求母本的雄不育性为100％，因为杂种的纯度低会导致严重的减产，对于小麦，水稻，玉米，油菜等粒类作物，收获部分或经济部分是经受精而来的粮食颗粒，这就要求F₁杂种植株具有正常的可育性，以经济有效地获得杂种优势。因此，经济有效地获取母本100％的雄不育性和杂种植株正常的可育性是作物杂交各体系的两个关键。

然而，母本100％的雄不育性和由母本雄性不育杂交而来的杂种植株的正常可育性是一对矛盾的两个极端点，在细胞质雄性不育的杂交体系中，母本的雄性不育是由杂种母本的细胞核与细胞质之间的遗传矛盾或遗传距离决定的。一般而论，核与质之间引起遗传冲突的遗传距离越大，雄不育性的程度就越高。例如，野败珍汕97(W-Zhenshan 97A)不育系目前覆盖了中国1700万公顷杂交水稻中的80％面积，此不育系的细胞质来自雄性不育的野生稻，细胞核来自当地早籼品种珍汕97(Zhenshan 97)。在中国西南地区比较普遍的G-型杂交水稻的母本包含的细胞质则来自非洲西部圭亚那的一个籼稻品种Gambiaka Kokoum。另一方面，杂种的可育性是由雄性不育的母本与父本或恢复系之间的遗传互作决定的。实际上，这种遗传互作是三个遗传背景之间的互作，即细胞质供体，细胞核供体和恢复因子供体。一般而论，雄性不育母本核与质之间的遗传距离越大，由此产生的F₁杂种植株被恢复，或将其可育性完全恢复就越难。实践上，一个成功杂种体系要求母本100％雄性不育和其F₁杂种正常可育，以便取得粮食颗粒产量的足够优势，而这正是母本核与质最尖锐的矛盾和父本最强恢复能力的组合。这种组合是三个供体之间完美的遗传契合。育种实践已经证明，这样一种严格的遗传契合在自然界是非常有限的，以致造成大面积单一化不可避免。单一化引起遗传脆弱性，遗传脆弱性则易引发毁灭性的流行病虫害。例如，七十年代美国发生毁灭性的玉米叶斑流行病时，T型雄性不育细胞质(cms-T)覆盖了杂交玉米80％的面积。目前在中国的1700多万公顷杂交水稻中，W-型野败雄性不育细胞质和其保持系核供体珍汕97从七十年代杂交水稻推广以来，一直覆盖着85％的面积，同时恢复系明恢63(Minghui63)连续15年占全国杂交水稻面积的85％，尽管众所周知玉米病害流行的先例(Mao，1994)。

产生如此巨大单一性的主要原因是缺乏替代品种适合育种中这一严格的遗传契合。但是，如果将这对矛盾的两极端点一方放松一点，即允许雄性不育系有部分可育，也是降低母本细胞核与细胞质之间的遗传距离的结果，杂种可育性的恢复就会容易些，因为不育性与可育性的矛盾冲突降低了。进而，培育的体系中各个成员的替换系机会将大大增加，这样单一化就会打破，遗传多样性就会增加。例如中国的雄性不育系II-32A，优1A(You-1A)，科珍A(Ke-zhen A)等就有更高的异交产量，这会降低杂交种子的生产成本，并且它们的配合力强，可恢复性好，当与现在的杂种相比较，它们不需要象恢复系Minghui 63那样强的恢复能力，因而与之配组的文本范围大，获得强优组合的机率高。但它们的雄性不育性只有95％，当环境异常时，它们的不育性会降低，因此从稳产因素考虑，它们不能用于商业生产中(黎恒庆，个人交流)。

本发明能保障作物生产的稳定性需要，同时减小雄性不育和可育之间的矛盾，即使雄性不育系有5-10％或更高的可育，它自交和系内互交的所有种子都没有如农达或自由等除草剂的抗性基因，因此它们都不是经转基因父本授粉而来的种子。只有群体中雄性不育植株和穗子经与转基因父本杂交而结的种子才是真正的杂种种子，因为只有雄性不育植株和穗子才有机会接受外来花粉，而且当在田间喷施除草剂后，只有真正的杂种植株才能成活。因此，允许雄性不育系不完全或100％的不育，然后在田间喷施除草剂杀死所有混杂株和假杂种，是本发明的两个主要点和主要优越性。这些优越性平衡了两个极端点，降低三个供体之间遗传契合的要求，增加了培育更多新品种的机会，因此遗传多样性将增加，杂种优势将在作物生产中增强。

同时，本发明可以使耗时烦琐的杂交种子纯度鉴定方法大大简化，避免种子公司和农户之间因杂交种子纯度问题导致减产而引起的法律纠纷。

以上优点将大大降低杂交种子生产的成本，使世界作物杂种优势的利用面积进一步扩大。

3)改良的二系体系(图6)：导入抗性基因到父本中，并用于温敏雄性不育(TGMS)，光敏雄性不育(PGMS)，温光互作雄性不育(P-TGMS)系制种，即由转基因父本授粉。当对杂种苗圃喷施除草剂时，雄性不育系母本群体中混杂植株的自交而来的植株，因环境变化如温度导致育性转化不彻底而自交得来的植株和母本群体内株间或系间杂交的植株，及与父本群体中混杂株杂交而来的植株，统统都要被除草剂杀灭。留下的植株都是来自与转基因父本杂交的真杂种，这样，环境波动造成部分雄性不育种群中少量可育的现象就可以容忍，因为它们将被农药杀死。因此，本发明可以推动两系进入商业化应用阶段。在常规杂交种子的生产中，省掉保持系环节就省掉了大约一半的资源投入；省掉父本恢复力的强烈要求，增大了父母本育种配合的选择范围，因此培育出高产优质杂交组合的概率增大，即更大机率地获得优势更强的杂交组合，本发明的技术有助于两系体系取代传统的三系体系，因为除了降低成本以后减少了两个环节。

4)改良的化学杀雄不育体系(图6)：导入抗性基因到父本中，用此父本给化杀母本授粉，在杂种田苗期喷施除草剂，杀死由于化学杀雄不彻底剩下的母本自交植株，这些母本互交或系间杂交，或与父本群体中混杂株异交等植株，留下的都是与转基因父本杂交的真杂种。这样，在化学杀雄制种田里由于杀雄不彻底导致的少量可育株或可育穗则可容忍，这种容忍使我们可以用较低浓度的杀雄剂，进而缓和了诱导雄性不育与其它生理紊乱之间的矛盾，促进化学杀雄体系进入商业应用阶段。在此改良体系中，主要考虑杂种优势的各个方面，如产量，品质等，考虑其中一项或一起考虑该系统使更好为最好。这一改良的化学杀雄不育体系可能会在作物杂种优势利用的生产中发挥主要作用。

5)本发明在小麦，水稻，玉米和油菜籽中的应用例证。

小麦(Triticum aestivum L.)

小麦是世界上最大的栽培作物，全世界每年小麦种植面积约为2.32亿公顷，产小麦约5.6亿公吨；美国每年为2500万公顷；产小麦6500万公吨。

作为主要作物的杂种优势利用在世界上总是热点。在小麦细胞质雄性不育已被证明希望不大后，目前一些私人公司正试图通过化学杀雄(CIMS)或杀配子剂来利用小麦的杂种优势，因为已经证明细胞质雄性不育是无助的。例如，孟山都(Monsanto)的一个分公司Hybri Tech种子跨国公司(HTSI)，正在推进昆腾(Quantum)系统，包括系列杂交小麦，它们是通过化学诱导杀雄技术生产的(Hybri Tech，1997)。该公司的时事通讯WAVES(波浪)报道，美国蒙达纳(Montana)州中南部哈特利(Huntley)市农民Leroy Gabel先生，七年前开始种植Hybri Tech公司的昆腾杂交小麦，至今他已种植了500英亩昆腾杂交小麦，HTSI总结了多年多点田间试验和农场示范的结果，表明杂交小麦稳定地比常规小麦增产10-20％。因此，只要它的杂交种子生产经济有效，发展杂交小麦是有利可图的。

已有人提出使用转基因技术将除草剂抗性基因结合进小麦杂种体系中(Gressel，1996)；即将显性抗除草剂基因转入母本。这样，母本和父本就可以一起播种以便利异交授粉更容易，父本完成授粉任务后就用除草剂将其杀掉，经过除草剂清理后，母本植株上收获来的种子则全是杂交种子。

这一提案有一重要假设，即母本种群是完全雄性不育的。但正是这个假设或要求，使全世界各国小麦科学家经过几十年的努力后仍觉希望不大，上面描述的二倍体水稻，玉米所面临的遗传契合的两个极端点的困难表明在异源六倍体的小麦中难度就更大。因此，这一提案没有触及根本的障碍，即雄性不育性与可育性的两个极端点或遗传冲突。至于异交授粉，中国杂交水稻的实践已证明，父本与母本植株行为1比10，甚至1比12时，异交授粉仍能有效地进行。

这里，我们设想这个假设可以象现在的小麦杂交体系和以前的杂交玉米的细胞质雄性不育那样可行，将除草剂抗性基因转到母本中仅仅能消除来自父本的混杂。实际上在杂交种子生产体系中，正常可育的父本植株仅占制种群体的十分之一到十二分之一。这十分之一到十二分之一的父本群体中的杂株可以用人工去除，特别是在发展中国家更没问题。另一方面，所有来自母本方面的混杂，包括细胞质雄不育体系中遗传操作产生的不完全彻底雄性不育，光敏和温敏雄不育体系中气候变化产生的不完全雄不育，化学杀雄体系中杀雄剂浓度和气候条件引起的不完全雄不育，以及母本群体中的天然突变体等都不能够用除草剂清除掉，因为所有这些来源的混杂植株都具有对除草剂的抗性。因此该项提议仍然需要作物杂交体系中雄性不育和可育两个极端点。事实上，成熟的父本植株是很难被除草剂杀死的。

因此，母本具有抗除草剂抗性的提案，虽然有助于发达国家采用机械化生产作物杂交种子，但是因为完全雄性不育的严格要求没有引起公众的注意。

本发明有助于改进的化学杀雄体系大面积的商业化推广应用。改进的化学杀雄体系没有两个极端点的遗传矛盾冲突和遗传契合问题，不需要培育雄性不育系母本程序，其改进的程序如下：

A)选择有较强一般配合力的大面积推广小麦品种作为父本，将对除草剂的显性抗性基因通过分子转化或者从转基因小麦材料杂交法转移整合到父本中；

B)用上述父本与许多有一定遗传距离的品种作母本杂交，通过鉴定杂种的产量，品质，抗逆性等育种目标筛选出与之匹配的母本；

C)将父本和母本间隔种植在田间；

D)在适当的时期对母本群体用较低浓度的化学品杀雄(低至不引起母本雌不育性和其它生理及形态异常，特别不能引起雌不育)，施以授粉辅助措施以使杂交种子高产。仅从母本上收获杂交种子。注意，由于化学杀雄不彻底，部分母本可育情形是可以容忍的，重点考虑杂交种子的产量，80％被诱发雄性不育或更低一些仍然可以商业使用；

E)对收获的杂交种子进行抽样，将样品种植在育苗盘中，苗期喷施与抗性基因对应的除草剂，通过统计死亡植株(假杂种)和成活植株(真杂种)计算种子纯度。并标度这批种子。

F)播种前，根据要求的田间作物密度和标度的种子纯度计算播种量，田间植株3-6叶期施肥前，喷施抗性基因相应的除草剂杀灭假杂种，同时控制杂草。

一种通过种子处理的化学诱导雄性不育的新领域值得开展研究，直穗(Straighthead)是一种穗不育的生理病害，因而圆锥花序直立，此病常见于美国南部的水稻种植带。甲砷酸单钠(MonosodiumMethanearsonate，MSMA)已被公认为是评估直穗病的药剂，即水稻播种前施于土中以便评估育种材料对直稔病的抗性。这个事实给我们一个启示或很好的理由，深入研究在杂种体系中通过种子处理而诱导母本的雄性不育。如果此研究成功，雄性不育的诱导程序将大大地减化，杂交种子的生产成本将进一步降低。

同时，本发明能缓和雄性不育和可育之间的遗传矛盾冲突，这给小麦科学家提供了探索提莫菲维(T.Timopheevii)以外的其它雄性不育细胞质的机会，提莫菲维是目前广泛用来产生完全雄性不育的细胞质。

水稻(Oryza sativa L.)

本发明通过单基因抗除草剂的转基因父本，就可直接在杂交水稻体系中应用。

在中国和其他亚洲国家，本发明能够：

1)降低或省掉在杂交制种和雄性不育系自我繁殖两个循环中田间去杂，使杂种纯度差的杂交稻种子免除报废(在中国，纯度低于96％的杂交种子则禁止商用)。

2)商业推广应用II-32A，You-1A，科珍A等多种雄性不育系，打破遗传单一性，增加遗传多样性，提高杂交制种产量和F₁杂种的产量。

3)通过有效地清除由于环境气候变化造成的雄不育不稳定，进而产生的假杂种和混杂株，用环境雄性不育(二系)包括光敏，温敏和温光敏不育系去取代三系(细胞质雄性不育)，简化水稻杂交体系，降低杂交种子生产成本。

4)通过有效地解决化学杀雄不彻底的问题，推动化学杀雄体系(CIMS)进入商业化实用性阶段。因为该体系中不需要象在PGMS和TGMS体系中那样培育雄性不育母本，它将进一步降低杂交种子生产的成本。

上述这些效益将能降低生产成本，增加生产利润，这又将推动杂交水稻面积的进一步扩大，增大除草剂在这些国家的用量。

在美国和其他发达国家，提高机械操作和稻米品质是这些国家主要关心的问题，这就决定了只有二系体系和化学杀雄体系才能在这些国家行得通。

因此，本发明能够：

1)改良二系体系：德克萨斯州的水稻技术公司(Rice Tech，Inc.)已对两系杂交水稻研究多年，该公司生产的杂交水稻已达到品质要求，并已有用户签约购销(谢放鸣，个人交流)。然而，种子的杂种纯度是它要商业化推广的主要问题，因为不育系在环境条件(温度)发生变化时，产生部分可育。应用本发明，水稻技术公司就能在3-5年内，将杂交水稻商业化地推广到美国和其他发达国家中去。

2)改良化学杀雄体系：在此CIMS体系中，杂种的米粒品质问题就能较易解决。例如，Cypress和Litton是两个标准的长粒型品种，它们都有着不同的遗传系谱和地理起源，如果这二品种之间杂种具强优势的话，则此杂种的稻米品质也应是典型的长粒稻。Cypress用作父本，因为它已被转入了除草剂自由(Liberty)的抗性基因；假如已研究出理想的杀雄剂，用Litton作母本，通过使用除草剂自由，整个生产程序与上述的小麦相同。如果Cypress的高度不足以充分授粉给母本穗子，自由的抗性基因也能够从Cypress转移到Kaybonnet，其方法是用Kaybonnet作为轮回亲本连续回交，对后代喷施「自由」进行连续选择，具有抗性的Kaybonnet就可作为父本和Litton配组，用同样的方法可以将抗「自由」的基因转移到中粒型水稻品种如Bengal和Orion等中，实现中粒型杂交稻的配组。中国已在化学杀雄杂交水稻方面进行了数十年研究，但仍需进一步研究和筛选有效的化学杀雄剂，完善雄性不育的诱导技术。杂交技术公司用到小麦的化学品，也可以用于水稻研究。

玉米(Zea mays L.)

每年全世界玉米种植1.3亿公顷，美国种植2700万公顷。玉米是第一个谷类作物通过细胞质雄性不育，成功地商业化利用杂种优势。花粉控制的两种普遍应用的方法是抽穗去雄和细胞质雄性不育，自七十年代T型雄不育细胞质引起玉米叶斑病流行后，抽穗去雄就成了最普遍采用的花粉控制方法。抽穗包括用人工拔出母本的雄花花序，即人工去雄，或用机械拔出雄花即机械去雄，或者二者的结合。为了保证每一制种田达到必须质量(种子遗传纯度)标准，必需在母本抽雄散粉前和/或母本的花丝抽出前拔去母本雄花序。如果在抽穗或抽丝期下雨或刮风，去雄工作就更加困难。这是一项费用昂贵的操作，九十年代初去雄一公顷母本植株，种子公司就得平均花费250-320美元，工资的增加和农业劳动市场的减弱(包括从事农业劳作的人减少和分布不均)，是玉米种子生产业面临的两个挑战。

先锋种子公司(Pioneer)报道，转基因技术在玉米杂种体系中的应用已取得重要实验进展(Songstad et al.，1997)。本发明技术的帮助下，鼓励玉米科学家走回细胞质雄性不育体系。由于可以容忍细胞质雄性不育系的部分可育，F₁杂种的正常可育性成为主要考虑对象。这样，雄性不育细胞质C型，S型和其它除T型外的许多型可用于玉米的杂种体系中，生产中势必出现遗传多样化的好局面，流行病害也会得到有效地控制。同时，与小麦相似的化学杀雄诱导雄不育也值得在玉米中开展研究。叶面喷施化杀剂的操作，玉米比其它禾谷类作物都容易些，三则，如水稻中所述的环境诱导雄不育包括光敏(PGMS)，温敏(TGMS)和光温敏(P-TGMS)的雄不育法也值得在玉米中开展研究。与本发明结合，这三方面的任何一方面成功都将使种子公司从耗工，费钱的抽穗去雄中解放出来。

油菜籽(Brassica napus L.)

发展芥菜型油菜杂种F₁的商业潜力十分大，已经证明杂种的产量优势与玉米，珍珠粟和水稻的相当，甚或更高(Banga，1993)。

油菜中，已主要对三种杂种优势体系进行过研究，即细胞质雄性不育(CMS)体系包括Raphanus  CMS，Bronewski-Shiga ThompsonCMS，Polina CMS，Oxyrrhina CMS等，自交不亲和系，和化杀雄不育体系。几个主要的农业化学公司，如安贵福(AgrEvo)，日本烟草(Japan Tobacco)，先锋等都在从事油菜和其它作物的转基因雄性不育体系(TMSS)的研究。安贵福公司的Liberty-Link和SeedLink项目就是这个体系的例子之一(AgrEvo U.S.A.Inc.，1997)。据该公司的通讯报道，通过转基因技术，雄性不育基因已被转移到油菜的母本中，对此雄不育恢复的基因也被转移到父本中。并称“从1996年秋，Liberty Link和Seed Link结合的油菜种子已在加拿大市场成功地应用”。

通过将自由或农达的基因转进父本品种，本发明的技术就可直接经济有效地应用于上述的三个体系中。如果一除草剂抗性父本品种具有对CMS系的恢复基因的话，则这一转基因父本可以同时应用于三种体系中。

1)改良的细胞质雄性不育体系：由于本发明降低了雄性不育与可育这两个矛盾极端点的遗传冲突，败育不很彻底但配合力很强的雄性不育系与转基因父本测配组合，与上述的水稻一样，在F₁生产田间下，杂种苗期喷施自由或农达除草剂，消灭假杂种和杂草，保证田间的杂种纯度。

2)改良的自交不亲和体系：在充分通风的塑料薄膜中用CO₂处理，诱导自交不亲和系自交结实以达自身繁殖。自交不亲和系与含有除草剂抗性基因的自交亲和系作父本间隔种植，大量生产杂交种子，真杂种则含有来自父本花粉的除草剂抗性基因，因此，不完全自交不亲和系产生的假杂种可以通过田间喷施除草剂而排除。

3)改良的化学杀雄杂交体系：任何转基因的品种都可在此体系中用作父本，技术程序或方法与上述的小麦或水稻之有关部分相同。

本发明与转基因雄性不育体系(TMSS)的比较

下列几点是上述安贵福，先锋，日本烟草(AgrEvo U.S.A.Inc.，1997；DeBlock and Debrouwer，1992；Denis et al.，1993；Mariani et al.，1990，1992；Songstad et al.，1997)等公司推崇的转基因雄不育系与本发明的差异：

(1).基因数量：转基因雄不育体系使用三个基因：即母本中需要共转化过程的与雄性不育(芽孢杆菌RNA酶)紧密连锁的除草剂抗性基因(bar)(De Block and Debrouner，1991)，和父本中的育性恢复(芽孢杆菌RNA酶抑制剂)。本发明只需要一个基因，即父本中的除草剂抗性基因(如bar)。基因转移是外源基因随机地插入DNA上的一个点，在那个点的原有基因被取代。对大量处理个体的广泛筛选，鉴定出哪些不可见的或不重要基因被取代的个体，即这些转基因系除了外源基因带入而增加的性状外，与原始野生型完全一样。因此，在转基因雄不育体系中，两个连锁基因转化进母本，和一个基因转进父本是一项困难得多，复杂得多，耗资巨大得多的工程，而且，TMSS成功的机率还被这困难性和复杂性大大降低。显然，仅单个基因转化的本发明技术具有大大的优势性。

(2).雄不育性的来源及其繁殖：转基因雄不育体系中，两个连锁基因(bar和芽孢杆菌RNA酶)的转化使母本变成雄性不育和对除草剂抗性，母本依靠与原始品种植株或野生型杂交而得以保持或繁殖自已，因为这些杂交后代要分离出一半的雄性不育株；分离出的另一半可育植株则通过对制种田喷施除草剂，或母本种子包衣来清除。这种消除会使制种田雄性不育母本样本分布很不均匀，进而限制杂种的制种产量。

本发明利用全世界数十年对杂种优势的研究而积累起来的雄性不育，即目前育种中所利用的三个杂种体系：

(A)CMS细胞质雄性不育体系：雄性不育由雄性不育细胞质而产生，雄性不育的繁殖是通过其保持系而实现，如杂交水稻，杂交玉米和杂交油菜等中的模式。

(B)环境遗传雄性不育(EGMS)体系：雄性不育的产生和繁殖都是通过对环境的操作实现的，即植株在夏天高温长日照条件下抽穗就表现雄不育，此用以制种；但在秋天低温短日照条件下抽穗则表现雄性可育，此用以繁殖。据报道，这一体系已在水稻，小麦，玉米，高粱，油菜，棉花等取得重大的研究进展。

(C)化学杀雄(CIMS)体系：雄性不育是通过施用化学药剂给植株而产生的，不施这种化学杀雄剂就能达到自身繁殖的目的，即让母本植株正常生长，自交结实。

(3).杂种组配的灵活性：在转基因雄不育体系中，母本是两个连锁基因的转基因系，父本是一个基因的转基因系。任何优良品种要进入杂种体系中成为一个亲本，必须先要经过转基因过程，才能得到与现有杂种体系中任何成员测交的机会。换言之，野生型包括天然雄性不育系不能与父本进行测交，因为它们不具有除草剂抗性基因(bar)和转基因雄性不育基因(芽孢杆菌RNA酶)，而这二个基因是该体系中母本的关键性状；同样地，任何野生型或天然植株都不能与母本测交，因为它们不具备对转进母本的雄不育基因的恢复基因(芽孢杆菌RNA酶抑制剂)，而这个基因正是该体系父本的关键性状。显然，这个杂交体系中亲本的选择受到极大的限制。

本发明的技术中，只有父本是一单基因(bar)的转基因系，因此表明，除了育种目的之外，根本没有任何限制因素使母本进入杂交体系。此外，任何优良品种要进入杂交体系成为父本，只需在正式进入以前转进抗除草剂基因即可。进入以前，可以将其与目标母本进行大量测交以保证该品种有产生强优势的能力。因此，所有转基因后的品种都能保证进入杂交体系中成为父本。实际上，环境雄不育和化杀而致的生理雄不育体系不要求特别的恢复基因恢复它们的育性。因此，如果三个体系共存在某种作物的生产中，优良的细胞质雄不育体系中的转基因父本也应该是环境雄不育体系和化杀雄不育体系中的优良父本，如果只有环境雄不育和化杀雄不育二体系在某种作物生产中的话，则这一优良转基因父本可以互相借用。一般而论，育种过程中任何具有很强一般配合力的新材料，都可转基因而成为杂交体系的潜在父本。一个转基因过程大约需要3年，即用此新材料与大多数情况下除草剂抗性品种杂交，再用此新材料作轮回亲本而连续回交，每一后代都用除草剂进行筛选。

(4).除草剂的施用：在转基因雄不育体系中，除草剂施用于制种田的母本群体中，以清除另一半的雄可育植株。然而，根据本发明的技术，除草剂施用于F₁杂种的生产大田中，以便消除所有的假杂种植株，保证杂种的均一性，包括细胞质雄不育体系中的MS细胞质，环境雄不育体系中的天气异常的因素和化杀体系中各诱导环节的因素，而造成的不完全彻底雄性不育，由此进而产生的自交株，系内异交株和混杂个体的杂交株等等。

本发明不仅能增加现有种子，作物或植物杂种优势的有效性，降低优势利用的成本，而且还能使以前不可能的商业应用杂种优势，杂交种子，作物或植物的一些方法变得可能，而且经济，有效。尽管本发明描述起来相当简单，但是却能产生难以预料和无法想象的结果，如降低成本，降低用工，增加生产，增加纯度，增加遗传多样性，增加杂种优势，促进杂种优势的进一步利用等等。

如图9所示，尽管杂交水稻的研究和商业的杂种优势和水稻的应用在过去二十年取得了重大的进展，但似乎现有杂交水稻的产量却徘徊不前。本发明通过增加母本或雄性不育系和父本的育种选择范围，定能进一步提高杂交水稻产量和杂种优势。

如图10所示的不同育种方法与水稻杂种优势水平的比较，本发明可望促进较远缘杂种的优势利用，使优势水平进一步提高。

如图11所示，给出了纯化亲本系方法的一个实施例。该实施例涉及传统三系体系，本发明对此程序有大大简化。

表1.中国杂交水稻常年种植面积及其占总水稻的比例

年份	杂交水稻面积(百万公顷)	占总面积比例％
			198019811982198319841985198619871988198919901991	4.795.115.626.758.858.619.5610.9713.3313.3316.6517.64	14.415.417.020.426.726.929.634.141.740.850.354.1

资料来源：中国农业科学院(CAAS)，1992年

表2.中国杂交水稻比常规水稻的产量增加

年份	杂交水稻(公斤/公顷)	常规水稻(公斤/公顷)	杂种产量增加(％)
				198019811982198319841985198619871988198919901991	5296.55310.05865.06375.06405.06472.56600.06615.06600.06615.06675.06660.1	2940.54113.04447.54774.54992.04815.04857.04779.04539.04534.54642.54537.5	34.429.331.933.528.234.435.938.445.445.943.846.8

资料来源：中国农业科学院(CAAS)，1992年

表3.亲本系和杂种的种子质量标准

系	级别	纯度＞＝(％)	净度s＞＝(％)	发芽率＞＝(％)	湿度＜(％)	杂草＜(g/kg)
							A系(CMS系)	原种一级二级	99.999.599.0	99.099.097.0	90.090.085.0	13.013.013.0	005
B系(保持系)	原种一级二级	99.999.599.0	99.099.097.0	96.096.093.0	13.013.013.0	005
							R系(恢复系)	原种一级二级	99.899.599.0	99.099.097.0	96.096.093.0	13.013.013.0	055
F1杂种	一级二级	98.096.0	98.097.0	93.090.0	13.013.0	05

图7，抗除草剂自由(Liberty)的转基因Gulfmont授粉常规水稻品种Ce-64，播种30天后每英亩1.0磅自由(草丁膦)活性成分的浓度喷施。喷雾Liberty后9天摄此照片，70株母本Ce-64全部死亡，58株父本Gulfmont和35株来自母本Ce-64与父本Gulfmont的杂种F₁全部成活，这表明显性的Liberty抗性基因通过转基因父本授粉的方式传递到了F₁杂种里。

图8，抗除草剂自由(Liberty)的转基因Cypress PB-6授粉常规水稻品种Ce-64，播种30天后以每英亩1.0磅自由(草丁膦)活性成分的浓度喷施，此照片摄于喷雾Liberty后9天。63株母本Ce-64全部死亡，83株父本Cypress PB-6和46株来自母本Ce-64与父本Cypress PB-6的杂种全部成活。这表明显性的Liberty抗性基因通过转基因父本授粉的方式传递到了F₁杂种里。

因此，人们将会认识到本发明的改良作用，提供了一高效率的种子，作物或植物杂种优势或杂交的体系，方法，技术程序或过程等。本发明的方法是经深思熟虑的，从前面的论述和图解，本领域的技术学者们会感到其可行性是显而易见的。具体实施时或许有些改动和/或完善，但不会偏离本发明的主要精神。前面的论述和图解仅想例论性地作些解释，但并不局限。本发明的真正精神和包含的范围由附录的权利要求来决定。

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Claims (21)

1.一种生产真的杂种种子及其作物并可防止来自母本方面混杂的杂交方法，其中母本是雄性不育，不含抗除草剂基因，因此对一种选定的非选择性除草剂没有抗性；父本是雄性可育，含有抗除草剂基因，并抗选定的非选择性除草剂来防止混杂，该杂交方法包括以下步骤：

使父本和母本杂交，其中父本是雄性可育的并含有抗选定的非选择性除草剂的显性核基因，并抗选定的非选择性除草剂；母本是雄性不育，不包含抗上述选定的非选择性除草剂的基因并且不抗上述的选定的非选择性除草剂；

从母本收获种子，这些种子含有携带来自父本的除草剂抗性基因的真的杂种种子和假的杂种种子，其中真的杂种种子产生的植株抗上述的选定的非选择性除草剂，而假的种子所产生的植株不抗上述的选定的非选择性除草剂。

2.权利要求1的方法，还进一步包括以下步骤：

播种上述收获的一部分种子，用所述选定的非选择性除草剂对所述种子的植株进行处理，以杀灭所有的杂草和假杂种植株，以此鉴定生产的杂种种子纯度。

3.权利要求1的方法，进一步包括以下步骤：

种植或播种收获的种子，处理从所述收获的种子长成的植株，杀死所有假的杂种植株和杂草，从而只剩下纯杂种植株生长、并收获之，以此获得最大的杂种优势。

4.权利要求1的方法，其中所述种子或植株选自如下：水稻，小麦，玉米，棉花，大豆，高粱，油菜籽，大麦，燕麦，黑麦，珍珠粟，苜蓿，番茄，糖甜菜，向日葵，洋葱，矮牵牛和胡罗卜。

5.权利要求1的方法，其中所述父本含有抵抗非选择性除草剂的显性核基因，这些非选择性除草剂完全无选择地杀除植物，包括草丁膦，草甘膦及其组合。

6.权利要求1的方法，其中所述产生的种子或作物用无选择性除草剂进行处理。

7.权利要求3的方法，其中农田里经除草剂处理后留下的作物都是纯粹的真杂种。

8.权利要求1的方法，其中所述方法增加了杂种种子及其作物的遗传多样性。

9.一种改良的杂种优势或杂交方法，包括的步骤有：

培育父本，此父本是正常可育并含有抵抗选定的非选择性除草剂的显性核基因；

培育母本，此母本是雄性不育的并不包含所说的抵抗所述的选定的除草剂的基因；

将父本和母本杂交；

从该母本上收获种子，这些种子包含具有来自父本的除草剂抗性基因的真杂种种子和不含除草剂抗性基因的假杂种种子。

10.权利要求9所述的方法，还包括的步骤有：

用选定的除草剂对由所收获的种子长成的植株进行处理，杀死所有的杂草和假杂种。

11.一种通过改良生产细胞质雄性不育即三系体系的方法，这种改良包括的步骤有：

使用的雄性恢复或R系是正常可育的，并且含有显性核基因对除草剂产生抗性，使用的母本是细胞质雄性不育，并且不含抗除草剂基因。

12.一种通过改良生产环境遗传雄性不育即二系体系的方法，这种改良包括的步骤有：

使用的父本是正常可育的，并且含有显性核基因对除草剂产生抗性，使用的母本是环境诱导的雄性不育，并且不含抗除草剂基因。

13.一种通过改良生产化学杀雄诱导雄性不育体系的方法，这种改良包括的步骤有：

使用的父本是正常可育的，并且含有显性核基因对除草剂产生抗性，使用的母本是化学杀雄后的雄性不育，并且不含抗除草剂基因。

14.一种新的杂交生产杂种种子的方法，其中应用了非选择性的除草剂和其抗性基因，该方法包括以下步骤：

将对选定的除草剂抗性的显性核除草剂抗性基因整合到雄性可育的父本中以产生除草剂抗性父本；

给不含所说的抗性基因并对选定的除草剂非抗性的雄性不育母本授以除草剂抗性父本的花粉；和

对来自除草剂抗性父本和非抗性母本的杂种群体处理选定的除草剂以控制杂种纯度和杂草。

15.权利要求14所述的方法，与下列作物相关联，它们是水稻，小麦，玉米，棉花，大豆，高粱，油菜籽，大麦，燕麦，黑麦，珍珠粟，苜蓿，番茄，糖甜菜，向日葵，洋葱，矮牵牛和胡罗卜。

16.一种改进的用于有效的生产杂种种子的杂交方法，该方法可以保证所用作物的田间杂种纯度，包括以下步骤：

整合对一种非选择性除草剂抗性的显性核抗性基因到将在杂种优势方法中被用作父本的作物的栽培品种中，并尽可能多的繁殖该父本以满足制种需要；

用父本的花粉给不含对所说的非选择性除草剂抗性基因的雄性不育母本群体授粉；

从母本群体收获杂种种子；

种植杂种种子以获得杂种作物，并用与整合的抗性基因相匹配的非选择性除草剂处理杂种幼苗以杀死所有的假杂种植物，这是因为所有的假杂种植物都不含有对非选择性除草剂抗性的基因，反之，所有的真杂种植物都不受非选择性除草剂的影响，这是因为它们都有通过授粉而从真父本转来的抗性基因，而且该抗性基因对除草剂的抗性是一个简单的显性基因遗传；除草剂可以在大田中使用，以杀死杂种群体中的任何假的杂种植物和同时杀死大田中的杂草。

17.权利要求1的方法，其中通过细胞质雄性不育，环境雄性不育，化学诱导雄性不育中的一种或其组合使所说的母本雄性不育。

18.权利要求1的方法，其中所说的母本是A系而所说的父本是三系系统中的恢复系。

19.权利要求1的方法，其中所说的父本和母本形成了一个两系系统。

20.权利要求1的方法，其中所说的母本不能用选定的非选择性除草剂处理，这是因为该母本对该除草剂没有抗性，必然被杀灭，而父本则可以用选定的非选择性除草剂处理以控制杂草和父本的纯度。

21.权利要求1的方法，其中所说的抗选定的非选择性除草剂的显性核基因是一单个的显性基因。

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