JP2001275685A

JP2001275685A - α−アガラーゼおよびその製造方法

Info

Publication number: JP2001275685A
Application number: JP2000099424A
Authority: JP
Inventors: Jun Tomono; 潤友野; Hiroaki Sagawa; 裕章佐川; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2001-10-09

Abstract

(57)【要約】【課題】優れた生理活性を有する低分子アガロオリゴ糖
製造に有用な新規なアガラーゼを提供すること。【解決手段】新規なα−アガラーゼ活性を有するポリペ
プチドであって、天然の酵素のアミノ酸配列に欠失を有
するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝
子、該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法、並びに該
ポリペプチドを使用するアガロオリゴ糖の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、α−アガラーゼお
よびその製造方法、さらに詳しくは、アガロースからの
種々の生理活性を有する低重合度のアガロオリゴ糖の製
造に有用なα−アガラーゼとその製造方法、ならびに該
酵素の用途に関する。また、本発明は、α−アガラーゼ
活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコー
ドする遺伝子に関する。さらに詳しくは、アガロースか
らの種々の生理活性を有する低重合度のアガロオリゴ糖
の製造に有用なα−アガラーゼのアミノ酸配列と、それ
をコードする塩基配列に関する。さらに、本発明は、α
−アガラーゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的
な製造方法に関する。さらにまた、本発明は、α−アガ
ラーゼ活性を有するポリペプチドによるアガロオリゴ糖
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】寒天の主要構成成分であるアガロース
は、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラ
クトースとが交互にα−１，３結合、β−１，４結合を
繰り返してなる多糖である。寒天由来のオリゴ糖を製造
するためには、このアガロースを分解し、低分子化しな
ければならないため、従来よりアガロースを化学的に分
解する方法および酵素的に分解する方法が知られてい
る。化学的に分解する方法では、酸を用いてアガロース
を加水分解することができ、この場合、主としてα−
１，３結合が切断される。また、アガロースを分解する
酵素としては、アガロース中のβ−１，４結合を切断す
るβ−アガラーゼ、ならびにα−１，３結合を切断する
α−アガラーゼの２種が知られている。アガロース中の
β−１，４結合を切断して得られるオリゴ糖はネオアガ
ロオリゴ糖と呼ばれ、その還元末端はＤ−ガラクトース
であり、その重合度は偶数である。一方、α−１，３結
合を切断して得られるオリゴ糖はアガロオリゴ糖と呼ば
れ、その重合度は偶数であり、その還元末端は３，６−
アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースである。還元末端に３，
６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを有するアガロオリ
ゴ糖については、近年、アポトーシス誘発作用、制ガン
作用、各種の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレルギー
作用、抗炎症作用、α−グリコシダーゼ阻害作用等の生
理活性を有することが明らかにされ（ＷＯ９９／２４４
４７号明細書、特願平１１−１１６４６号明細書）、そ
の生理作用により、該アガロオリゴ糖を有効成分として
含有する医薬品や機能性飲食品の提供が可能となってい
る。アガロースを化学的に分解する方法では、生産され
るオリゴ糖の大きさを制御することが難しく、特に重合
度の低い低分子オリゴ糖を選択的に作ることは極めて難
しい（徳永隆久ら、バイオサイエンスとインダストリ
ー、第49巻、第734頁(1991) 等)。また、β−アガラー
ゼはβ−１，４結合のみを切断するため、該酵素を用い
た場合には、上記の生理活性を有しないネオアガロオリ
ゴ糖しか得ることができない。α−１，３結合を切断す
る活性を有するα−アガラーゼを使用することにより、
生理活性を有するアガロオリゴ等を製造することが期待
される。公知のα−アガラーゼとしては、海洋性のグラ
ム陰性細菌ＧＪ１Ｂ株［カーボハイドレート・リサーチ
（Carbohydrate Research）、第66巻、第207〜212頁（1
978）、なお、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイ
オケミストリー（European Journal ofBiochemistr
y）、第214巻、第599〜607頁（1993）には、該菌株はア
ルテロモナス・アガーリティクスＧＪ１Ｂ株として記載
されている］やビブリオ属細菌（特開平７−３２２８７
８号公報、ＪＴ０１０７−Ｌ４株）の生産する酵素があ
る。しかしながら、アルテロモナス・アガーリティクス
ＧＪ１Ｂ株由来のα−アガラーゼは６糖以下のオリゴ糖
を分解することができないため、生理活性が顕著なアガ
ロビオースを生産することは不可能である。さらに、ビ
ブリオ属細菌由来のα−アガラーゼは６糖以下のオリゴ
糖にのみ活性を示す酵素であり、アガロースに対しては
まったく作用しないために、アガロースを原料とするア
ガロオリゴ糖の製造に使用することはできない。このよ
うに、従来の技術では、還元末端が３，６−アンヒドロ
−Ｌ−ガラクトースであり、様々な生理活性を有するア
ガロビオース、アガロテトラオース等の低分子アガロオ
リゴ糖の製造に関して問題を有していた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、当該
低分子アガロオリゴ糖の効率よい製造に使用することの
できるα−アガラーゼ活性を有するポリペプチド、該ポ
リペプチドのアミノ酸配列、該ポリペプチドをコードす
る遺伝子、該ポリペプチドの製造方法、ならびに当該低
分子アガロオリゴ糖の製造方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の事
情に鑑み、アガロースのα−１，３結合を切断し、かつ
顕著な生理活性を有するアガロオリゴ糖を生成する酵素
を得ることを目的として鋭意研究、探索を行った結果、
この目的に適した性質の酵素を生産する２株の微生物を
見出すことに成功し、これらの微生物の生産する酵素を
単離し、理化学的、酵素学的性質を解明した。さらに、
本発明者らは、該酵素の遺伝子を単離することに成功
し、該遺伝子を用いる遺伝子工学的手法により、α−ア
ガラーゼ活性を有するポリペプチド、特に天然型酵素の
アミノ酸配列に欠失を有し、かつα−アガラーゼ活性を
有するポリペプチドを簡便に製造する方法を見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち、本発明を概説すれ
ば、本発明の第１の発明は新規のα−アガラーゼに関す
る。上記α−アガラーゼとしては、配列表の配列番号１
４に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号３３５
〜９２５の５９１残基からなるアミノ酸配列、または該
５９１残基からなるアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸
の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なくとも一つが導
入されているアミノ酸配列を含む酵素、あるいは配列表
の配列番号１５に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ
酸番号３６５〜９５０の５８６残基からなるアミノ酸配
列、または該５８６残基からなるアミノ酸配列に１個以
上のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入の少なく
とも一つが導入されているアミノ酸配列を含む酵素等が
例示される。

【０００５】本発明の第２の発明は、α−アガラーゼ活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に関し、第
１の発明のα−アガラーゼをコードすることを特徴とす
る。該遺伝子としては、配列表の配列番号１２に示され
る塩基配列のうちの塩基番号１００３〜２７７５の１７
７３塩基からなる塩基配列、または該１７７３塩基から
なる塩基配列に１個以上の塩基の置換、欠失、付加もし
くは挿入の少なくとも一つが導入されている塩基配列を
含む遺伝子、あるいは配列表の配列番号１３に示される
塩基配列のうちの塩基番号１０９３〜２８５０の１７５
８塩基からなる塩基配列、または該１７５８塩基からな
る塩基配列に１個以上の塩基の置換、欠失、付加もしく
は挿入の少なくとも一つが導入されている塩基配列を含
む遺伝子等が例示される。本発明の第３の発明は、第２
の発明の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダ
イズすることができ、かつ第１の発明のα−アガラーゼ
をコードする遺伝子に関する。本発明の第４の発明は、
第２の発明または第３の発明の遺伝子を含む組換えＤＮ
Ａ分子に関する。本発明の第５の発明は、第４の発明の
組換えＤＮＡ分子を有する形質転換体に関する。本発明
の第６の発明は、α−アガラーゼ活性を有するポリペプ
チドの製造方法に関し、第５の発明の形質転換体を培養
し、該培養物から第１の発明のα−アガラーゼを採取す
ることを特徴とする。さらに、本発明の第７の発明はア
ガロオリゴ糖の製造方法に関し、第１の発明のα−アガ
ラーゼによりアガロースを分解し、該分解物よりアガロ
オリゴ糖を採取することを特徴とする。

【０００６】

【発明の実施の形態】本明細書において、オリゴ糖と
は、２個以上１０個以下の単糖から構成され糖類をい
い、アガロオリゴ糖とはＤ−ガラクトースと３，６−ア
ンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にα−１，３結合、
β−１，４結合を繰り返し、還元末端に３，６−アンヒ
ドロ−Ｌ−ガラクトースを有するオリゴ糖をいう。ま
た、多糖類とは単糖およびオリゴ糖以外の糖をいう。本
発明のα−アガラーゼは、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガ
ラクトースとＤ−ガラクトースとの間のα−１，３結合
を加水分解する酵素であり、アガロースのような多糖、
ならびにアガロヘキサオースのようなオリゴ糖のいずれ
にも作用することができるものである。このような性質
を有しているものであれば本発明の酵素に特に限定はな
いが、例えば、海洋性の微生物である微生物ＴＫＲ１−
７ＡＧα（ＦＥＲＭＢＰ−６９９０）または微生物Ｔ
ＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭＢＰ−６９９１）の生産す
るα−アガラーゼを挙げることができる。

【０００７】微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαの生産するアガ
ラーゼ１−７、および微生物ＴＫＲ４−３ＡＧαの生産
するアガラーゼ４−３は、多糖、オリゴ糖中に存在する
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクト
ースとの間のα−１，３結合を加水分解する酵素であ
る。該酵素はアガロース、アガロヘキサオース以上のア
ガロオリゴ糖、およびネオアガロヘキサオース以上のネ
オアガロオリゴ糖に作用する。上記の２種の酵素の活性
測定方法および両酵素の理化学的、酵素化学的性質を以
下に示す。（１）酵素活性測定方法本発明のα−アガラーゼの活性測定は、アガロースを基
質として酵素反応を行った後、生じたアガロテトラオー
スの量を定量することにより行う。本明細書において、
精製酵素標品および精製中の酵素の活性測定に用いられ
た酵素活性測定方法は詳しくは以下のとおりである。
０．２％のアガロース（宝酒造社製、Code：5003）溶液
［１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ塩化
カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］を調製し、この
１８０μｌを基質として、酵素溶液２０μｌと混合し、
４２℃で３０〜１２０分間、好ましくは６０分間反応さ
せた後、６０℃で１分間加熱することによって反応を停
止させる。この反応溶液３０μｌを、内径７．８ｍｍ、
長さ３００ｍｍのＴＳＫｇｅｌ α−２５００（東ソー
社製、Code：18339）なるカラムに供し、７０％アセト
ニトリル溶液を溶離液とし、０．８ｍｌ／分の流速で溶
出させた時の約２６分の保持時間を示すピークとして酵
素反応によって生じたアガロテトラオースを定量し、１
０分間当たり１マイクロモルのアガロテトラオースを生
じる酵素量を１単位（１Ｕ）とする。

【０００８】（２）至適ｐＨアガロースを基質とし、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、リ
ンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．５）、酢酸緩衝液（ｐＨ６．
０、６．５）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０、７．
５、８．８）を用いて調製した反応液に酵素を作用させ
た結果より、アガラーゼ１−７は中性から弱酸性、ア
ガラーゼ４−３は弱アルカリ性から弱酸性でアガロース
分解活性を示すことが明らかとなった。（３）至適温度本発明の酵素は５５℃以下の温度で酵素活性を示し、ま
た、３０〜４８℃の範囲で高活性を示し、さらに、３７
〜４２℃付近で最大活性を示す。（４）熱安定性４８℃、５０℃、６０℃で３０秒間処理した酵素標品の
残存活性を測定した結果、アガラーゼ１−７は４８℃処
理で２５％、アガラーゼ４−３は５０℃処理で２２％の
活性を示した。（５）分子量１０〜２０％ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを使用し
たＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）により、アガラーゼ１−７の分子量は約９５，
０００と推定された。また、アガラーゼ４−３について
は、グリセロール密度勾配を用いた平衡密度勾配遠心分
離法と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとによって分子量の測定を行
った。この結果、アガラーゼ４−３の分子量は、約８
５，０００と推定された。（８）エドマン分解法によるアミノ酸配列エドマン分解法により決定されたアガラーゼ１−７のＮ
末端アミノ酸配列はAsp-Thr-Leu-Ser-Val-Glu-Ala-Glu-
Met-Phe、また、アガラーゼ４−３の配列はGly-Asp-Ile
-Val-Ile-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-T
hr-Gly-Arg-Val-Alaであった。配列表の配列番号１およ
び２に、それぞれアガラーゼ１−７およびアガラーゼ４
−３のＮ末端アミノ酸配列を示す。なお、下記に示すよ
うにアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３をコードする
遺伝子は共に単離されており、該遺伝子にコードされる
アミノ酸配列も決定されている。アガラーゼ１−７、ア
ガラーゼ４−３遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配
列表の配列番号１４、１５にそれぞれ示す。配列番号１
４に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１７７
〜９２５の７４９アミノ酸からなるポリペプチド、並び
に配列番号１５のアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号１
８４〜９５０の７６７アミノ酸からなるポリペプチド
は、それぞれ本発明のα−アガラーゼ活性を示す。さら
に、配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列のう
ちのアミノ酸番号２０１〜９２５の７２５アミノ酸から
なるポリペプチド、配列表の配列番号１４に示されるア
ミノ酸配列のうちのアミノ酸番号３３５〜９２５の５９
１アミノ酸からなるポリペプチド、配列表の配列番号１
５に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号２５１
〜９５０の７００アミノ酸からなるポリペプチド、並び
に、配列表の配列番号１５のアミノ酸配列のうちのアミ
ノ酸番号３６５〜９５０の５８６アミノ酸からなるポリ
ペプチドも、それぞれ本発明のα−アガラーゼ活性を示
す。本発明のα−アガラーゼは、後述するように、その
遺伝子を用いて遺伝子工学的に生産することが出来る。
タンパク質の遺伝子工学的生産において、現在広く使用
されている大腸菌や枯草菌などを宿主として用いる場
合、外来のタンパク質を発現させる際にそのタンパク質
の分子量が大きければ大きいほど以下に示すのような問
題が生じる危険性が高くなると考えられている。（１）宿主を変えた場合、発現させたタンパク質がincl
usion bodyを形成し、不溶化してしまう。（２）宿主のアミノ酸コドンの嗜好により発現量が減少
する。（３）本来宿主に含まれるタンパク質と比べ分子量が大
きいため、不安定で発現量が少なく、時には分解を受け
てしまう。（４）その他修飾を受けて活性を失う。そのため、生産しようとするタンパク質の目的の活性を
示すポリペプチドの最小単位をつかんでおくことが重要
である。本発明のアガラーゼにおいて、配列表の配列番
号１４に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号３
３５〜９２５の５９１アミノ酸からなるポリペプチド、
配列表の配列番号１５のアミノ酸配列のうちのアミノ酸
番号３６５〜９５０の５８６アミノ酸からなるポリペプ
チドは、それぞれアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３
におけるアガラーゼ活性の最小単位と考えられる。

【０００９】本発明のα−アガラーゼは、微生物ＴＫＲ
１−７ＡＧα（ＦＥＲＭＢＰ−６９９０）または微生
物ＴＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭＢＰ−６９９１）を
培養し、該培養物から精製することができる。ＴＫＲ１
−７ＡＧα、ＴＫＲ４−３ＡＧαは、寒天資化性の細菌
として海水中から分離されたものであって、下記の菌学
的性質を有するものである。菌学的性質：（１）形態人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリ
ー社製）１００ｍｌを調製し、これにペプトン（ＤＩＦ
ＣＯ社製、Code：0123-17-3）を０．３ｇ、酵母エキス
（ＤＩＦＣＯ社製：Code, 0127-17-9）を０．０２ｇ加
えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ８．０に調整し
た。これを５００ｍｌ容の三角フラスコに移し、寒天
（ナカライテスク社製、Code：010-28）を０．１ｇ加
え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った後、上記
微生物を接種し、２５℃、１２０ｒｐｍで一晩培養し
た。該培養液に生育した細胞は、ＴＫＲ１−７ＡＧα、
ＴＫＲ４−３ＡＧαのどちらのものも桿菌であり、ま
た、運動性を有していた。（２）生育状態人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリ
ー社製）１００ｍｌを調製し、これにペプトンを０．３
ｇ、酵母エキスを０．０２ｇ加えた後、３Ｍの炭酸ナト
リウムでｐＨ８．０に調整した。これに寒天（ナカライ
テスク社製、Code：010-28）１．５ｇを加え、オートク
レーブした後に平板培地とした。この培地に上記の微生
物を接種したところ、（イ）２３〜３０℃で良好に生育
する、（ロ）菌体の生育に従って、寒天ゲルは液化され
る、ことが示された。人工海水（商品名ジャマリンＳ、
ジャマリンラボラトリー社製）１００ｍｌを調製し、こ
れにペプトンを０．３ｇ、酵母エキスを０．０２ｇ加え
た後、３Ｍの炭酸ナトリウムで種々のｐＨに調整した。
これを５００ｍｌ容の三角フラスコに移し、寒天０．１
ｇを加え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行った
後、上記微生物を接種したところ、（ハ）ｐＨ７．０〜
ｐＨ８．５において旺盛に生育する、ことが示された。
ＴＫＲ１−７ＡＧαおよびＴＫＲ４−３ＡＧαは、ブダ
ペスト条約のもと、１９９９年１月２６日（原寄託日）
より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
に、それぞれ受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６９９０および
ＦＥＲＭＢＰ−６９９１として寄託されている。

【００１０】上記微生物について、菌株によって特異的
な塩基配列を持つことが知られている、１６Ｓリボソー
ムＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列を解析すること
により、その分類学上の位置に関する情報を得ることが
できる。すなわち、微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαおよびＴ
ＫＲ４−３ＡＧαの菌株から染色体ＤＮＡを抽出し、上
記の遺伝子、またはその一部の領域を増幅可能なプライ
マーを使用したＰＣＲを実施する。増幅されたＤＮＡ断
片の塩基配列を決定し、該配列についてＧｅｎＢａｎｋ
データベースを利用したホモロジー検索を行うことによ
り、上記の領域において類似した塩基配列を有する微生
物、すなわち分類学的に近縁に位置する微生物を知るこ
とができる。ブレッティン・オブ・ジャパニーズ・ソサ
エティ・オブ・ミクロビアル・エコロジー（Bulletin o
f Japanese Society of Microbial Ecology）、第10
巻、第31〜42頁（1995）に記載の方法により、微生物Ｔ
ＫＲ１−７ＡＧαおよびＴＫＲ４−３ＡＧαの１６Ｓリ
ボソームＲＮＡ遺伝子由来のＤＮＡ断片を増幅した。な
お、ＰＣＲには上記文献に記載のプライマー２７ｆおよ
び１４９２ｒを使用した（配列表の配列番号１６および
１７に、それぞれプライマー２７ｆおよび１４９２ｒの
塩基配列を示す）。得られた増幅ＤＮＡ断片の塩基配列
を解析した結果、上記の領域に関して、本発明のα−ア
ガラーゼを生産する微生物との間に９５％程度のホモロ
ジーをもつものとして以下のものが見い出された。ＴＫＲ１−７ＡＧα：Colwellia like bacterium ＴＫＲ４−３ＡＧα：Marine psychrophile IC079

【００１１】上記微生物の培養に用いる培地には、当該
微生物が利用し得る窒素源、無機物等を含み、寒天、ア
ガロース等を炭素源として含むものを用いることができ
る。寒天、アガロースは、市販のものを用いることがで
きる。窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキ
ス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン等が挙げら
れるが、好ましくは酵母エキス、ペプトンを用いる。こ
れらの窒素源は寒天、アガロース以外の炭素源としても
使用できる。さらに、塩類としては、塩化ナトリウム、
クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化
カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナ
トリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸
ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝
酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を組み合わ
せて用いることができる。特に好適には、人工海水であ
るジャマリンＳなる培地に、ペプトン、酵母エキス、寒
天またはアガロースを加えた培地を用いることができ
る。寒天またはアガロースの濃度は０．１〜２．０％が
好ましい。寒天またはアガロースの濃度を任意に変える
ことにより固体培地、液体培地を作り分けることが可能
であるが、酵素生産を目的とする場合は濃度０．１〜
０．３％の液体培養が好ましく、菌体の保存を目的とす
るときは濃度１．２〜２．０％の固体培養が好ましい。
なお、低融点アガロースを液体培養に用いる場合には、
０．１〜１．０％の濃度で使用することができる。培養
条件は、培地の組成によって多少異なるが、培養温度は
２３〜３０℃、好ましくは２５℃、培地のｐＨはｐＨ
７．０〜８．５、好ましくは７．２〜８．２、培養時間
は１２〜４８時間、好ましくは２４〜３６時間である。
以上のようにして培養中に産生された本発明のα−アガ
ラーゼは、菌体外に分泌されるので、培養終了後、菌体
を遠心分離、濾過等の方法を用いて除去して培養液上清
を得る。

【００１２】得られた培養液上清を、真空濃縮法または
限外濾過法を用いて濃縮した液状酵素として、あるいは
凍結乾燥法、噴霧乾燥法等により粉状酵素として粗酵素
標品を調製することができる。また、通常用いられる精
製方法、例えば硫安塩析、溶媒沈澱法により本発明のα
−アガラーゼを部分精製することができる。さらに、陰
イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等のカラムクロマト
グラフィー等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳
動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができ
る。このようにして得られた培養液または種々の精製度
の本発明のα−アガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖で
ある寒天またはアガロースを基質として反応させること
により、アガロビオース、アガロテトラオース、アガロ
ヘキサオース等のアガロオリゴ糖を製造することができ
る。アガロースは、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒ
ドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にα−１，３結合、β−
１，４結合を繰り返してなる多糖である。β−アガラー
ゼは、このアガロースのβ−１，４結合を加水分解する
酵素である。該酵素によって生成する、還元末端にＤ−
ガラクトースを有するオリゴ糖はネオアガロオリゴ糖と
呼ばれ、アガロオリゴ糖に見られるような生理活性を示
さない。アガロースのα−１，３結合を切断するα−ア
ガラーゼを用いた場合には、還元末端が３，６−アンヒ
ドロ−Ｌ−ガラクトースであるアガロオリゴ糖を製造す
ることが可能である。α−アガラーゼは、これまでにア
ルテロモナス・アガーリティクスＧＪ１Ｂ株由来、ビブ
リオ属細菌（ＪＴ０１０７−Ｌ４株）由来の２種の酵素
が知られている。ところが、アルテロモナス・アガーリ
ティクスＧＪ１Ｂ株の生産するα−アガラーゼはアガロ
ヘキサオース以下のオリゴ糖に作用することができず、
一方、ビブリオ属細菌由来のα−アガラーゼはアガロー
スを分解することができない。すなわち、従来公知のα
−アガラーゼでは、アガロースを原料としたアガロビオ
ース、アガロテトラオースの効率の良い生産は不可能で
あった。

【００１３】本発明のα−アガラーゼは、上記理化学的
性質から明らかなように、アガロース、ならびにアガロ
ヘキサオース以上のアガロオリゴ糖に作用する酵素であ
るため、アガロースに作用してアガロオリゴ糖を生成
し、さらにこうして生じたアガロヘキサオース中の一ヶ
所のα−１，３結合を切断することも可能である。すな
わち、本発明のα−アガラーゼをアガロースに作用させ
ることによって、従来の方法では殆ど生成されなかった
２糖と４糖であるアガロビオースとアガロテトラオース
を大量に得ることが可能となる。従来公知のα−アガラ
ーゼと本発明のα−アガラーゼの基質特異性を表１に示
す。表中、＋はその基質を分解できることを、また、−
は分解できないことをそれぞれ示す。

【００１４】

【表１】

【００１５】なお、本発明のα−アガラーゼは、アガロ
ヘキサオースに作用してアガロビオースとアガロテトラ
オースとを生成する。本発明のα−アガラーゼを使用し
て生産されたアガロオリゴ糖はアガロビオース、アガロ
テトラオースを含有するものであり、その使用目的に支
障のない限りにおいてアガロヘキサオース以上のアガロ
オリゴ糖を含んでいてもよい。本発明のα−アガラーゼ
を使用してアガロビオース、アガロテトラオース、アガ
ロヘキサオースを生産するための原料としては、寒天、
アガロース、または寒天およびアガロース由来のオリゴ
糖を使用すればよい。α−アガラーゼを作用させる条件
は、該酵素が活性を示すものであれば特に限定はない
が、例えば、アガラーゼ１−７の場合は中性〜弱酸性、
アガラーゼ４−３は弱アルカリ性〜弱酸性で、いずれも
３７〜４２℃で作用させることが好ましい。また、反応
液の組成も当該酵素の作用に適したものであれば特に限
定はない。本発明のα−アガラーゼによって生産される
オリゴ糖は、上記のように６糖以下の重合度の低いオリ
ゴ糖を中心とするが、反応条件等により重合度の異なる
オリゴ糖を自由に製造することも可能である。このよう
にして得られたオリゴ糖を分離精製することにより、ア
ガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオー
スを単独で得ることも可能である。本発明のα−アガラ
ーゼ遺伝子とは、上記α−アガラーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子であり、すなわち、α−ア
ガラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を含む核酸をいう。本発明のα−アガ
ラーゼ遺伝子としては、例えば、上記の微生物ＴＫＲ１
−７ＡＧα（ＦＥＲＭＢＰ−６９９０）由来のアガラー
ゼ１−７をコードする塩基配列を含む遺伝子、または微
生物ＴＫＲ４−３ＡＧα（ＦＥＲＭＢＰ−６９９１）
由来のアガラーゼ４−３をコードする塩基配列を含む遺
伝子が挙げられる。アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−
３をコードする遺伝子としては、例えば配列表の配列番
号１４のアミノ酸番号１７７〜９２５の７４９アミノ酸
残基からなるポリぺプチドをコードする塩基配列を有す
る遺伝子、配列表の配列番号１５のアミノ酸番号１８４
〜９５０の７６７アミノ酸残基からなるポリぺプチドを
コードする塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。さら
に、例えば、配列表の配列番号１４のアミノ酸番号２０
１〜９２５の７２５アミノ酸残基からなるポリペプチド
をコードする遺伝子、配列表の配列番号１４のアミノ酸
番号３３５〜９２５の５９１アミノ酸残基からなるポリ
ぺプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子、配列表
の配列番号１５のアミノ酸番号２５１〜９５０の７００
アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードする遺伝
子、配列表の配列番号１５のアミノ酸番号３６５〜９５
０の５８６アミノ酸残基からなるポリぺプチドをコード
する塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。

【００１６】本発明のα−アガラーゼ遺伝子は、上記し
たアミノ酸配列において、1個以上のアミノ酸の置換、
欠失、付加または挿入が導入されたアミノ酸を有し、か
つα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードす
る塩基配列を含む核酸をも包合する。また、本発明の遺
伝子には、配列表の配列番号１２の塩基番号５２９〜２
７７５の２２４７塩基からなる塩基配列を有する遺伝
子、配列番号１３の塩基番号５５０〜２８５０の２２４
７塩基からなる塩基配列を有する遺伝子が包含される。
また、配列表の配列番号１２の塩基番号６０１〜２７７
５の２１７５塩基からなる塩基配列を有する遺伝子、配
列表の配列番号１２の塩基番号１００３〜２７７５の１
７７３塩基からなる塩基配列を有する遺伝子、配列表の
配列番号１３の７５１〜２８５０の２１００塩基からな
る塩基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号１３の塩
基番号１０９３〜２８５０の１７５８塩基からなる塩基
配列を有する遺伝子も本発明に包含される。さらに上記
した塩基配列において1個以上の塩基の置換、欠失、付
加または挿入が導入された塩基配列を有し、かつα−ア
ガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配
列を含む核酸をも包含される。さらに、本発明の遺伝子
は、上記の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつα−アガラーゼ活性を有するポリペプ
チドをコードする塩基配列を含む核酸も包合される。ハ
イブリダイゼーションは、例えば、１９８９年、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｔ．マ
ニアティス（T.Maniatis）ら編集、モレキュラー・クロ
ーニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Mole
cular Cloning：A Laboratory Manual 2nd ed.）に記載
の方法により実施することができる。上記ストリンジェ
ントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ
の組成：０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デ
ンハルト、１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶
液中、プローブとともに６５℃で一晩保温するという条
件があげられる。

【００１７】本発明のα−アガラーゼ遺伝子のクローニ
ングは、例えば、以下のようにして行なうことが出来
る。α−アガラーゼを生産する微生物よりゲノムＤＮＡ
を調製する。ゲノムＤＮＡは適当な公知の方法に従って
調製でき、例えば、リゾチーム処理、プロテアーゼ処
理、ＲＮａｓｅ処理、フェノール処理、エタノール沈殿
等の公知の操作を組合わせて調製することが出来る。こ
のようにして得られたゲノムＤＮＡを適当な公知の方
法、例えば、超音波処理、制限酵素消化によって分解す
る。こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いられている
方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに
組み込み、組み換えＤＮＡ分子を作製する。ついで、該
組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導
入し、形質転換体を得る。組み換えＤＮＡ分子の作製、
形質転換等の操作は、通常用いられる方法、例えば、上
記したモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー
・マニュアル第２版等に記載の方法から、使用するベク
ター、宿主に応じたものを選んで用いることが出来る。
このようにしてα−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換
体を含むゲノムライブラリーが得られる。

【００１８】つぎに、上記のゲノムライブラリーをスク
リーニングし、α−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換
体を選択する。スクリーニングの方法としては、例え
ば、以下の方法が挙げられる。（１）α−アガラーゼ活性の発現を指標にしたスクリー
ニングゲノムライブラリーを寒天プレート上で増殖させる。α
−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体は、α−アガラ
ーゼ活性を持つポリペプチドを発現し、そのα−アガラ
ーゼ活性により寒天ゲルを溶解するので、寒天プレート
の寒天ゲルを溶解するコロニーまたはプラークを選択す
る。（２）抗体を用いたスクリーニング α−アガラーゼの粗酵素標品、部分精製酵素標品、精製
酵素標品を前記した方法に従って調製し、これらの何れ
かを抗原として常法に従って抗α−アガラーゼ抗体を調
製する。ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、
生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニト
ロセルロースのフィルターに移し取る。発現された組み
換えタンパク質はコロニー、プラークと共にフィルター
に移し取られる。フィルター上の組み換えタンパク質と
上記の抗α−アガラーゼ抗体を反応させ、該抗体と反応
するクローンを同定する。抗体と反応するクローンの同
定は、公知の方法に従って、例えば、抗α−アガラーゼ
抗体を反応させたフィルターを、パーオキシダーゼ結合
二次抗体と反応させた後、発色基質とインキュベート
し、発色を検出することによって行なうことが出来る。
なお、上記（１）、（２）の方法に用いるゲノムライブ
ラリーの作製に、ベクターに組み込まれたＤＮＡ上の遺
伝子が高発現されるような発現ベクターを用いた場合に
は、容易に目的の遺伝子を有する形質転換体を選択する
ことが出来る。（３）ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション
によるスクリーニングゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育した
コロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロ
ースのフィルターに移し取り、変性処理によりＤＮＡを
フィルターに固定する。このフィルター上のＤＮＡと標
識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従って行
い、該プローブとハイブリダイズするクローンを同定す
る。本スクリーニングに用いられるプローブとしては、
上記したα−アガラーゼのアミノ酸配列の情報をもとに
作製したオリゴヌクレオチド、その他のアミノ酸配列の
情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、またはこれ
らのアミノ酸配列の情報から作製したプライマーによっ
て増幅したＰＣＲ断片等が挙げられる。これらのプロー
ブの標識は特に限定はないが、例えば、ラジオアイソト
ープ標識、蛍光色素標識、ジゴキシゲニン標識、ビオチ
ン標識等が挙げられる。スクリーニングに用いるゲノム
ライブラリーとしては、以下の方法で作製したα−アガ
ラーゼ遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムラ
イブラリーを使用しても良い。α−アガラーゼを生産す
る微生物のゲノムＤＮＡを調製し、これを適当な制限酵
素で消化してアガロースゲル電気泳動で分離した後、常
法に従いナイロンまたはニトロセルロースのフィルター
にブロッティングする。このフィルター上のＤＮＡと上
記の標識プローブのハイブリダイゼーションを常法に従
って行い、該プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片
を検出する。このシグナルに対応するＤＮＡ断片をアガ
ロースゲルから抽出、精製する。

【００１９】こうして得られたＤＮＡ断片を通常用いら
れている方法によってベクター、例えば、プラスミドベ
クターに組み込み、組み換えDNA分子を作製する。つい
で該組み換えＤＮＡ分子を適当な宿主、例えば、大腸菌
に導入し、形質転換体を得る。形質転換の方法は通常用
いられる方法、例えば、モレキュラー・クローニング：
ア・ラボラトリー・マニュアル第２版等に記載の方法か
ら、使用するベクターに応じたものを選んで用いること
が出来る。このようにしてα−アガラーゼ遺伝子を有す
る形質転換体が富化されたゲノムライブラリーが得られ
る。該ゲノムライブラリーを用いることにより、より効
率の良いスクリーニングを行なうことが出来る。（４）ＰＣＲを用いたin vitroクローニング上記（１）〜（３）の方法は、何れも形質転換体をスク
リーニングして目的に遺伝子をクローニングする方法で
あるが、ＰＣＲ法を用いることによって、形質転換体を
利用することなくin vitroでクローニングを行なうこと
が出来る。α−アガラーゼを生産する微生物のゲノムＤ
ＮＡを調製し、これを適当な公知の方法、例えば超音波
処理、制限酵素消化によって分解する。こうして得られ
たＤＮＡ断片に通常用いられている方法によってリンカ
ーを連結する。α−アガラーゼのアミノ酸配列の情報を
もとに作製したオリゴヌクレオチドと、リンカーにハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとし
て、上記ゲノムライブラリーを鋳型とするＰＣＲ反応を
行なう。得られた増幅産物を通常用いられている方法に
よってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込
む。

【００２０】以上（１）〜（３）のようにして得られた
α−アガラーゼ遺伝子を有する形質転換体中、および
（４）のようにして得られたα−アガラーゼ遺伝子を有
する組み換えＤＮＡ分子中のα−アガラーゼ遺伝子の塩
基配列は公知の方法に従って決定することが出来る。該
クローンがα−アガラーゼのポリペプチド全長をコード
していない場合は、解読された塩基配列をもとに新たな
プローブを作製し、該プローブを用いてゲノムライブラ
リーのスクリーニングを行い、新たなクローンを得る操
作を繰り返すことにより、α−アガラーゼのオープンリ
ーディングフレーム全体が解読される。その情報をもと
に、例えば、α−アガラーゼをコードするオープンリー
ディングフレーム全体を含むクローンを作製することが
出来る。以上のようにして得られたα−アガラーゼをコ
ードする遺伝子を適当な発現ベクターに連結することに
より、α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドを遺伝
子工学的に大量に製造することが出来る。

【００２１】以下に、アガラーゼ１−７の遺伝子を取得
する方法についてその概略を説明する。ＴＫＲ１−７Ａ
Ｇを培養し得られた菌体をリゾチームで溶菌させた後、
タンパク質除去、エタノール沈殿等の操作を施し、ゲノ
ムＤＮＡを得る。このゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで部分消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベク
ター（アンピシリン耐性）に挿入してプラスミドライブ
ラリーを作製する。このプラスミドライブラリーで大腸
菌を形質転換して、その形質転換体を１．５％（ｗ／
ｖ）の寒天を含む含むＬＢ寒天培地（アンピシリン５０
μg／ｍｌ）上で生育させ、３７℃で５日間培養する。
培養後、周辺の寒天が分解されているコロニーを単離
し、これをアンピシリンを含むＬＢ培地に接種して培養
し、菌体から調製された粗抽出液のα−アガラーゼ活性
を確認する。α−アガラーゼ活性が確認された形質転換
体より常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、そこに挿
入されているインサートＤＮＡの長さを確認したところ
約８ｋｂであった。この組換えプラスミドはｐＡＡ１と
命名され、また該プラスミドで形質転換された大腸菌は
Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＡＡ１と命名表示さ
れ、ブダペスト条約のもと、１９９９年５月２６日（原
寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−６９９２として寄託さ
れている。

【００２２】上記のプラスミドｐＡＡ１の挿入ＤＮＡ断
片の塩基配列を解析した結果、α−アガラーゼをコード
する領域として９２５個のアミノ酸からなるポリペプチ
ドをコードする読み取り枠（ＯＲＦ）を有することが明
らかとなった。該読み取り枠の塩基配列を配列表の配列
番号１２に、該読み取り枠がコードするアミノ酸配列を
配列表の配列番号１４に示す。すなわち、配列表の配列
番号１４に示されるアミノ酸配列は本発明のアガラーゼ
の一例である。また、該アミノ酸配列と先に決定された
アガラーゼ１−７のＮ末端アミノ酸配列Ｐ１を比較する
ことにより、アガラーゼ１−７は配列表の配列番号１４
に示されるアミノ酸配列のうちの２８〜９２５のアミノ
酸配列からなるポリペプチドであり、該アミノ酸配列は
配列表の配列番号１２の塩基配列のうちの８２〜２７７
８（終止コドンを含む）にコードされることが示され
る。また、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のう
ちの１〜２７のアミノ酸配列はシグナル配列と考えられ
る。さらに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列のう
ちの１７７〜９２５の７４９残基からなるアミノ酸配列
のポリペプチドも、本発明のα−アガラーゼ活性を有し
ている。以下に、α−アガラーゼ４−３の遺伝子を取得
する方法について、その概略を説明する。配列表の配列
番号２で示されるアガラーゼ４−３のＮ末端アミノ酸配
列Ｐ２をもとにミックスプライマー３、およびミックス
プライマー４を作製した。配列表の配列番号６にミック
スプライマー３の配列を、配列番号７にミックスプライ
マー４の配列を示す。

【００２３】上記のα−アガラーゼ１−７の場合と同様
に調製したＴＫＲ４−３ＡＧαの染色体ＤＮＡを制限酵
素ＢａｍＨＩで完全消化し、その末端にＢａｍＨＩリン
カーを連結した。得られたＤＮＡを鋳型とし、ミックス
プライマー３、LA PCR in vitro cloning kit（宝酒造
社製）に添付のプライマーＣ１を用いたＰＣＲを実施し
た。つぎに、このようにして得られた一次ＰＣＲ産物を
鋳型に用い、ミックスプライマー４とLA PCR in vitro
cloning kit（宝酒造社製）に添付のプライマーＣ２を
用いたＰＣＲを実施したところ、約２ｋｂの増幅産物が
確認され、該ＤＮＡフラグメントを４−３Ｎと命名し
た。この増幅フラグメントの末端領域の塩基配列を解析
し、アガラーゼのＮ末端側をコードする領域に相当する
塩基配列より、配列表の配列番号８および９にそれぞれ
塩基配列を示すプライマー６および７を作製した。同様
にアガラーゼのＣ末端側に相当する塩基配列より、配列
表の配列番号１０および１１にそれぞれの塩基配列を示
すプライマー８および９を作製した。ミックスプライマ
ー３および４にかえて、それぞれプライマー６および７
を使用し、上記の４−３Ｎの場合と同様にＰＣＲを実施
し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片４−３ＵＮを取得した。
同様にプライマー７および８を使用したＰＣＲを実施
し、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片４−３Ｃを取得した。得
られたフラグメント４−３ＵＮ、４−３Ｃの塩基配列を
解析し、この結果を先に解析された４−３Ｎの塩基配列
と総合した結果、９５１個のアミノ酸からなるポリペプ
チドをコードする読み取り枠（ＯＲＦ）が見出された。
該読み取り枠の塩基配列を配列表の配列番号１３に、該
読み取り枠の塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列
表の配列番号１５に示す。なお、４−３ＵＮ中にはアミ
ノ酸配列Ｐ２部分の塩基配列が存在し、その上流に１８
３個のアミノ酸をコードする塩基配列、さらにその上流
にＳＤ様配列が見出された。すなわち、配列表の配列番
号１５に示されるアミノ酸配列は本発明のアガラーゼの
一例である。また、該アミノ酸配列を先に決定されたア
ガラーゼ４−３のＮ末端アミノ酸配列を比較することに
より、アガラーゼ４−３は配列表の配列番号１５に示さ
れるアミノ酸配列のうちの１８４〜９５１のアミノ酸配
列からなるポリペプチドであり、該アミノ酸配列は配列
表の配列番号１３の塩基配列のうちの５５０〜２８５６
（終止コドンを含む）にコードされることが示される。

【００２４】以上のようにして得られたアガラーゼ１−
７、アガラーゼ４−３のアミノ酸配列および該酵素をコ
ードする遺伝子の塩基配列は、公知のアガロース分解酵
素で本発明のアガラーゼと異なる切断様式を持つβ−ア
ガラーゼのアミノ酸配列および該酵素をコードする遺伝
子の塩基配列とのホモロジーはなく、全く新規の配列で
あると考えられる。

【００２５】本発明のα−アガラーゼをコードする遺伝
子、例えば、上記のアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−
３をコードする遺伝子を適当なベクターに連結して組換
えＤＮＡ分子を作製することが出来る。また、当該組換
えＤＮＡ分子を適当な宿主に導入して形質転換体を作製
することが出来る。当該形質転換体を培養することによ
り、培養物中に本発明のα−アガラーゼが産生される。
すなわち、該形質転換体を使用して、本発明のα−アガ
ラーゼ、例えば、アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３
を大量に製造することが可能となる。また、公知の方法
でα−アガラーゼをコードする遺伝子に変異を導入する
ことにより、変異を導入したα−アガラーゼを製造する
ことも出来る。変異の導入方法としては特に限定はな
く、例えばオリゴヌクレオチドダブルアンバー法（Hash
imoto-Gotoh, T. et al., Gene, 152, 271-275 (199
5)）、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法（Kramer, W. et
al., Nucl. Acids Res., 12, 9441 (1984); Kramer, W.
et al., Mehods in Enzymology, 154, 350 (1987)）、
Ｋｕｎｋｅｌ法（Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 82, 488 (1985); Kunkel, T.A., Methods in E
nzymology, 154, 367 (1987)）等を用いることが出来
る。上記の、配列表の配列番号１２および１３に示され
る塩基配列のα−アガラーゼ遺伝子をそれぞれ５’末端
側より欠失させ、得られた欠失遺伝子にコードされるポ
リペプチドを発現させた上、該ポリペプチドについてα
−アガラーゼ活性を調べたところ、配列表の配列番号１
２の塩基番号５２９〜２７７５の２２４７塩基からなる
塩基配列を有する遺伝子、塩基番号６０１〜２７７５の
２１７５塩基からなる塩基配列を有する遺伝子、並びに
塩基番号１００３〜２７７５の１７７３塩基からなる塩
基配列を有する遺伝子、配列表の配列番号１３の塩基番
号５５０〜２８５０の２３０１塩基からなる塩基配列を
有する遺伝子、塩基番号７５１〜２８５０の２１００塩
基からなる塩基配列を有する遺伝子、並びに塩基番号１
０９３〜２８５０の１７５８塩基からなる塩基配列を有
する遺伝子は、それぞれ本発明のα−アガラーゼ活性を
有するポリペプチドをコードすることが示された。ま
た、発現させようとするα−アガラーゼのＮ末端側にシ
グナル配列を付加したものをコードする遺伝子を発現さ
せれば、目的のα−アガラーゼを形質転換体外に分泌さ
せることが出来る。このようなシグナル配列に特に限定
はなく、例えば配列表の配列番号１４のアミノ酸番号１
〜２７で表されるα−アガラーゼ１−７のシグナル配列
が挙げられ、該シグナル配列は配列表の配列番号１２の
塩基番号１〜８１にコードされている。

【００２６】上記の組換えＤＮＡ分子の作製に使用され
るベクターは、特に限定するものではなく、例えば、プ
ラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクタ
ー等を使用することが出来、組換えＤＮＡの使用目的に
応じて適当なベクターを選択すれば良い。α−アガラー
ゼの生産を目的として組換えＤＮＡ分子を作製する場合
には、プロモーターやその他の発現調節のための領域を
含むベクターが好適である。そのようなプラスミドベ
クターとしては、特に限定はないが、例えば、ｐＫＦ１
９ｋ、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ、ｐＥＴ１６ｂ等が挙げられ
る。また、形質転換体の作製に使用される宿主も、特に
限定するものではなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物
の他、哺乳動物、魚類、昆虫等の培養細胞等を使用する
ことが出来る。形質転換体の作製には、宿主に適したベ
クターで作製された組換えＤＮＡ分子が使用される。

【００２７】以下に、アガラーゼ１−７を遺伝子工学的
に製造する方法についてその概略を説明する。例えば、
配列表の配列番号１４のアミノ酸番号２８、若しくは１
７７以降のポリペプチドをコードする塩基配列を含むＤ
ＮＡ断片を、α−アガラーゼ１−７の遺伝子をコードす
る上記したプラスミドｐＡＡ１を鋳型としたＰＣＲによ
って増幅し、これを適当なプラスミドベクター、例えば
ｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製）、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ（宝酒
造社製）、又はｐＥＴ１６ｂ（宝酒造社製）等に挿入し
たプラスミドを構築する。これらのプラスミドで形質転
換した大腸菌、例えば大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ等を適当な液体培地中で培養
し、必要に応じてＩＰＴＧ等による誘導を行い、各プラ
スミド上の挿入ＤＮＡ断片にコードされているポリペプ
チドを発現させる。これらの形質転換体の発現する単位
培養液あたりのα−アガラーゼ活性は、通常、ＴＫＲ１
−７ＡＧαの培養液より高い値を示す。

【００２８】また、アガラーゼ４−３は、例えば配列表
の配列番号１５のアミノ酸番号１８４以降のポリペプチ
ドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を、微生物Ｔ
ＫＲ４−３α由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲに
よって増幅した後、上記のアガラーゼ１−７と同様の方
法によってα−アガラーゼを発現する形質転換体を遺伝
子工学的に作製することが出来る。得られた形質転換体
は、α−アガラーゼ活性を発現し、かつその単位培養液
あたりの活性は、通常、ＴＫＲ４−３ＡＧαの培養液よ
り高い。以上のようにして遺伝子工学的に生産させた本
発明のα−アガラーゼは、通常用いられる精製方法、例
えば硫安塩析、溶媒沈澱法により本発明のα−アガラー
ゼを部分精製することができる。さらに、陰イオン交換
カラム、ゲル濾過カラム等のカラムクロマトグラフィー
等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一
バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。このよ
うにして得られた種々の精製度の本発明の遺伝子組換え
α−アガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖である寒天ま
たはアガロースを基質として反応させることにより、ア
ガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオー
ス等のアガロオリゴ糖を製造することができる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるもので
はない。実施例１ＴＫＲ１−７ＡＧα由来のα−アガラーゼの製造本発明のα−アガラーゼの精製を行うにあたって、その
酵素活性は、アガロースＬ０３（宝酒造社製、Code：50
03）を基質として酵素反応を行った後、生じたアガロテ
トラオースの量を高速液体クロマトグラフィーを用いて
定量することにより測定した。以下にその操作の詳細を
示す。０．２％のアガロースＬ０３溶液［１０ｍＭト
リス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、
１０ｍＭ塩化ナトリウム］を調製し、その１８０μｌを
酵素溶液２０μｌと混合し、４２℃で３０〜１２０分
間、好ましくは６０分間反応させた後、６０℃で１分間
加熱することによって反応を停止させる。この反応溶液
３０μｌを内径７．８ｍｍ、長さ３００ｍｍのＴＳＫｇ
ｅｌ α−２５００（東ソー社製、Code：18339）なるカ
ラムに供し、７０％アセトニトリル溶液を溶離液とし、
０．８ｍｌ／分の流速で溶出させた時の約２６分の保持
時間を示すピークとして酵素反応によって生じたアガロ
テトラオースを定量する。本発明のα−アガラーゼ１単
位（１Ｕ）は、１０分間当たりに１マイクロモルのアガ
ロテトラオースを生じる酵素量と定義する。

【００３０】１００ｍｌの人工海水（商品名ジャマリン
Ｓ、ジャマリンラボラトリー社製）を調製し、これにペ
プトン（ＤＩＦＣＯ社製、Code：0123-17-3）を０．３
％、酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社製、Code：0127-17-9）
を０．０２％となるようにそれぞれ加えた後、３Ｍの炭
酸ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。これを５００ｍ
ｌ容の三角フラスコに移し、寒天（ナカライテスク社
製、Code：010-28）０．１ｇを加え、オートクレーブを
用いて滅菌操作を行った後、微生物ＴＫＲ１−７ＡＧα
を接種し、２５℃、１２０ｒｐｍで一晩培養した。得ら
れた培養液を前培養液とした。本培養は、以下の手順で
行った。５リットル容のジャーファーメンター容器に上
記の培地３リットルを調製し、オートクレーブを用いて
滅菌操作を行った。この培地に上記の前培養液３０ｍｌ
を接種し、２５℃、２５０ｒｐｍで２４時間培養した
後、培養液について８，０００×ｇ、２０分間の遠心分
離を行い、菌体を除いた約３リットルの上清を回収し
た。これより以降の操作は４℃以下で行った。上記の上
清を透析膜（三光純薬社製、Code：UC-36-32-100）に入
れ、約５００ｇのポリエチレングリコール中に二晩浸漬
させて内液が約１００ｍｌとなるまで濃縮した後、緩衝
液Ａ［２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ
塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］に対して透
析を行い脱塩を行った。この透析液を、予め緩衝液Ａで
平衡化した強陰イオン交換樹脂であるＳｕｐｅｒＱ（東
ソー社製、Code：17227）３０ｍｌを充填したカラム
（φ２ｃｍ×９．５ｃｍ）に負荷し、吸着したα−アガ
ラーゼを１０ｍＭから１５０ｍＭへの塩化カルシウムの
直線濃度勾配法（総溶出量６００ｍｌ）で溶出させ、塩
化カルシウム濃度が５０ｍＭから１００ｍＭの間に溶出
してくる約６０ｍｌのα−アガラーゼ活性画分を回収し
た。この画分を緩衝液Ｂ［１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナ
トリウム］に対して透析して脱塩を行い、２０ｍｌのＳ
ｕｐｅｒＱを充填したカラム（φ２ｃｍ×６．３ｃｍ）
に負荷した。この場合は塩化ナトリウムの１０ｍＭから
１．０Ｍへの直線濃度勾配法（総溶出量２００ｍｌ）に
より吸着した酵素を溶出させ、０．５Ｍ前後で溶出する
α−アガラーゼ画分４０ｍｌを得た。この画分を緩衝液
Ｂで透析し、１０ｍｌのＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ
（東ソー社製、Code： 007473）を充填したカラム（φ
０．８ｃｍ×５．７ｃｍ）に供した。１０ｍＭから１５
０ｍＭの塩化カルシウムの直線濃度勾配法（総溶出量１
００ｍｌ）により、約２０ｍｌのα−アガラーゼ活性画
分を回収した。ついで、この画分を遠心限外濾過膜セン
トリプレップ−10（アミコン社製、Code：4304）を用い
て約１ｍｌに濃縮した。これを緩衝液Ｂで平衡化したＳ
ｅｐｈａｄｅｘＧ−１００（ファルマシア社製、Cod
e：17-0060-01）を充填したカラム（φ０．８ｃｍ×６
０ｃｍ）を用いたゲル濾過に供し、約１５ｍｌのα−ア
ガラーゼ活性画分を得た。この画分を５ｍｌのＱＡＥ−
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（東ソー社製、Code：14026）なる
カラム（φ０．８ｃｍ×１０ｃｍ）に供し、１０ｍＭか
ら１５０ｍＭへの塩化カルシウムの直線濃度勾配法（総
溶出量１００ｍｌ）による溶出を行い約４ｍｌのα−ア
ガラーゼ画分を得た。こうして得られたα−アガラーゼ
画分をＳＤＳーＰＡＧＥにより分析したところ、目的の
酵素はほぼ単一に精製され、その分子量は約９５,００
０であった。また、こうして得られた精製α−アガラー
ゼ標品の全活性は４５Ｕであった。以降、この画分をア
ガラーゼ１−７として実験に使用した。

【００３１】実施例２ＴＫＲ４−３ＡＧα由来のα−アガラーゼの製造微生物ＴＫＲ４−３ＡＧαの培養は、実施例１に記載の
微生物ＴＫＲ１−７ＡＧαと同じ方法により実施し、約
３リットルの培養液上清を得た。この培養液上清を透析
膜（三光純薬社製、Code：UC-36-32-100）に入れ、約５
００ｇのポリエチレングリコール中に二晩浸漬させて内
液が約３００ｍｌとなるまで濃縮した後、緩衝液Ｃ［１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ塩化カル
シウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム］に対して透析を行っ
た。この透析液の約３分の２を、予め緩衝液Ｃで平衡化
した３０ｍｌのＳｕｐｅｒＱを充填したカラム（φ２ｃ
ｍ×９．５ｃｍ）に負荷し、吸着したα−アガラーゼを
１０ｍＭから８０ｍＭへの塩化カルシウムの直線濃度勾
配法（総溶出量４００ｍｌ）で溶出させ、塩化カルシウ
ム濃度が４０ｍＭから５０ｍＭの間に溶出してくる約４
０ｍｌのα−アガラーゼ活性画分を回収した。この画分
をセントリプレップ−１０にて濃縮した後、緩衝液Ｂで
希釈を行って脱塩し、１０ｍｌのＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰ
ＥＡＲＬを充填したカラム（φ１．５ｃｍ×５．７ｃ
ｍ）に負荷した。吸着したα−アガラーゼは塩化カルシ
ウムの１０ｍＭから１００ｍＭへの直線濃度勾配法（総
溶出量１００ｍｌ）により溶出させ、塩化カルシウム濃
度４５ｍＭ前後で溶出するα−アガラーゼ活性画分９ｍ
ｌを得た。この画分をセントリプレップ−３０（アミコ
ン社製、Code：4306）で濃縮後、緩衝液Ｂで５倍希釈
し、次いで緩衝液Ｂで平衡化した２ｍｌのＱＡＥ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬを充填したカラム（φ０．８ｃｍ×４ｃ
ｍ）に供した。１０ｍＭから１２０ｍＭの塩化カルシウ
ムの直線濃度勾配法（総溶出量４０ｍｌ）でカラムに吸
着したα−アガラーゼの画分を回収した。こうして得ら
れたα−アガラーゼ画分をＳＤＳーＰＡＧＥにより分析
したところ、α−アガラーゼはほぼ単一に精製されてい
た。得られた全活性は、１．５３Ｕであった。以降、こ
の画分をアガラーゼ４−３として実験に使用した。

【００３２】実施例３酵素の諸性質の検討（１）基質特異性および作用アガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキサオ
ース、アガロオクタオースの４種類のアガロオリゴ糖
（それぞれ２．５ｍＭ）、ネオアガロビオース、ネオア
ガロテトラオース、ネオアガロヘキサオースの３種類の
ネオアガロオリゴ糖（それぞれ２．５ｍＭ）ならびにア
ガロースＬ０３（１％）のそれぞれを含む１０μｌの反
応用緩衝液［１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１
０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］を
調製し、これにアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３溶
液１０μｌずつをそれぞれ加えて４２℃、３０分間の反
応を行った。この反応生成物をクロロホルム：メタノー
ル：酢酸＝３：３：１の組成から成る展開溶媒を用いた
薄層クロマトグラフィーに供し、展開後、オルシノール
硫酸法により反応生成物の確認を行った。その結果、ア
ガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３ともにアガロヘキサ
オース、アガロオクタオース、ネオアガロヘキサオース
およびアガロースを切断することが明らかとなった。ア
ガロヘキサオースにアガラーゼ１−７を作用させた場合
の薄層クロマトグラフィーの結果を図１に、また、アガ
ラーゼ４−３を作用させた場合の薄層クロマトグラフィ
ーの結果を図２に示す。図１および２において、１はア
ガロビオース、２はアガロテトラオース、３はアガロヘ
キサオース、４は本発明のアガラーゼを作用させたアガ
ロヘキサオース、５はアガロビオースとアガロテトラオ
ースの混合物が展開されたレーンをそれぞれ示す。これ
らの図より明らかなように、本発明のα−アガラーゼは
アガロヘキサオースを分解し、アガロビオースとアガロ
テトラオースを生成する。

【００３３】（２）α−アガラーゼの反応産物の同定２．０ｍｌの１．０％のアガロースＬ０３溶液［１０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、１０ｍＭ塩化ナトリウム］にアガラーゼ１−７、ア
ガラーゼ４−３をそれぞれ添加して４２℃、６０分間の
反応を行った。反応終了後、溶離液として７０％アセト
ニトリルを用いたゲル濾過カラム（東ソー社製、ＴＳＫ
ｇｅｌ α−２５００）に反応液の一部を供し、０．８
ｍｌ／分の流速でクロマトグラフィーを実施した。約２
６分の保持時間で溶出される画分を分取し、該画分をロ
ータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固したのち、そ
の重量を測定したところ約４ｍｇであった。ついで、上
記の画分をＪＮＭ−ＥＸ２７０ＦＴＮＭＲシステム
（日本電子社製）を用いた核磁気共鳴法によって分析し
たところ、両酵素によりアガロースから生成される、上
記画分に含有される物質はアガロテトラオースであるこ
とが確認された。すなわち、アガラーゼ１−７、アガラ
ーゼ４−３はともにアガロース分子中のＤ−ガラクトー
スと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとの間のα
−１，３結合を加水分解し、アガロテトラオースを含有
するアガロオリゴ糖を生成することが明らかとなった。（３）反応ｐＨ１％アガロースＬ０３、１０ｍＭ塩化カルシウム、１
０ｍＭ塩化ナトリウムを含み、それぞれ終濃度１０ｍＭ
の緩衝液でｐＨを４．５（酢酸緩衝液）、５．５（リン
ゴ酸緩衝液）、６．０、６．５（酢酸緩衝液）、７．
０、７．５、８．８（トリス緩衝液）に調整した１０μ
ｌの反応液を調製し、これに酵素溶液１０μｌを加えて
４２℃にて１時間反応させた。この反応液を薄層クロマ
トグラフィーに供し、クロロホルム：メタノール：酢酸
＝３：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）で展開し、オルシノール硫
酸法により反応生成物の確認を行った。これによりアガ
ラーゼ１−７は中性から弱酸性、アガラーゼ４−３は弱
アルカリ性から弱酸性でアガロース分解活性を示すこと
が明らかとなった。

【００３４】（４）至適温度アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３の酵素活性測定を
種々の温度において実施した。酵素の失活が抑制され、
速やかに反応が進む温度はアガラーゼ１−７、アガラー
ゼ４−３ともに３７〜４２℃であった。（５）熱安定性アガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３精製酵素溶液を４
８℃、５０℃、６０℃で３０秒間加熱した後、０．２％
のアガロースＬ０３溶液［１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナ
トリウム］を添加し、４２℃で１時間反応させた。沸騰
水中で１分間加熱することにより反応を停止させたの
ち、実施例１に記載の活性測定方法に準じて反応生成物
を定量した。この結果、上記の加熱処理を行わない場合
の活性を１００％とした場合、アガラーゼ１−７は４
８℃処理で２５％、アガラーゼ４−３は５０℃処理で２
２％の活性を示した。（６）分子量アガラーゼ１−７の分子量はＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法で測定した。ＳＤＳを含む１０〜２０％
ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを使用し、分子量マー
カー（バイオラッド社製、分子量２００,０００のミオ
シン、１１６,２５０のβ−ガラクトシダーゼ、９７,４
００のフォスフォリラーゼｂ、６６,２００のウシ血清
アルブミン、４５,０００のオブアルブミン、３１,００
０のカルボニックアンヒドラーゼ、２１,５００のトリ
プシンインヒビター、１４,４００のリゾチーム）とと
もにアガラーゼ１−７の電気泳動を行った。ゲル上での
移動度から分子量を求めたところ、アガラーゼ1−７の
分子量は約９５,０００ダルトンであった。また、アガ
ラーゼ４−３については平衡密度勾配遠心分離法によっ
て分子量を求めた。密度勾配は１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
ｐＨ７．０、１０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭ塩化ナ
トリウムの緩衝液中でグリセリン濃度を１５％〜３５％
に変化させて作製した。２本の５ｍｌ容の遠心管のそれ
ぞれに、最下層が３５％、最上層が１５％グリセリンに
なるように４．８ｍｌの直線密度勾配液を作製した。さ
らに、その一方の上層には、分子量マーカーローレンジ
（Low Range、バイオ・ラッド社製）１５μｌを前述の
緩衝液で１５%のグリセリンを含む１００μｌの溶液と
したものを重層し、もう１本にはアガラーゼ４−３酵素
標品１００μｌを重層した。これらの遠心管を、スイン
グローターを用い、４５,０００rpm、４℃、２１時間遠
心分離した。遠心後、両遠心管の上層から順に２５０μ
ｌずつ緩衝液を抜き取り、フラクション１〜２０とし
た。分子量マーカー遠心管の各フラクションはＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供し、酵素標品遠心管の各フラクションはＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性測定に供した。α−アガ
ラーゼ酵素活性のピークはフラクションＮｏ．８〜１０
に検出され、それは分子量マーカーのフラクションでの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果からは分子量約６５,０００〜
８５,０００に相当した。この結果と、酵素標品フラク
ションのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果とから、アガラーゼ４
−３の分子量は約８５,０００と推定された。

【００３５】（７）エドマン分解法によるアミノ酸配列
分析実施例１、２で得られたα−アガラーゼ１−７、４−３
のアミノ酸配列をエドマン分解法にて決定した。それぞ
れ１０ピコモル相当の酵素タンパクを含むアガラーゼ１
−７と４−３の精製酵素標品溶液を１０〜２０％ポリア
クリルアミド濃度勾配ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに
供した。泳動終了後、ゲル上で分離された酵素をプロブ
ロット（アプライドバイオシステムズ社製）なる膜にブ
ロッティングし、酵素が吸着した部分の膜をプロテイン
シークエンサー（Ｇ１０００Ａ、ヒューレット・パッカ
ード社製）を用いて分析した。この結果、アガラーゼ１
−７についてはアミノ酸配列Ｐ１：Asp-Thr-Leu-Ser-Va
l-Glu-Ala-Glu-Met-Phe（配列番号１）、アガラーゼ４
−３についてはアミノ酸配列Ｐ２：Gly-Asp-Ile-Val-Il
e-Glu-Leu-Glu-Asp-Phe-Asp-Ala-Thr-Gly-Thr-Thr-Gly-
Arg-Val-Ala（配列番号２）が明らかにされた。

【００３６】実施例４アガロオリゴ糖の製造２ｍｌの反応用緩衝液［１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナ
トリウム］に１．０％（ｗ／ｖ）になるようにアガロー
スＬ０３を加え、さらに２Ｕのアガラーゼ１−７精製標
品を加えて４２℃で１６時間反応させた。反応終了後、
反応液を０．２２μｍフィルター（ミリポア社製、Cod
e：SLGVL040S）で濾過した。この反応液を実施例１に記
載の、本発明の酵素の活性測定において使用されたもの
と同条件の高速液体クロマトグラフィーにより分析し、
生成したアガロオリゴ糖を確認した。この結果、反応液
中にアガロビオース、アガロテトラオース、アガロヘキ
サオースが検出され、上記の酵素反応により、これらの
低分子アガロオリゴ糖が生成していることが確認され
た。

【００３７】実施例５ＴＫＲ１−７ＡＧα、ＴＫＲ４−３ＡＧαの染色体ＤＮ
Ａの調製人工海水（商品名ジャマリンＳ、ジャマリンラボラトリ
ー社製）を調製し、ペプトン（ＤＩＦＣＯ社製、Code:
0123-17-3）を０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（ＤＩ
ＦＣＯ社製、Code: 0127-17-9）を０．０２％（ｗ／
ｖ）となるよう加えた後、３Ｍの炭酸ナトリウムでｐＨ
８．０に調整し、これに寒天（ナカライテスク社製、Co
de: 010-28）を０．１％（ｗ／ｖ）になるように加え、
オートクレーブを用いて滅菌操作を行った。２ｍｌの培
地にα−アガラーゼ生産菌株であるＴＫＲ１−７ＡＧ
α、ＴＫＲ４−３ＡＧαのグリセロールストックより１
０μlを植菌し、２５℃で一晩培養した。それより１ｍ
ｌを１００ｍｌの同培地へ植菌し、同じく２５℃で一晩
培養し、８，０００×ｇ、１０分間遠心することより
菌体を回収した。その菌体を１０ｍｌの緩衝液Ａ［１０
０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．０）、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］に懸濁
し、０．２５ｍｌのリゾチーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）
を添加、３７℃、１時間インキュベートした。つぎに、
２．５ｍｌの５％ＳＤＳ含有緩衝液Ａを加えた後、６０
℃で２０分間振とうしながらインキュベートし、１．５
ｍｌのプロテアーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加し
た。その後３７℃で一晩インキュベートし、その溶液に
対してほぼ等量のフェノールを加えて室温で約１０分間
穏やかに振とうした。２,０００×ｇ、１０分間遠心
し、その上清を冷エタノールに移し、染色体ＤＮＡをガ
ラス棒で巻き取った。この操作を２回繰り返した後、５
０μｌのＲＮａｓｅ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加、３
７℃で１０分間インキュベートした。この溶液から染色
体ＤＮＡをエタノール沈澱により回収し、５ｍｌの緩衝
液Ｂ［１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）］
に懸濁し、同緩衝液で一晩透析し、それぞれ約１．５ｍ
ｇ（ＴＫＲ１−７ＡＧα）、約３．１ｍｇ（ＴＫＲ１−
７ＡＧα）の染色体ＤＮＡを得た。その純度をＯＤ２６
０ｎｍ／２８０ｎｍで検定したところ、両方共に約１．
８であり、以下のクローニングに使用することにした。

【００３８】実施例６ α−アガラーゼ１−７遺伝子のクローニング制限酵素ＢａｍＨＩで部分消化したＴＫＲ１−７ＡＧα
の染色体ＤＮＡ１０μｇについて１．０％低融点アガ
ロースゲルを用いた電気泳動を行ない、エチジウムブロ
ミドによる染色後、紫外線照射下で４〜１０ｋｂに相当
する部分を切り出した。ゲルから常法に従って熱融解に
よりＤＮＡを抽出精製し、回収したＤＮＡ断片をプラス
ミドｐＵＣ１９（宝酒造社製）のＢａｍＨＩサイトにＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて挿入
した。このプラスミドライブラリーで大腸菌ＪＭ１０９
を形質転換して、その形質転換体を寒天を１．５％（ｗ
／ｖ）濃度含むＬＢ寒天培地（アンピシリン５０μｇ／
ｍｌ）上で生育させた。３７℃で一晩培養したところ１
プレート当たり約１，０００株の形質転換体が生育し、
このプレート２０枚をさらに２５℃で４日間インキュベ
ートした。その結果コロニー周辺の寒天が分解されてい
るものが２株存在し、この株を２ｍｌのアンピシリンを
含むＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩培養し、得られた
菌体から調製された粗抽出液にα−アガラーゼ活性が認
められた。この株より常法に従いプラスミドＤＮＡを抽
出し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断してインサートＤＮＡ
の長さを確認したところ両方ともに約７．２ｋｂであっ
た。このハイブリッドプラスミドはその制限酵素切断パ
ターンから同じ物と考えられ、ｐＡＡ１と命名した。プ
ラスミドｐＡＡ１で形質転換された大腸菌はEscherichi
a coli ＪＭ１０９／ｐＡＡ１と命名表示され、ブダペ
スト条約のもと１９９９年５月２６日（原寄託日）より
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＲＭＢＰ−６９９２のもとで寄託されている。
つぎに、配列表の配列番号１で示されるアガラーゼ１−
７のアミノ酸配列Ｐ１に基づいて配列表の配列番号３で
示されるミックスプライマー１をデザインし、該プライ
マーと配列表の配列番号４で示されるｐＵＣベクターに
特異的にハイブリダイズするプライマー２を用い、ｐＡ
Ａ１を鋳型としたＰＣＲを行なった。０．５ｍｌＰＣＲ
用チューブに５０ｎｇのｐＡＡ１、５μｌのＥｘＴａｑ
緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、１μｌのミックスプ
ライマー１、１μｌのプライマー２、0.５μｌのＴａＫ
ａＲａＥｘＴａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０
μｌとした。この溶液に５０μｌのミネラルオイルを重
層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝
酒造社製）にセットし、９４℃で２分間変性を行なった
後、９４℃で１分（変性）、５０℃で２分（プライマー
のアニーリング）、７２℃で３分（合成反応）を１サイ
クルとする３０サイクルのＰＣＲを実施した。このＰＣ
Ｒ反応後の反応液全量を１．０％低融点アガロース電気
泳動を行なった後、約３．５ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を切
り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）に連結し
た。このＤＮＡ断片の塩基配列をＮ末端側よりＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを用いたジデオキシチェーンターミ
ネーター法で決定した。このようにして決定された配列
に基づいて配列表の配列番号５で示されるプライマーを
デザインし、該プライマーを用いて上流側の塩基配列
を決定した。その結果、配列表の配列番号１で示される
アミノ酸配列Ｐ１に対応する塩基配列の上流に２７個の
アミノ酸をコードする塩基配列が存在し、さらにその上
流にＳＤ様配列が存在することが見出され、ｐＡＡ１が
合計９２５個のアミノ酸からなるポリペプチドをコード
する読み取り枠（ＯＲＦ）を有することが明らかとなっ
た。該読み取り枠の塩基配列を配列表の配列番号１２
に、該読み取り枠がコードするアミノ酸配列を配列表の
配列番号１４に示す。なお、微生物ＴＫＲ１−７ＡＧα
より精製されたα−アガラーゼのＮ末端配列Ｐ１は配列
表の配列番号１３に示されたアミノ酸配列の２８〜３７
番目のアミノ酸配列に一致していた。

【００３９】実施例７ α−アガラーゼ４−３遺伝子のクローニング配列表の配列番号２で示されるアガラーゼ４−３のアミ
ノ酸配列Ｐ２のアミノ酸番号２〜１１の配列に基づくミ
ックスプライマー３、およびアミノ酸番号１２〜２０の
配列に基づくミックスプライマー４をデサインし、これ
らのプライマーを用いてLA PCR in vitro cloning kit
（宝酒造社製）によるアガラーゼ４−３遺伝子のクロー
ニングを試みた。配列表の配列番号６にミックスプライ
マー３の配列を、配列番号７にミックスプライマー４の
配列を示す。一次ＰＣＲ反応は以下のように行なった。
実施例５で調製したＴＫＲ４−３ＡＧαの染色体ＤＮＡ
を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化し、その末端にＢａｍ
ＨＩリンカーをＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いて連結した。その一部を０．５ｍｌＰＣＲ用
チューブにとり５μｌの１０×LA PCR 緩衝液、８μｌ
のｄＮＴＰ混合液、１μlのミックスプライマー３、１
μlのLA PCR in vitrocloning kit（宝酒造社製）に添
付のプライマーＣ１、０．５μｌのＴａＫａＲａＬＡ
Ｔａｑ加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。こ
の溶液に５０μｌのミネラルオイルを重層した後、自動
遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセ
ットし、９４℃で２分間変性を行なった後、９４℃で１
分間（変性）、５０℃で２分間（プライマーのアニーリ
ング）、７２℃で３分間（合成反応）を１サイクルとす
る３０サイクルのＰＣＲを実施した。このようにして得
られた一次ＰＣＲ産物を用い、次に、二次ＰＣＲを行な
った。一次ＰＣＲ後の反応液１μｌをテンプレートと
し、ミックスプライマー４とLAPCR in vitro cloning k
it（宝酒造社製）に添付のプライマーＣ２の組み合わせ
で一次ＰＣＲと同様の条件でＰＣＲを行なった後、上層
のミネラルオイルを除去し、次いで反応液５μｌを１．
０％アガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロミ
ドでＤＮＡを染色して増幅産物の確認を行なった。その
結果、約２ｋｂの増幅産物が確認され、該ＤＮＡフラグ
メントを４−３Ｎと命名した。この増幅フラグメントを
アガロースゲルより切り出し、常法に従って抽出精製
し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクターに連結し、大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換した。得られた形質転換体を用いて４−３
の末端領域の塩基配列をジデオキシチェーンターミネー
ター法で決定した。このようにして決定された４−３Ｎ
の末端領域の配列に基づいてプライマーをデザインし、
４−３Ｎの上流および下流のＤＮＡ断片のクローニング
をLA PCR in vitro cloning kit（宝酒造社製）を用い
て行なった。４−３Ｎの上流のＤＮＡ断片のクローニン
グには、配列が明らかになった４−３Ｎの末端領域のＮ
末端付近の領域に基づいてデザインされた、配列表の配
列番号８および９に示されるプライマー６および７を用
いた。クローニングはプライマーのアニーリング温度を
５５℃としたことを除いて４−３Ｎのクローニングと同
様の操作にて行なった。その結果、約１．０ｋｂのＤＮ
Ａ断片が得られ、４−３ＵＮと命名した。４−３Ｎの下
流のＤＮＡ断片のクローニングには、配列が明らかにな
った４−３Ｎの末端領域のＣ末端付近の領域に基づいて
デザインされた、配列表の配列番号１０および１１に示
されるプライマー８および９を用いた。クローニングは
プライマーのアニーリング温度を５５℃としたこと除い
て４−３Ｎのクローニングと同様の操作にて行なった。
その結果、約２．０ｋｂのＤＮＡフラグメントが得ら
れ、４−３Ｃと命名した。得られたフラグメント４−３
ＵＮ、４−３Ｃは、共にｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（ノバ
ジェン社製）に連結し、ジデオキシチェーンターミネー
ター法で塩基配列を決定した。以上にようにして決定さ
れた４−３Ｎ、４−３ＵＮ、４−３ＣのＤＮＡフラグメ
ントの塩基配列を解析し、重ねあわせた結果、９５１個
のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする読み取り
枠（ＯＲＦ）が見出された。該読み取り枠の塩基配列を
配列表の配列番号１３に、該読み取り枠の塩基配列がコ
ードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１５に示す。
なお、４−３ＵＮ中にはアミノ酸配列Ｐ２部分の塩基配
列が存在し、その上流に１８３個のアミノ酸をコードす
る塩基配列、さらにその上流にＳＤ様配列が見出され
た。なお微生物ＴＫＲ４−３より精製されたα−アガラ
ーゼについて決定されたＮ末端アミノ酸配列Ｐ２は、配
列表の配列番号１５に示されたアミノ酸配列の１８４〜
２０３番目のアミノ酸配列に一致していた。以上のよう
にして得られたアガラーゼ１−７、アガラーゼ４−３の
アミノ酸配列および遺伝子の塩基配列は公知のアガロー
ス分解酵素で本発明のアガラーゼと異なる切断様式を持
つβ−アガラーゼのアミノ酸配列および遺伝子の塩基配
列とのホモロジーはなく、全く新規の配列であると考え
られた。

【００４０】実施例８ α−アガラーゼ１−７を発現するプラスミドの構築配列表の配列番号１８で表される配列を有するプライマ
ー１０を合成した。このプライマー１０は、塩基番号８
〜１３に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を持ち、α−アガ
ラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ
酸番号２８〜３１のアミノ酸配列に相当する塩基配列を
塩基番号１４〜２５に持つプライマーである。プライマ
ー１０とｐＡＡ１中のｐＵＣ１９ベクター側にハイブリ
ダイズするプライマー２（配列番号４）を用い、ｐＡＡ
１を鋳型としたＰＣＲを行なった。０．５ｍｌＰＣＲ
用チューブにプライマー１０、プライマー２を１０ｐｍ
ｏｌずつ、鋳型として実施例６で得たｐＡＡ１１０ｎ
ｇ、５μｌの１０×ＥｘＴａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴ
Ｐ混合液、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘＴａｑを加
え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。これを自動
遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセ
ットし、９４℃で２分間変性を行った後、９４℃で１分
間、５５℃で２分間、７２℃で３分間を１サイクルとす
る２５サイクルのＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をエ
タノール沈澱により濃縮、脱塩し、制限酵素ＮｄｅＩ
（宝酒造社製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で二重消
化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄ
ｅＩ−ＢａｍＨＩ消化物を分離し、抽出精製した。この
精製したものとＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＫ
Ｆ１９ｋ（宝酒造社製）を混合し、ＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その後、ラ
イゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９
を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃
度の寒天を含むＬＢ培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ
含む）上で生育させた。白色を呈したコロニーからプラ
スミドを調製し、ＤＮＡシークエンシングを行い、正し
くＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これを
ｐＡＡ２０１と命名した。ｐＡＡ２０１はα−アガラー
ゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番
号２８〜９２５のアミノ酸配列をコードするプラスミド
である。このｐＡＡ２０１を導入した形質転換体を２．
５ｍｌのＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、
１０ｍＭ塩化カルシウムを含む）に植菌し、３７℃で一
晩培養した。この一部を新たに２．５ｍｌの同培地に植
菌し、２５℃で対数増殖期まで培養した。ここでＩＰＴ
Ｇを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、さらに一晩
１５℃で培養して目的タンパク質を発現誘導させた。そ
の後菌体を遠心分離により集め、１５０μｌの細胞破砕
溶液｛２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ塩
化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム｝に再懸濁し
た。超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄み
の抽出液と沈澱とに分けた。それぞれを試料としてアガ
ロースを基質としたα−アガラーゼ活性を測定したとこ
ろ、抽出液に活性が確認された。なお、この活性は１０
０ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、野性株で
あるＴＫＲ１−７ＡＧαのもつ活性の約２５倍であっ
た。

【００４１】実施例９ α−アガラーゼ１−７のｐＴ７ＢｌｕｅＴを用いた発現
系配列表の配列番号１９で表される配列を有するプライマ
ー１１を合成した。このプライマー１１は、α−アガラ
ーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸
番号２８〜３３のアミノ酸配列に相当する塩基配列を塩
基番号１３〜３０に持つプライマーである。プライマー
１１とプライマー２を用い、ｐＡＡ１を鋳型とするＰＣ
Ｒを行い、得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲ
ル電気泳動で分離し、抽出精製した。精製されたＰＣＲ
産物を、クローニングするために設計されたベクターで
あるｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター（宝酒造社製）に連結
し、発現ベクターを構築した。なおＰＣＲのの反応条件
は実施例８に準じた方法で行った。ＤＮＡシークエンシ
ングを行い、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミド
を選択した。このハイブリッドプラスミドをｐＡＡ３０
１と命名した。ｐＡＡ３０１はｐＡＡ２０１と同様α
−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）の
アミノ酸番号２８〜９２５のアミノ酸配列をコードする
プラスミドである。ｐＡＡ３０１を用いて大腸菌ＪＭ１
０９を形質転換し、得られた形質転換体をＬＢ液体培地
（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ塩化カルシウ
ムを含む）に植菌し、実施例８と同様にＩＰＴＧにより
目的タンパク質の発現を誘導し、α−アガラーゼ活性を
確認したところ、抽出液に活性が確認された。これは１
００ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、ＴＫＲ
１−７ＡＧαのもつ活性の約１００倍であった。

【００４２】実施例１０ α−アガラーゼ１−７のｐＥＴ１６ｂを用いた発現系配列表の配列番号２０で表される配列を有するプライマ
ー１２を合成した。このプライマー１２はα−アガラー
ゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番
号９１９〜９２４に相当する塩基配列の相補鎖の塩基配
列を塩基番号１７〜３４にもち、制限酵素ＢａｍＨＩの
認識配列を塩基番号９〜１４に持つプライマーである。
実施例８に準じた条件で、プライマー１０（配列番号１
８）と、プライマー１２（配列番号２０）を用いて、ｐ
ＡＡ１をテンプレートとしたＰＣＲを行った。その増幅
断片をエタノール沈澱により濃縮、脱塩後、ＮｄｅＩ
（宝酒造社製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で切断
し、アガロースゲル電気泳動により分離し、抽出精製し
た。これをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ１
６ｂ（宝酒造社製）に連結し、得られたハイブリッドプ
ラスミドをｐＡＡ４０１と命名した。ｐＡＡ４０１はｐ
ＡＡ２０１、ｐＡＡ３０１と同様α−アガラーゼ１−７
のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号２８〜
９２５のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。
ｐＡＡ４０１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙ
ｓＳを形質転換し、得られた形質転換体を用いて実施例
８と同様にα−アガラーゼの活性を確認したところ（た
だし薬剤はカナマイシンの代わりにアンピシリンを用い
た）、その抽出液に活性が確認された。この活性は１０
０ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、ＴＫＲ１
−７ＡＧαのもつ活性の約１００倍であった。

【００４３】実施例１１ α−アガラーゼ４−３を発現するプラスミドの構築配列表の配列番号２１で表される配列を有するプライマ
ー１３、及び配列表の配列番号２２で表される配列を有
するプライマー１４を合成した。プライマー１３は制限
酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１２〜１７に持ち、
さらにα−アガラーゼ４−３のアミノ酸配列（配列番号
１５）のアミノ酸番号１８４〜１８７のアミノ酸配列に
相当する塩基配列を塩基番号１８〜２９に持つプライマ
ーである。プライマー１４は制限酵素ＢａｍＨＩの認識
配列を塩基番号８〜１３に持ち、なおかつクローニング
の結果得られたα−アガラーゼ４−３遺伝子の読み枠の
下流とハイブリダイズする配列を持つプライマーであ
る。プライマー１３及びプライマー１４を用いて、Ｔ
ＫＲ４−３ＡＧα野生株由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし
たＰＣＲを行った。プライマー１３、１４を１０ｐｍｏ
ｌずつ、鋳型としてＴＫＲ４−３ＡＧα野生株由来の染
色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化したもの１０ｎ
ｇ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を含むＰＣＲ反応液を調
製し、９４℃で２分間変性を行った後、９４℃で１分間
→５０℃で２分間→７２℃で３分間を１サイクルとする
２５サイクルのＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を
エタノール沈澱により濃縮し、制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒
造社製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で二重消化し、
１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＮｄｅＩ−
ＢａｍＨＩ消化物を分離し、抽出精製した。実施例８と
同様にしてｐＫＦ１９ｋとのハイブリッドプラスミドを
作製し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形
質転換体よりプラスミドを調製し、ＰＣＲ産物が正しい
方向で挿入されたものを選択し、これをｐＡＨ１０１と
命名した。ｐＡＨ１０１はα−アガラーゼ４−３のアミ
ノ酸配列（配列番号１５）のアミノ酸番号１８４〜９５
１のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。プラ
スミドｐＡＨ１０１で形質転換された大腸菌はEscheric
hia coli JM109／pAH101と命名表示され、ブダペスト条
約のもと２０００年１月２７日より通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−
７００８のもとで寄託されている。ｐＡＨ１０１を保持
する形質転換体について、実施例８と同様にしてα−ア
ガラーゼ活性を確認したところ、その抽出液に活性が存
在した。その活性は１００ｍｌの培養液当たりの活性で
比較した場合、野性株であるＴＫＲ４−３ＡＧαのもつ
活性の約１５倍であった。

【００４４】実施例１２ α−アガラーゼ４−３のｐＥＴ１６ｂを用いた発現系配列表の配列番号２３で表される配列を有するプライマ
ー１５を合成した。プライマー１５は制限酵素ＢａｍＨ
Ｉの認識配列を塩基番号１０〜１５に持ち、α−アガラ
ーゼ４−３のアミノ酸配列（配列番号１５）のアミノ酸
番号９４５〜９５０のアミノ酸配列に相当する塩基配列
の相補鎖の塩基配列を塩基番号１８〜３５に持つプライ
マーである。実施例８に準じた条件で、プライマー１３
とプライマー１５を用いて、実施例１１に記載のＴＫＲ
４−３ＡＧα野生株由来の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰ
ＣＲを行った。その増幅断片をエタノール沈澱により濃
縮後、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ切断し、アガロースゲル
電気泳動により分離し、抽出精製した。これをＮｄｅＩ
及びＢａｍＨＩで切断したｐＥＴ１６ｂ（宝酒造社製）
に連結し、得られたハイブリッドプラスミドをｐＡＨ２
０１と命名した。ｐＡＨ２０１はα−アガラーゼ４−３
のアミノ酸配列（配列番号１５）のアミノ酸番号１８４
〜９５０のアミノ酸配列をコードするプラスミドであ
る。ｐＡＨ２０１を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐ
ＬｙｓＳを形質転換し、得られた形質転換体を用いて実
施例８と同様にα−アガラーゼの活性を確認したところ
（ただし薬剤はカナマイシンの代わりにアンピシリンを
用いた）、その抽出液に活性が確認された。これは１０
０ｍｌの培養液当たりの活性で比較した場合、ＴＫＲ４
−３ＡＧαのもつ活性の約７５倍であった。

【００４５】実施例１３改変タンパク質の活性遺伝子工学的手法により、以下に示す改変タンパク質を
作製し、それぞれについてα−アガラーゼ活性を確認し
た。配列表の配列番号２４で表される配列を有するプラ
イマー１６を合成した。プライマー１６は、α−アガラ
ーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸
番号１７２〜１７４のアミノ酸配列に相当する塩基配列
を塩基番号３〜１１に持ち、α−アガラーゼ１−７のア
ミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号１７７〜１
８１のアミノ酸配列に相当する塩基配列を塩基番号１８
〜３２に持ち、さらに制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩
基番号１２〜１７にもつプライマーである。プライマー
１６とプライマー２（配列番号４）を用いて、ｐＡＡ１
をテンプレートとしたＰＣＲを行い、実施例８と同様に
してｐＫＦ１９ｋへ連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転
換した。形質転換体よりプラスミドを調製し、ＤＮＡシ
ークエンシングにより連結部分の配列を確認して、得ら
れたハイブリッドプラスミドをｐＡＡ５０１と命名し
た。ｐＡＡ５０１はα−アガラーゼ１−７のアミノ酸番
号１７６番目までが欠失したもの、即ち配列番号１４の
アミノ酸番号１７７〜９２５のアミノ酸配列をコードす
るプラスミドである。ｐＡＡ５０１で形質転換した大腸
菌ＪＭ１０９を実施例８と同様にして培養し、ＩＰＴＧ
でｐＡＡ５０１がコードするタンパク質の発現を誘導さ
せ、活性を確認したところ、その抽出液にα−アガラー
ゼの活性が存在した。

【００４６】実施例１４サザンハイブリダイゼーション α−アガラーゼ４−３のクローンであるｐＡＨ１０１の
挿入断片をプローブとし、野性株であるＴＫＲ１−７Ａ
Ｇαの染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。以下の操作は、DIG DNA標識・検出キッ
ト（ロシュ社製）のプロトコルに従い実施した。この際
のプローブは、ｐＡＨ１０１を制限酵素ＮｄｅＩ及び制
限酵素ＢａｍＨＩで切断して得られた約２．４ｋｂのＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離、抽出精
製し、その約１．０μｇ分を上記キットのプロトコルに
従い標識したものを用いた。約２．０μｇ分のＴＫＲ１
−７ＡＧαの染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、１．
０％アガロースゲル電気泳動した後、常法に従って０．
４Ｎ水酸化ナトリウムによりニトロセルロースメンブレ
ン（アマシャム社製）にＤＮＡ断片をトランスファーし
た。その後、６８℃で１時間プレハイブリダイゼーショ
ンを行い、標識したプローブを熱変性させたものを添加
して、６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
尚、ハイブリダイゼーションは［６×ＳＳＣ、０．５％
ＳＤＳ、５×デンハルト、１００ｍｇ／ｍｌニシン精
子ＤＮＡ］の溶液中で行なった。そのメンブレンを室温
で２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで５分間（２
回）、６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳで１５分間（２回）洗浄し、余分なプローブを排除
した。その後プロトコルに従い検出反応を行った結果、
約７．２ｋｂの位置にバンドが確認された。このよう
に、α−アガラーゼ４−３の遺伝子をプローブに用いて
ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを実
施することにより、活性なα−アガラーゼをコードする
遺伝子である野性株ＴＫＲ１−７ＡＧαのα−アガラー
ゼ遺伝子を検出することができた。なお、α−アガラー
ゼ１−７とα−アガラーゼ４−３のオープンリーディン
グフレーム全長の配列を比較したところ、アミノ酸配列
のホモロジーは５１％、遺伝子の塩基配列のホモロジー
は６１％であった。

【００４７】実施例１５欠失体α−アガラーゼの作成遺伝子工学的手法により、以下に示すＮ末端側より欠失
させたタンパク質を作製し、それぞれについてα−アガ
ラーゼ活性を確認した。（１）α−アガラーゼ１−７欠失体のα−アガラーゼ活
性プライマー１７（配列番号２５）は、α−アガラーゼ１
−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸番号１
９７〜２００、２０１〜２０６のアミノ酸配列に相当す
る塩基配列を塩基番号１〜１２、１９〜３６にもち、さ
らに制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１３〜１８
にもつ。これとプライマー２（配列番号４）を用いて、
上記のプラスミドｐＡＡ１をテンプレートとしたＰＣＲ
を以下のように行った。０．５ｍｌ容のＰＣＲ用チュー
ブにプライマー１７、プライマー２を１０ｐｍｏｌず
つ、テンプレートとして１０ｎｇのｐＡＡ１、さらに５
μｌの１０×ＥｘＴａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合
液、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘＴａｑを加え、滅
菌水を加えて５０μｌとした。これを自動遺伝子増幅装
置サーマルサイクラー（宝酒造社製）にセットし、９４
℃で２分間変性を行った後、９４℃で１分間→５５℃で
２分間→７２℃で３分間を１サイクルとする２５サイク
ルのＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をエタノール沈澱
により濃縮、脱塩した後、制限酵素ＮｄｅＩ（宝酒造社
製）及びＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で二重消化した。こ
の消化物を１．０％アガロース電気泳動に供し、Ｎｄｅ
Ｉ、ＢａｍＨＩで消化されたＰＣＲ産物を抽出精製し
た。精製されたＰＣＲ産物と、同じくＮｄｅＩ、Ｂａｍ
ＨＩで消化したｐＫＦ１９ｋ（宝酒造社製）を混合し、
ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いてこ
れらを連結した。その後、このライゲーション反応液１
０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形
質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培
地（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む）上で生育さ
せた。白色を呈したコロニーからプラスミドを調製し、
次いでプラスミド中の挿入断片の塩基配列を調べて上記
のＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これを
ｐＡＡ−ｄｅＮ１と命名した。これから発現されるタン
パク質は、α−アガラーゼ１−７のアミノ酸番号２００
番目までが欠失したものである。このｐＡＡ−ｄｅＮ１
を大腸菌に導入して得られた形質転換体を２．５ｍｌの
ＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ
塩化カルシウムを含む）に植菌し、３７℃で一晩培養し
た。この一部を新たに２．５ｍｌの同培地に植菌し、２
５℃で対数増殖期まで培養した。ここでＩＰＴＧを終濃
度１．０ｍＭになるように添加し、同時に１５℃に培養
温度を下げて、さらに一晩培養して目的タンパク質を発
現誘導した。その後菌体を遠心分離により集め、１５０
μｌの細胞破砕溶液｛２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．
０）、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ塩化ナトリウ
ム｝に懸濁した。超音波処理により菌体を破砕した後、
遠心分離により上澄みの無細胞抽出液と沈澱とに分け
た。それぞれを試料としてアガロースを基質とした上記
の方法によりα−アガラーゼ活性を測定したところ、無
細胞抽出液に活性が確認された。以下上記と同様の操作
により欠失体を作製し、そのα−アガラーゼ活性を測定
した。プライマー１８（配列番号２６）は、α−アガラ
ーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１４）のアミノ酸
番号３３２〜３３４、３３５〜３４０のアミノ酸配列に
相当する塩基配列を塩基番号３〜１１、１８〜３５にも
ち、さらに制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１２
〜１７にもつ。このプライマーをプライマー１７のかわ
りに使用して作製したハイブリッドプラスミドをｐＡＡ
−ｄｅＮ２とした。これから発現されるタンパク質は、
α−アガラーゼ１−７のアミノ酸番号３３４番目までが
欠失したものである。プライマー１９（配列番号２７）
は、α−アガラーゼ１−７のアミノ酸配列（配列番号１
４）のアミノ酸番号３７６〜３７８、３７９〜３８５の
アミノ酸配列に相当する塩基配列を塩基番号２〜１０、
１８〜３８にもち、さらに制限酵素ＮｄｅＩの認識配列
を塩基番号１１〜１６にもつ。このプライマーをプライ
マー１７のかわりに使用して作製したハイブリッドプラ
スミドをｐＡＡ−ｄｅＮ３とした。これから発現される
タンパク質は、α−アガラーゼ１−７のアミノ酸番号３
７８番目までが欠失したものである。これらのプラスミ
ドを導入された形質転換体の発現するα−アガラーゼ活
性の結果をまとめて表２に示した。

【００４８】（２）α−アガラーゼ４−３欠失体のα−
アガラーゼ活性アガラーゼ４−３の欠失体は、上記のアガラーゼ１−７
の場合と同様に作成した。プライマー２０（配列番号２
８）は、α−アガラーゼ４−３のアミノ酸配列（配列番
号１５）のアミノ酸番号２４７〜２５０、２５１〜２５
５のアミノ酸配列に相当する塩基配列を塩基番号１〜１
２、１９〜３３にもち、さらに制限酵素ＮｄｅＩの認識
配列を塩基番号１３〜１８にもつ。これとプライマー２
（配列番号４）を用いて実施例１１に記載のプラスミド
ｐＡＨ１０１をテンプレートとしたＰＣＲを行い、その
後、実施例１５（１）と同様の操作を行なって、ｐＫＦ
１９ｋとのハイブリッドプラスミド（ｐＡＨ−ｄｅＮ
１）を作製した。このハイブリッドプラスミドを導入し
た大腸菌ＪＭ１０９からは、α−アガラーゼ４−３のア
ミノ酸配列（配列番号１５）のアミノ酸番号２５０番目
までのポリペプチドが欠失したタンパク質が発現され
る。この形質転換体について実施例１５−（１）と同様
にして活性を確認したところ、その無細胞抽出液にα−
アガラーゼの活性が存在した。プライマー２１（配列番
号２９）は、α−アガラーゼ４−３のアミノ酸配列（配
列番号１５）のアミノ酸番号３６１〜３６４、３６５〜
３７０のアミノ酸配列に相当する塩基配列を塩基番号３
〜１４、２１〜３８にもち、さらに制限酵素ＮｄｅＩの
認識配列を塩基番号１５〜２０にもつ。このプライマー
をプライマー２０のかわりに使用して作製したプラスミ
ドをｐＡＨ−ｄｅＮ２とし、これを導入した大腸菌ＪＭ
１０９からはα−アガラーゼ４−３のアミノ酸配列（配
列番号１５）のアミノ酸番号３６４番目までのポリペプ
チドが欠失したタンパク質が発現される。プライマー２
２（配列番号３０）は、α−アガラーゼ４−３のアミノ
酸配列（配列番号１５）のアミノ酸番号４０６〜４０
８、４０９〜４１３のアミノ酸配列に相当する塩基配列
を塩基番号３〜１１、１８〜３２にもち、さらに制限酵
素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１２〜１７にもつ。こ
のプライマーをプライマー２０のかわりに使用して作製
したプラスミドをｐＡＨ−ｄｅＮ３とし、これからはα
−アガラーゼ４−３のアミノ酸配列（配列番号１５）の
アミノ酸番号４０８番目までのポリペプチドが欠失した
タンパク質が発現される。これらのプラスミドが導入さ
れた形質転換体の発現するアガラーゼ活性の結果をまと
めて表２に示した。

【００４９】

【表２】

【００５０】

【発明の効果】本発明により、新規なα−アガラーゼが
提供される。また、該酵素を用いることにより、重合度
が低く、還元末端に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクト
ースを有するアガロオリゴ糖、たとえばアガロビオー
ス、アガロテトラオースをアガロースから直接生産する
ことが可能となる。本発明のα−アガラーゼを使用して
製造されたアガロオリゴ糖は、アポトーシス誘発作用、
制ガン作用、各種の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレ
ルギー作用等の生理活性を有しており、医薬品、飲食品
の分野で有用である。また、本発明によりα−アガラー
ゼのアミノ酸および塩基配列が初めて明らかとなり、α
−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺
伝子を提供することが可能となった。また該遺伝子を用
いるα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドの工業的
に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。さらに、
該遺伝子を用いる遺伝子工学的製造方法においてはα−
アガラーゼの誘導生産のために培地にアガロースを添加
する必要がないため培養時の手間を省くことが出来、ま
た酵素精製も容易であると考えられる。さらにまた、本
発明により、初めてα−アガラーゼ遺伝子が提供された
ことにより、該遺伝子の情報をもとにして、そこにコー
ドされる組換えポリペプチドおよび該ポリペプチドに特
異的に結合する抗体またはその断片、α−アガラーゼに
特異的にハイブリダイズするプローブやプライマーが提
供される。

【００５１】

【配列表フリーテキスト】 SEQ ID NO:1: N-terminal amino acid sequence of agarase 1-7 SEQ ID NO:2: N-terminal amino acid sequence of agarase 4-3 SEQ ID NO:3: Designed oligonucleotide primer for PCR using pAA1 as template SEQ ID NO:4: Designed oligonucleotide primer for PCR using pAA1 as temp late SEQ ID NO:5: Designed oligonucleotide primer for DNA sequencing of pAA1 SEQ ID NO:6: Designed oligonucleotide primer for amplifying DNA fragment 4-3N SEQ ID NO:7: Designed oligonucleotide primer for amplifying DNA fragment 4-3N SEQ ID NO:8: Designed oligonucleotide primer for cloning DNA fra gment 4-3UN SEQ ID NO:9: Designed oligonucleotide primer for cloning DNA fra gment 4-3UN SEQ ID NO:10: Designed oligonucleotide primer for cloning DNA fr agment 4-3C SEQ ID NO:11: Designed oligonucleotide primer for cloning DNA fr agment 4-3C SEQ ID NO:12: Nucleotide sequence of ORF in agarase 1-7 gene SEQ ID NO:13: Nucleotide sequence of ORF in agarase 4-3 gene SEQ ID NO:14: Amino acid sequence of agarase 1-7 SEQ ID NO:15: Amino acid sequence of agarase 4-3 SEQ ID NO:16: Designed oligonucleotide primer for amplifying DNA fragment from 16S ribosomal SEQ ID NO:17: Designed oligonucleotide primer for amplifying DNA fragment from 16S ribosomal SEQ ID NO:18: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 1-7 SEQ ID NO:19: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 1-7 SEQ ID NO:20: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 1-7 SEQ ID NO:21: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 4-3 SEQ ID NO:22: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 4-3 SEQ ID NO:23: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 4-3 SEQ ID NO:24: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 1-7 SEQ ID NO:25: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 1-7 SEQ ID NO:26: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 1-7 SEQ ID NO:27: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 1-7 SEQ ID NO:28: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 4-3 SEQ ID NO:29: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 4-3 SEQ ID NO:30: Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing agarase 4-3

【００５２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co,. Ltd. <120> α-agarase and method for producing the same <130> T-1504 <160> 30 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> N-terminal amino acid sequence of agarase 1-7 <400> 1 Asp Thr Leu Ser Val Glu Ala Glu Met Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> N-terminal amino acid sequence of agarase 4-3 <400> 2 Gly Asp Ile Val Ile Glu Leu Glu Asp Phe Asp Ala Thr Gly Thr Thr 1 5 10 15 Gly Arg Val Ala 20 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR using pAA1 as template <400> 3 gayacnytnt cngtngargc ngaratgtty 30 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for PCR using pAA1 as template <400> 4 gttttcccag tcacgac 17 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for DNA sequencing of pAA1 <400> 5 attgatgtcg taatcaacat agtcccccgc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying DNA fragment 4-3N <400> 6 gayathgtna thgarctnga rgayttygay 30 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying DNA fragment 4-3N <400> 7 gcnacnggna cnacnggnmg ngtngc 26 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for cloning DNA fragment 4-3UN <400> 8 gttacccagc tgacattggt tgcacccgcc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for cloning DNA fragment 4-3UN <400> 9 gctgcaacga aaccatcatt aggatcactg 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for cloning DNA fragment 4-3C <400> 10 gagtgttacc aacaacagca atggtgatgc 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for cloning DNA fragment 4-3C <400> 11 gtaatcacgg ttaacaactt agaggtgtgg 30 <210> 12 <211> 2778 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Nucleotide sequence of ORF in agarase 1-7 gene <400> 12 atgaataaaa atatcaagct atcactgctt agtatggggg ttttatgctc tgctggtcta 60 gtgactaaca ttgctgttgc agatacccta tctgttgaag cagaaatgtt tagcaattca 120 gggggaacat ttgctgatgg ccaagctaat ccaattacca tttacacagt taatggtgag 180 caggcgatta gttatgtcaa tgcgggggac tatgttgatt acgacatcaa taccgaaggg 240 ggcgactact cagttgaata tcttgtcggg acaagtgttg cttctggccc gacaatagaa 300 atgctagtaa aagaaaatgg tgtttgggta agtcaaggta cagtcgctgt tccacaaggc 360 agttgggata actttcaacc actttcaccg tcacatttag taaccttacc tgcaggtgcc 420 gcttcaattc gccttcatgc cataggttca aattggcaat ggaacttaga gtctttttcc 480 ttaacacaag taacaccact acctggcgct tccgtagctg atgtagtggt agagttagaa 540 aactttatta atactgataa agaccgcaat gctattgctg gtgattctgt ggtgggtttt 600 ggcaccacta acaatggcat taactttaat acccttggtg attacgctga ctatcatgtc 660 aattttgcta gcccaggtac ctataatgta tccattgctg ctggttcaac ggttcaaggg 720 caaataggcg cagaaatttt actgaatggt aataccgttg cttcaaatta tctgtcagca 780 acagcaggtt gggatgatta ccaagatttt gcgctgactg gtgatgtaat aattgctaat 840 gctgggactc ataccataag agtaaaaagc tacggtagtg caaattggca atggaatggt 900 gactctatta ccttcactca tatttcggat gacaccaacg gcggcagcaa ccaagcaatg 960 catctagaac caccttatgc gataccagag agccgtaaaa ttaaaaaatc ttctgtatgg 1020 tacacctacc cacaaaactc taatttagct ggctttagtg actttggtgc taccggcgct 1080 ttctggggac acatgccaga agaagatcta tacgatagtg gcgtgctttc taactgggtt 1140 aaccaagtac aagggtatcg caatcaaggt ttagactatg ttggtcgtgg tgaatttgat 1200 tggggtttca gatggtttat tgaatatgtt ggcgacccta catcacactg ggcacgaacg 1260 ttagacgatg atcccatttt aatgtctttt atgggatacc atgaacacaa tggttatctg 1320 aacggctggt taagtaacca tagccccacc tttgttgatt tttttaagtc tcaagttgat 1380 gccttattaa gcgctaacgt ttcacacatc atgtttgatt cgcaaacttc atcgacgcga 1440 tctaccgatt taggccaatt tggtggcgat ttctctactt ggtcaatgga tgcttttcgt 1500 gaatatatgc gtgataaata caccacagcc gagttaaaca ccaaaggcat aactaatatc 1560 aatgcgttta attatcgaaa ctttttaaga agtcgaggct acacccatgc ttcgtatatg 1620 gctgctgcca ataaaatcac tagtggcata ccattgtttg atgattttat ttattttaat 1680 cgtgctgtgc taaatgaaaa aatggcagaa gtactggatt atatccgctc aattgatgct 1740 gatattgaaa ttggcgcgac caccgcttta accgaagcac gtggctatat ttttgataaa 1800 gacctaactt tcttagccgg tgaattagcc atgggttcag cggttgctga cgaaatgcca 1860 ataccaatta tttcacactt aaaaagtgct gaagccgttg ataaaacgct cgtttacttc 1920 ccttatcctt ggaactttaa agacctgtac gaccgtaatt cgcctcaaat ggcacgaact 1980 tggattgctc aatcgtatgc tatgggggca atattctcaa tccctgccaa cgtttggata 2040 ggtgatgctg gcgtttggtc acctggtgct gataattatc gcgatctcta tcaatttgcc 2100 agcgacaata gcgcattact tgatggttat gatgcctttt ctaaggttgg gttagtttca 2160 cctatgatgg cttcacttga taccacatgg attgatggta gcaatcgttt acaaacgagt 2220 atccgttacc ttattgaaaa taacttaaac tttgatttat taatttttgg tgaccctggt 2280 aaacccgtag tccctactca agcacaatta tctgcactag atgcgattat tgttgatagt 2340 gatcgcaagt acttaaccga cgcacaaaat gccttgttag atgcaaataa tcagaaagta 2400 ttggacttaa acaacagtgc tgataccgcc gccattaatg ccctgaaagc aacaaatata 2460 tcagtgacta tcggtaatgc cgctgctgat gatacgatta ctgcgctttc tcgtgtgcat 2520 gaaagcaata ataacgcgcc ttatgttatt cagttattaa atcgtcctgt taatccagcc 2580 aatggtgtaa caccagtatt aagtaatgtt aaaattgcta ttccacaagg ctattttcct 2640 gaaggaataa cacaagcaac cgtgcataaa cctggcgccg gctcggtcaa tgccaatatt 2700 acctcaaata acaatggtga ttatgttatt accgttaata atttaggggt ttggggaatg 2760 attgaattag cgcattaa 2778 <211> 13 <211> 2856 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Nucleotide sequence of ORF in agarase 4-3 gene <400> 13 atgaaatcca acaaaaaacg cagagtactc ggagttgcta tccctctcac atacacatta 60 ttacttagtt ttagcaattc agccttgagc gaaacactaa ttgttcaagc cgaatccttt 120 acccattcag gaggcacctt taacgatggg caatcctccc ccatcagtat ttatactgtt 180 aacggtgaac aagcaattag ctgggtcaac gctggtgatt atgttgacta taacgtcacc 240 gcagttggcg gtgaatataa catcgagtat ttggttggaa catctgtagc ggctaacccg 300 attatcgaag tattggttga cagtaatggt acttttgaga gccaaggtac ggttattgtg 360 ccattaggta gttgggacga tttccaacca cttgtagctg cgcacacggt gacactgcca 420 gcgggcacct caactatacg cttgcatgct attggtccag attggcaatg gaatttagag 480 tcattttcac tgactggtgg ctcagaaaca ggtagtggcg atatagttga ttcggtcctt 540 ccgcctctgg gtgatattgt cattgagcta gaagactttg atgccacagg tacaaccggc 600 agagtggcca gtgatcctaa tgatggtttc gttgcagcgg cgggtgcaac caatgtcagc 660 tgggtaacca acggtgattt cggcgactac aataacatct accttgaagc tgggacttat 720 cgttcgttta ttacggtagc aactggcagc gacggtagct atggtgcacg cattgaccta 780 gatggttcgc cggcttcctg gggttacttt gatagtactg gtggctggga aaccccagag 840 gaagtcgagc tttatggcgg tgattttgta gttgaaacaa gtggcactca tacattacgt 900 gtagaagcca ttggtggctc agattggcaa tggagcggtg ataacgttcg cctcactaaa 960 gtgggcgacg catctgtcaa accatcacct ttgtataatc ctaaagacca taccgttaca 1020 gaaattgaag gtcctgtcgt tggtttacca tttttgaaaa aaccagttca ggttccaaca 1080 gccaacagat tgttgaaatc agacgtatgg tatacctatc ctcaaaataa cgagctgcaa 1140 ggttttgata atttcggtgc aacaggttca ttttggggcc atcctccaga agaaaatttc 1200 tacgatgaca ccaccataat tgattggaca caactcgttc aaaactatca aggaataggc 1260 attgaataca ctgctcgcgg cgaatttgat tggggcttcc gctgggttac tgaatacttg 1320 actaatcccg aaccccatta tgtaaaaaca cttgatgatc gcaatgtgcg aatgacgttc 1380 atgggttacc tcagttataa cggctacaac aacaactggt tgagtaatca cagtccagcg 1440 tttgtgccgc acatgaagtc acaagtggat caaatactaa gagccaaccc agacaagctg 1500 atgtttgata cacaaaccaa ctctactcgt tcaaccgaca tgcgcacttt cgggggtgat 1560 ttcaacgatt atgccatggc aaacttccgt gtttggctag ataaaaaata tagtagctca 1620 gaactttcag ctatgggtat tgataatatt gcaaccttta actatcgtga tttcttgtta 1680 gctagagggg taacgcacac atcattttct aatgctgcag ataccatttc aggtgacgtt 1740 cctttgcttg aggatttcat ctacttcaat cgagatgttt ggaatcaaaa gtttgctgaa 1800 gtgttagatt acattcgcat gcaacgtcca aacatcgaga taggtgcaag cacacatttg 1860 tttgaatctc gtggttacat atttaacgag aacatcacct tcttatcggg tgaattaaat 1920 ttgggtgcca gaaccaccat agctgaacta cccaccaata ttcttgttca cttaaaaggc 1980 gcgcaagctg tcgataaacc cttggcgtat ttcccatacc cttgggagtt cgccgaatta 2040 cgtgaccaaa atgcgccgcg ttttggtcgt ggttgggttg ctcaggctta tgcctacgga 2100 gggttgttct caatccctgc taacgtatgg gttggcggca atacaggtga aaacacgtgg 2160 tcacctggcg ccgataacta tcgcgacatt taccaatttg ttcgtgcgca atcaaatttg 2220 tttgacaact acacttcata cgcaaaagta gggcttgttc atgccatgta ttcatcaatg 2280 aaggcaggtt ttatcgatgg tggtaatcaa attcagtcaa gcgtgaaact tctaactgaa 2430 gacaacatca actttgactt attagtgttt ggcgatgagg gttatccggt tgtgcctcgc 2400 actgaagact tcaatcagtt tgcgcatata ttctatgacg gcgaccttag ttacttaact 2460 gcagagcagc aagctgtgct agatcaacag ggctctaaag taaaacacat aggtcaacgc 2520 ggaacattaa ctggtatcga catcaatgtg agtattaatg gttcactttc taatgaaact 2580 gtatcagcgg tatcccgcat tcatgaaaca aataccaatg caccctatgt tgtacattta 2640 ataaaccgac ctttttcggg tggcgtcacg ccaatactta gcggagttga agttgctatt 2700 cctcaaggat acttccctga agatgtaacg tctgcaacct tgcatttacc tgatggtaca 2760 agcaccaacc tgagtgttac caacaacagc aatggtgatg cagtaatcac ggttaacaac 2820 ttagaggtgt ggggaattct tgaattagct cactaa 2856 <210> 14 <211> 925 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Amino acid sequence of agarase 1-7 <400> 14 Met Asn Lys Asn Ile Lys Leu Ser Leu Leu Ser Met Gly Val Leu 1 5 10 15 Cys Ser Ala Gly Leu Val Thr Asn Ile Ala Val Ala Asp Thr Leu 20 25 30 Ser Val Glu Ala Glu Met Phe Ser Asn Ser Gly Gly Thr Phe Ala 35 40 45 Asp Gly Gln Ala Asn Pro Ile Thr Ile Tyr Thr Val Asn Gly Glu 50 55 60 Gln Ala Ile Ser Tyr Val Asn Ala Gly Asp Tyr Val Asp Tyr Asp 65 70 75 Ile Asn Thr Glu Gly Gly Asp Tyr Ser Val Glu Tyr Leu Val Gly 80 85 90 Thr Ser Val Ala Ser Gly Pro Thr Ile Glu Met Leu Val Lys Glu 95 100 105 Asn Gly Val Trp Val Ser Gln Gly Thr Val Ala Val Pro Gln Gly 110 115 120 Ser Trp Asp Asn Phe Gln Pro Leu Ser Pro Ser His Leu Val Thr 125 130 135 Leu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Ile Arg Leu His Ala Ile Gly Ser 140 145 150 Asn Trp Gln Trp Asn Leu Glu Ser Phe Ser Leu Thr Gln Val Thr 155 160 165 Pro Leu Pro Gly Ala Ser Val Ala Asp Val Val Val Glu Leu Glu 170 175 180 Asn Phe Ile Asn Thr Asp Lys Asp Arg Asn Ala Ile Ala Gly Asp 185 190 195 Ser Val Val Gly Phe Gly Thr Thr Asn Asn Gly Ile Asn Phe Asn 200 205 210 Thr Leu Gly Asp Tyr Ala Asp Tyr His Val Asn Phe Ala Ser Pro 215 220 225 Gly Thr Tyr Asn Val Ser Ile Ala Ala Gly Ser Thr Val Gln Gly 230 235 240 Gln Ile Gly Ala Glu Ile Leu Leu Asn Gly Asn Thr Val Ala Ser 245 250 255 Asn Tyr Leu Ser Ala Thr Ala Gly Trp Asp Asp Tyr Gln Asp Phe 260 265 270 Ala Leu Thr Gly Asp Val Ile Ile Ala Asn Ala Gly Thr His Thr 275 280 285 Ile Arg Val Lys Ser Tyr Gly Ser Ala Asn Trp Gln Trp Asn Gly 290 295 300 Asp Ser Ile Thr Phe Thr His Ile Ser Asp Asp Thr Asn Gly Gly 305 310 315 Ser Asn Gln Ala Met His Leu Glu Pro Pro Tyr Ala Ile Pro Glu 320 325 330 Ser Arg Lys Ile Lys Lys Ser Ser Val Trp Tyr Thr Tyr Pro Gln 335 340 345 Asn Ser Asn Leu Ala Gly Phe Ser Asp Phe Gly Ala Thr Gly Ala 350 355 360 Phe Trp Gly His Met Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Asp Ser Gly Val 365 370 375 Leu Ser Asn Trp Val Asn Gln Val Gln Gly Tyr Arg Asn Gln Gly 380 385 390 Leu Asp Tyr Val Gly Arg Gly Glu Phe Asp Trp Gly Phe Arg Trp 395 400 405 Phe Ile Glu Tyr Val Gly Asp Pro Thr Ser His Trp Ala Arg Thr 410 415 420 Leu Asp Asp Asp Pro Ile Leu Met Ser Phe Met Gly Tyr His Glu 425 430 435 His Asn Gly Tyr Leu Asn Gly Trp Leu Ser Asn His Ser Pro Thr 440 445 450 Phe Val Asp Phe Phe Lys Ser Gln Val Asp Ala Leu Leu Ser Ala 455 460 465 Asn Val Ser His Ile Met Phe Asp Ser Gln Thr Ser Ser Thr Arg 470 475 480 Ser Thr Asp Leu Gly Gln Phe Gly Gly Asp Phe Ser Thr Trp Ser 485 490 495 Met Asp Ala Phe Arg Glu Tyr Met Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Ala 500 505 510 Glu Leu Asn Thr Lys Gly Ile Thr Asn Ile Asn Ala Phe Asn Tyr 515 520 525 Arg Asn Phe Leu Arg Ser Arg Gly Tyr Thr His Ala Ser Tyr Met 530 535 540 Ala Ala Ala Asn Lys Ile Thr Ser Gly Ile Pro Leu Phe Asp Asp 545 550 555 Phe Ile Tyr Phe Asn Arg Ala Val Leu Asn Glu Lys Met Ala Glu 560 565 570 Val Leu Asp Tyr Ile Arg Ser Ile Asp Ala Asp Ile Glu Ile Gly 575 580 585 Ala Thr Thr Ala Leu Thr Glu Ala Arg Gly Tyr Ile Phe Asp Lys 590 595 600 Asp Leu Thr Phe Leu Ala Gly Glu Leu Ala Met Gly Ser Ala Val 605 610 615 Ala Asp Glu Met Pro Ile Pro Ile Ile Ser His Leu Lys Ser Ala 620 625 630 Glu Ala Val Asp Lys Thr Leu Val Tyr Phe Pro Tyr Pro Trp Asn 635 640 645 Phe Lys Asp Leu Tyr Asp Arg Asn Ser Pro Gln Met Ala Arg Thr 650 655 660 Trp Ile Ala Gln Ser Tyr Ala Met Gly Ala Ile Phe Ser Ile Pro 665 670 675 Ala Asn Val Trp Ile Gly Asp Ala Gly Val Trp Ser Pro Gly Ala 680 685 690 Asp Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Gln Phe Ala Ser Asp Asn Ser Ala 695 700 705 Leu Leu Asp Gly Tyr Asp Ala Phe Ser Lys Val Gly Leu Val Ser 710 715 720 Pro Met Met Ala Ser Leu Asp Thr Thr Trp Ile Asp Gly Ser Asn 725 730 735 Arg Leu Gln Thr Ser Ile Arg Tyr Leu Ile Glu Asn Asn Leu Asn 740 745 750 Phe Asp Leu Leu Ile Phe Gly Asp Pro Gly Lys Pro Val Val Pro 755 760 765 Thr Gln Ala Gln Leu Ser Ala Leu Asp Ala Ile Ile Val Asp Ser 770 775 780 Asp Arg Lys Tyr Leu Thr Asp Ala Gln Asn Ala Leu Leu Asp Ala 785 790 795 Asn Asn Gln Lys Val Leu Asp Leu Asn Asn Ser Ala Asp Thr Ala 800 805 810 Ala Ile Asn Ala Leu Lys Ala Thr Asn Ile Ser Val Thr Ile Gly 815 820 825 Asn Ala Ala Ala Asp Asp Thr Ile Thr Ala Leu Ser Arg Val His 830 835 840 Glu Ser Asn Asn Asn Ala Pro Tyr Val Ile Gln Leu Leu Asn Arg 845 850 855 Pro Val Asn Pro Ala Asn Gly Val Thr Pro Val Leu Ser Asn Val 860 865 870 Lys Ile Ala Ile Pro Gln Gly Tyr Phe Pro Glu Gly Ile Thr Gln 875 880 885 Ala Thr Val His Lys Pro Gly Ala Gly Ser Val Asn Ala Asn Ile 890 895 900 Thr Ser Asn Asn Asn Gly Asp Tyr Val Ile Thr Val Asn Asn Leu 905 910 915 Gly Val Trp Gly Met Ile Glu Leu Ala His 920 925 <210> 15 <211> 951 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Amino acid sequence of agarase 4-3 <400> 15 Met Lys Ser Asn Lys Lys Arg Arg Val Leu Gly Val Ala Ile Pro 1 5 10 15 Leu Thr Tyr Thr Leu Leu Leu Ser Phe Ser Asn Ser Ala Leu Ser 20 25 30 Glu Thr Leu Ile Val Gln Ala Glu Ser Phe Thr His Ser Gly Gly 35 40 45 Thr Phe Asn Asp Gly Gln Ser Ser Pro Ile Ser Ile Tyr Thr Val 50 55 60 Asn Gly Glu Gln Ala Ile Ser Trp Val Asn Ala Gly Asp Tyr Val 65 70 75 Asp Tyr Asn Val Thr Ala Val Gly Gly Glu Tyr Asn Ile Glu Tyr 80 85 90 Leu Val Gly Thr Ser Val Ala Ala Asn Pro Ile Ile Glu Val Leu 95 100 105 Val Asp Ser Asn Gly Thr Phe Glu Ser Gln Gly Thr Val Ile Val 110 115 120 Pro Leu Gly Ser Trp Asp Asp Phe Gln Pro Leu Val Ala Ala His 125 130 135 Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Thr Ser Thr Ile Arg Leu His Ala 140 145 150 Ile Gly Pro Asp Trp Gln Trp Asn Leu Glu Ser Phe Ser Leu Thr 155 160 165 Gly Gly Ser Glu Thr Gly Ser Gly Asp Ile Val Asp Ser Val Leu 170 175 180 Pro Pro Leu Gly Asp Ile Val Ile Glu Leu Glu Asp Phe Asp Ala 185 190 195 Thr Gly Thr Thr Gly Arg Val Ala Ser Asp Pro Asn Asp Gly Phe 200 205 210 Val Ala Ala Ala Gly Ala Thr Asn Val Ser Trp Val Thr Asn Gly 215 220 225 Asp Phe Gly Asp Tyr Asn Asn Ile Tyr Leu Glu Ala Gly Thr Tyr 230 235 240 Arg Ser Phe Ile Thr Val Ala Thr Gly Ser Asp Gly Ser Tyr Gly 245 250 255 Ala Arg Ile Asp Leu Asp Gly Ser Pro Ala Ser Trp Gly Tyr Phe 260 265 270 Asp Ser Thr Gly Gly Trp Glu Thr Pro Glu Glu Val Glu Leu Tyr 275 280 285 Gly Gly Asp Phe Val Val Glu Thr Ser Gly Thr His Thr Leu Arg 290 295 300 Val Glu Ala Ile Gly Gly Ser Asp Trp Gln Trp Ser Gly Asp Asn 305 310 315 Val Arg Leu Thr Lys Val Gly Asp Ala Ser Val Lys Pro Ser Pro 320 325 330 Leu Tyr Asn Pro Lys Asp His Thr Val Thr Glu Ile Glu Gly Pro 335 340 345 Val Val Gly Leu Pro Phe Leu Lys Lys Pro Val Gln Val Pro Thr 350 355 360 Ala Asn Arg Leu Leu Lys Ser Asp Val Trp Tyr Thr Tyr Pro Gln 365 370 375 Asn Asn Glu Leu Gln Gly Phe Asp Asn Phe Gly Ala Thr Gly Ser 380 385 390 Phe Trp Gly His Pro Pro Glu Glu Asn Phe Tyr Asp Asp Thr Thr 395 400 405 Ile Ile Asp Trp Thr Gln Leu Val Gln Asn Tyr Gln Gly Ile Gly 410 415 420 Ile Glu Tyr Thr Ala Arg Gly Glu Phe Asp Trp Gly Phe Arg Trp 425 430 435 Val Thr Glu Tyr Leu Thr Asn Pro Glu Pro His Tyr Val Lys Thr 440 445 450 Leu Asp Asp Arg Asn Val Arg Met Thr Phe Met Gly Tyr Leu Ser 455 460 465 Tyr Asn Gly Tyr Asn Asn Asn Trp Leu Ser Asn His Ser Pro Ala 470 475 480 Phe Val Pro His Met Lys Ser Gln Val Asp Gln Ile Leu Arg Ala 485 490 495 Asn Pro Asp Lys Leu Met Phe Asp Thr Gln Thr Asn Ser Thr Arg 500 505 510 Ser Thr Asp Met Arg Thr Phe Gly Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Ala 515 520 525 Met Ala Asn Phe Arg Val Trp Leu Asp Lys Lys Tyr Ser Ser Ser 530 535 540 Glu Leu Ser Ala Met Gly Ile Asp Asn Ile Ala Thr Phe Asn Tyr 545 550 555 Arg Asp Phe Leu Leu Ala Arg Gly Val Thr His Thr Ser Phe Ser 560 565 570 Asn Ala Ala Asp Thr Ile Ser Gly Asp Val Pro Leu Leu Glu Asp 575 580 585 Phe Ile Tyr Phe Asn Arg Asp Val Trp Asn Gln Lys Phe Ala Glu 590 595 600 Val Leu Asp Tyr Ile Arg Met Gln Arg Pro Asn Ile Glu Ile Gly 605 610 615 Ala Ser Thr His Leu Phe Glu Ser Arg Gly Tyr Ile Phe Asn Glu 620 625 630 Asn Ile Thr Phe Leu Ser Gly Glu Leu Asn Leu Gly Ala Arg Thr 635 640 645 Thr Ile Ala Glu Leu Pro Thr Asn Ile Leu Val His Leu Lys Gly 650 655 660 Ala Gln Ala Val Asp Lys Pro Leu Ala Tyr Phe Pro Tyr Pro Trp 665 670 675 Glu Phe Ala Glu Leu Arg Asp Gln Asn Ala Pro Arg Phe Gly Arg 680 685 690 Gly Trp Val Ala Gln Ala Tyr Ala Tyr Gly Gly Leu Phe Ser Ile 695 700 705 Pro Ala Asn Val Trp Val Gly Gly Asn Thr Gly Glu Asn Thr Trp 710 715 720 Ser Pro Gly Ala Asp Asn Tyr Arg Asp Ile Tyr Gln Phe Val Arg 725 730 735 Ala Gln Ser Asn Leu Phe Asp Asn Tyr Thr Ser Tyr Ala Lys Val 740 745 750 Gly Leu Val His Ala Met Tyr Ser Ser Met Lys Ala Gly Phe Ile 755 760 765 Asp Gly Gly Asn Gln Ile Gln Ser Ser Val Lys Leu Leu Thr Glu 770 775 780 Asp Asn Ile Asn Phe Asp Leu Leu Val Phe Gly Asp Glu Gly Tyr 785 790 795 Pro Val Val Pro Arg Thr Glu Asp Phe Asn Gln Phe Ala His Ile 800 805 810 Phe Tyr Asp Gly Asp Leu Ser Tyr Leu Thr Ala Glu Gln Gln Ala 815 820 825 Val Leu Asp Gln Gln Gly Ser Lys Val Lys His Ile Gly Gln Arg 830 835 840 Gly Thr Leu Thr Gly Ile Asp Ile Asn Val Ser Ile Asn Gly Ser 845 850 855 Leu Ser Asn Glu Thr Val Ser Ala Val Ser Arg Ile His Glu Thr 860 865 870 Asn Thr Asn Ala Pro Tyr Val Val His Leu Ile Asn Arg Pro Phe 875 880 885 Ser Gly Gly Val Thr Pro Ile Leu Ser Gly Val Glu Val Ala Ile 890 895 900 Pro Gln Gly Tyr Phe Pro Glu Asp Val Thr Ser Ala Thr Leu His 905 910 915 Leu Pro Asp Gly Thr Ser Thr Asn Leu Ser Val Thr Asn Asn Ser 920 925 930 Asn Gly Asp Ala Val Ile Thr Val Asn Asn Leu Glu Val Trp Gly 935 940 945 Ile Leu Glu Leu Ala His 950 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying DNA fragment from 1 6S ribosomal <400> 16 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer for amplifying DNA fragment from 1 6S ribosomal <400> 17 ggctaccttg ttacgactt 19 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 1-7 <400> 18 gctgttgcat atggataccc tatctg 26 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 1-7 <400> 19 gctgttgcca tggataccct atctgttgaa gc 32 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 1-7 <400> 20 cggatcgggg atcctgcgct aattcaatca ttcccc 36 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 4-3 <400> 21 cggtccttcc gcatatgggt gatattgtc 29 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 4-3 <400> 22 gctgtatgga tcctatctgc aaacggtgcg 30 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 4-3 <400> 23 gtactcaagg gatcctgagc taattcaaga attcc 35 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 1-7 <400> 24 ccgtagctga tcatatggta gagttagaaa ac 32 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 1-7 <400> 25 gtggtgggtt ttcatatggg caccactaac aatggc 36 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 1-7 <400> 26 gccgtaaaat tcatatgaaa aaatcttctg tatgg 35 <210> 27 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 1-7 <400> 27 gctttctaac catatgtggg ttaaccaagt acaaggg 37 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 4-3 <400> 28 gcaactggca gccatatgga cggtagctat ggtgc 35 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 4-3 <400> 29 cagccaacag attgcatatg ttgaaatcag acgtatgg 38 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Designed oligonucleotide for constructing plasmid for expressing a garase 4-3 <400> 30 ccataattga tcatatgtgg acacaactcg ttc 33

【００５３】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のα−アガラーゼによるアガロヘキサ
オースの分解を示す図である。

【図２】本発明のα−アガラーゼによるアガロヘキサ
オースの分解を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/40 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 19/00 Ｃ１２Ｒ 1:00） 21/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:00） (Ｃ１２Ｎ 9/40 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/40 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:00）Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA12 CA04 CA09 DA06 EA03 EA04 GA11 HA01 4B050 CC01 CC04 DD01 FF05E FF11E FF12E LL01 LL02 4B064 AF04 CA01 CA19 CC24 CD19 DA01 DA10 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA02 BA25 CA31 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の群より選択され、かつα−アガラ
ーゼ活性を有することを特徴とするポリペプチド。（１）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列の
うちのアミノ酸番号３３５〜９２５の５９１残基からな
るアミノ酸配列を含むポリペプチド。（２）配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列の
うちのアミノ酸番号３３５〜９２５の５９１残基からな
るアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付
加もしくは挿入の少なくとも１つが導入されたアミノ酸
配列を含むポリペプチド。（３）配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列の
うちのアミノ酸番号３６５〜９５０の５８６残基からな
るアミノ酸配列を含むポリペプチド。（４）配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列の
うちのアミノ酸番号３６５〜９５０の５８６残基からな
るアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付
加もしくは挿入の少なくとも１つが導入されたアミノ酸
配列を含むポリペプチド。
【請求項２】請求項１に記載のポリペプチドをコード
する遺伝子。
【請求項３】下記の群より選択され、かつα−アガラ
ーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴
とする請求項２記載の遺伝子。（１）配列表の配列番号１２に示される塩基配列のうち
の塩基番号１００３〜２７７５の１７７３塩基からなる
塩基配列を含む遺伝子。（２）配列表の配列番号１２に示される塩基配列のうち
の塩基番号１００３〜２７７５の１７７３塩基からなる
塩基配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加もし
くは挿入の少なくとも１つが導入された塩基配列を含む
遺伝子。（３）配列表の配列番号１３に示される塩基配列のうち
の塩基番号１０９３〜２８５０の１７５８塩基からなる
塩基配列を含む遺伝子。（４）配列表の配列番号１３に示される塩基配列のうち
の塩基番号１０９３〜２８５０の１７５８塩基からなる
塩基配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加もし
くは挿入の少なくとも１つが導入された塩基配列を含む
遺伝子。
【請求項４】請求項２または３に記載の遺伝子とスト
リンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、
かつα−アガラーゼ活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子。
【請求項５】請求項２〜４いずれか１項記載の遺伝子
を含む組換えＤＮＡ分子
【請求項６】請求項５記載の組換えＤＮＡ分子を有す
る形質転換体。
【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培養し、該
培養物からα−アガラーゼを採取することを特徴とする
α−アガラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法
【請求項８】請求項１に記載のアガラーゼ活性を有す
るポリペプチドによりアガロースを分解し、該分解物よ
りアガロオリゴ糖を採取することを特徴とするアガロオ
リゴ糖の製造方法。