PT94560B - Processo para a preparacao de alfa-amilases microbianas mutantes com maior estabilidade termica,acida e/ou alcalina - Google Patents

Description

A presente invenção refere-se ao campo da enge1 nharia genética e proporciona novas moléculas de ADN que compreendem sequências de ADN que codificam enzimas eom actividade de alfa-amilase. Especificamente, a invenção refere-se a al fa-amilases microbianas mutantes que têm características aperfeiçoadas para utilização na degradação de amido na eliminação do acabamento de materiais têxteis e em outros processos indus triais. Ás alfa-amilases referidas possuem uma maior estabilidade térmica, ácida e alcalina, o que as torna idealmente apro, priadas para realizarem a sua actividade em condições de processo em que atê agora não se podiam empregar amilases.

Enquadramento Geral da Invenção amido consiste numa mistura de amilose (15 a 30% em peso/peso) e amilopectina (70 a 85% em peso/peso). A amilose consiste em cadeias lineares de unidades de glucose ligadas nas posições alfa-1,4 que têm um peso molecular compreen dido entre cerca de 60.000 e cerca de 800.000* A amilopectina é um polímero ramificado que contêm pontos de ligação alfa-1,6 cada vinte e quatro a trinta unidades de glucose, podendo o seu peso molecular ser tão elevado como 100 milhões.

A partir de amido, produzem-se correntemente açú cares, sob a forma de xaropes de dextrose concentrados, por ac ção de um processo catalisado por enzimas que compreende: 1) liquefação (ou diminuição da viscosidade) de amido sólido com uma alfa-amilase com obtenção de dextrinas com um grau de poli merização médio igual a cerca de 7 - 10; e 2) sacarificação do amido líquido resultante (isto é, produto de hidrólise de amido) com amiloglucosidase (também chamada glucoamilase ou AG).

xarope resultante tem elevado teor de glucose. A maior parte dos xaropes de glucose que são comercialmente produzidos é subsequentemente isomerlzada enzimaticamente de modo a obter-se uma mistura de dextrose/frutose, conhecida co, mo iso-xarope.

cogenio e poli-sacáridos relacionados clivando as ligações internas alia-l,4-è'iuco&iciicas aleatoriamente, nsta enzima tem um certo número de aplicações comerciais importantes na indústria» por exemplo, açucareira, da cerveja, do álcool e têxtil.

Isolara-se alfa-amilases de uma larga variedade de lentes bacte rianas, fúngicas, vegetais e animais, ns alfa-amilases indusvrialmente mais importantes sao as isoladas a partir de Baeilli.

Na primeira operação do processo de degradação do amido» gelatinisa-se & suspensão de amido aquecendo-a a uma temperatura relativamente elevada (até 110° 0). 0 amido gelati nizado é liquefeito e dextrinizado por uma alfa-amilase termos tável num processo contínuo em dois andares. As variáveis mais importantes do processo são a concentração de amido» a dose de alfa-amilase» a temperatura e o pn.

Durante a reacção de liquefação-dextrinização, as variáveis do processo têm de ser mantidas dentro de apertados limites para se conseguirem boas proporções de transformação, visto que, caso contrário, se podem verificar sérios problemas de filtração. Yeja-so, por exemplo» D. 3. Goker e χ'Ζ. Yenkatasu bramaniaa, em Biotechnology, páginas 165 - 171» Sd. P. li. Oheremisinoff, P. 3. Quellette, fecbnicom Publ. Gorp., lanoaster ilenn., 1935. Um dos problemas que frequentemente se levantara é a regulação apropriada da temperatura na fase inicial do processo de degradação: o sobre-aquecimento muitas vezes provoca, a desnaturação da alia-amilase d® modo que a diluição final não é suficiente. Uma maneira de evitar este problema consiste em utilizar alfa-amilases mais termostáveis.

Gom esta finalidade, foi proposta a adição de iões cálcio ou de um anfilílio (veja-se, por exemplo, a Petente Nuropeia 3P-A-0139833)> mas esta solução verificou-se ser insatisfatória.

3a, portanto, ainda um substancial interesse em proporcionar alfa-amilases com a termostabilidade aumentada.

Literatura Helevante

A Patente Europeia .EP-A-O57976 descreve o isolamento de uma alfa-amilase termostável que codifica o gene de B.s tearothermoph.ilus» em que o gene e clonado num plasmídio que contém ou um Bacillus ou um E, coli como origem da replica ção. 0 plasmídio quimérico assim obtido é utilizado para produ zir a alfa-amilase. 0 gene da alfa-amilase foi isolado e utili zado sem qualquer modificação posterior.

A Patente Europeia SP-A-O134O48 descreve um processo paraçaumentar a produção comercial inter alia, de alfa-amilase clonando e provocando a expressão de um ou mais genes de alfa-amilase em estirpes industriais de Bacillus.

A Patente Europeia EP-A-252666 descreve uma alfa-amilase quimérica com a formula geral Q-H-I, em que Q é um ra dical de polipéptido 3-terminal com cinquenta e cinco a sessen ta resíduos de aminoácidos, que é pelo menos 75z« homologa com os trinta e sete resíduos 3-terminais da alfa-amilase de B. amyloliquef aciens. fí. é um determinado polipéptido e 1 é um radical de polipéptido C-terminal com trezentos e noventa a quatrocentos resíduos de aminoácidos que é pelo menos 75% homólogo com os trezentos e noventa e cinco resíduos O-terminais de alfa-amilase de B. licheniforais.

Cray e col. (J. Bacteriol., 1986, 166» 635) descre ve alfa-amilases quiméricas formadas na região terminal iíHg de alfa-amilase de B. stearothermophilus e a região terminal COOH de alfa-amilase de 3. lieheniformis. A maior parte das moléculas de enzimas híbridas mostrou ser menos estável do que as enzimas naturais que lhe deram origem. Além disso, nenhuma das mo léeulas híbridas se verificou possuir melhores propriedades de

- Δ »

estabilidade.

Xíehhuma das referências acima citadas descreve a utilização de substituições de aminoácidos simples para se obterem novas alfa-amilases.

A Patente Europeia KP-a-0235123 descreve um processo para a mutagénese completa de sequências de ácidos nucleicos. Como exemplo, descreve-se a mutagénese da alfa-amilase de S. gtearothermophilus. Líuito embora haja a sugestão de que este processo pode ser utilizado para obter mutantes de al fa-amilase de B. stearothermoghilus com estabilidade melhorada, não ôe descrevem quaisquer exemplos.

SUiiÂRIO SA IHWíQZQ

A presente invenção proporciona alfa-amilases mu tantes e maneiras de se obterem esses mutantes. As referidas alfa-amilases mutantes caracterisam-se pelo facto de diferirem em pelo menos um aminoácido da enzima do tipo natural. Além disso, proporcionam-se também moléculas de ABS que codificam esses mutantes, vactores que contêm estes ADN sob forma exprejs sionável e células hospedeiras que contêm esses vectores.

De acordo com um aspecto da presente invenção, ela engloba a mutagénese aleatória em genes de alfa-amilase clonados. Os genes mutados são expressos no organismo apropria do utilizando uo sistema de vector adequado»

De acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, descrevem-se e aplicam-se métodos de selecção de alfa-amilases mutantes. Os mencionados métodos originam alfa-ami lases mais termoestáveis e mais estáveis a ácidos. Além disso, este processo é utilizado com uma ligeira modificação para se obterem alfa-amilases mais estáveis em meio alcalino. Isolara-se e purificam-se os produtos de expressão dos clones assim

- 5 «MeisKSVSBRWiWiHV*!

detectados

Le acordo alada coa um outro aspecto da presente invenção, proix>rcicnam-se alfa-aailases com termoestabilidade aumentadaϊ estas alfa-amilases mutantes reduzem os problemas de filtração com aplicação de condições de degradação do amido.

Ainda de acordo com um outro aspecto da presente invenção, proporcionam-se alfa-amilases com estabilidade a áci dos aumentada, as quais reduaem a formação de subprodutos desfavoráveis, tais como maltulose, ao mesmo tempo que fazem dimi nuir a quantidade de ácido a ser adicionada antes da reação com amiloglueosidase. As novas alfa-amilases possuem preferivelmente propriedades aperfeiçoadas tanto relativamente à termoestabilidade e s estabilidade em meio ácido, como tambám em relação à termoestabilidade e à estabilidade era meio alcalino.

Le acordo ainda com um outro aspecto da presente invenção, verifica-se que as proteínas mutantes tem um melhor comportamento, sob as condições de aplicação, de liquefação do amido. A estabilidade em meio alcalino á especialmente útil pa ra aplicação na remoção do acabamento de tecidos.

2stes aspectos serão mais adiante descritos na descrição pormenorizada que se segue e nos Sxeraplos referidos na presente memória descritiva.

LSSQRIgãC R5SUH1LA SOS L2S^HQS

Figura 1 : Sequencia de núcleotidos de pHa5-8

Stanssens e col., 1987, SMBG laboratory Oourse Kartinsried, Julho de 1987. Para a descrição dos diferentes elementos, veja-se o texto.

Figura 2 s Sequência de Bucleótidos do Inserto do

Plasmídio pFBQgl 8FG2

Λ construção deste vector foi descrita na Patente Europeia EP-A-0224294· A sequencia de aminoácidos da alfa-amilase é representada por baixo dos tripletos. A numeração começa a partir do primeiro aminoácido da proteína madura (Auhn e col., 1982, 1. Bacteriol., 149« 372)· 0 inserto do promotor SPG2 vai desde a posição 61 à 344.

Pigura 3 s Sequência de Núcleotidos de pv-agniaé

Sste vector foi construído a partir de pIia5-8» do inserto de pPS.01· SPG2 e de um fragmento de ABI sintético que codifica o promotor PAG, 0 fragmento de ADN promotor de PAG vai desde a posição 3757 até à posição 3859· A sequência de aminoácidos de alfa-amilase está representada por baixo dos tri pletos.

Figura 4 ? Mapa de Restrição de p^aPLiaS

Os seguintes sítios de enzimas de restrição únicos estão disponíveis para a construção do intervalo no gene de alfa-amilase : 3amHI, Spel, SacII, Knpl, Glal, Narl, Sall, fhtllll, XmalII e BstSII. Sintetizaram-se primários de sequenciaraento para a todas os possíveis intervalos a fim de permitir a fácil determinação das mutações. 0 plasmídio pNefldaG é idêntico ao plasmídio pi«íaP£á.a6, com a diferença da presença de um codão ambar no gene de ampicilina (remove o sítio Seal) e a ausência de um codão ambar no gene de cloranfenicol (associado com a presença de um sítio Pvull).

Figura 5 s Esboço do Vector de Vaivém,Bacillus/B. coli de pBna/c

A secção de pMa/c (esquerda) permite a convenien- 7 -

te mutagénese em 5» coli* A cassete de Bacillus subtilia (da direita) contém o gene de alfa-amilase (ou qualquer outro gene de Bacillus) e ainda mais um replicão mínimo para a propagação em subtilis» Depois da mutagénese realizada com êxito em 3. coli, a cassete de 3. subtilia pode ser circularizada permitia do que o promotor SP02 se mova em frente do gene de alfa-amila se após a transformação em Bacillus.

figura 6 i napa de Restrição de pBHa/cl

Ssteisctor é um exemplo do vector de expressão da mutagénese esboçado na figura 5» (1) e (2) são sítios de clonagem múltipla. 0 gene pretendido é inserido em 2). Variando os sítios em (1) e (2), podem construir-se sítios de restrição convenientes para a criação duplex com folga;

PDi' tfi.oai

3. coli OKI

3LA

OAí

3A0 ORI

ΚΑΠΑΠΪΟΪΗ

8302 terminsdor de transcrição, origem de replicaçao originada a partir do fago 31, origem de replicaçao a partir de p3R322, gene de resistência a ampicilina, gene de resistência a cloranfenicol, origem da replicaçao de pUBllO, gene de resistência a canamicina (neomicina) de pUBllO, promotor do fago SP02.

figura 7 t fapa de Restrição âe c6Li&6 gene de alfa-amilase de Bacillus liolieniformis foi preparado para introdução em pBKa/cl no sítio de clonagem aúltiplu (2) da figura 6. Sesta figura, o promotor áB)2 é ind:

— 8 ·* cado por (2) e ο CAi de β. coli ê representado por (4).

ligura Q ; Sequência do fragmento da Sequência de Sinal phoA era pRa/cgPIúaé

Está representada a sequência. a montante do sítio ZcoAI a partir do promotor TAG até aos primeiros aminoácidos de alfa-arailase madura. A sequência de aminoácidos nhoA está re presentada por baixo da sequência de AIW.

figura 9 : Representação Sraflca de Richaelis-i enten para

AT e 255 Alfa-Amilase

Ssta representação gráfica mostra a velocidade inicial das actividades enzimáticas em função da concentração do substrato para πϊ e 2B5 alfa-smilase. As condições do ensaio são descritas no Exemplo 8.

figura 10 ϊ Termo-Inactivagao de AT e 17 Alfa-Amilase

Esta, representação gráfica representa a variação do tempo de semitransformação tanto de UT como de 17 alfa-amila

4W tf j.Jt se em função da concentração de Ga‘ a pH 5,5 e a 90,5 0.

figura 11 í Termo-Inac ti vagão de UT e 57 Alfa-Amilase ê semelhante à figura 10, eom a diferença de o pH ser igual a 7,0.

figura 12 : Termo-Inactlvaçao de UT e......255 Alfa-j&milase

Esta representação gráfica mostra a variação dos tempos de semitransforaação tanto de UT como de 2D5 alfa-amila se em função da, concentração de Oa a pH 7,u e 95 0.

ligura 14 ϊ Termo-Inactlvação de UT e de. ,255 Alfa-âmilsse em Junção do pH zlfíura lg : BE em...Junção do pg ginal ledido depois de liquefação a 110° 0

Bascaigão BQB^ojnEÁBÁ ba...

Pela expressão ”possui propriedades aperfeiçoadaá*, tal como é utilizada em ligação com ”alfa-amilase mutante” na presente memória descritiva, pretende-se significar alfa-amila ses que têm uma maior actividade enzimática ou ura tempo de semi trans formação mais longo nas condições de aplicação da lique fação do amido, remoção de acabamento de tecidos e outros processos industriais.

Oom ”termoestabilidade aperfeiçoada”, pretende-se significar que a enzima mutante retém a sua actividade a uma temperatura do processo mais elevada e que a realiza durante um intervalo de tempo maior à mesma temperatura do que a enzima de tipo natural de que é originária.

Oom estabilidade a ácidos (ou a bases) aperfeiçoada”, pretende-se significar que a enzima mutante se comporta melhor a valores de pH menores (ou maiores) do que a enzima de tipo natural de que deriva.

Compreende-se que as propriedades aperfeiçoadas são provocadas pela substituição de um ou mais aminoácidos.

ADI cromossómico pode ser isolado de um microrganismo que contém alfa-amilase. Dreferivelmente, utiliza-se um microrganismo que pertence ao género Bacillus, mais preferi.

velmente , 3. lichoniforrais e, ainda mais preferivelmente, g. lioheniformis $5 (veja-se Patente de Invenção europeia 2S-A-154043).

ΑΡΕΙ a digerido com uma enzima de restrição apro priada e clonado num vector. Pode utilizar-se um número de pos síveis maneiras de selecção, por exemplo, hibridisação, deteoção imunológica e detecção de actividade enzimática. A escolha do vector utilizado para clonar o AJAS cromossómico digerido de pende do método de escolha disponível. Se se utilizar a hibridização, nao são necessárias precauções especiais. Ho entanto, se a detecção é imunológica ou baseada na actividade enzimática, o vector tem de eonter os sinais próprios.

 detecção real de clones contendo alfa-amilase realizou-se em placas de agar que contém amido. Depois do desenvolvimento e da incubação, detectam-se halos com vapor de I₂ em volta dos clones positivos. Oomo fase seguinte, determina-se a sequência do gene. A sequência de aminoácidos derivada é utilizada para comparar eom outras sequências de alfa-amilase conhecidas para dor uma primeira impressão dos aminoácidos importantes (por exemplo, sítio activo, ligação de Ga, , possíveis pontes de S-S).

Obtém-se uma indicação melhor quando se determina a estrutura a três dimensões. Gomo esta é muitas vezes muito laboriosa, utiliza-se outra aproximação. Na ausência de progra mas de previsão da estrutura a três dimensões para determinar os elementos estruturais secundários (por exemplo, hélice alfa, chapa beta), utilizam-se com êxito, eventualmente, os elementos estruturais terciários, por exemplo, determina-se o barril beta. Para uma revisão deste assunto, veja-se <J. Janin e S. J.

odack, Prog. Biophys. Aolec. Biol., 1985, 42, 21 - 78.

Podem visionar-se substituições valiosas de amino ácidos. A estabilidade de uma estrutura de proteína é determi- 11 nada pela diferença líquida de energia livre entre as conforma ções dobrada e não dobrada da proteína. Oomo o resíduo de prolina se restringe a um menor numero de conformações do que os outros aminoácidos, a entropia de configuração de desdobramento de uma proteína é diminuída (e, portanto, a sua estabilidade aumentada) quando um aminoácido ô substituído por prolina.

Outra substituição útil é a substituição de glici na por alaaina» Resíduos tais como cs resíduos de treonina, va lina e isoleucina com átomos de carbono beta ramificados restringem a conformação da cadeia de átomos de carbono mais do que os resíduos não ramificados.

Como uma. parte da termo-estabilidade de certas proteínas é devida a pontes de sal, pode ser vantajoso introdu zir resíduos de lisina e de arginina (8. J. fomozie e â. «. hli bc.no v, J. tiol. Chem., 1988, 265, 5092 - 509o). Além disso, a substituição de lisina por resíduos de arginina pode melhorar a estabilidade das pontes de sal porque a arginina é apropriada para formar uma ligaçao adicional lí. para revisão deste assunto veja-se D. 3. Uigby e col., Biochem. Biophys. Res. Coma., 1987» 149. 927-929. A desamidação da aspsragina e da glutsmina menciona-se que provoca uma seria disrupção da estrutura da ensimaj a substituição por resíduos diferentes ce amida pode evitar esta disrupçao. As substituições dos aminoácidos realizam-se melhor por mutagénese ao nível de ASE.

3m princípio, podem realizar-se erperiéncias de mutagénese imediatamente es clones isolados. íTo entanto, 0 inserto é preferivelmente cionado num vector de mutagénese/expressão. A mutagénese ao acaso é possível e 0 mesmo acontece no caso da mutagénese dirigida para 0 sítio, fendo em vista a quantidade gigantesca de clones mutados do primeiro método e oo. mo não se sabe que exista nenhuma estrutura tridimensional de alfa-amilase que toe possível uma estimativa apropriada para a mutagénese dirigida para o sítio, a Requerente decidiu reali

- 12 zar a mutagénese ”ao aca-so” em regiões específicas.

Seguidamente, descreve-se uma. possível tentativa para realizar na prática a presente invenção»

Bn primeiro lugar, o gene é modificado pela intro dução de sítios de restrição silenciosos”. $ também possível a introdução de sítios de restrição não silenciosos. Isto torna possível e eliminação de regiões específicas do gene. Em segundo lugar, o gene ó clonado num fasmídio» A combinação de um fago com um plasmídio facilita a produção de JZjTi de cadeia única.

Outras maneiras de se obter ASE de cadeia única são também possíveis. Hibridizando â3S de um vector de cadeia dupla fundido (mais o inserto) com uma combinação vector/iaser bo que contém uma folga no inserto, obteve-se ASA bétero-duplex cora folgas (para a descrição pormenorizada deste assunto, veja-se Y. Morinaga. e col., 1984-, Biotecbnology, 2, 636).

A folga é utilizada para a mutagénese química ou enzimática. Preferivelmente, utilizou-se o método do bissulfito (Polk e Hofstetter, Cell 33, 1983, 535) e um método eazimático de incorporação deficiente (versão modificada de Lehtovaara e col., Prot. Sng., 1988, 2, 63)· Estes métodos podem ser aplicados de tal maneira que cada nucleótido simples na folga seja substituído por todos os outros tres nucleótidos (mutagénese de saturação). Este último método pode ser aplicado de diversas maneiras. ISn ura deles, hibridiza-se um primário sintético com a folga. Subsequentemente, realiza-se uma reacção de prolongamento em que falta o desoxi-nucleótido complementar do primeiro desoxinueleótido 3’ a partir do primário não está presente. Em princípio, todos os tres outros desoxinu cleótidas podem ser assim incorporados. Isto pode realizar-se ou utilizando uma mistura dos três desoxinucleótidos ou utilizando três reacções separadas contendo cada uma apenas um deso xinucleótiáo

Outra maneira d© aplicar o método origina clones aleatórios. Heste caso» estabelecem-ss quatro reacções separa» das cada uma das quais contém um desoxinucleótidos de limitação. Isto origina segundas cadeias que param antes de cada núcleo tido simples. As operações subsequentes podem realizar-se como se descreveu acima. Snpregaram-se tanto o método de mutagénese enzimática como o método de bissulfito para se obter os mutantes.

Para ensaiar as propriedades ensimáticas, pode ser conveniente expressar os genes clonados no mesmo hospedeiro que se utilizou durante a experiência de mutagénese. Sm princípio, este pode ser qualquer célula hospedeira desde que estejam disponíveis sistemas de vectores de mutagénese/espres . . são apropriados para estas células. Ha maior parte dos casos, é muito conveniente trabalhar-se com Ξ. coli, por exemplo, com B. coli M6.

Depois do desenvolvimento das colónias em placas de microtitulação, amostras das reentrâncias destas placas são manchadas em placas de agar suplementadas com amido e tampouizadas a diferentes valores de pH. Os clones positivos podem ser detectados pela formação de halos. Ã selecção eom tampões apropriados pode ser usada para escolher a termo-estabilidade, a estabilidade em meio ácido, a estabilidade em meio alcalino, a estabilidade em meio salino ou qualquer outra estabilidade que se pretenda seleccionar.

As estirpes hospedeiras apropriadas para a produção de alfa-amilases mutantes incluem microrganismos transformáveis noq quais se podem realizar a expressão de alfa-amilase· Aspecificamente, são apropriadas estirpes de hospedeiros da mesma espécie ou do mesmo género a partir do qual a alfa-smila se deriva, como uma estirpe de Bacillus. Preferivelmente, uti- 14 -

liza-se uma estirpe de Bacillus negativa em alfa-aailase e» mais preferivelmente» uma estirpe de Bacillus negativa a alfa-amilase e protease.

Por exemplo» B» licheniformis ±3 tem sido utilizado para produzir grandes quantidades de alfa-amilases mutantes .

Preferivelmente» as alfa-aiailases que estão a ser produzidas são segregadas para o meio de cultura (durante a fermentação), o que facilita a sua recuperação. Para se conseguir a secreção» pode utilizar-se qualquer sequeacia de sinais apropriada.

A alfa-amils.se expressada é segregada a partir das células e pode ser subsequentemente purificada por cjualquer mé todo apropriado.

A filtração em gel e a cromatografia com Aono q sao exemplos desses métodos. 3nsaion-se a alfa-amilase isolada relativamente à termo-inactivação a diferentes concentrações

p.

de Ca (0,5 - 15 m») e num largo intervalo de pE (5,5 - 8,0). .Realizaram-se também ensaios sob as condições de aplicação prá tica. Ensaiou-se especlficamente alfa-amilase mutante em condi ções de liquefação de amido a pH 5>5 e 5»25* llém disso» ensaiaram-se aplicações para remoção de acabamento de tecidos.

As propriedades de alguns destes mutantes .que foram seleccionados são melhor apropriadas sob as condições de comportamento pretendido na prática.

A presente invenção refere-se a alfa-amilases com termo-estabilidade aperfeiçoada» melhor estabilidade em meio acido e melhor estabilidade em meio alcalino. Geralmente, o nú mero de substituições de aminoácidos não é importante desde que a actividade da proteína mutada seja igual ou melhor do que

Ç. dct SU& enzima CtS tipO ilci vUTal» LS alxS,“£ií]iXGS©S iuUUc&U iiSS diferem em pelo menos um aminoácidos das ensinas de tipo natural, preferivelmente, as enzimas mutantes difere® ea um até dez ami noecidos. ns enzimas mutantes específicas com propriedades melhoradas incluem alfa-amilases mutantes gue contêm uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições 111, 133 e 149 (a nu meraçao e de acordo com a alfa-aailase de 8.. lichení fornis ? >

hhtre os aminoácidos e as substituições preferíveis contam-se Ala-lll-fhr, nis-133-fyr e i3ar-14S-Ile.

Sssas enzimas mutantes possuem um comportamento aperfeiçoado a valores de píl inferiores a 6,5 e/ou superiores a 7,5· 0 comportamento e também melhorado a altas temperaturas, o oue origina um tempo de semi-transformaçao ausentado a por exemplo a temperaturas de até 110°u.

i ui tos dos produtos de alfa.-amilase disponíveis são obtidos a partir de fontes baoterianas, em particular de JaciIlus, por ezenplo, 3« subtiUs, 3» llcheaiformis, 3. ,„stearothermophilus, 3. coagulans e 3. ^gyloliguGfaolens. 3stas enzimas possuem elevado grau de homologia e semelhança (Xuuki o col., J. Biochem·, 1985, 98, 1147, Uchajima e col., Appl. 41crobiol. Bioteehnol., 1986, 25, 355)· lor conseguinte, o conhe cimento de mutações favoráveis obtidas a partir âe uma destas¹ alfa-amilases pode ser utilizado para melhorar outras csiler.es· presente invenção x^roporeioaa uma maneira para obter esse co nhecimento·

A seguir, encontra-se a descrição dos métodos expe rimentais utilizados e exemplos que ilustram a presente invenção. Os exemplos são apresentados apenas a título ilustrativo e, portanto, de nenhuma forma se pretende que limitem o âmbito da presente invenção.

lEGUICA WSAIMSHíÀI,

Materiais e Métodos

1. lecnicas Gerais de Olonagem

Utilizaram-se as técnicas de clonagem que sao descritas nos manuais de I'. «aniatis e col», 1982, Molecular Jloning, Gold Spring 3arbor laboratory; E. ?!. Ausubel e col., 1387 Gurrent Pro toco Is in Molecular Biology, John Uiley Sons Inc* Mova Iorque; B. Berbal, 1983, A Bractical Guide to Molecular Oloning, 2« Edição, John Uiley 5: Sons Inc., nova Iorque. Estes manuais descrevem pormenorizadamente os protocolos para a cons trução e para a propagação de moléculas de MEU recombinante, as maneiras de proceder para obtenção de bibliotecas de genes e as maneiras de proceder para sequenciamento e mutação de AMtí e os protocolos para o tratamento enzimático de moléculas de nUN.

2. mutagénese Química

A® clonado pode ser tratado in vitro com produtos químicos a fim de provocar mutações no ADN. Se estas mutações são dirigidas a codões tripletes que codificam os aminoá^· cidos, pode produzir-se uma proteína mutada pelo ASN clonado nutado. Um método para a mutagénese por via química eom auxílio de bissulfito de sódio é descrito por Shortle e Botstein ( iethods Enzymol., 1983, 100, 457)· Um método preferível ê des; crito por Eolk e Hofstetter (Oell, 1983, 33, 585). Cutros méto dos para realização de mutagêneses são descritos por Smith, Ann. Rev. Genet., 1985, 19, 432. Um protocolo particularmente útil é descrito por Ausubel e col., ibid.

3. .lutagénese em ADN com folga MDuplex

Utilizou-se um método baseado na tentativa de ASN com folga duplex (Iramer e col., 1984, Fucl. Acide res. 12, 9441) e utilizou-se um plasmídio (híbrido de plasmídio/fego). Assencialmente, o método baseia-se nu® Αλί; duplex co® folga in termediério, que consiste numa cadeia com folga (-cadeia) que contém um marcador de resistência a antibiótico de tipo natural e uma cadeia que serve como modelo (+eadeia) que possui uma mutação âmbar no gene que confere resistência ao antibióti co.

Depois de se anelizer, o oligonucleótido mutagénieo fica incorporado na cadeia com folga durante a reacção de preenchimento da folga ia vitro e de vedação. As moléculas resultantes são utilizadas para transformar o hospedeiro deficiente na reparação de u® desempsrelhaaento (Aut 3), sm qne a ligação entre a mutação pretendida e o marcador de resistência a antibiótico são preservados. A população de plasmídios nist$ isolada a partir desta estirpe, é então feita segregar numa es tirpe de hospedeiro negativa de supressor* Os trans fornantes são placados num meio contendo antibiótico, impondo-se assim uma selecção da progénie derivada da cadeia com intervalo.

sistema de vector gémeo pAa/c5~3, que foi descri

to por ?. Stai
é constituído
pos	11-105
pos	121-215
pos	221-307
pos	313-763
pos	772-2571
pos	2572-2635
pos	2513-2772

: bacteriofago fd, terminador, ϊ bacteriofago fd, terminador, : plasmídio ?3A322 (pos 2069-2153), í bacteriofago fl, origem da replicação (pos 5432-5943), : plasmídio pBA.322, origem de replicação e gene de beta-laetamase, s transposão AnQÔJ, í terminador de triptofano (duplo),

- 18 pos 2773-3729 í trsasposão 3n9, gene de cloranfenicol-aoetil -transferes e, pos 3730-3803 ϊ sítio de cloaagem múltipla,.

Λ sequência está representada na Pigura 1.

Io vector do tipo pna, o nucleótido 3409 foi alterado de G para A, enquanto no vector do tipo pile o nucleótido 2238 foi alterado de G para G, criando codões de interrupção âmbar no gene de acetil-trans feras e e no gene de beta-lactama^· se, respectivamente, tornando os citados genes inactivos.

•fodas as sequências referidas foram obtidas a partir do Qenbanlc (3-1) (forneeimento 54)» Haticnal lueleie Aeid Se quence Lata Bank, ΠΪΗ. USA. 0 plasmídio púc5-8 foi depositado sob a referencia 3SA 4566. Para realiaar a mutagénese, o fragmento de ADH pretendido foi clonado no sítio de clonagem multi pia pía5-3. Subsequentemente, constrói-se um duplex com folga entre p3a5-8 contendo o ASA pretendido e pAc5-8.

A folga de cadeia única, consistindo no ALI preren dido, pode ser submetida a mutagénese com o oligonucleótido au tagénico com oligonucleótidos sintéticos compridos eom pequeno nível de nucleótidos não incorporados com produtos químicos ou com incorporação errada provocada por enzimas de nucleótidos também ΪΌΕ de mutagénese ao acaso podem ser aplicados, rara uma descrição pormenorizada, veis>se Ausubel e col., ibid ou Aerbal, ibid.

Gomo alternativa a mutagénese ia vitro, pode uear-se a mutagénese in vivo quer com auxílio de radiação ultrayio leta ou produtos químicos ou por aplicação de uma estirpe muta dora de E» coli (lovler e col», J. Bacteriol., 1986, 167» 13^/

Os nucleótidos autagênicos podem ser

- 19 usando o aparelho que se pode obter a partir de Applied Bio rfystems.

4» -'utagéaese ao Acaso por incorporação Alterada Bagimática de Nucleótidos

Um duplex com folga pKa/pMe pode ser submetido a extensão com primário e autagénese com falha de incorporação, como foi originalmente descrito i^or tíhortle e col· (Proc, íatl. .xcad. Sei. USa, 1932, 1533), por 3» 0. Junningham e

J. A. Wells (Prot. Bng,, 1937» 1» 519)» uma modificação desta maneira de proceder é descrita por uehtovasra e col. (frot. -ing., 1933, 2, 63).

Bste método baseia-se na utilização controlada de polimerases. Quatro populações âe moléculas de A33 são primeiramente geradas por alongamento com primário de um duplex com folga de pAa/pac de modo que eles terminam ao acaso, na folga, mas sempre precisamente antes de ua tipo conhecido de base (an tes de n, 0, G ou f, respectivamente). Uaúa una das quatro populações é em seguida sutsgenizada numa reacção de incorporação errada separada, em aue se pode agora omitir a base correc ta. Sesta maneira, podem gerar-se todos os tipos cie mutações de substituição da base em cada posição da folga. A utilisação de sequenase (marca registada) (íí. S, Biochenieal Corporation) foi preferida em. relação à, utilisação da poliniex^ase de Aloncv. Além disso, utilisou-se transcriptase inversa AoAuãV ea vez da transcriptase inversa A. Μ. V., que foi utilizada, por lehtovaara e col., (ibid).

Para garantir substituições num sítio único, intro duziu-se a seguinte modificação no protocolo descrito por nehtovaara e col., ibid: no tampão da transcriptase inversa não estão presentes tres nucleótidos de incorporação errada mas apenas um. Por exemplo, a mistura de prolongamento da base liml tada específica de A é incubada em tres reacçóes separadas com

rara um conjunto completo de quatro misturas de prolongamento limitado de base específica, realizou-se um conjunto total de doze reacções separadas de incorporação errada, depois de 1,5 horas de incubação a 42°0, adiciona-se nm conjunto de todos os quatro desoxinucleótidos com uma concentração de 0,5 mG e incubam-se depois as misturas reaccionais durante pelo menos vinte minutos a 37°G. 3m seguida, as amostras são processadas de acordo com lehtovaara e col. (ibid), com a modificação de que- se aplicou não uaa eontra-selecção a uma ca deia de A3U contendo uracilo, mas uma contra-selecção baseada no vector pHa/e.

5* frodução de Alfa-Aailases mutantes

Inocularam-se traasforraantes de m. coljl, estirpe h'K6 (3. 2ell e H. J. fritz» ΚΪ30 J.» 198?» 6, 1309), contendo um vector de expressão, recolhendo qualquer dos oonstructos de alfa-amilase em meio ds 23 (10 ml) a 30° 0.

O meio de Ϊ3 consistia em 0,017 n de rlí^rO^» 9,972 ’ de K_oIE?0., 12 g/1 de triptona Bacto» 24 g/1 de extracto de <-4 _A levedura Bacto, 0,4% de glicerol e um antibiótico (ampicilina com pfa ou cloranfenicol com constructos de pAe).

Utilizaram-se amostras da cultura para inocular 259 ral de 23 ea balões de dois litros. Quando se obteve uma. densidade óptica a SOO nm igual a 10 - 12» adicionou-se 0,1 nd de IPTU (isopropil- β-d-tiogalactopiranósido) e continuou-se a incubação durante mais doze a dezasseis horas.

b. ruriflcagão de nlfa-/aailases„ Mutantes

Recolherara-se as eélula3 por centrifugação e res- 21 suspenderam-se em tampao contendo 20$ de sacarose a 0 0. Depois de uma segunda centrifugação, as células foram ressuspensas em água fria» Removeram-se os resíduos de células por meio de uma terceira centrifugação e regulou-se o sobrenadante a pH 8,0 com tampão cie Tris 20 ml-I. Adieionou-se 0a01_o até se obter uma concentração final de oa^' igual a 50 mil* Tratou-se termicamente o material durante quinze minutos a 70° C e separou-se o material insolúvel por centrifugação, filtrou-se o sobrenadante através de um filtro dillipore de 0,22 nierometro e concentrou-se até 1/10 do seu volume inicial.

Realizou-se a purificação posterior utilizando fil tração em gel (em fSR Hu~55~werck) e cromatografia em ííono Q. Antes da cromatografia em I-Iono S, ajustou-se o pH das fracções que contém actividade enzimática a 4,8,. usando acetato de sódio. .Jluiu-se a alfa-smilase com HaGl 250 mí-R Para evitar a inactivação, ajustou-se imediatamente o píl de maneira a ser igual a 8,0.

bcemplo 1

Olonagem noleculer do Gene de Alfa-Amilase de.Bonillus licheniformis

Mgeriu-se ADH cromossóraico isolado de Bacillus licheniformis S5 (patente Europeia 2^«Α-134Ο48; G3S 470.83) com enzima de restrição EcoRI e ligou-se ao sítio de EcoRI de ρΌΙΙΟ (2. J. Grycsan e col., J. Bacteriol., 1978, 134. página 318). 2ransforraou-se a mistura resultante da ligação em Baoillus subtifis 1A4O (taeillus Genetie Stock Oenter).

Ensaiaram-se as colónias resistentes a. neomicina relativamente à produção de alfa-amilase em placas de agar HI (LI3/W) suplementadas com 0,4 grama/litro de amido (amido de

Zulkovsky, Ilerek). De^sois de desenvolvimento e incubação com va por de 1^, escolheu-se uma colónia positiva que produziu um grande halo para posterior caracterização. Verificou-se que o plasmídio isolado a partir desta colónia positiva contém um fragmento de EcoEI-EcoEI com 3,4 kb proveniente de 3. licheaiformis 25· Bste plasmídio foi designado pGB33 (Patente Europeia 3P-Ã-134Ú48; C3S 466.83).

inserto que codifica alfa-amilase foi ligado a uma sequência de Shine-Dalgarno sintética e o promotor do bacteriófago 8P02 resultante no plasmídio pProm SEGg (veja-se Patente Europeia BP-Á-0224294» 03S 696.35).

A sequência de nucleótidos do inserto de pProm 8P0₂ foi determinada pelo método de Sanger (Proc. ITatl. ncad. uci USA, 1977, 74. 6463) θ está representada na figura 2. A se_ quência mostra uma única estrutura de leitura aberta de grandes dimensões que codifica uma alfa-amilase, que é virtualmente idêntica à sequência de alfa-amilase de B. licheniformis. como determinada por fuuki e col. (ibid). Os primeiros vinte e nove aminoácidos constituem uma sequência de sinal que é cliva da durante a secreção de alfa-amilase. A numeração dos aminoácidos, tal como se faz na presente memória descritiva, refere-se à numeração de acordo com a proteína madura.

A sequência de iuuki difere nas seguintes posições: na posição 134, encontra-se presente um resíduo de Arg em vez de Deu; na posição 310, eneontra-se presente ura resíduo de Ser em vez de Gly; e na posição 320, encontra-se presente um resíduo de Ala em vez de Ser.

Exemplo 2

Construção dos Vectores de Hutagénese/Expressão pAaTDiaá

Digeriu-se o plasmídio pPSGIí SPO^ com EcoRI e Bell

—'-XíTot,

i.-_M... J—.yrrtt^^L, ‘ λ-αβΟΙι^.?·*^^ ¹

e purificou-se o inserto BcoBI-3clZ com 1,3 kb e clonou-se em p Ia5-8 digerido com EcoRI-BaraBI, Este vector pIa.5-3 foi anteri ormente dotado com um sítio de clonagem múltiplo modificado. 0 fragmento BaraHI-HindIII a partir da posição 3767 até à posição 3786 da Figura 1 foi trocado por uma sequência de ΑΒΠ'sintética, como se lê da posição 5647 atê à posição 5660 da Figura 3. Isto realizou-se para obter alguns sítios de restrição dentro do gene de alfa-amilase único.

A alfa-amilase que contém pKa5-8 assim derivado re sultante foi digerido eom EcoRI e BamíII e ligado a um fragmento de ADH sintético que .possui uma cópia do promotor TAO (De doer e col., Proc. Bati. Acad. Sei. USA, 1983, 80, 21). A sequência deste fragmento de ADH sintético está representada, áuntaraente com o vector de mutagénese/expressão de alfa-amilase final plalDiaô, na Figura 3, desde a posição 3757 atê à posição 3859.

Sste vector de mutagénese/expressão de alfa-amilase final foi completado pela introdução de diversos sítios de restrição silenciosos que se destinam a produzir folgas no gene de alfa-amilase durante as experiências de mutagénese (Pigu ra 4)* Para esta finalidade, fizeram-se as seguintes mutações usando mutagénese de oligonucleótidos dirigidos para o sítios

- introduziu-se um sítio de Spel por mutagénese silenciosa;

T492 e S50S

AOS > AG2 ASO —> AST

- introduziu-se um sítio de BarI pela mutação silenciosas

A269A

GOS —) SOO

-introduziu-se ura sítio de BstEII precisamente a jusante do codão de interrupção TAS

IASAASAGC —> SASSISAOO.

- 24 Este vector de mutagénese de alfa-eaílace pJaJEiaó é apropriado para a mutagénese eom o método de folga duplex. O i/ON de pBafliaô de dupla cedeia preparado por digestão de ensi mas de restrição apropriadas foi aaelisado de asneira a obter-se ABx? pJcfliaô de cadeia única.

As folgas de cadeia única resultantes foi subraetidas a mutagénese dirigida para o sítio, a mutagénese química e e. mutagénese ensinstiea ao acaso, como se descreve ne. secção experimental.

 disponibilidade do promotor ϊΒϋ em frente do gene de alfa-amilase permite que se faça a expressão indusível de alfa-amilase era E. coli, por adição de ΣΕΒΑ.

plasmídio praax‘Sia6 era E« . coli foi depositado como òJb 255.89 em 2 de Junho de 1989.

Ibcemplo 5

Construção de um Vector de vaivém de Eaeillus/E. coli para, rautagénese e Expressão

Este vector permite a mutagénese de um gene inseri, do ^em coli e a expressão imediata em Eacillus. ή estratégia escolhida para a construção do vector consistiu em combinar um derivado de ρΰΒΙΙϋ (dryesan, ibid) eom o sistema de vector gémeo p_; a/c, de tal maneira queí

1. A cassete de B. subtilis pode ser removida por uma experiência única de restrição/religação.

L. Xiferentes genes de alfa-amilase e diferentes promotores possam ser facilmente elonados neste vector.

?. fepois da recircularização, o gene clonado fique sob o controlo de un promotor de Bacillus aoroDriado.

·-» ητΠΜΜΠΐττι,·.ι J—Wir nrwjlfi *-* *—

4. Durante a mutagénese em 3» coli, o promotor ds facillus e o gene estrutural de alfa-amilase sejam fisicamente separa dos evitando uma acumulação letal possível de alfa-aaile.se em λ. coli.

desenho esquemático do vector de vaivém está representado na Figura 5· A estrutura da versão final do vector p3 la/ol está representada na Figura 6.0 vector pd lai foi dego sitado sob o número 033 252.89 ea 2 de Junho de 1939· 0 vector foi construído da seguinte maneira?

- 0 fragmento EcoAI-SnaBI de pU311õ contendo o gene HF2 e o gene Heo^ foi purificado e clonado ea pU>38 digerido oom

j.—jjmai«

- 0 fragmento de gçoai-HindlII deste derivado de pUG‘3 foi clonado ea pfa5-3 digerido com Ego&I-HlndlXI, obtendo-se como resultado o plasmídio pl·ls5-8u.

- Substituíu-se o fragmento de poliligador 3amIlI-ZbaI por um fragmento sintático cie ADN que codifica o promotor SP0_o do baeteriúfago S3?0g (Uilliams e col., J. 'Saeteriol., 1981, 146, 1162) mais os sítios de reconhecimento de restrição para SacII, Apsl, ZhoX, Saci, Bgll, KluI e Sbal,

- 0 sítio único de BcoAZ de pKa5-8G foi utilizado para inserir ura fragmento de poliligador que constitui os seguin tes sítios de reconhecimento í BcoHZ, Smal, Saci, BcqhV, Sphl, llrpl, loal e HlndlII.

Para finalidades específicas, desenvolveram-se os derivados pBfa/c2 e pFIa/c6 fora de pBFs/el.

hm p54a/c2, substituiu-se o poliligador FcoAI-SindiZX de p . a/cl pelo correspondente jjoliligador de pUG19.

·“ χ, .a/c6j adição ao sítio de SacII no poliligador de direita de p3Ia/cl, foi removido por reacçao de Alenov.

- 26 dealisou-se a mutagénese dirigida ao sítio sobre o gene de alfa-awils.se de B. licbeniforiais depois da construção de pl-ia/o6Ma6. Uonstruíu-se este vector ligando o fragmento de jamnl-HindlZZ isolado de pdaiSiaô no pBZa/e6 acima menciona do que foi clivado por BawHZ e HindIII. 0 plasmídio resultante (figura 7) pode ser utilizado para construir duplicados com folga para a mutagénese em B. coli.

Os mutantes resultantes foram expressos em Baolllus subtilis ΙΔ40 (3SSG 1A40) depois de restrição com Saci, ro ligação e transformação de acordo com Qbang e Oohen (vol. den. Benet., 1979, 163, Ul).

Dxemplo 4 /bzprçssão ,ea Ξ. poli de Alfa-Amilase de Bacillus licneniformis óorrectameate Amadurecida

Á caracterização de alfa-amilase produzida por puafDiaõ (ikemplo 2) mostrou que una parte da alfa-amilcse foi ineorreotamente processada durante a secreção. 0 sequeacianenbo da extremidade ΠΠ₂ revelou ua resíduo extra de alanina para a, alfa-amilase produsida em D. „ coli dl 6.

Iluito embora nao se tivesse indicação de que este facto originava propriedade diferentes para a amilase, a ãecjaereate substituiu a sequencia de sinal de alfa-aiiHa.se pela cequência de sinal Phoí de fosfatas© alcalina.

fara esta finalidade» realizou-se um ensaio de nutagénese de modo a introduzir o sítio de restrição i-spl em p. afliaô na junção áo péptido de sinal e da alfa-anilase madura· Depois da digestão eom fspl e BamHI, inseriu-se ua fragnen to de sintético que codifica a sequência de sinal pliod. (qi câaelis e col., c. Bsetsriol., 1983» 154, 366). A sequência desta construção esta representada na Ligara 8. Verificou-se

que a alfa-amilase produzida por p&ia/c2MaS possuía a sequência terminal H3g correcta.

templo 5 selecção de. Alfa-Amilase Hstável . Selecção de Antantes de Alfa-Ãallase Hstáveis em Heio ácido

As mutantes de alfe-milase, que se comportam melhor ou pior e. baixos valores de pH do que a alfa-amilase de tipo natural, podem ser escolhidos por comparação des halos em placas de amido teapoaisadas a diferentes valores de pH, depois de se manchar o amido con uma solução de iodo.

é bodo

1. Desenvolvimento

3esenvolvem-se as possíveis mutantes em placas de microtitulaçâo. 0 meio de desenvolvimento ê constituído por 25G micro litros de caldo de infusão cie cérebro-coração (Dãíog), Lazem-se as seguintes adiçõesí cloranfenieol 50 mierogramas/nililitro

IP2G· (GZGíA) 0,2 nh

CaGl„ 2 rad.

Picara-se colónias de chapas de agar com palitos esterilizados e inocula-se em reentrâncias separadas (noventa e seis) de uma placa de microtitulaçâo. Em eada piscas, incluem-se como controlo quatro colónias de tipo natural.

Estas placas de microtitulaçao sao colocadas a 57° C durante quarenta horas, sem agitação.

2. linsaio da Placa

Depois deste intervalo de tempo, ea que a alfa-amilase é produzida, retiram-se amostras de 5 sicrolitros de ca da. reentrância e introdusem-se em dois tipos diferentes de eha pas de agar (144 x 140 ma). 0 primeiro tipo é una chape, de agar rica em infusão de coração (1)1300) + 0,4 r de amido (amido de Sulkowsky, nerek) * sloranfenieol 50 mierogrssas/ml. Sepois de incubação durante dezasseis horas a 37° 0, esta placa serve como armazenagem de mutantes.

Us segundo tipo de placa c a placa real fie selec· çao e conrem agar lacto (23x300) amido de iulBowky

1,5^

0,2£>.

DissoIvem-se agar e amido ea agua da rede de distribuição sintética (Sxii). 3sta é constituída por agua decKiue raliz-ade nais

Oaulp.

dgoi₂

ITgHOO2

2,5 tíi-i

Lu··

Ξϊί micro gramas/ml.

is placas de selecção sso tamponizadas eom una se lecção a, 100 vezes de solução de tampão de acetato de potássio 5 . de armazenagem neste meio. Os valores de pH das soluções de armazenagem são 4?SG, 5,0 e 5,2 à temperatura ambiente. Os valores finais do pH da placa de agar quando medidos são ligei ramente menores fio que os das soluções de armazenagem. Por cada cavidade, colocam-se 5 microlitros de cultura em três placas de selecção eom diferentes valores de pH.

intervalo de pH é escolhido de tal maneira que há uma pequena ou nenhuma actividade deixada para a alfa-amila àe de tipo natural na placa con valor cie pl menor.

3. Coloração ««ΜΜΜΜΜΜίΐα··»

Iaeubam~s© as placas d© selseção durante duas horas a 55° 0. Sspsis deste intervalo d© tempo, despcja-se una .·.olução do Σ_ο sobrs as placas. 10 s solução fie 2^ contém yà .ranao de I_n e 70 gramas de ZI por litro.

δ quantidade das aianehas ê correlacionada con a actividade da alfa-amilase residual a este valor de pH. As mrtantes cue se comportas melhor do que os controlos fio tipo nasural são escolhidas para uma segunda operação ds selecção. Gs halos do tipo natural são muito reprodutíveis nesta evperiãíl·c i í , *

4. deserda Óslseção

Aicam-se as mutantes positivas provenientes fia chapa rica e purifieari-s® ea placas fie ΣΙΣ Zrsseo o elcraniericol. Zicam-se quatro colónias individuais fie cada mutante -s en .^:aian-£^!e no vamente de maneira semelhante à fia prineira operação de selecção. Além disso, fasem-se diluições em série destas culturas con STfi e colocam-se essas diluições en placas fie selecção fie pZ neutro (ρΐΐ = 7,0)· A comparaçao eom culturas fie tipo natural permite decidir se 0 melhor comportamento a bairc pfi é devido a uma produção global melhor de alfa-acilase ou a alfa-anilaee intrinsecamente cais estável·

Ãs mutantes que ”sobrevivem” à segunda selecção cão caracterisefia© determinando a sequência fie nucleótidos des tc. parte do gene que foi submetido a mutagénese.

- * fielcccão fie Á3J?a.-Aailqse_ gstével em Zelo Alcalino fiealísa-se a selecção de alfc-amilasoc estáveis em ~ 30 -

meio alcalino ds uma maneira semelhante à utilisada para as al ia-amilases estáveis & ácidos. Sepois de desenvolvimento ea placas de microtitulação, retiram-se amostras de 5 microlitros de cada reentrância e colocam-se numa placa de armasensgem s na placa de selecção real. Esta última é constituída por

Agar tacto (31100) 1,5% nmido de áulkcwsky 0,2%.

e completada co® água desmineralizada s oais

õaOl,,	2	ml
	1	a l
	2,3
384	10	microgramas/tíl

As placas d© selecção sao ta^iponisadas com ΰηηρεο de c-rrboaatO/biôarbcaato 50 &%, os valores de p~i são 9,0, 9,5 e 10,0. hecolhe-ss a gana de pH de tal maneira çue lieja peque na on nula aetividaús da alfa-amilase de tipo natural ao valor de p% mais elevado.

oopois de duas horas de incubação a 55^v v, despeia-se uma solução dc Ãn sobre cs placas. SseoUxen-se as mutantes cue origiuan melhor halo do que as ensimas de tipo natural, para uma segunda fase de selecção. Esta segunda fase de selecção realiza-se de maneira semelhante á. selecção para ε. estatili caúe em meio ácido.

ú · Seleogao ds lutantes fie Alfa-iailase lerso-Estáveis is mutentss ds alxa-asilase, cue se coador tar. melhor· ou pior a elevada temperatura do que a al.fa.-arilass de ti po natural, podem também ser escolhidas por comparação dos halos sobre placas de amido causados pela actividade residual de amilase nos caldos de cultura depois do aquecimento.

efodo

1.

Lesenvolvem-se mutantes da mesma maneira cue para a selecção da resistência ao pH.

2. Replicas-se os niutantes em placas de agar com Ηλ, como na selecção para resistência a pH.

3. fecham-se as reentrâncias separadas das placas ão micro titulação cora tampas descartáveis (iiov Laboratories) pera evitar a evaporação dos caldos de cultura durante a operação de aquecimento.

4. aquecem-se as placas de microtitulaçao em banho-maria durante uma hora a 95° G. Depois ds aquecidas, cr pia cas de microtitulação são colocadas numa centrífuga pera coleetar a amostra total no fundo dc placa de rii orotitulação.

5. fez-se a selecção das mutantes termoestáveis procedeu do da seguinte asneiras

De cada reentrância, retirou-se uma amostra de 5 microlitros de cultura para placas de selecção neutras (ver selecção de pH). Ãncubsrao-se depois estas placas durante uraa, hora a 55° 0.

Depois de se iaanehsr o amido coe a solução de iodo, as Eutaates o os controlos podem sor seleccionados pe la actividade de alfa-ssailase residual comparando as intensidades das manchas (halos).

Do caso da actividade residual dos controlos ser cena siadamente grande, poderá faser-se diluições em serie e aplicarem-se a chapa de selecção para ser possível discriminar as mutantes que são mais termostáveis do eue a ensina de tipo natural.

6. Ensaiam-se possíveis mutantes interessantes como se fez ao método de selecção de pAÃ.

Je se pretender una combinação de propriedades, po de realizar-SG uma combinação de selecção do tipo ú. ou 3 com o tipo ú. Dor exemplo, dejíois da primeira operação de selecção relativamente a alfa-amilase estável em meio alcalino, pode realizar-se uma segunda operação de selecção relativamente à termostabilidade. As mutantes que tem classificação positiva em ambos os ensaios podem ser escolhidas como candidatos que apresentais uiaa combinação das propriedades pretendidas.

; &emplo 6 rutagénese de pl-iarld.a6 Provocada por Bissulfito

Anelisou-se A.SA de cadeia simples de p. .'arrdaõ eom uigerido com AscZI-Glal pficZMaô, para se obter um hétero-duplex com uma folga que vai da posição 4315 até 4569 (figura 3). ?;ste nétero-dupler foi submetido a mutagénese provocada per bissulfito (veja-se a parte experimen*bel)·

Depois de transformação em E. coli bu6 raut S (l. iell e A. <7. Irits, ibid) e selecção en placas de agar contendo cloranfenieol (50 micrograsas/ml), isolaram-se os conjuntos de plasmídios e traasformaraE-se em B. coli 276» Q 3« coli AJ’6 i.ut ΰ foi depositado coso CBS 472.88; o 3» coli t.h.6 foi depo tado como CBS 473.83. Besenvolversm-se os transformantes rcsul tentes em seio fie BfiZ (BZfOO), contendo 2,0 ml de OaClg, 50 si crogranas/ml de cloranfenieol e 0,20 mZ de IPAG (SIGAM.), durar te quarenta horas a 37° G, en reentrâncias fie placa fie microti tulação, ses agitaçã?. P.ealizou-se a selecção de mutantes está veie a pA como se descreveu no Exemplo 5.

Escolheram-se cerca de 3GG Cm? transformantes. A . frequência da mutação foi determinada por sequsnciamento fie

- 33 <?ww»s»KS5o:S53&Xkjh5í

.. - o ara, er nédia, igual a 0,4 mutação/molécula co longo da folga. Identificou-se ua© mutante estável ea meio ácido, 17, depois da seleoção da resistência ao pH. 0 sequeneiamsato deste 'lutante revelou a mutação Hi33f₉ proveniente de una natação do tripleto de codificação de -Οήΰ para 2âb.

7erificou-se que o mutante W era também positivo no ensaio de selecção de ternoestabilidade (Exemplo 5).

lealisou-se o' sequeneiameato de 137 em .aof de cadeia simples con un oligonucleótido específico concebido para servir de primário precisameato antes do fragmento de taoll-blal. fama experiência d® mutagénese separada, escolheram-se e ~ · on iransformaates 1000 Om”-. identificou-se outro mutante estafei em meio ácido, 235 ₉ depois da selecção de resistência ao _j*í* ,-Jir» GG iilíXuQilóO dXiiiitíz QS CGíá iilioQÇGGS ©

Π1331

21491

OAO

2ηϋ xiUíi —> a2.íí·

Aplicou-se a mutagénese coa bissulfito de usa maneira semelhante à que se acaba de descrever sobre a folga vlal-dall, que vai da posição 4569 até á posição 4976 da figura 3. fscolheram-se cerca de 300 transformantes òm““ (frequência da mutação ϊ 0,6 mutações/molécula), lião se encontraram vransformantes estáveis em meio ácido. Encontrou-se certo nume ro de mutantes lábeis ea meio ácido. Batre estes autantes lábeis em meio ácido, alguns podem ter um espectro de p-ϊ desloca do que resulta nua fenótipe mais estável em meio alcalino.

xemplo 7 . .utagénesc llizimátlca_ de pfaSlía.6 fnelisou-se gfarMao de cadeia simples (figura 4) com Olal-Sall digerido com nfeílisE a fim de se obter um hêtc· ro-duplex que vai da posição 4569 atê 4976 (Figura 3). Submeteu-se o duplex coro folga a mutagénese enzimática de incorpora ção errada, como se descreveu na secção experimental.

Dma amostra obtida apos o prolongamento de primário limitado com dA© foi cortada era tres partes e incubaram-se na presença de transcriptase inversa com dGTP, dSTP e dffP, respectivamente. Depois da incubação a 37° θ durante dez minute adicionou-se uma caixa com todos os quatro dSflP e polimerase de Klenow a AM S4 ligase para acabar o prolongamento e se obterem moléculas de cadeia dupla completa.

Estas moléculas foram transformadas em E. coli M6 i-Iut S e recuperaram-se as piscinas de plasmídios. Estas piscinas de plasmídios foram subsequentemente transformadas em E. coli l‘JK 6 e as colónias foram escolhidas em placas de agar con tendo cloranfenícol (50 microgramas/ml). As mutantes resultantes foram ensaiadas relativamente à estabilidade da alfa-amila se como se descreveu no Exemplo 5.

Em uma outra experiência, a folga Spel-SacII foi submetida a prolongamento limitado por primário com dATP, dCTP, dGTP e d‘2SP, respectivamente. Estas piscinas de primário foram mutagenizadas por incorporação errada (veja-se parte experimen tal). Ensaiaram-se 10Õ transformantes Om em placas de pH (Éxemplo 5) e identificou-se o mutante M29 como mais estável a baixo valor de pH. Determinou-se a sequência da mutação:

A111T GGG- —> 1GG.

Exemplo 8

Propriedades de mutantes Estáveis inilimwmiwrwwffniulitlim, I -I . II I llllll HIIL.JIH Ι'ΙΊΙΙΙ I·· I H1I--III

Caraeterizaram-se melhor dois dos mutantes obtidos a partir de experiências de mutagénese com bissulfito. Gomo se

descreveu anteriormente, o sequenciamento de-ADN sugeriu as se guintes substituições de aminoácidoss

- Tfl continha um grupo de tirosina na posição 133, era vez de um grupo de histidina (B7 = H133Y);

- 2B5 continha a mutação B7 e além disso a treonina 149 foi substituída por isoleucina (2B5 = Hi33I, Τ1499Ϊ).

a) Medição da Actividade Bazimática

A actividade enzimática de alfa-amilase WT e mutan tes de B, lieheniformis foi medida usando como substrato 4-nitrofenil-malto-pentosido (4KP-BP5),^formam-se 4-nitrofenol e malto-pentosido, sendo esta reacção seguida por medição da alteração da densidade optida a 405 nm. 0 ensaio realizou-se a 35° 0 em· 50 mM de MOPS, 50 mM de NaCl, 2mM de CaClg (pH 7,15) e 0 a 1 mM de 4NP-BP5*

Mediram-se as velocidades iniciais e E-nitrofenol foi considerado como 10.000 1/M/cm. A Figura 9 mostra os resul tados de alfa.-amilases WT e 2B5, Calcularam-se os valores de V___„ e de km que são indicados na Tabela 1:

TABEbA 1

Ymax (^mol/min/mg ) km (mM )

WT 66,7 ± 0,9 0,112 + 0,005

2D5 66,3 * 0,7 0,119 ± 0,004

A Tabela 1 mostra claramente que as mutações de al fa-amilase 2D5 não influenciam a actividade enzimática de maneira substancial,

b) Influência de Ca^^v sobre a Termo-Inactivação

Realizaram-se experiências de inaetivaçao por ae- 36 -

ção de calor para WT, D? e 2D5, a várias concentrações de cálcio. A maneira de proceder foi a seguintes

1) Desme talização

Dialisou-se a enzima (2-3 mg/ml) durante vinte e quatro horas contra 3x1 litro de MO3?S 20 mM de EDTA 5 mM de EGTA 5 míí pã 7,0

3x1 litro de M03?S 20 mM pH 7,0

2) Remetalização

- 500 microlitros de tampão 100 mK (por exemplo, MBS, I-ÍGPS,

EFPS)³²

- 145 microlitros de enzima desmetalizada (por .exemplo, 2,15 mg/ml)

- 100 microlitros de CaClg (100, 50, 30» 20, 10, 5 ou 2,5 mM)

- x microlitros de IC^SO^ (100 mM)

- (255 - x) microlitros de ΈΜ,Ο» /~0a01₂_7 final Z~^E2^S0^_7 final (mM) (mM)

0,25

0,5

14,75

14,5

3Ε - pH HSS, por exemplo, 6,77 à temperatura ambiente origina 6,0 a 90° 0 (pEa )6,15 pEa/°C = - 0,011).

- os valores de pEa foram obtidos da tabela de Merck (Substâncias Tampão Híbridas).

3) Inactivação pelo Calor

Aqueceu-se a 90,5° 0 ou a 95° C 1 mililitro de solução de enzima previamente incubada à temperatura, ambiente em frascos de Pierce fechados (vedações revestidas com teflon) a uma concentração de cerca de 0,2 mg/ml. Hetiraram-se amostras de 50 microlitros a intervalos de tempo regulares, entre 0 e 6 horas, com uma seringa, e arrefeceram-se em gelo. Determinaram-se as actividades residuais eom 4NP-DP5 (0,5 mH).

Determinaram-se os tempos de semi-transformação usando um programa de adaptação exponencial simples (GfiAPHPAD).

As figuras 10 e 11 representam as variações dos tempos de semi-transformação de alfa-amilases WT e D7 a pH 5,5

- |fe, A> D— e 7,0, respectivamente, em função da concentração de Ca a 90,5°0. A dependência do Ca^2> de 2D5 foi apenas determinada a pH 7,0 a 95°C (figura 12). Pode também ver-se que a dependência de Ca^dv dos mutantes não ê diferente da de WT.

c) Termoestabilidade de Alf a-Amilases Mutantes a Diferentes Yâlores de pH

Determinou-se a dependência de pH da termo-inactivação tanto para D7 como para 2D5 a 90,5 e 95° C, respeetivamente, usando 0 tampão que se descreveu acima, a uma concentra ção 1 mH de Ga²*’. Pode coneluir-se que a estabilidade térmica de ambas D7 e 2D5 é muito aumentada (até ao dobro para 2D5) ao longo de toda a gama de pH (figuras 15 e 14).

- 38 Exemplo 9

Produção cie Enzimas Mutantes, ea Bacillus

Transferiram-se mutações na alfa-amilase de B»0Licheniforgis que foram identificadas por expressão em B. coli EK6 para um vector de expressão de Bacillus de duas maneiras diferentes,

a) Com o auxílio de sítios de restrição única dentro do gene de alfa-amilase (Pigura 4), isolaram-se fragmentos que possuem mutações a partir de mutantes pMaTIúaô e subclonaram-se na posição homóloga de p3Aa6<Iàaé>< O último plasmídio, que pode ser replicado ou em E. coli ou em Bacillus ₉ foi subsequentemente digerido com Saci e reeireularizado com T4 ABI ligase. Depois de transformação em Bacillus subtilis 1A4O, obteve-se um eleva do nível de produção de alfa-amilase sob controlo do promotor SBOg. 0 pBHaS.Iàaô reeireularizado ê designado pB6,Iàa6 para indicar a remoção da porção de E. coli do vector.

b) Beeolheu-se ADI de cadeia única pBMa6.Ida6 a partir de B. coli e anelizou-se com ABI de cadeia dupla de pBlcó.Biaõ digerido com enzima de restrição, a, fim de se obter um duplex com folga eom a folga pretendida no gene de alfa-amilase. Esta folga foi então submetida a mutagénese dirigida para o sítio eom um oligonucleótido (como se descreve na secção experimental) que codifica a mutação pretendida. 0 vector pBMc6»Bia6 é então transformado em vector do tipo pBS.Maó, como se descreveu acima. Bode realizar-se a combinação da mutação de diferentes sítios únicos pelo método a)5 se as muta çoes são em folgas diferentes? preferivelmente, no entanto, utiliza-se o método b).

As mutações do mutante B? e 2B5 foram transferidas ϊ

para pBíía6.Ma6 pelo método a) trocando os fragmentos de SacII -Sall e recuperou-se a alfa-amilase a partir do meio de Bacillus subtilis transformado» Submeteram-se os sobrenadantes dos dois mutantes aos procedimentos de selecção dos Exemplos e con firmou-se que ambos os mutantes produzem alfa-amilase que e mais estável em meio ácido e mais termoestável do que a alfa-amilase produzida por pB6.Dia6 de tipo natural.

fenotipo das mutações de alfa-amilase em Bacillus não á assim diferente do fenotipo em Ε.Γ coli.

Binalmente, os mutantes pN6*Isia6 foram transformados em Bacillus licheniformis T9 que e um derivado negativo de protease. negativo de alfa-amilase de Bacillus licheniformis T5 (Patente Europeia EP-0253455, CBS 470.83).

hospedeiro T9 foi utilizado para produzir quanti dades de elevado nível de mutantes de alfa-amilases num sistema homologo. Λ remoças do gene.de alfa-amilase cromossomico torna esta estirpe muito apropriada para a produção de alfa-amilase mutante quando se deixa de produzir alía.-amilase do tipo natural que não contamina. Λ enzima recuperada a partir desta estirpe foi utilizada para ensaios de aplicação industriais* Bemonstrou-se a possibilidade de utilização industrial dos mutantes pB6.Bia6.2D5 β pB6.Bia6.D7·

Exemplo 10

Ensaio de Aplicação de Alf a-Amilase Mutante sob Condições de Biquefacção de Amido

Para ensaiar alfa-amilase mutante 2D5 em circunstâncias mais realísticas, purificou-se o caldo de fermentação (do Exemplo 9) por ultraf iltração e formulo u-se a enzima eom 50% de propilenoglicol.

gO, 3,84 gramas de n₂0r₂0„ e 1

Ensaiaram-se três amostras?

893701 : UT B«'licheniformis T5 alfa-amilase 1530 SAU/g

893703 í 235 mutante preparada como ΪΤ 2820 TAU/g

Aaxamyl 0819 amostra comercial 7090 TAU/g

Uma TÁTÍ (unidade de alfa-amilase termo estável) é definida, qomo a quantidade de enzima que transforma, em condições normalizadas, 1 mg de amido por minuto num produto que tem uma absorção igual a uma cor de referência a 620 nm depois de reacção com iodo. As condições normalizadas são pH 6,6$ 30° O? tempo de reacção - vinte minutos. A cor de referência á obtida com 25 gramas de Co01₂*6H ml de HC1 (1 tí) era 100 ml de água destilada.

1. Ensaio de liquefaeção a pH baixo (5,5 e 5,25)

Aumenta-se a temperatura da suspensão de amido para 110 + 0,5° 0 o mais rapidamente possível e conserva-se a e£ ta, temperatura durante seis minutos.

A liquefaeção realiza-se mediante passagem contínua (5,4 litros/hora). Retiram-se três amostras de 135 ml (1,5 minutos de liquefaeção) depois de quarenta e cinco, sessenta e setenta e cinco minutos de liquefaeção e mantêm-se a 95° 0 durante duas horas. Depois deste'intervalo de tempo, ácidulara-se 50 ml de amostra com 0,4 ml de HgSO^ H para se obter um pH 3,5 e colocam-se num banho aquecido à fervura durante dez minutos para interromper a actividade enzimática antes da determinação de D. S.

Arrefece-se a parte restante da amostra a fim de determinar-se a actividade enzimática residual.

Composição da suspensão?

- 3,3 quilogramas de amido de milho D. 8. 88?á (2,904 kg de amido seco),

- 5»54 litros de água do poço (40 Τ. H.) teor de matéria seca da suspensão á igual a 33%·

Gorrige-se o pH de maneira a ser igual a 5,5 com ácido sulfúrico 1 H ou com NaOH II.

Concentração da enzima s 4,4 TAU/grama de amido seco. Verifica-se o caudal duas ou tres vezes durante a experiência.

2. Determinação de D. B.

Verifica-se o teor de substancia seca do amido liquefeito com um reíractómetro (cerca de 34%)· 0 valor de D. D. e determinado com o método conhecido de Dane S^ynon· Os resulta dos estão representados na Pigura 15«

3. Actividade Enzimática Residual

A actividade da amilase residual no amido liquefei to é determinada com um amilógrafo de Brabender.

g de amido de batata 390 ml de água destilada a 50° G ml de tampão Tris 0,05 S pH 6,50 5 ml de CaClg.SH^O a 30 gramas/litro*

Aumenta-se a·temperatura para 80° 0 (1,5°/minuto) quando a viscosidade está estabilizada (dez minutos), adicionam-se 5 ml de amido liquefeito diluído (7 gramas em 50 ml com água destilada), mede-se a diminuição de viscosidade depois de decorridos vinte minutos, sendo esta diminuição função da aeti vidade enzimática. Uma curva padrão com as concentrações enzimáticas conhecidas permite calcular a actividade residual em

mutante 2Β5 eoraporta~se significativamente melhor a pH 5,5 e 110° C do que a enzima hl. Obtém-se uma melhoria de 2-3 unidades BS a pH 5,25 com o mutante 2D5.

Ssemplo 11

Ensaio de Aplicação de Alfa-Amilase Mutante sob Condições

Sara ensaiar a aplicaçao industrial de mutantes de alfa-amilase alcalina, realiza-se um ensaio sobre a estabilida * «atar ** de a 20 0 na seguinte solução?

1,4%

1,0 - 1,5%

- 20 ml/1

0,3 - 0,5%

0,5 - 1,0%

H₂0₂ (35%) soda cáustica (100%) silicato de sodio (38 Be) alquil-benzeno-sulfonato (Banaryl Η. A. - 101) estabilizador orgânico (Tinoclarite G).

Bepois de incubação durante 2,5 horas, escolhem-se os mutantes de alfa-amilase pelas suas propriedades pretendidas, desde que apresentem actividade enzimática residual.

Claims (1)

1. - lã Processo para a preparaçao de <χ —amilases microbia nas mutantes com maior estabilidade térmica, ácida e/ou alcali na para aplicação na degradação do amido ou na remoção do acabamento de tecidos, caracterizado por compreender as seguintes operações i mutageneizar-se um gene clonado que codifica uma enzima amilolitica de interesse ou um seu fragmento s isolar-se o gene ou os genes da amilase mutante as sim obtidos?

   introduzir-se o referido gene ou os mencionados ge, nes de amilase mutante numa estirpe de um hospedeiro apropriado para expressão e produção 5 e recuperar-se a amilase mutante produzida e identificarem-se as amilases mutantes que têm melhores propriedades para aplicação na degradação do amido ou na remoção do acabamento de tecidos* «Mi 2 “*

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma «-amilase mutante que é 0 produto de expressão de uma sequência de APS'mutageneizado que codifica uma ot-amilase mutante que tem uma sequência de aminoácidos que difere em pelo menos um amino ácido da sequência da enzima natural e possui melhores propriedades para aplicação na degra dação do amido e/ou na remoção do acabamento de tecidos em vir tude da substituição dos amino ácidos.

   „ 3a Processo de acordo com a reivindicação 2, caracte- 44 rizado por se obter uma ©(-amilase com melhor termoestabilidade.

   - 4a _

   Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se obter uma tf-amilase com melhor estabilidade a um pH menor que 6,5 e/ou maior do que 7,5«

   5“ ~

   Processo de acordo com a reivindicação 2_S caracterizado pelo facto de se obter uma oç-amilase que possui uma me lhor termoestabilidade e estabilidade em meio ácido.

   — 6£- —

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 5, caracterizado por se obter uma Oc-amilase mutante cujo gene original de que deriva á obtido de um microorganismo, pre ferivelmente, uma estirpe de Bacillus.

   — yê —

   Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se obter uma <x-amilase cujo gene deriva de um gene do tipo natural de uma, estirpe escolhida do grupo que consiste em B. stearo thermophllus , B. licheniformis e B. amyloliquefaeiens.

   - 8ã Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se obter uma ος-amilase que difere da, &-amilase natural que se pode obter a partir de Bacillus lícheniformis por substituição de um amino ácido numa ou mais das posiçoes 111, 133 e 149 ou em posiçoes correspondentes em qual quer Qfr-amilase homóloga.

   Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se obter uma ος-amilase que contém uma ou mais das seguintes substituições de amino ácidos? nla-lll-ihr, his-133-‘i’yr, Shr-149-Ile.

   10ã Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9j caracterizado por se empregar um gene mutante que codifica a af-amilase que se definiu em qualquer das reivindicaçoes 2 a 9·

   Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se empregar um vector de expressão que compreende um gene mutante como se definiu na reivindicação 10.

   - 12ã - Processo de acordo eom a reivindicação 11, caracte rizado por. se empregar uma célula hospedeira que inclui um vee tor de expressão de acordo com a reivindicação 11.

   - 13 â Processo de acordo eom a reivindicação 12, caracte rizado por se empregar uma célula hospedeira que é substancial mente incapaz de produzir enzimas amilolí ficas extracelulares antes da transformação com um vector de expressão de acordo • com a reivindicação 11.

   — 46 —

   Processo de acordo com a reivindicação 13» caracte rizado por se empregar como célula hospedeira S. licheníformis

   19.

   - 15^ Processo de acordo com a reivindicação 11» eeracte, rizado por se empregar um vector vai-vem 3actilIus/B. coli de tal maneira que a expressão do gene cionado em coli ê torna da. impossível pela separação física das sequências de regulação do geçe estrutural e a expressão do gene cionado em Pacillus pode ser restaurada por digestão com uma unica, enzima de restrição e subsequente recircularização*

   - 16s· Processo para a preparaçao de uma CX-amilase mutan te de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreen der cultivar-se uma célula hospedeira de acordo com qualquer das reivindicações 12 a 14 num meio de cultura apropriado e re cuperar-se a α-amilase produzida.

   - 17a Processo para a degradação do amido» caracterizado por compreender a utilização de uma ot-amilase mutante quando obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9«

   - 18ã Processo para a remoção de acabamento de tecidos» caracterizado por compreender a utilização de uma ^-amilase mutante quando obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9.

   19*

   Processo para a preparação duma composição para a degradação do amido , caracterizado por se incorporar uma 0(-ami lase mutante quando obtida de acordo com qualquer das reivindi caçoes 1 a 9 numa substancia veicular apropriada.

   - 20 s

   Processo para a. preparação de uma composição para a remoção de acabamento de tecidos, caracterizado por se incor por ar uraa oc -amilase mutante quando obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9 numa substância veicular apropriada.

   As requerentes reivindicam a prioridade do pedido de patente europeio apresentado em 29 de Junho de 1989, sob o nõ 89201735.1.

   Lisboa, 29 de Junho de 1990.