CN1036120A - 一种培育杂交水稻种子的方法 - Google Patents

Abstract

现公开一种有效地培育杂交水稻种子的方法。 本发明的方法包括使雄性不育性母本水稻具有抗除 草剂性，将母本水稻与父本水稻杂交以生成杂交水稻 种子，以及通过使用母本对其有抗性的除草剂来处理 亲本，以便只将父本水稻杀死，从而选出杂交水稻种 子。

Description

本发明涉及一种培育杂交水稻种子的方法，尤其涉及利用雄性不育水稻有效地培育杂交水稻种子的方法。

水稻通过自花传粉进行自然繁殖。因此为获得杂交水稻种子，必须在开花之前摘除雄蕊。摘除雄蕊很费力，故难以获得大量的杂交水稻种子。为解决这个问题，使用了雄性不育的水稻秧并省去摘除雄蕊的费力工作，从而大大地提高了生产效率。

众所周知，一般说来，如果将植株进行杂交、杂交产物（第一代杂交后代F1）获得高度改善的特性，从而提高了质量和产量。我们把这种现象称之为杂种优势。利用杂种优势可培养出杂交水稻。

保持母本的胞质雄性不育性，这对培育杂交水稻来说是不可缺少的。为保持胞质雄性不育性，在母株和父株杂交后，分别收集在母株中培育的种子和在父株中培育的种子（已无用）。

这种方法有一个缺点，即要用人工将杂交种子同由父株自花传粉培育的种子分离开。因而，培育杂交水稻的效率受到限制。此外，由于母株和父株应在不同的拢里种植，以确保分别收集杂交种子，这样就不可能缩短母株和父株之间的距离，因此，传粉率低，导致杂交种子单位面积产量也相应变低。

本发明的目的是提供一种培育杂交水稻种子的方法，这种方法克服了传统方法中的缺点，而且用这种方法能高效培育出杂交种子。

众所周知，植株对除草剂的敏感程度不同。申请人通过广泛研究发现、利用植株对除草剂的不同敏感性，可以把杂交种子和由自花传粉产生的种子分离开，以便达到本发明的目的。

在本发明的方法中，使具有雄性不育性的母本水稻具有抗除草剂的特性。然后，让这种母本水稻与一种父本水稻进行异花授粉，从而培育出杂交种子。如果不进行处理，父本水稻的自花传粉也培育出种子，那是无用的种子。可是在本发明的方法中，用除草剂处理亲本，被选出来的只有杂交水稻种，母本对该除草剂具有抗性，只有父本水稻被杀死，而母本却保持存活。

根据本发明的方法，由于存活的只是具有雄性不育性的母本，那么能够高效率地收集杂交种子。从而摘除雄蕊的繁重工作就可免掉。另外，由于在收集种子时，没有必要区分母本和父本，所以母本和父本可以混合种植，结果，不象在传统方法中那样让母本和父本分垄种植，母本和父株之间的距离就能够缩短，因此提高了母株和父株之间的传粉率，也提高了杂交种子的单位面积产量。再者，由于能使胞质对除草剂具有抗性，所以能用三系法培育出比由传统方法培育的种子具有更高纯度的种子。

在本发明的方法中，通过遗传重组技术，或者通过促使变异的方法使雄性不育性的母本水稻对除草剂具有抗性。

可以通过遗传重组技术形成除草剂抗性的办法，举例如下：

首先，将水稻原生质体从水稻细胞悬浮液中离析出来。从细胞悬浮液中生成原生质体是众所周知的现有技术。用众所周知的电击穿技术将一种产生除草剂抗性的基因引入由上述方法离析出来的原生质体〔例如参见FrommM等所著《电击穿法转入双子叶（Monocot）和单子叶（Dicot）植物细胞内的基因表达》（Expression）of    Genes    Transferred    into    Monocot和Dicot    Plant    Cells    By    Electroporation），美国全国科学院文集Proc.Natl.Soi.U.S.A.82（17），1985〕。在本技术领域，产生抗除草剂特性的基因是公知的，例如，这包括抗磺酰尿素的基因〔Mazur    B.J等所著《用密码进行乙酰乳酸（Acetolactate）合成的植物基因的分离与定性，两类除草剂的靶酶》（Isolation    and    Characterization    of    Plant    Genes    Coding    for    Acetolactate    Synthase，The    Target    Enzyme    for    Two    Classes    of    Herbioides），《植物生理学》（Bethesda），85（4），1987，第1110-1117页〕，抗镇草宁（Glyphosate）基因〔见Shad    D.M.等所著《转移基因植物中工程除草剂的耐量（Engineering    Hericide    Tolerance    in    Transgenio    Plants），《科学》（华盛顿），233（4762），1986，第478-481页，Thompson    G.A.等人所著《用密码导致抗镇草宁特性的一种细菌基因在植物中的表达》（Expression    in    Plants    of    a    Baoterial    Gene    Coding    for    Glyphosate    Resistance）Weed    sci    35（副刊1），1987，第19-23页〕和抗莠去津基因。然后，经培养，原生质体再生出愈伤组织。从原生质体中再生愈伤组织是公知的技术，并且在美国正审查中的专利申请06/865，519号，06/865，422和06/865，423号（或在中国申请的86103448号和中国专利8610337.4和86103461.9）均有所描述。在使愈伤组织再生的培养基中加入有效量的、基因对其有抗性的除草剂，加入量以能选出抗除草剂的愈伤组织为准。经过除草剂处理，那些对除草剂不具有抗性的愈伤组织被杀死，从而只选出符合要求的对除草剂具有抗性的愈伤组织。

通过促使变异也可产生抗除草剂的性能，方法如下：首先，需对水稻细胞的悬浮液进行一种常规的变异处理。常规变异处理包括，X射线辐照（最佳值为15-100千拉德）或γ射线辐照和用乙烷基甲烷磺酸盐处理（重量百分比的最佳值约为0.25），或用亚硝基脲，亚硝基胍或吖丙啶处理。将处理过的细胞放在含一种除草剂的培养基中进行培养〔除草剂例如用莠去津Atrazine（Ciba-Geigy公司生产的市面上供应的以三嗪triazine为基础的除草剂），绿黄隆Chlorosulfone（E.I.Du    Pont    De    Nemours公司生产的市面上供应的以磺酰脲类Sulfonylurea为基础的除草剂），Sulfometuronmethyl（E.I.Du    Pont    De    Nenours公司生产的市面上供应的以磺酰脲类为基础的除草剂），镇草宁Glyphosate（Monsante公司生产的市面供应的以磷酸盐为基础的除草剂）、Basta（Hoechst公司生产的市面上供应的以磷酸盐为基础的除草剂）、百草枯（Paraguat）（皇家化工公司生产的市面上供应的以四价铵盐为基础的除草剂）以及西玛津〕，除草剂的用量以有效地选出接受除草剂抗性的细胞为准，使用该除草剂的目的就是为了选出有抗性的细胞。然后将已得到的抗除草剂细胞放在生长基中以生成愈伤组织。

将通过遗传重组技术或促使变异技术所获得到的愈伤组织转入一种分化介质中。这种分化介质是公知的，06/865，519号美国审理中的专利申请（或为86103448号的中国专利申请）有所描述。这样就可以使完整水稻植株再生。这种完整水稻植株在驯化之后最好在温室中生长。

通过涂抹或喷洒一种含除草剂的溶液，对全部再生植株的抗除草剂性进行核查。作为对照将不具抗除草剂性质的水稻植株用同样的方法进行处理，大约二周以后，就检查出这些植株是否被杀死。如果不具抗除草剂性的对照植株被杀死而具有抗除草剂性的植株仍旧存活，那么，这种抗除草剂植株就可以用作母本植株。

水稻植株的这种抗除草剂的特性通常在许多品种可以稳定地遗传。这样，一旦这种抗除草剂的特性确立下来，就可以通过常规的杂交方法将这种特性引入其它品种。

杂交水稻的采种体系包括含有母本和父本的二品系法和含有母本、残留母本及父本的三品系法。在三品系法中，母本残留系中产生的种子可能与母本中产生的种子发生混染。如果发生了这种混染，就会降低杂交的纯度。将抗除草剂基因引入原生质体，就可以解决这个问题。如果将这种抗除草剂基因引入原生质体，再用除草剂对幼苗进行处理就能够排除混杂在由母本产生的种子中的、由残留系产生的种子，于是就可以获得具有高纯度的杂交种子。通过上述遗传重组技术或促使变异法可以将抗除草剂基因引入原生质体。

在已获得的具有雄性不育性和抗除草剂性的母本水稻与一种父本水稻之间，通过异花授粉可以产生杂交种子。这种杂交最好是通过随意地或混合地种植母本和父本植株来进行。将母本种子和父本种子混合后组成幼苗，然后在田里种植这些幼苗，这就是随意种植可采用的方法。将母本和父本混合，可以缩短它们之间的距离，从而提高异花授粉率。母庸赘言，母本植株和父本植株也可以分垄种植。

然后用除草剂对父系植株和对该除草剂有抗性的母本植株进行处理。使用适量的除草剂杀死父本植株而保存母本植株。这样，只有母本植株存活，所以后来收获的所有种子都是母本中生成的杂交种子。虽然不一定非这样做不可，但最好在开花后约10-20天给这种植株施用除草剂。当父本植株和母本植株混合种植时，在除草剂处理后3周左右和在收获种子时，要核实植株死亡百分比与父本植株在全部植株中所占百分比相同。当母本植株和父本植株分垄种植时，经除草剂处理后3周左右和在收获种子时，也要核实父本植株全部死亡。

采用本发明的方法，在收获种子时或在收获种子以后，不需任何选择，所获得的杂交种子的纯度不低于99%。即使将父本植株和母本植株混合种植，杂交种子的纯度也不会降低。另外，如果将母本植株和父本植株混合种植，它们之间的距离也缩短了，以致异花授粉率，也就是结实率就大大地提高了。

下面要用实例来描述本发明。应当指出，所列案例仅仅是为了说明问题，而不能对实例作限制性理解。

例1：

从水稻〔水稻属（Oryza sativa），品种：栽培品种MT-CMA5〕种子中产生出愈伤组织，这种水稻种子是依据常规方法从具原生质体雄性不育性因素的Chinsura BoroⅡ中产生的。为了得到细胞悬浮液，每周在R₂液体培养基中对愈伤组织进行中间培养，这种培养基（见Ohira等人在Plant Cell Physiol.14.pp.1113-1121上发表的文章）含重量百分比为0.3%的酪素水解产物，重量百分比为3%的蔗糖以及浓度为1ppm的2.4-D。用60KradX射线对这种悬浮液进行辐照，将辐照后的细胞放在含50ppm莠去津的生长基中培养。所用的生长基（以下简称生长基）为R₂培养基，它含重量百分比为0.1%的酪素水解产物，重量百分比为3%的蔗糖，1ppm的2.4-D，重量百分比为0.8%的琼脂。将存活的愈伤组织转入含50ppm莠去津的生长基中。然后，将愈伤组织转入一种分化介质，以再生完整植株。这种分化基为N6基（见Chu等人发表在《中国科学》18期第659-663页上的文章），它含重量比为3%的蔗糖（以下简称“分化基”）。用1000ppm的莠去津喷洒这种再生植株，并选出活着的植株。对选出的抗除草剂植株进行无性繁殖，以便保留其特性，通过花药培养使这种特性稳定。通过这个过程，获得53种具有雄性不育性的品系。为了F1种子，用已获得的抗除草剂的植株作为母本，通过父本和母本混合种植进行杂交。开花20天后，每公顷田里喷洒40公斤的莠去津。在收获种子时，父本植株完全被杀死。于是就获得F1种子，结实率为28%。

例2：

对于例1中所获得的悬浮培养细胞，用含重量比为0.25%的乙烯基甲烷（ethylenemethane）磺酸盐进行处理。这种细胞在含有0.5mM甘草膦的生长基中培养1个月。为了进一步精选，将存活的愈伤组织转入含有1mM甘草膦的生长基中。然后将存活的愈伤组织转入分化基中，以再生完整植株。对由此而得的再生植株，施用0.1ml的膦酸甘氨酸（Roundup除草剂成分中所含有效成分），选出了35个抗除草剂的单株。为了保持抗除草剂特性，对被选出的植株进行无性繁殖。此外，为了获得稳定保持抗磺酸盐特性并具有细胞质雄性不育特性的二种品系（MT-CM5-GR1和MT-CMA5-GR2），将所获得的植株与普通水稻（水稻属，品种：栽培品种：MT-B5）杂交并进行无性繁殖。通过无性繁殖保留了这两种品系。

为了获得F1种子，用所得到的植株作为母本植株，通过分垄种植母本植株和父本植株来进行杂交。亲本植物开花10天和30天后，每公顷田里喷洒20公升的膦酸甘氨酸。在采集种子的时候，父本植株已完全被杀死。F1种子的结实率为30.0%。

例3：

用与例1相同的方法从由Yahai（中国原产）生成的具有胞质雄性不育因素的水稻（水稻属，品种：栽培品种MT-CMA9）中，获得悬浮培养出来的细胞。将这种悬浮的细胞放在含有0.1mM    Bensulfuronmethyl的生长基中培养1个月。为了再生完整植株，将所获得的愈伤组织转入分化基中。给得到的再生植株喷洒1000ppm的Bensulfuronmethyl，即选出了62个具有很强的抗除草剂性的单株。为了保持抗除草剂特性，对被选出的植株进行无性繁殖。此外，为了获得稳定保持抗Bensulfuronmethyl特性并具有原生质体雄性不育性的4种品系（MT-CMA9-BR1，MT-CMA9-BR2，MT-CMA9-BR3和MT-CMA9-BR4）将被选出的植株与具有常规繁殖力的水稻（MT-B9）进行杂交，然后进行无性繁殖。

为了获得F1种子，用上述所获植株作为母本植株，分垄种植母本植株和父本植株，按常规方法进行杂交。在亲本植株开花20天后，每公顷田里喷洒0.5公斤Bensulfuronmethyl。一个月以后，父本植株死亡得到了证实。F1种子的结实率为43%。

例4：

同例3中所获得的抗Bensulfuronmethyl植株，（其种子颜色正常，再生的种子颜色也正常）作为母本植株，通过分开种植母本植株和父本植株，或者混合种植母本植株和父本植株，杂交后获得F1种子。父本植株具有使种子呈黄色的特性。另外，改变亲本数的比率，就可测出结实率。亲本植株开花10天后，整个稻田用0.5公斤/公顷的Bensulfuronmethyl进行喷洒。种子成熟时，无选择地采集田里所有的种子。在这种情况下，根据种子的颜色可以清楚地识别出F1种子和由父本植株自花传粉产生的种子。本例子中采集得到的种子都是F1种子，没有由父本自花传粉产生的种子。在这个例子中，F1种子的结实率如下表所示：

表    1    分垄种植

母本植株/父本植株比率    结实率

1/1    41.4%

2/1    37.7%

3/1    32.7%

4/1    32.5%

5/1    30.5%

表    2    混合种植

母本植株/父本植株比率    结实率

1/1    75.4%

2/1    70.5%

3/1    71.8%

4/1    68.0%

5/1    60.4%

例5：

用常规的核子-交换方法将例1中获得的抗除草剂特性转入其它品种，即用品种MT-CMA5-AR2作母本植株，用水稻属，品种：栽培品种AKitakomachi作父本植株进行杂交。用父本花粉使父本植株与由F1种子生成的植株进行杂交。这种回交共重复5次。这样得到的品系（MT-CMA51-AR2）在形态、成熟时间和种子特性方面与品种Akitakomachi无区别。该品系具有胞质雄性不育性，而且对莠去津有抗性。

使用由此而得的品系作为母本，用常规方法进行杂交，可获得F1种子。亲本植株开花20天后，在整个稻田里，每公顷喷洒40公斤的莠去津。采集种子时，父本植株已全部被杀死。F1种子的结实率为35%

例6：

用常规核交换方法将例1中获得的抗除草剂性转入其它品种。也就是说，用品种MT-CMA5-GR2作为母本植株，用水稻属，品种：栽培品种Satohonami作为父本植株进行杂交。从F1种子生成的植株通过父本花粉同父本进行杂交。这种回交共重复5次。这样得到的一个品系（MT-CMA52-GR2）在形态、成熟时间和种子特性方面都与品种Satohonami无区别。该品系具有胞质雄性不育性，而且抗甘草膦。

使用由此而得的品系做为母本，用常规方法进行杂交便获得F1种子。亲本植株开花20天后，整个稻田以每公顷20公升喷洒甘草膦。采集种子时，父本植株已全部被杀死。F1种子的结实率为31%。

Claims (6)

1、一种培育杂交水稻种子的方法，它包括：

使雄性不育性母本水稻对除草剂具有抗性；

使母本水稻和父本水稻杂交，以培育杂交水稻种子；以及

使用母本对其有抗性的除草剂处理亲本，以便只杀死父本水稻，来选出水稻杂交种子。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于将一种产生将抗除草剂性的基因引入母本水稻的胞质中。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于一种产生将抗除草剂性的基因引入母本水稻核内的一个染色体中。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过遗传重组技术将一种产生抗除草剂性的基因引入母本水稻中。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过在母本中促使变异将一种产生抗除草剂性的基因引入母本水稻中。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过种植母本水稻和父本水稻，以使将它们混合起来，从而使母本水稻和父本水稻杂交。