TWI413692B - 分離自洋菜分解海洋單胞菌（ＴＨＡＬＡＳＳＯＭＯＮＡＳ ＡＧＡＲＩＶＯＲＡＮＳ）之β－洋菜酶、其製備方法及其用途 - Google Patents

Description

分離自洋菜分解海洋單胞菌(THALASSOMONAS AGARIVORANS)之β-洋菜酶、其製備方法及其用途

本發明係關於一種自洋菜分解海洋單胞菌(Thalassomonas agarivorans )分離之β-洋菜酶。本發明亦提供一種製備該β-洋菜酶之方法及該β-洋菜酶之用途。

洋菜為自一些紅藻之細胞壁獲得的直鏈多醣且其係由洋菜糖及洋菜膠構成。洋菜糖係由3-O連接之β-D-哌喃半乳糖及4-O連接之3,6-無水-α-L-半乳糖之雙醣單元組成。洋菜糖可被洋菜酶水解。洋菜酶可根據其酶裂解位點而分為兩類，亦即α-洋菜酶及β-洋菜酶，其中α-洋菜酶裂解洋菜糖中之α-1,3鍵，而β-洋菜酶裂解洋菜糖中之β-1,4鍵。洋菜可被酸或α-洋菜酶水解以獲得在還原端具有3,6-無水-α-L-半乳糖基團之洋菜寡醣。另一方面，β-洋菜酶可將洋菜水解成在還原端具有D-半乳糖基團之新洋菜寡醣(neoagaro-oligosaccharide)。新洋菜寡醣僅可藉由酶催化產生，不可藉由化學方法產生。

β-洋菜酶可基於其胺基酸序列而分為三個糖苷水解酶家族，即GH16、GH50及GH86。大多數的β-洋菜酶屬於GH16家族，其可水解洋菜及新洋菜六糖，而主要產物為新洋菜四糖[參見Schroeder等人，(2003)Investigation of the role of a β(1-4)agarase produced byPseudoalteromonas gracilis B9 in eliciting disease symptoms in the red algaGraci1aria graci1is. Microbiology 149 2919-2929，及Allouch等人，(2003)The three-dimensional structures of two β-agarases. J. Biol. Chem. 278:47171-47180]。GH50家族之代表性β-洋菜酶為自弧菌屬(Vibrio sp.)獲得之AgaA蛋白質，其可水解新洋菜四糖，且其主要產物為新洋菜二糖[參見Sugano等人，(1993)Cloning and sequencing ofagaA ，a unique agarase 0107 gene from amarine bacterium，Vibrio sp. strain JT0107. Appl. Environ. Microbiol. 59:3750-3756]。GH86家族之代表性β-洋菜酶為由大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica )T6c產生之AgrA蛋白質[參見Belas等人，(1988)Cloning and gene replacement mutagenesis of aPseudomonas atlantica agarase gene.Appl.Environ.Microbiol.54:30-37]，及自產微球莖菌樣細菌(Microbulbifer-like bacerium)菌株JAMB-A94獲得之AgaO蛋白質。AgaO可水解洋菜，且其主要終產物為新洋菜六糖[參見Ohta等人，(2004)Cloning,expression,and characterization of a glycoside hydrolase family 86 β-agarase from adeep-sea Microbulbifer-like isolate. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66:266-275]。

新洋菜寡醣已廣泛用於食品、化妝品及醫藥工業。已發現新洋菜寡醣可降低澱粉分解速率且可抑制細菌生長，因此可用作低熱量食品添加劑。此外，由以β-洋菜酶水解海藻所產生之多醣可刺激巨噬細胞之活化，因此可用作功能性食品以增強免疫反應[參見Yoshizawa等人，(1995)Macrophage stimulation activity of the polysaccharide fraction from amarine alga(Porphyra yezoensis ):structure-function relationships and improved solubility. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1933-1937]。此外，由β-洋菜酶水解產生之新洋菜二糖具有皮膚保濕及美白作用[參見Kobayasgu等人，(1997)Neoagarobiose as a novel moisturizer with whitening effect. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:162-163]。在分子生物學實驗室中，洋菜酶可用於純化以洋菜糖電泳分離之DNA，或用於製造藻類之原生質體[參見Araki等人，(1998)Optimization of parameters for isolation of protoplasts fromGracilaria verrucosa (Rhodophyta ). J. Mar. Biotechnol. 6:193-197]。

然而，由當前方法產生之習知β-洋菜酶之活性、穩定性及產率均無法令人滿意。仍需要具有較佳活性、穩定性及產率之新穎β-洋菜酶。

洋菜分解海洋單胞菌係由國立臺灣大學之謝文洋教授之實驗室分離[參見Jean等人，(2006)Thalassomonas agarivorans sp. nov.,a marine agarolytic bacterium isolated from shallow coastal water of An-Ping Harbour,Taiwan,and emended description of the genusThalassomonas. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56:1245-1250]。已發現洋菜分解海洋單胞菌可在培養平板中水解洋菜糖，但藉此產生之洋菜酶的類型未知。在Jean等人(2006)之前，已知具有洋菜分解活性之海洋單胞菌屬中的唯一菌株為海洋單胞菌株JAMB-A33[參見Hatada等人，(2006)Hyperproduction and application of α-agarase to enzymatic hancement of antioxidant activity of porphyran. J. Agric. Food Chem. 54:9895-9900]，且海洋單胞菌株JAMB-A33之洋菜酶為α-洋菜酶。因此，在本發明之前，並未發現海洋單胞菌屬菌株具有產生β-洋菜酶之能力。

本發明之一個目的為提供一種包含選自由以下各序列組成之群之胺基酸序列的經分離多肽：

(a)SEQ ID NO:2之胺基酸序列；

(b)SEQ ID NO:2之胺基酸序列，其中一或多個胺基酸係經刪除、取代及/或添加，且其具有β-洋菜酶活性；及

(c)與SEQ ID NO:2之胺基酸序列具有至少80%一致性且具有β-洋菜酶活性之胺基酸序列；

或其生物功能等效物、衍生物或變體。

本發明之另一目的為提供一種經分離之聚核苷酸，其包含選自由以下各序列組成之群的核苷酸序列：

(a)編碼本發明之多肽的核酸序列；

(b)SEQ ID NO:1之核酸序列；

(c)與SEQ ID NO:1之核酸序列具有至少80%一致性且編碼具有β-洋菜酶活性之多肽的核酸序列；

(d)與(a)至(c)中之任一者互補的核酸序列；及

(e)在嚴格雜交條件下與(a)至(d)中之任一者雜交的核酸序列。

本發明之另一目的為提供一種包含本發明之聚核苷酸的經分離重組載體。

本發明之另一目的為提供一種包含本發明之載體的經分離重組宿主細胞。

本發明之另一目的為提供一種產製本發明之多肽的方法，該方法包含：

(a)在適於表現多肽之條件下培養本發明之宿主細胞；及

(b)自宿主細胞及/或宿主細胞培養物中分離該多肽。

本發明之另一目的為提供一種自洋菜糖凝膠中萃取物質之方法，該方法包含：

(a)以本發明之多肽水解含有該物質之洋菜糖凝膠；及

(b)自水解產物中分離該物質且純化該物質。

本發明之又一目的為提供一種產生新洋菜寡醣(例如新洋菜四糖、新洋菜六糖及新洋菜二糖)之方法，該方法包含以本發明之多肽水解洋菜、洋菜糖、新洋菜六糖、新洋菜四糖或其混合物。

本發明之另一目的為提供一種套組，其包含本發明之多肽及一或多種可用於分離核酸之試劑。

本發明將於以下部分中詳細描述。本發明之其他特徵、目的及優點可易於見於本發明之實施方式及申請專利範圍中。

命名為agaB1 之新穎洋菜酶基因係自洋菜分解海洋單胞菌(BCRC 17492,JCM 13379)中選殖。發現該agaB1 之序列不同於由Hatada等人發現之來自海洋單胞菌屬菌株JAMB-A33之α-洋菜酶基因agaA33 (GenBank登錄號AB211981)之序列[參見Hatada等人(2006)Hyperproduction and application of α-agarase to enzymatic hancement of antioxidant activity ofporphyran.J. Agric. Food Chem. 54:9895-9900]。經比較發現，agaB1 可編碼屬於GH50家族之β-洋菜酶。

定義

除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科技術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。該等術語之含義及範疇應為明確。然而，若出現任何潛在歧義，則本文所提供之定義優先於任何詞典或外賦定義。

一般來說，本文所使用之命名法及其技術為細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及雜交技術中所熟知者，且為通常使用之命名法及技術。除非另外指出，否則本發明之方法及技術通常係根據此項技術中所習知之方法且如本說明書通篇所引用及論述之各種一般參考文獻及更具體之參考文獻所述來執行。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書，以本發明技術領域中之通常技術所完成或如本文所述來執行。結合本文所用之命名法及其實驗程序為分析化學、合成有機化學及醫藥化學等技術中所熟知且常用之彼等命名法及程序與技術。可將標準技術用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳送以及患者之治療。

除非另外指出，否則如本揭示案所利用之以下術語應理解為具有以下含義：

本文提及之術語“經分離多肽”意謂標的多肽(1)至少不含一些通常會與其伴隨存在之其他多肽，(2)實質上不含來自同一來源(例如來自同一物種)之其他多肽，(3)由來自不同物種之細胞表現，(4)與至少約50%在天然狀態下與其結合之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(5)不與在天然狀態下與經分離多肽結合(藉由共價或非共價相互作用)之多肽部分結合，(6)與在天然狀態下不與其結合之多肽操作性結合(藉由共價或非共價相互作用)或(7)在自然界中不發生者。基因體DNA、cDNA、mRNA或合成來源之其他RNA或其任何組合可編碼該經分離多肽。較佳地，經分離多肽實質上不含在其天然環境中存在，且將干擾其研究或其他用途之多肽或其他污染物。亦可使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術分離以提供實質上不含天然結合之組份之經分離多肽。

術語"胺基酸序列"意謂天然存在之蛋白質分子之胺基酸序列。"胺基酸序列"及類似術語(諸如"多肽"或"蛋白質")不表示將胺基酸序列限於與所述蛋白質分子有關之完整、天然胺基酸序列。胺基酸序列包括寡肽、肽、多肽或蛋白質序列及其片段或部分，及天然存在或合成之分子。

術語"生物功能等效物"係指關於本發明之多肽的等效物，其含有與本發明之新穎多肽之序列相似性的序列或部分，且具有與本文所揭示之多肽相同或類似之功能特性，亦即洋菜酶活性。舉例而言，本發明之多肽的生物功能等效物在胺基酸序列上可具有一些改變，其不同於該多肽之胺基酸序列但實質上與該胺基酸序列相同，且具有實質上相同(不論較小或較大程度)之如本文所述之多肽特性。

術語本發明之蛋白質、多肽及肽之"衍生物"及"變體"係依據與本發明之蛋白質及/或多肽及/或肽之差異來描述，意謂本發明之蛋白質/多肽/肽之衍生物及變體與本發明之未衍生化或非變體之蛋白質、多肽或肽之定義不同。熟習此項技術者應瞭解衍生物及變體本身為本發明之蛋白質、多肽及肽。

本文提及之術語"經分離聚核苷酸"意謂標的聚核苷酸(1)不與在天然狀態下與標的聚核苷酸結合(共價或非共價)之所有或一部分其他聚核苷酸結合，(2)不與在天然狀態下與其結合之分子結合，或(3)在天然狀態下不與任何其他聚核苷酸結合出現。該聚核苷酸可為基因體DNA、cDNA、mRNA或合成來源之其他RNA，或其任何組合。較佳地，本發明之經分離及經純化聚核苷酸包含單一編碼區。儘管該聚核苷酸包括單一編碼區，但其可含有不會不利地影響該聚核苷酸功能之其他核苷酸。舉例而言，5'及3'非轉譯區可含有可變數量之核苷酸。其他核苷酸較佳為在單一編碼區之外。

術語"核酸序列"意謂至少10個鹼基長之單鏈或雙鏈核酸聚合物。在某些實施例中，包含聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類核苷酸之經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-雙去氧核糖；及核苷酸間鍵修飾，諸如二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷醯胺酸及其類似物。本發明之核酸序列可包括標記，其包括用於偵測檢定之放射性標記、螢光標記、半抗原或抗原標記。

術語"載體"意謂用於將編碼資訊轉移至宿主細胞中之任何分子(例如核酸、質體、離合染色小體或病毒)。該術語亦包括"重組載體"、"表現載體"或"表現構築體"。術語"表現載體"或"表現構築體"係指適於宿主細胞轉形之載體，且其含有可(與宿主細胞一起)指引及/或控制一或多個與其操作性連接之異種編碼區之表現的核苷酸序列。表現構築體可包括(但不限於)影響或控制與其操作性連接之編碼區的轉錄、轉譯及RNA拼接(若存在內含子)之序列。較佳載體為能夠自主複製且表現其所連接之核酸的彼等載體。

術語"宿主細胞"意謂已用核酸序列轉形或能夠用核酸序列轉形且藉此表現所要之經選擇基因的細胞。該術語包括母細胞之後代，不管該後代在形態學或遺傳組成上是否與原始母細胞相同，只要所選基因存在即可。

術語"轉形"係指細胞遺傳特徵之改變，且當細胞經修飾而含有新穎DNA時，該細胞經轉形。舉例而言，將細胞藉由轉染、轉導或其他技術轉形，其中該細胞由其天然狀態經基因修飾。

術語"一致性"係指如藉由比較序列所判定之兩個或兩個以上多肽分子或者兩個或兩個以上核酸分子之序列之間的關係。"一致性"量測兩個或兩個以上序列中與較小者之間相同配對的百分比。

術語"相似性"係此項技術中與"一致性"相關之概念；然而，"相似性"係指關聯性之量測，其包括相同配對及保守取代配對。

除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數術語且複數術語應包括單數術語。

β-洋菜酶及其基因

在本發明之某些實施例中，存在包含選自由以下各序列組成之群之胺基酸序列的經分離多肽：

(a)SEQ ID NO:2之胺基酸序列；

(b)胺基酸序列SEQ ID NO:2之胺基酸序列，其中一或多個胺基酸係經刪除、取代及/或添加，且其具有β-洋菜酶活性；及

(c)與SEQ ID NO:2之胺基酸序列具有至少80%一致性且具有β-洋菜酶活性之胺基酸序列；

或其生物功能等效物、衍生物或變體。

在本發明之一較佳實施例中，包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之多肽，其為具有以下物理化學特性(a)至(e)之β-洋菜酶：

(a)約87.6kDa之分子量；

(b)約35℃至40℃之最佳反應溫度；

(c)約150mM至200mM之最佳反應NaCl濃度；

(d)約pH7至8之最佳反應pH值；及

(e)將洋菜糖水解為新洋菜寡醣(主要為新洋菜二糖而非λ-角叉菜膠、κ-角叉菜膠或-角叉菜膠)之活性。

肽、多肽、蛋白質、本發明之蛋白質的生物功能等效物、衍生物及變體皆涵蓋於本發明之範疇內，且包括在蛋白質之基本序列中含有保守胺基酸改變之胺基酸序列。在該等胺基酸序列中，基本序列中之一或多個胺基酸經其他胺基酸取代，其電荷及極性類似於該天然胺基酸，亦即保守胺基酸取代，因此產生沉默改變。基本多肽序列內之胺基酸的取代物可選自天然存在之胺基酸所屬種類之其他成員。

胺基酸可分為以下四組：(1)酸性胺基酸、(2)鹼性胺基酸、(3)中性極性胺基酸及(4)中性非極性胺基酸。該等不同組內之代表性胺基酸包括(但不限於)(1)酸性(帶負電)胺基酸如天冬胺酸及麩胺酸；(2)鹼性(帶正電)胺基酸如精胺酸、組胺酸及離胺酸；(3)中性極性胺基酸如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；(4)中性非極性(疏水性)胺基酸如丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。

本發明亦涵蓋上述(亦即含有胺基酸刪除與添加之多肽形式)之組合。亦可存在胺基酸取代。

因此本文所涵蓋之肽、多肽及蛋白質之生物功能等效物、衍生物及變體應與本發明之多肽之基本胺基酸序列的序列或其內相應部分具有約80%或更高之序列一致性，較佳約85%或更高之序列一致性，且最佳約90%或更高之序列一致性，例如95%。蛋白質之生物功能等效物可具有20個或更少之保守胺基酸變化，更佳10個或更少之保守胺基酸變化，且最佳5個或更少之保守胺基酸變化。因此編碼該蛋白質之核苷酸序列(基因、質體DNA、cDNA或合成DNA)具有相應鹼基取代，使得其可編碼該蛋白質之生物功能等效物形式。

生物功能等效物、衍生物或變體亦包括可與抗本發明蛋白質之抗體(包括單株與多株抗體)發生反應(亦即特異性結合)且具有相同或類似β-洋菜酶活性之肽、多肽及蛋白質。

改變胺基酸序列之方法(如遺傳工程技術)為此項技術中所熟知者，例如定位突變誘發以修飾核苷酸序列或胺基酸序列及表現重組蛋白。

更詳言之，可以下述方法產製多肽：製備能夠在宿主細胞中表現編碼所要蛋白質之基因的重組DNA(表現載體)；將DNA引入宿主細胞中以藉此轉形細胞；培養所得轉形株；且自培養產物中回收蛋白質。

本發明亦提供編碼本發明之蛋白質或肽的聚核苷酸(經分離或經純化或純聚核苷酸)、包含該等聚核苷酸之載體(包括選殖載體及表現載體)及經本發明之聚核苷酸或載體轉形或轉染之細胞(例如宿主細胞)。在本發明之某些實施例中，存在包含選自由以下各序列組成之群之核苷酸序列的經分離聚核苷酸：

(a)編碼本發明之多肽的核酸序列；

(b)SEQ ID NO:1之核酸序列；

(c)與核酸序列SEQ ID NO:1之核酸序列具有至少80%一致性且編碼具有β-洋菜酶活性之多肽的核酸序列；

(d)與(a)至(c)中之任一者互補的核酸序列；及

(e)在嚴格雜交條件下與(a)至(d)中之任一者雜交的核酸序列。

聚核苷酸較佳包含SEQ ID NO:1之核酸序列。

由於遺傳密碼之簡併性，即蛋白質中天然存在之大部分胺基酸存在一個以上密碼子，故含有與本發明之DNA實質上相同之遺傳資訊且編碼與由SEQ ID NO:1之核苷酸序列所編碼之胺基酸序列實質上相同之胺基酸序列的其他DNA(及RNA)序列可用以實施本發明。此原理亦適用作本文所述之任一其他核苷酸序列。

本發明不僅包括SEQ ID NO:1中所示之核酸序列，且亦包括生物功能等效之核酸序列。"生物功能等效之核酸序列"一詞表示DNA及RNA，包括編碼具有與SEQ ID NO:2相同或類似之活性的肽、多肽及蛋白質之基因體DNA、質體DNA、cDNA、合成DNA及mRNA核苷酸序列，亦即當以功能性可操作方式引入宿主細胞中以使其表現時，其產生具有β-洋菜酶活性之肽、多肽或蛋白質。

除編碼基本多肽序列中保守胺基酸變化的核酸序列外，本發明之生物功能等效之核酸序列亦包括含有其他鹼基取代、添加及/或刪除之核酸序列。該等核酸序列包括含有與SEQ ID NO:1之DNA中所含相同之固有遺傳資訊的核酸，且其編碼具有與SEQ ID NO:2相同或類似之β-洋菜酶活性之肽、多肽或蛋白質。可將該等核酸序列稱為SEQ ID NO:1所示之DNA的"遺傳等效之修飾形式"，且其可藉由本文所述之方法鑑別。

編碼本發明之多肽的cDNA、質體DNA、基因體DNA、合成DNA或其他核酸(諸如SEQ ID NO:1)中所產生之突變較佳者保留編碼序列之讀碼區。此外，該等突變較佳者不會產生可雜交產生影響mRNA轉譯之二級mRNA結構(諸如環或髮夾)的互補區。

儘管突變位點可預先確定，但突變本身之特性無須預先確定。舉例而言，為選擇所給位點處突變體之最佳特徵，可在目標密碼子處進行隨機突變誘發。或者，可藉由合成含有突變體序列之寡核苷酸在特定基因座處引入突變，藉由限制酶位點與天然cDNA序列片段側接。連接之後，所得重建核酸序列編碼具有所要胺基酸插入、取代或刪除之多肽序列的衍生物形式。在任一情況下，可使用實例1及7中所述之方法篩選具有所要β-洋菜酶活性之突變體。

SEQ ID NO:1之核酸序列之基因等效修飾形式的特定例子包括具有與SEQ ID NO:1高度序列一致性之核酸序列的聚核苷酸。變體聚核苷酸與如本文所定義序列之聚核苷酸中之一者具有至少75%且較佳80%、85%、90%、95%或99%之一致性，或與所定義序列之彼等聚核苷酸中之一者在下列嚴格雜交條件下雜交：0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉於65-68℃或在0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉及50%甲醯胺於42℃。聚核苷酸變體保持編碼本發明之蛋白質的能力。

術語"嚴格"用以指此項技術中通常理解為嚴格之條件。雜交嚴格度主要係由溫度、離子強度及變性劑(諸如甲醯胺)之濃度決定。用於雜交及洗滌之嚴格條件的實例為0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉於65-68℃或0.015M氯化鈉、0.0015M檸檬酸鈉及50%甲醯胺於42℃。參見Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor，N.Y. 1989)。

亦可使用更嚴格之條件(諸如較高溫度、較低離子強度、較高甲醯胺或其他變性劑)；然而，雜交之速率將受影響。在與去氧寡核苷酸之雜交有關的實例中，其他例示性嚴格雜交條件包括在37℃(對於14個鹼基之寡核苷酸而言)、48℃(對於17個鹼基之寡核苷酸而言)、55℃(對於20個鹼基之寡核苷酸而言)及60℃(對於23個鹼基之寡核苷酸而言)下於6×SSC、0.05%焦磷酸鈉中洗滌。

本發明之聚核苷酸較佳係藉助於DNA/RNA擴增方法使用聚合酶鏈反應(PCR)獲得[參見Science,230,1350(1985)]。用於該PCR中之引子係基於本發明之聚核苷酸(諸如SEQ ID NO:1)之序列資訊而適當設計，且可藉助於慣用方法來合成。引子之實例包括含有本發明之聚核苷酸的一部分核酸序列，且通常具有約10至35個核苷酸、較佳約15至30個核苷酸之引子。經擴增之DNA/RNA片段之分離及純化可經由習知方法(例如經由凝膠電泳)進行。

載體及宿主系統

本發明之另一目的為提供含有本發明之聚核苷酸的載體。為表現本發明之生物活性蛋白質，可將編碼本發明之蛋白質或生物功能等效物的核苷酸序列插入適當表現載體(亦即含有用於轉錄及轉譯所插入之編碼序列之必要元件的載體)中。根據本發明，可使用熟習此項技術者熟知之方法來構築含有編碼本發明蛋白質序列以及適當轉錄及轉譯控制元件之表現載體。該等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內遺傳重組。通常選擇載體以使其在所用特定宿主細胞中作用(亦即該載體與宿主細胞基因表現工具相容，因此能發生基因之擴增及/或基因之表現)。

本發明之另一目的為提供經本發明之聚核苷酸序列或含有該序列之載體轉形之宿主細胞。根據本發明，可利用許多種宿主系統以包含及表現編碼本發明之蛋白質的序列。該等宿主系統包括(但不限於)微生物，如以重組噬菌體、質體或黏質體DNA表現載體轉形之細菌；以酵母菌表現載體轉形之酵母菌；以病毒表現載體感染之昆蟲細胞系統；以病毒表現載體或細菌表現載體轉形之植物細胞系統；或動物細胞系統。在構築載體並將編碼本發明之蛋白質的聚核苷酸序列插入該載體之適當位點後，可將完整載體插入用於擴增及/或多肽表現之合適宿主細胞中。

原核宿主細胞之例子包括廣泛使用之大腸桿菌(Escherichia coli )及枯草桿菌(Bacillus subtilis )。較佳使用大腸桿菌。真核宿主細胞之例子包括脊椎動物細胞及酵母細胞。脊椎動物細胞之較佳例子包括猴COS細胞[參見Gluzman Y.,(1981)SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell,23:175-182]、中國倉鼠卵巢細胞及該卵巢之二氫葉酸還原酶缺陷型細胞株[參見Urlaub等人，(1980)Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 77(7):4216-4220]。酵母細胞之較佳例子包括酵母菌屬(Saccharomyces)細胞。宿主細胞不限於以上實例。

當使用原核細胞作為宿主時，使用可在宿主細胞中複製之載體。較佳載體之例子包括表現質體，其含有在本發明之基因上游位置處之啟動子、SD(Shine-Dalgarno)序列及起始蛋白質合成所必需之起始密碼子(例如ATG)，以使基因可於宿主細胞中表現之表現質體。一般而言，大腸桿菌來源之質體(諸如pBR322、pBR325、pUC12 pUC13、pUC19、pEZseq或pCC1)被廣泛用作上述載體。載體不限於該等實例且可使用多種已知載體。用於表現基因之市售大腸桿菌來源之載體之例子包括CopyControl^TM pCC1^TM 載體(Epicentre)。

當使用脊椎動物細胞作為宿主時，所使用之表現載體之例子包括含有位於待表現之本發明基因之上游位置處的啟動子、RNA拼接位點、聚腺苷酸化位點及轉錄終止序列的載體。必要時，載體可含有複製起點。表現載體之特定實例包括具有SV40之起始啟動子之pSV2dhfr[參見Subramani等人，(1981)Expression of the mouse dihydrofolate reductase complementary deoxyribonucleic acid in simian virus 40 vectors. Mol. Cell. Biol.,1:854-864]。此外，可使用多種市售之已知載體。用於表現基因之市售脊椎動物細胞來源之載體的例子包括動物細胞載體，如pEGFP-N及pEGFP-C(Clontech公司之產品)、pIND(Invitrogen公司之產品)及pcDNA3.1/His(Invitrogen公司之產品)；及昆蟲細胞載體，如pFastBac HT(GibcoBRL公司之產品)、pAcGHLT(PharMingen公司之產品)及pAc5/V5-His、pMT/V5-His及pMT/Bip/V5-his(Invitrogen公司之產品)。

當使用酵母細胞作為宿主時，所使用之表現載體之特定例子包括具有對應於酸性磷酸酶基因之啟動子的pAM82[參見Miyanohara等人，(1983)Expression of hepatitis B surface antigen gene in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci.,USA.,80(1):1-5]。市售酵母細胞表現載體之實例包括pPICZ及pPICZ[α](Invitrogen公司之產品)。

所用啟動子之類型並不特別受限制。舉例而言，當使用埃希氏菌屬(Escherichia )細菌作為宿主時，較佳使用色胺酸(trp)啟動子、lpp啟動子、lac 啟動子、recA 啟動子或PL/PR啟動子。當使用桿菌屬細菌用作宿主時，例如較佳使用SP01啟動子、SP02啟動子或penP啟動子。當使用酵母作為宿主時，較佳使用pH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子或ADH啟動子。當使用動物細胞作為宿主時，較佳使用SV40來源之啟動子、反轉錄病毒啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、位點巨細胞病毒啟動子(site megalovirus promoter)或SR[α]啟動子。

用於將所要重組聚核苷酸(或載體)引入宿主細胞中且轉形該宿主細胞之方法並無特別受限制。可藉由熟知方法將包含本發明之聚核苷酸的表現載體轉形至經選擇宿主細胞中，該等方法包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂轉染、DEAE-葡聚糖介導之轉染或其他已知技術。所選擇的方法將隨所用宿主細胞之種類而變。當在適當條件下培養時，宿主細胞可合成本發明之蛋白質，之後蛋白質可自培養基(若宿主細胞將其分泌至培養基中)中或直接自產生其之宿主細胞(若不分泌)中收集。適當宿主細胞之選擇將視各種因素而定，諸如所要表現程度、活化所需或所必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)及摺疊成生物活性分子之容易性。

可藉助於慣用方法培養由此獲得之轉形株。經由培養，由所設計之基因編碼之本發明之標的多肽可在轉形株細胞內或細胞外或者在轉形株之細胞膜上表現及產生(積聚及分泌)。

根據所使用的宿主細胞，用於培養之培養基可選自多種常用培養基。可在適於宿主細胞生長之條件下進行培養。

若需要，可將由此獲得之本發明之重組多肽利用蛋白質之物理及化學特性之多種分離技術進行的分離及純化[參見"Biochemistry Data Book II"，第1175-1259頁，第1版，第一次印刷，1980年6月23日，由Tokyo Kagaku Dojin出版；Arakawa等人，(1986)Structure of unfolded and refolded recombinant derived[Ala125]interleukin 2. Biochemistry,25(25):8274-8277；及Langley等人，(1987)Recombinant-DNA-derived bovine growth hormone from Escherichia coli 1. Demonstration that the hormone is expressed in reduced form,and isolation of the hormone in oxidized,native form. Eur. J. Biochem. 163:313-21]。

分離技術之特定例子包括一般重建處理、使用蛋白質沈澱劑(鹽析)之處理、離心、滲透壓衝擊法、超音波處理、超濾、分子篩層析法(凝膠過濾)、吸附層析法、離子交換層析法、親和層析法、高效液相層析法(HPLC)、透析及其組合。更佳地，可使用對本發明之多肽具特異性結合之抗體之管柱進行親和層析法。

用途

由於本發明之多肽為能夠水解洋菜組合物中之洋菜糖的β-洋菜酶，故本發明之多肽可用於自洋菜糖凝膠中萃取所要物質。舉例而言，使用洋菜糖電泳初步鑑別之目標區中的DNA或RNA片段，可藉由本發明之多肽水解該區周圍之洋菜使其易於萃取。

本發明之多肽可以套組之形式提供。本發明之套組可包含本發明之多肽及熟習此項技術者所熟知之一或多種用於自經水解洋菜糖中分離及/或純化該核酸樣品(DNA或RNA樣品)的試劑。該套組可進一步包含用於自洋菜糖中分離及/或純化核酸樣品的書面說明。實例包括(但不限於)各種容器(例如瓶子、紙箱、發泡包裝及安瓿)，其附有描述偵測說明之包裝插頁或其中將說明書印刷或貼於該容器上。

本發明之多肽的另一功能為分解洋菜、洋菜糖、新洋菜六糖或新洋菜四糖以產生新洋菜寡醣。因此，本發明之多肽可用於產製新洋菜寡醣，諸如新洋菜二糖。

本發明提供以下實例以幫助熟習此項技術者實踐本發明。即使如此，亦不應將該等實例視為用於過度限制本發明，此係因為一般熟習此項技術者可在不背離本發明之精神或範疇之情況下對本文所論述之實施例進行修改及變更產生。

實例 實例1　洋菜分解海洋單胞菌染色體DNA之抽取

洋菜分解海洋單胞菌係由生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC；中華民國台灣省30062新竹市食品路331號)(寄存編號BCRC 17492)及日本微生物保存中心(Japan Collection of Microorganisms，JCM；2-1 Hirosawa，Wako，Saitama 351-0198，Japan)(寄存編號JCM 13379)公開得到。洋菜分解海洋單胞菌之最佳生長溫度為約26℃，且發現該菌株可在培養基中分解洋菜。

將洋菜分解海洋單胞菌株培養於100ml BCRC培養基615(每公升含有2g聚蛋白腖、0.5g細菌培養用酵母萃取物、30g NaCl、5g MgCl₂ ．6H₂ O、0.005g CaCl₂ 、0.005g Na₂ MoO₄ ．7H₂ O、0.004g CuCl₂ ．2H₂ O、0.006g FeCl₃ ．6H₂ O及6g Tris之聚蛋白腖-酵母(PY)培養液；需要時可添加1.5%洋菜；在高壓釜處理之前調節pH值至pH 8.0)，在26℃下振盪培養3日。將培養物以4,500rpm離心20分鐘。丟棄上清液並收集菌體。

將菌體再懸浮於11ml的B1緩衝液(50mM Tris-HCl，pH 8.0；50mM EDTA，pH 8.0；0.5% Tween-20；0.5% TritonX-100)，再加入30mg溶菌酶及110μl RNase(20mg/ml)。在37℃下反應1小時之後，再加入10mg蛋白酶K及110mg月桂醯基肌胺酸鈉(Amresco Co.)，並將溶液在50℃下反應2小時。將Tris飽和之酚以1:1(v/v)比率添加至溶液中，並將其以旋轉盤混合10分鐘。將混合溶液在室溫下以3,500rpm離心30分鐘後收集上清液。將上述以Tris飽和之酚去蛋白、混合、離心及收集之步驟重複兩次。用相同體積之氯仿萃取所收集之溶液，將上清液取出並將其與相同體積之異丙醇以旋轉盤混合10分鐘。以塑膠接種環勾出絲狀之染色體DNA。將染色體DNA以70%乙醇清洗，並在室溫下風乾。

將乾燥染色體DNA溶解於無菌水中，並以洋菜糖電泳及Nanodrop(NanoDrop Technologies)分析DNA濃度。

實例2　洋菜分解海洋單胞菌洋菜酶基因之選殖

為構築洋菜分解海洋單胞菌之基因體DNA散彈槍基因庫(shotgun library)，將獲自實例1之染色體DNA藉由HydroshearDNA剪切機(BST Scientific)剪切成具有1至5kb之DNA片段。將DNA片段藉由洋菜糖凝膠電泳分離，並切下含有2至4kb之DNA片段的凝膠部分，將其中所含有之DNA片段用凝膠純化套組(Geneaid Co.)純化。將每一經純化DNA片段末端修復，並選殖至載體CopyControl^TM pCCl^TM (Epicentre)中，再將該載體轉形至大腸桿菌勝任細胞TransforMax^TM EPI300^TM (Epicentre)中。

將重組大腸桿菌選殖株接種於含有LB培養基(含有0.01%阿拉伯糖、0.4mM IPTG及12.5μg/ml氯黴素(chloramphenical))之培養平板上。在37℃下培養隔夜，再置於室溫下培養10日，並觀察由洋菜酶之產生所引起之培養基中洋菜之水解。發現名為pcclclone A之選殖株具有水解培養基中之洋菜之能力。

將pcclclone A選殖株接種於含有LB培養基(含有0.01%阿拉伯糖、0.4mM IPTG及12.5μg/ml氯黴素)之培養平板上，並在37℃下培育24小時。將該培養平板以革蘭氏碘試劑(溶解於0.12M KI中之0.05M I₂ )染色，並以該培養平板中所產生之淺黃色透明圈判斷pcclclone A能夠產生洋菜酶(參見圖1A)。

實例3　洋菜酶之DNA定序

將獲自pcclclone A之質體以BamH1消化，獲得約4.4kb之DNA插入片段。將此DNA片段純化並以HydroshearDNA剪切機來剪切。將所得片段以洋菜糖凝膠電泳分離，並切下含有0.75至1.0kb之DNA片段的凝膠部分，再將其中所含有之DNA片段純化。利用pEZSeq^TM Amp平端選殖套組(pEZSeqTM Amp Blunt Cloning Kit)(Lucigen Co.)將每一經純化DNA片段與選殖載體pEZSeq Amp連接，再將重組載體轉形至大腸桿菌勝任細胞TransforMax^TM EPI300^TM 中。

將重組大腸桿菌選殖株接種於含有LB培養基(含有100μg/ml安比西林(ampicillin)、0.4mM IPTG及90μg/ml X-Gal)之培養平板上。在37℃下培養隔夜後，選取46個白色菌落。將每一菌落接種至1ml LB培養液(包含100μg/ml安比西林)中，並在37℃下培養隔夜。將每一菌落之質體DNA使用鹼溶解法分離，並使用BigDyeTerminator v3.1循環定序套組(Applied Biosystem)定序。定序所使用的引子為Z-For(M13正向引子)5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'(SEQ ID NO:5)及Z-Rev(M13反向引子)5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'(SEQ ID NO:6)，進行兩端定序，再以ABI 3730定序儀(Applied Biosystem)分析。

獲得92筆序列資料，以Vector NTI(Invitrogen Co.)軟體之序列組合程式ContigExpress將序列進行組合，以獲得4,434bp之經組合序列。利用NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)之ORF探測軟體來分析經組合序列之開放續碼區(ORF)。利用NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)之blastx程式來分析所找到之ORF。發現該序列為具有2,325bp之新穎β-洋菜酶基因(SEQ ID NO:1)，且將其命名為agaB1 。agaB1 基因編碼具有774個胺基酸之蛋白質AgaB1(SEQ ID NO:2)。此蛋白質之預測分子量為87,613Da且預測等電點為pH 5.05。

實例4　AgaB1之序列比對分析

使用blastn程式針對NCBI之無多餘(non-redundant)核苷酸序列資料庫(nr/nt等)比對agaB1 之DNA序列(SEQ ID NO:1)。運算方法之選擇為"略微類似序列(Somewhat similar sequence)"。表1提供Blast搜索之結果。發現最類似於agaB1 基因之基因為大西洋假交替單胞菌T6c(GenBank登錄號ABG40489.1及ABG41155.1)之洋菜酶基因，且其相似性為73%。由agaB1 基因與其他洋菜酶基因之最高相似性僅為73%之事實證實洋菜分解海洋單胞菌中所發現之agaB1 基因為新穎洋菜酶基因。

使用blastp程式針對NCBI之無多餘蛋白質序列資料庫(nr等)比對自agaB1 基因轉譯之胺基酸序列(AgaB1；SEQ ID NO:2)。表2提供Blast搜索之結果。發現AgaB1與大西洋假交替單胞菌T6c(GenBank登錄號ABG40489.1)之β-洋菜酶具有63%之相似性，與交替單胞菌(Alteromonas sp.)E-1(GenBank登錄號BAE97587.1)之β-洋菜酶具有57%之相似性，且與嗜糖降解菌(Saccharophagus degradans )2-40(GenBank登錄號ABD81904.1)之β-洋菜酶具有58%之相似性。AgaB1與其他洋菜酶之最高相似性僅為63%之事實進一步證實洋菜分解海洋單胞菌中所發現之AgaB1為新穎洋菜酶。

實例5　表現載體之構築

為擴增agaB1 之全長ORF，以pcclclone A之質體DNA作為PCR模板，且正向引子為5'-CACC ATGCATAATAAAATGAGT-3'(SEQ ID NO:3；加下底線之序列係經設計以與pET151/D-TOPO質體接合)而反向引子為5'-TTACTGCGCTTTAAAGCG-3'(SEQ ID NO:4)進行PCR。PCR反應溶液包含250ng pcclclone A質體DNA、8μl 2.5mM dNTP、10μl 10×PCR緩衝液、2μl 10μM正向引子及反向引子及5U Taq酶(Takara Co.)。反應溶液之總體積為100μl，且PCR條件為(1)95℃ 5分鐘；(2)每週期95℃ 30秒、50℃ 30秒及72℃ 2分鐘，總計30個週期；(3)72℃ 10分鐘；及(4)最後保持在4℃。以洋菜糖電泳分離AgaB1 基因片段，並以凝膠純化套組(Geneaid Co.)純化。將經純化之agaB1 基因片段接至pET151/D-TOPO載體(Invitrogene Co.)上，並隨後轉形至大腸桿菌菌株Top10(Invitrogen Co.)中。

將重組之大腸桿菌塗菌於LB平板(包含100μg安比西林)上，並在37℃培養隔夜。選擇6個選殖株，將其培養於3ml LB培養液(含有100μg/ml安比西林)，在37℃培養隔夜。以質體DNA抽取套組(Geneaid Co.)抽取質體DNA，並經NdeI/SacI雙酵素或BglII限制酶切割與定序，以證實所插入之基因序列為agaB1 ，且插入的位置無誤。將所得的質體命名為pAGAB1(參見圖2)。將此質體轉形至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，並將重組之大腸桿菌接種於LB平板上(含有0.4mM IPTG及100μg/ml安比西林)，在37℃培養24小時以觀察培養基中洋菜之分解情況。將該平板以革蘭氏碘試劑(0.05M I₂ 溶解於0.12M KI)染色，觀察到之淺黃色透明圈證實洋菜酶的表現(圖1B)。

實例6　重組洋菜酶AgaB1之純化

將pAGAB1轉形至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，挑取單一菌落，以LB培養液(含有100μg/ml安比西林)在37℃下培養隔夜。隔日加入新鮮的培養液將菌液稀釋至OD₆₀₀ 值為0.2，且總體積為200ml。在37℃培養經稀釋之菌液至OD₆₀₀ 值達到0.8時，加入0.1mM IPTG，並在25℃以250rpm振盪培養6小時以誘導重組洋菜酶AgaB1蛋白之表現。以3,500rpm離心20分鐘收集菌體。

將菌體懸浮於含有0.3mg/ml溶菌酶(最終濃度)之4ml 5×緩衝液B(25mM Tris-HCl，pH 7.4；1mM EDTA，pH 7.4；250mM蔗糖)中。將混合物置於冰上反應30分鐘。將16ml冷無菌水加至混合物中，並置於冰上反應20分鐘。再將1單位Benzonase(Merck Co.)加入混合物中，並置於冰上反應10分鐘。最後將含有Triton X-100及150mM NaCl之溶液加入混合物中達0.1%之最終濃度，並將溶液充分混合後在4℃下以12,000rpm離心15分鐘，收集上清液。

將Ni-NTA洋菜糖(Invitrogen Co.)添加至上清液中，並在4℃下旋轉反應16小時後，將混合物倒入空管柱中。先將未結合之蛋白質流出之後以10倍於Ni-NTA洋菜糖體積的沖提緩衝液(30mM咪唑；25mM Tris-HCl，pH 7.4；150mM NaCl；1mM PMSF)沖提出結合親和力較低之蛋白質。將管柱再以沖提緩衝液(250mM咪唑；25mM Tris-HCl，pH 7.4；150mM NaCl；1mM PMSF)進一步沖提出洋菜酶AgaB1。將此洋菜酶AgaB1收集並放入Amicon ultra-15 ultracel-30K離心管(Millipore Co.)中，在4℃以2,000rpm離心至適當體積。將10ml的25mM Tris-HCl(pH 7.4)及150mM NaCl之溶液加入離心後之溶液，並將其在4℃以2,000rpm離心。將此步驟重複4次以去除咪唑並濃縮，得到經純化之重組AgaB1洋菜酶。

以布萊德福蛋白質檢定套組(Bradford protein assay kit)(Bio-Rad)測定經純化洋菜酶之濃度。取適量經純化之洋菜酶以二次蒸餾水稀釋至體積800μl，再加入200μl布萊德福試劑。將反應溶液在室溫下混合反應15分鐘後量測OD₅₉₅ 值。以BSA作為標準液繪製標準曲線。利用內插法計算經純化洋菜酶之蛋白濃度。結果顯示由200ml培養液可獲得4.2mg之AgaB1洋菜酶。

實例7　AgaB1之洋菜酶活性

洋菜酶活性係以量測由洋菜酶消化洋菜獲得之產物中還原糖之量來檢定。將200μl 0.3%低熔點洋菜糖(溶解於150mM NaCl及25mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)中)在35℃反應10分鐘，再將0.4μg經純化AgaB1洋菜酶與低熔點洋菜糖溶液混合，並在35℃下反應15分鐘。另外添加200μl之DNS溶液(1% 3,5-二硝基水楊酸、30%酒石酸鉀鈉、1.5% NaOH)，將其於沸水中加熱5分鐘。加熱之後，立即將混合物置於冰浴中冷卻，再以分光光度計量測OD_595nm 值。

以D-半乳糖(Sigma Co.)作為還原糖之標準。利用不同濃度之D-半乳糖溶液與DNS反應，以建立標準曲線。將以AgaB1洋菜酶處理之樣品的OD_595nm 值與該標準曲線比較，以獲得洋菜酶反應活性。每單位(U)洋菜酶活性表示在以上文所提及之條件下於1分鐘內產生1μmol還原糖，亦即1活性單位=1μmol D-半乳糖/min。

結果顯示由200ml培養液獲得之AgaB1洋菜酶之總酶活性為136.5U，且酶比活性為30.25U/mg。

實例8　AgaB1之特徵 (1)分子量

由10% SDS-PAGE電泳分析之經純化重組AgaB1洋菜酶的分子量為約90kDa(參見圖3)，其接近於預估分子量91.6kDa(AgaB1蛋白分子量為87.6kDa，再加上pET151/D-TOPO載體標籤之4.0kDa)。

(2)最適反應溫度

取200μl之0.3%低熔點洋菜糖(溶解於150mM NaCl及25mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)中)與0.4μg經純化AgaB1洋菜酶混合。將AgaB1洋菜酶混合物分別在30℃、35℃、40℃、45℃及50℃下反應15分鐘。測定各組中還原糖之量。結果顯示於下表3中。

結果顯示AgaB1之最適反應溫度為40℃(定義為相對活性=100%)，在35℃下AgaB1之相對活性(95.7%)接近於40℃下之相對活性。在50℃之溫度下AgaB1失去活性。

(3)熱穩定性

為檢定AgaB1之熱穩定性，將三組AgaB1洋菜酶分別先在30℃、35℃及40℃下反應90分鐘。在反應期間，在以下時間點時自每一組中取出0.8μg測試樣品：0分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、75分鐘及90分鐘。將每一樣品與200μl 0.3%低熔點洋菜糖(溶解於150mM NaCl及25mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)中)混合，並在40℃下反應15分鐘。隨後量測自每一組取得之樣品中還原糖的量。結果顯示於圖4中。

在30℃及35℃之組中，時間點90分鐘時所測得之洋菜酶活性分別為78.7%及83.7%。在40℃之組中，在同一時間點時所偵測之洋菜酶活性降低至30.7%。結果顯示儘管洋菜酶AgaB1之最適反應溫度為40℃，但其在35℃之溫度下較穩定。

(4)最適鹽濃度

將低熔點洋菜糖溶解於含有不同濃度(0至200mM)NaCl之25mM Tris-HCl緩衝(pH 7.4)溶液以製備0.3%低熔點洋菜糖受質溶液。將0.6μg經純化AgaB1洋菜酶與200μl各受質溶液混合，並於35℃反應15分鐘。量測每一組中還原糖之量。結果顯示於圖5中。

在150mM及200mM NaCl之溶液中，洋菜酶之活性最高分別為99.2%及100%。當NaCl濃度為0mM時，相對活性僅為33.0%。當NaCl濃度為25mM時，相對活性增加至83.4%。當鹽濃度高於25mM時，酶活性隨鹽濃度之增加而增加。

(5)最適反應pH

製備具有不同pH值(6.0至10.0)之含有150mM NaCl之25mM緩衝溶液，其中pH 6.0及7.0之緩衝溶液係以磷酸鉀配製，pH 7.4及8.0之緩衝溶液係以Tris-HCl配製，而pH 9.0及10.0之緩衝溶液係以甘胺酸-NaOH配製。將低熔點洋菜糖溶解於各25mM緩衝溶液中以製備0.3%低熔點洋菜糖受質溶液。將200μl之各受質溶液於乾浴器中加熱10分鐘，使溫度平衡在40℃。隨後將0.8μg洋菜酶與各受質溶液混合，並將其在40℃反應15分鐘。量測每一組中還原糖之量。結果顯示於圖6中。

結果顯示AgaB1洋菜酶之最適pH值為pH 7.4(相對活性為100%)。在pH 7.0及8.0之相對活性分別為91.2%及89.7%。在pH 9.0之相對活性為38.7%。在pH 6.0及10.0未偵測到活性。

實例9　水解產物之分析 (1)薄層層析(TLC)分析

將20μg經純化洋菜酶與1ml 1%低熔點洋菜糖(溶解於150mM NaCl及25mM Tris-HCl緩衝液(pH7.4)中)混合。將9組混合物在35℃下反應。在0小時、0.25小時、0.5小時、1.0小時、1.5小時、2.0小時、3.0小時及4.0小時之反應時間時，各將1組混合物在60℃下加熱使洋菜酶失活。隨後將混合物置於冰浴15分鐘，並在4℃下以13,000rpm離心10分鐘以移除未完全反應之高分子多醣。以矽膠60(Silica Gel 60)TLC片(Merck Co.)來分析上清液。所用的標準品為新洋菜六糖(Sigma Co.)，展開液為正丁醇/乙酸/H₂ O(2:1:1)。之後將TLC片浸泡在硫酸鈰溶液(1%硫酸鈰(IV)及1M H₂ SO₄ )中，並加熱使呈色。結果顯示於圖7中。

結果發現，反應0.25小時之後，即可於混合物中偵測到水解產物。結果發現主要水解產物為新洋菜二糖(NA2)。此外，亦可在反應混合物中偵測到少量新洋菜四糖(NA4)及新洋菜六糖(NA6)(參見圖7之泳道2)。

亦使用TLC以分析用AgaB1水解新洋菜六糖之產物。將10μl 2.5mM新洋菜六糖(溶解於150mM NaCl及25mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)中)與200ng經純化洋菜酶混合，並在35℃反應24小時。隨後以60℃加熱使洋菜酶失活來終止反應。以TLC分析產物。結果發現AgaB1水解新洋菜六糖之主要終產物為新洋菜二糖(參見圖8之泳道2)。

(2)質譜分析

將20μg經純化洋菜酶與1ml 1%低熔點洋菜糖(溶解於150mM NaCl及25mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)中)混合。將混合物在35℃反應4小時，並隨後以60℃下加熱使洋菜酶失活來終止反應。將混合物置於冰浴15分鐘，並在4℃下以13,000rpm離心10分鐘以移除未完全反應之高分子多醣。以20×10cm之矽膠60 TLC片(Merck Co.)分析上清液。所用之展開液為正丁醇/乙酸/H₂ O(2:1:1)。將分離好之主要水解產物相對位置之TLC片切下，並以100%甲醇自TLC片萃取主要產物。利用玻璃絨及0.22μm PVDF(Millipore)濾出萃取物中之矽膠殘餘物。再以加熱減壓法濃縮經過濾之萃取物，並使用高效液相層析/質譜儀(HPLC/MS)來鑑定其中所含產物。

HPLC/MS系統係由具有控制器之Waters 600型幫浦(Miford,MA,USA)、Waters-Micromass Quattro LC質譜儀(Manchester，UK)及MassLynx 4.0分析軟體組成。HPLC/MS方法係使用Luna 3μ C18(2)管柱(150×2mm內徑)(Phenomenex,USA)溶離相係由(A)液：H₂ O+0.1%(v/v)甲酸及(B)液乙腈+0.1%(v/v)甲酸組成。溶離條件如下：

-流速：0.2ml/min

-樣品量：10μl

-溶離輪廓：

質譜儀參數設定如下：

-電灑游離：電噴霧正離子(ESI+)模式

-毛細管電壓：4.5kV

-入口錐體電壓：20V

-溫度：

‧入口溫度：120℃

‧溶劑去除溫度：350℃

-氮氣流速：

‧入口氮氣流速：100l/hr

‧溶劑去除流速：500l/hr

MS/MS分析之撞擊能量：25V

HPLC/MS分析結果顯示於圖9中。發現在滯留時間1.91分鐘處僅有一個波峰，其質譜顯示高濃度的m/z 347正離子(參見圖9A)。繼續將m/z 347正離子進行MS/MS分析，得到兩個主要碎片m/z 203及m/z 185(參見圖9B)，其中m/z 203離子應為新洋菜二糖之[G單元+Na]⁺ 碎片(G表示半乳糖)而m/z 185離子應為新洋菜二糖之[An單元+Na]⁺ 碎片(An表示3,6-脫水-α-L-半乳糖))(參見圖9C)，所以提出m/z 347離子為[新洋菜二糖+Na]⁺ 。質譜分析之結果證明以AgaB1水解低熔點洋菜糖之主要產物為新洋菜二糖。

實例10　受質特異性

使用之受質包括低熔點洋菜糖(分子生物學級)(Sigma公司，目錄號A9414)、Seakem LE洋菜糖(用於電泳)(Cambrex公司，目錄號50004)、細菌學級洋菜(用於製備培養基)(AGAR 1號，Oxoid公司目錄號LP0011)、食用洋菜粉(食品級)(Chuen-Guang公司，Taiwan)、λ-角叉菜膠、κ-角叉菜膠及-角叉菜膠(Sigma公司，C1138)等。將每一受質分別溶解於150mM NaCl及25mM Tris-HCl(pH 7.4)中以製備含有3%受質之溶液。將200μl之各受質溶液於乾浴器中加熱10分鐘，使溫度平在35℃。隨後將0.6μg洋菜酶AgaB1(最終濃度為3ng/μl)與各溶液混合，並在35℃反應15分鐘。量測每一組中還原糖之量。結果顯示於表4中。

結果顯示洋菜酶AgaB1對細菌學級洋菜之活性最高(將該相對活性定為100%)，對Seakem LE洋菜糖、食用洋菜粉及低熔點洋菜之相對活性分別為75.9%、70.9%及49.3%。對於λ-角叉菜膠、κ-角叉菜膠及-角叉菜膠完全沒有活性。結果表示AgaB1可水解不同種類之洋菜受質，但不能水解λ-角叉菜膠、κ-角叉菜膠及-角叉菜膠。

藉由TLC分析用AgaB1水解細菌學級洋菜、Seakem LE洋菜糖、食用洋菜粉及低熔點洋菜糖之產物。發現所有受質之主要產物皆為新洋菜二糖(參見圖10)。

實例11　自洋菜糖凝膠萃取DNA

將2.5μg之DNA樣品、pUC19質體及λDNA/HindIII標記分別與200mg 1%低熔點洋菜糖(溶解於0.5倍之TBE緩衝液中)混合，並將該等混合物置於冰浴中使其凝固，以製備DNA洋菜糖凝膠樣品。

將樣品先以70℃加熱10分鐘至洋菜糖熔解，再將樣品置於35℃乾浴器中15分鐘。加入最終濃度為150mM NaCl、25mM Tris-HCL pH 7.4之緩衝溶液，再將1.5μg及3μg洋菜酶AgaB1與每一樣品混合。將該等混合物在35℃反應1小時，並隨後在60℃加熱以使洋菜酶失活。將該等混合物置於冰浴10分鐘，並在4℃下以13,000rpm離心10分鐘以移除未完全反應之高分子多醣。取上清液加入2.5倍體積的酒精及0.1倍體積之3M乙酸鈉(pH 5.6)，置於-20℃冰箱20分鐘。在4℃下以13,000rpm離心20分鐘，倒去上清液，再加入0.5ml 70%乙醇再懸浮。將懸浮液在4℃下以13,000rpm離心5分鐘並倒去上清液。將沈澱之DNA以真空乾燥，最後以無菌水回溶DNA。分別吸取等量的回收DNA樣品及250ng原始DNA樣品(pUC19質體及λDNA/HindIII標記)，以1%洋菜糖進行電泳分析。

如圖11所示，所有pUC19質體及λDNA/HindIII標記DNA樣品均可自洋菜糖凝膠中回收且回收率高於90%。結果證明洋菜酶AgaB1可用於自洋菜糖凝膠回收核酸樣品。

圖1A顯示pcclclone A選殖株於培養平板上生長(左圖)及以革蘭氏碘試劑(Gran's iodine reagent)將培養平板染色之結果(右圖)。

圖1B顯示由pAGAB1轉形之選殖株於培養平板上之生長(左圖)及以革蘭氏碘試劑將培養平板染色之結果(右圖)。

圖2顯示pAGAB1之限制酶圖譜。將2,325bp之agaB1基因與pET151/D-TOPO表現載體連接，質體之尺寸為8,085bp。

圖3顯示經純化洋菜酶AgaB1之SDS-PAGE分析。以10% SDS-PAGE分析3μg經純化重組AgaB1蛋白，重組AgaB1蛋白之分子量約91.6kDa。M：PageRuler預染階梯標記SM0671(Fermentas)。

圖4顯示洋菜酶AgaB1之熱穩定性分析結果。未預反應之樣品的酶活性定為100%。

圖5顯示洋菜酶AgaB1在不同鹽濃度下之相對酶活性。在200mM NaCl下所測定之樣品的酶活性定為100%。

圖6顯示洋菜酶AgaB1在不同pH值下之相對酶活性。在pH 7.4下所測定之樣品的酶活性定為100%。

圖7顯示以洋菜酶AgaB1水解低熔點洋菜糖之產物的TLC分析結果。泳道1至8分別表示在0小時、0.25小時、0.5小時、1.0小時、1.5小時、2.0小時、3.0小時及4.0小時之反應時間時的產物。泳道9：新洋菜六糖標準物。NA2：新洋菜二糖。NA4：新洋菜四糖。NA6：新洋菜六糖。

圖8顯示以洋菜酶AgaB1水解新洋菜六糖之產物的TLC分析結果。泳道1：新洋菜六糖。泳道2：用AgaB1水解新洋菜六糖24小時之產物。泳道3：經純化新洋菜二糖標準物。NA2：新洋菜二糖。NA6：新洋菜六糖。

圖9A顯示以AgaB1水解低熔點洋菜糖之主要產物的質譜分析結果。

圖9B顯示質譜分析之m/z 347離子的MS/MS結果。

圖9C顯示[新洋菜二糖+Na]⁺ (m/z 347)之α-1,3鍵之裂解形成[3,6-脫水-α-L-半乳糖(An)+Na]⁺ (m/z 185)及[β-D-哌喃半乳糖(G)+Na]⁺ (m/z 203)。

圖10顯示以洋菜酶AgaB1水解各種洋菜之產物的TLC分析結果。泳道1：細菌學級洋菜(用於製備細菌培養基)。泳道2：LE洋菜糖(用於電泳)。泳道3：可食用洋菜粉末(食品級)。泳道4：低熔點洋菜糖(分子生物學級)。泳道5：低熔點洋菜糖(Sigma)。泳道6：新洋菜六糖。NA2：新洋菜二糖。NA4：新洋菜四糖。NA6：新洋菜六糖。

圖11A顯示以洋菜酶AgaB1處理後自低熔點洋菜糖回收之pUC19質體DNA。M：1Kb階梯標記(Fermentas)。泳道1：250ng pUC19質體。泳道2：使用1.5μg洋菜酶AgaB1所回收之pUC19樣品。泳道3：使用3μg洋菜酶AgaB1所回收之pUC19樣品。

圖11B顯示以洋菜酶AgaB1處理後自低熔點洋菜糖回收λDNA/HindIII標記。泳道1:250ng λ DNA/HindIII標記。泳道2：使用1.5μg洋菜酶AgaB1所回收之λ DNA/HindIII標記樣品。泳道3：使用3μg洋菜酶AgaB1所回收之λ DNA/HindIII標記樣品。

(無元件符號說明)

Claims (14)

1. 一種經分離多肽，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列且具有β-洋菜酶活性。
2. 如請求項1之經分離多肽，其為具有以下物理化學特性(a)至(e)之β-洋菜酶：(a)約87.6 kDa之分子量；(b)約35℃至40℃之最佳反應溫度；(c)約150 mM至200 mM之最佳反應NaCl濃度；(d)約pH 7至8之最佳反應pH值；及(e)將洋菜糖水解為新洋菜寡醣、主要為新洋菜二糖之活性。
3. 一種經分離聚核苷酸，其包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：(a)編碼如請求項1或2之經分離多肽的核酸序列；(b)SEQ ID NO：1之核酸序列；(c)與(a)及(b)中之任一者互補的核酸序列；及(d)在高度嚴格雜交條件下與(c)雜交且可編碼具有β-洋菜酶活性之多肽的核酸序列。
4. 如請求項3之經分離聚核苷酸，其包含SEQ ID NO：1之核酸序列。
5. 一種經分離重組載體，其包含如請求項3或4之經分離聚核苷酸。
6. 一種經分離重組宿主細胞，其包含如請求項5之經分離重組載體。
7. 一種產製如請求項1或2之經分離多肽的方法，其包含：(a)在適於表現該多肽之條件下培養如請求項6之經分離重組宿主細胞；及(b)自該宿主細胞及/或宿主細胞培養物中分離該多肽。
8. 一種自洋菜糖凝膠萃取物質之方法，其包含：(a)以如請求項1或2之經分離多肽水解含有該物質之洋菜糖凝膠；及(b)自該水解產物中分離該物質且純化該物質。
9. 如請求項8之方法，其中該物質為核酸樣品。
10. 如請求項9之方法，其中該核酸樣品為DNA或RNA。
11. 一種產生新洋菜寡醣之方法，其包含以如請求項1或2之經分離多肽水解洋菜、洋菜糖、新洋菜六糖、新洋菜四糖或其混合物。
12. 如請求項11之方法，其中該新洋菜寡醣包括新洋菜四糖、新洋菜六糖及新洋菜二糖。
13. 如請求項11或12之方法，其中該新洋菜寡醣為新洋菜二糖。
14. 一種用於自洋菜糖中分離及/或純化核酸樣品之套組，其包含如請求項1或2之經分離多肽及一或多種用於分離及/或純化該核酸樣品之試劑。