WO2002068659A1

WO2002068659A1 - Agarose et gene correspondant

Info

Publication number: WO2002068659A1
Application number: PCT/JP2002/001700
Authority: WO
Inventors: Jun Tomono; Hiroaki Sagawa; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2002-09-06
Also published as: KR100601333B1; DE60206885T2; DE60226182D1; EP1365025A4; EP1624065A3; ATE392477T1; US7329524B2; JP2008220378A; ATE307889T1; US20080096249A1; DE60226182T2; EP1365025B1; US20040132036A1; JPWO2002068659A1; DE60206885D1; KR100601331B1; KR20030078910A; CN100549177C; EP1624065A2; JP4411351B2

Description

明細書ァガラーゼぉよびその遺伝子技術分野

本発明は、高温でァガラーゼ活性を有することを特徴とする新規のァガラーゼおよびその製造方法、並びにその用途に関する。また、本発明は、高温でァガラーゼ活性を有するポリぺプチド、および該ポリぺプチドをコ一ドする遺伝子に関する。さらに、該遺伝子を用いた高温でァガラーゼ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的製造方法に関する。

さらに詳しくは、ァガロースから種々の生理活性を有する低重合度のァガロォリゴ糖の製造に有用な高温で活性を有するひーァガラーゼとその製造方法、ならびに該酵素の用途、ァガロースゲル電気泳動後のァガ口ースゲルから核酸等を抽出する際に有用な高温で活性を有する β—ァガラーゼとその製造方法、ならびに該酵素の用途、及び該酵素を用いたァガロースゲルからの核酸等の抽出方法に関する。背景技術

寒天の主要構成成分であるァガロースは、 D—ガラクトースと 3， 6 _アンヒドロー L—ガラクトースとが交互に α— 1， 3結合、 β— 1 , 4結合を繰り返してなる多糖である。寒天由来のオリゴ糖を製造するためには、このァガロースを分角早し、低分子化しなければならないため、従来よりァガロースを化学的に分解する方法および酵素的に分解する方法が知られている。化学的に分解する方法では、酸を用いてァガロースを加水分解することができ、この場合、主としてひ一 1 ， 3結合が切断される。また、ァガロースを分角军する酵素としては、ァガロース中の一 1 , 4結合を切断するーァガラーゼ、ならびにひ _ 1， 3結合を切断する α—ァガラーゼの 2種が知られている。

ァガロース中の一 1， 4結合を切断して得られるオリゴ糖はネオアガロオリゴ糖と呼ばれ、その還元末端は D—ガラクトースであり、その重合度は偶数である。一方、ひ一 1， 3結合を切断して得られるオリゴ糖はァガロオリゴ糖と呼ばれ、その重合度は偶数であり、その還元末端は 3， 6—アンヒドロー L—ガラクトースである。還元末端に 3， 6_アンヒドロー L—ガラクトースを有するァガ口オリゴ糖については、近年、アポトーシス誘発作用、制ガン作用、各種の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、 α—ダルコシダーゼ阻害作用等の生理活性を有することが明らカ、にされ（国際公開第 99/24447 号パンフレット、特願平 1 1一 11646号）、その生理作用により、該ァガ口オリゴ糖を有効成分として含有する医薬品や機能性飲食品の提供が可能となっている。

ァガロースを化学的に分解する方法では、生産されるオリゴ糖の大きさを制御すること力 S難しく、特に重合度の低い低分子ォリゴ糖を選択的に作ることは極めて難しい〔徳永隆久ら、バイオサイエンスとインダストリ一、第 49巻、第 73 4頁（1991) 等〕。また、 ]3—ァガラーゼは ]3— 1, 4結合のみを切断するため、該酵素を用いた場合には、上記の生理活性を有しないネオァガロオリゴ糖しか得ることができない。

-1, 3結合を切断する活性を有する α—ァガラーゼを使用することにより、生理活性を有するァガロオリゴ等を製造することが期待される。公知のひ一ァガラーゼとしては、海洋性のグラム陰性細菌 G J IB株〔カーボハイドレート■ リサーチ（C a r b o hy d r a t e Re s e a r c h) 、第 66巻、第 207 〜212頁（1978) 、なお、ョ一口ピアン ·ジャーナル■ォブ'バイオケミストリー Eu r o p e a n j ou r n a l o f B i o c h em i s t r y) 、第 214巻、第 599〜607頁（1993) には、該菌株はアルテロモナス 'ァガリリテイクス G J 1 B株（A 1 t e r omo n a s a g a r i 1 y t i c u s GJ 1B) として記載されている〕やビブリォ（V i b r i o) 属細菌（特開平 7— 322878号公報、 J T0107— L4株）の生産する酵素がある。しかしながら、アルテロモナス 'ァガリリテイクス G J 1 B株由来のひーァガラーゼは 6糖以下のォリゴ糖を分解することができないため、生理活性が顕著なァガロビオースを生産することは不可能である。さらに、ビブリォ属細菌由来の α—ァガラーゼは 6糖以下のオリゴ糖にのみ活性を示す酵素であり、了ガロースに対してはまったく作用しないために、ァガロースを原料とするァガ口オリゴ糖の製造に使用することはできない。

本発明者らは、ァガロースの "一 1， 3結合を切断し、かつ顕著な生理活性を有するァガロオリゴ糠を生成する酵素を得ることを目的として鋭意研究を行ない、この目的に適した性質の酵素を生産する 2株の微生物を見出し、これらの微生物の生産する酵素を単離し、理化学的、酵素学的性質を解明した。さらに、これら 2種類の酵素の遺伝子を単離し、該遺伝子を用いた遺伝子工学的手法によりひ一ァガラーゼ活性を有するポリべプチドを簡便に製造する方法を見出した（国際公開第 0 0 / 5 0 5 7 8号パンフレット）。し力し、これら 2種類のひーァガラーゼの至適反応温度は 4 0 °C付近であり、ァガロースを溶解してこれらの酵素で処理し、ァガロオリゴ糖を得る場合、反応温度を 4 0 °C付近にまで下げる必要がある。この場合、ァガロースの濃度が高いと固形化してしまい酵素反応がすすまなくなるため、これらの酵素を用いる場合は、ァガロース濃度を低くした状態で処理する必要があり、高濃度のァガロースを処理することは出来ず、ァガロオリゴ糖の生産性は低かった。従って、ァガロースが高濃度であっても固形化することのない高レ、温度で活性を有する耐熱性のひ一ァガラーゼが望まれていた。

—方、遺伝子工学の分野では、制限酵素処理、あるいは増幅反応処理を行なつた核酸等をァガロースゲルにて電気泳動し、その後ァガロースゲル中から抽出する操作が広く行われている。この操作において、従来は至適温度が 3 7 °C付近の ]3—ァガラーゼが用いられてきた。しかしながら、この場合も、反応温度を酵素の至適温度に合わせて低下させる必要があり、ァガロースの固形化を防ぐために、処理を行なう核酸等を含んだァガロースゲルを大量の水に溶解してァガロース濃度を低下させさせなければならない。この場合、回収しょうとする核酸等の濃度も必然的に低下し、このことは回収率の低下、ァガロース分解効率の低下を招き、さらに操作に時間がかかるという問題点を有している。この問題点を克服するためには、従来よりも高温で反応させることが出来るァガラーゼが必要である。そのようなァガラーゼとして、 F l a v o b a c t e r i u m s p . s t r a i n NR 1 9由来の^—ァガラーゼ（米国特許第 5， 8 6 9 , 3 1 0号）が知られているが、その至適温度はさほど高くなく、また、耐熱性も十分ではなく、ァガロースが高濃度であっても固形化することのない高い温度で活性を有する耐熱性の βーァガラーゼが望まれていた。

このように、従来の技術では、ァガロオリゴ糖の製造、ァガロースゲルよりの核酸等の物質の抽出に関して問題を有していた。

発明の目的

本発明の目的は、効率の良いァガロオリゴ糖の製造、効率の良いァガロースゲルょりの核酸等の物質の抽出等の使用することの出来るァガラーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドのアミノ酸配列、該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリぺプチドの製造方法、ならびにァガロオリゴ糖の製造方法およぴァガロースゲノレよりの核酸等の物質の抽出方法を提供するものである。

発明の概要

本明者らは、上記事情に鑑み、高温でァガロースの a— 1 , 3結合を切断し、かつ顕著な生理活性を有するァガロオリゴ糖の製造等に有用な酵素、および高温でァガロースの _ 1， 4結合を切断し、かつァガロースゲルからの効率よい核酸等の抽岀等に有用な酵素を得ることを目的として鋭意研究、探索の結果、これらのそれぞれの目的に適した性質を有する 2種類の酵素を生産する微生物を見出すことに成功し、該微生物よりそれぞれの酵素を単離し、その理化学的、酵素化学的性質を明することに成功した。

さらに、本発明者らは、上記のそれぞれの酵素をコードする遺伝子を単離することに成功し、該遺伝子を用いる遺伝子工学的手法により、本発明.のひ一ァガラーゼ活性を有するポリぺプチド、 eーァガラーゼ活性を有するポリべプチドをそれぞれ簡便に製造する方法を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は、新規のァガラーゼに関し、下記から選択されるァミノ酸配列、もしくは該ァミノ酸配列に 1個以上のァミノ酸の置換、欠失、付加もしくは揷入の少なくとも 1つが導入されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする：

( 1 ) 配列表の配列番号 2 2に示されるァミノ酸配列のうちのァミノ酸番号 2 1 〜437の 417残基からなるアミノ酸配列；または

( 2 ) 配列表の配列番号 23に示されるァミノ酸配列のうちのァミノ酸番号 31 8〜 1089の 772残基からなるアミノ酸配列。

上記ァガラーゼとしては、 D—ガラクトースと 3， 6—アンヒドロ一 L—ガラクトースとの間の J3— 1， 4結合を加水分解する活性を有することを特徴とする酵素、 3, 6—アンヒドロ一 L—ガラクトースと D—ガラクトースとの間の c¾— 1， 3結合を加水分解する活性を有することを特徴とする酵素等が例示される。本発明の第 2の発明は、ァガラーゼ活性を有するポリべプチドをコ一ドする遺伝子に関し、第 1の発明のァガラーゼをコードすることを特徴とする。該遺伝子としては、配列表の配列番号 20に示される塩基配列のうちの塩基番号 61〜 1 31 1の 125 1塩基からなる塩基配列、または該 1251塩基からなる塩基配列に 1個以上の塩基の置換、欠失、付加もしくは揷入の少なくとも 1つが導入された塩基配列を含む遺伝子、あるいは配列表の配列番号 21に示される塩基配列のうちの塩基番号 952〜3267の 2316塩基からなる塩基配列、または該 2316塩基からなる塩基配列に 1個以上の塩基の置換、欠失、付加もしくは揷入の少なくとも 1つが導入された塩基配列を含む遺伝子等が例示される。

本発明の第 3の発明は、第 2の発明の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ第 1の発明のァガラーゼ活' !·生を有するポリぺプチドをコードする遺伝子に関する。

本発明の第 4の発明は、第 2の発明または第 3の発明の遺伝子を含む組換え D

NA分子に関する。

本発明の第 5の発明は、第 4の発明の組換え DNA分子を有する形質転換体に関する。

本発明の第 6の発明は、ァガラーゼ活性を有するポリぺプチドの製造方法に関し、該ァガラーゼの産生能を有する微生物、例えば、微生物 NAB 2-1-1

(FERM BP-7855) が属する微生物属の微生物（例えば、微生物 NA B 2— 1一 1) を培養する工程、および該培養物から第 1の発明のァガラーゼを採取する工程を包含することを特徴とする。

本明の第 7の発明は、ァガラーゼ活性を有するポリべプチドの製造方法に関し、第 5の発明の形質転換体を培養する工程、および該培養物から第 1の発明のァガラーゼを採取する工程を包含することを特徴とする。

本発明の第 8の発明は、ァガロオリゴ糖の製造方法に関し、第 1の発明のァガラーゼによりァガロースを分解する工程、および該分解物よりァガロオリゴ糖を採取する工程を包含することを特徴とする。

本発明の第 9の発明は、ァガロースゲルよりの物質の抽出方法に関し、第 1の発明のァガラーゼによりァガロースゲルを分解する工程を包含することを特徴とする。

本発明の第 1 0の発明は、第 9の発明のァガロースゲルよりの物質の抽出方法に使用されるキットに関し、第 1の発明のァガラーゼを含有することを特徴とする。

本発明の第 1 1の発明は、第 1の発明のァガラーゼの熱安定性の向上方法に関し、ァガラーゼの N末端側の 3 0 %までのポリぺプチドを欠失させる工程を包含することを特徴とする。発明の詳細な説明

本明細書において、オリゴ糖とは、 2個以上 1 0個以下の単糖から構成された糖類をいい、ァガロオリゴ糖とは D—ガラクトースと 3， 6—アンヒドロ一 L— ガラクトースが交互にひ一 1， 3結合、 β - 1 , 4結合を繰り返し、還元末端に 3， 6—アンヒドロー L—ガラクトースを有するオリゴ糖をいう。一方、ネオアガロオリゴ糖とは D—ガラクトースと 3 , 6—アンヒドロ一 L一ガラクトースが交互に a— 1 , 3結合、 8— 1， 4結合を繰り返し、非還元末端に 3， 6 _アンヒドロー L—ガラクトースを有するオリゴ糖をいう。

また、多糖類とは単糖およぴォリゴ糖以外の糖をいう。

本発明のァガラーゼは、配列表の配列番号 2 2に示されるァミノ酸配列のうちのアミノ酸番号 2 1〜4 3 7の 4 1 7残基からなるアミノ酸配列、もしくは配列表の配列番号 2 3に示されるアミノ酸配列のうちのアミノ酸番号 3 1 8〜1 0 8 9の 7 7 2残基からなるアミノ酸配列を含むァガラーゼである。また、上記ァミノ酸配列に 1個以上のァミノ酸の置換、欠失、付加もしくは揷入の少なくとも 1 つが導入されたァミノ酸配列を含むポリぺプチドも本発明の一つの様態であり、例えば、上記ァミノ酸配列と少なくとも 70 %以上、好ましくは 80 %以上、さらに好ましくは 90%以上の相同性を有する領域を有するものが含まれる。相同性は、公知の方法で計算することが出来、この計算を行なうための任意コンビュータプログラム、例えば DNAS I S (宝酒造社製）を用いて計算することが出来る。

本発明のァガラーゼは、ァガロースのような多糖、ならびにァガロオリゴ糖、ネオァガロオリゴ糖等のオリゴ糖のいずれにも作用することが出来、例えば、反応至適温度が 45 °C以上であるものである。このような性質を有しているものであれば本発明の酵素に特に限定はないが、例えば、海洋性の微生物である微生物 NAB 2-1- 1 (FERM B P— 7855 ) の生産するァガラーゼが挙げられる。

本発明のァガラーゼの切断様式にも特に限定はなく、例えば、 3, 6—アンヒドロ一 L—ガラクトースと D—ガラクトースとの間の α— 1, 3結合を加水分解する α—ァガラーゼ、あるいは D—ガラクトースと 3， 6—アンヒドロー L—ガラタトースとの間の ]3— 1 , 4結合を加水分角早する β—ァガラーゼが挙げられる。本努明のひーァガラーゼは、 3， 6—アンヒドロー L—ガラクトースと D—ガラタトースとの間の α— 1， 3結合を加水分解する酵素であり、ァガロースのような多糖、ならびにァガ口へキサオースのようなオリゴ糖のいずれにも作用することができるものである。このような性質を有しているものであれば本発明の酵素に特に限定はないが、例えば、海洋性の微生物である微生物 N A Β 2-1-1 (FERM BP— 7855) の生産する α—ァガラーゼであるァガラーゼ I I を挙げることができる。

微生物 NAB 2-1-1の生産するァガラーゼ I Iは、多糖、オリゴ糖中に存在する 3， 6—アンヒドロー L—ガラクトースと D—ガラクトースとの間の α—

1， 3結合を加水分解する酵素である。該酵素はァガロース、ァガロォクタォース等のァガ口へキサオース以上のァガロオリゴ糖、およぴネオアガ口へキサォ一ス以上のネオァガロオリゴ糖に作用する。

本発明の ;3—ァガラーゼは、 D—ガラクトースと 3, 6—アンヒドロー Lーガラタトースとの間の一 1， 4結合を加水分角军する酵素であり、ァガロースのような多糖、ならびにァガ口へキサオースのようなオリゴ糖のいずれにも作用することができるものである。このような性質を有しているものであれば本発明の酵素に特に限定はないが、例えば、海洋性の微生物である微生物 N A B 2-1-1 (FERM B P— 7855) の生産する /3—ァガラーゼであるァガラーゼ Iを挙げることができる。

微生物 NAB 2-1-1の生産するァガラーゼ Iは、多糖、オリゴ糖中に存在する D—ガラクトースと 3， 6—アンヒドロー L—ガラクトースとの間の ;3— 1， 4結合を加水分解する酵素である。該酵素はァガロース、ネオァガロォクタォース等のネオァガ口へキサオース以上のネオァガロオリゴ糖、およびァガ口へキサオース以上のァガロオリゴ糖に作用する。

上記の酵素の活性測定方法および両酵素の理化学的性質、酵素化学的性質を以下に示す。

(1) 酵素化学的測定方法

本発明のァガラーゼの活性測定は、ァガロース LO 3 (宝酒造社製）を基質として酵素反応を行なった後、生じたァガロテトラオースまたはネオァガロテトラオースの量を高速液体ク口マトグラフィ一を用いて定量することにより行なう。本明細書において、精製酵素標品および精製中の酵素の活性測定に用いられた酵素活性測定方法は詳しくは以下のとおりである。

0. 2% (w/v) または 0. 5% (w/v) のァガロース溶液〔ァガラーゼ

Iの場合： 10 mM 塩化ナトリゥムを含む 20 mM T r i s— HC 1緩衝液 (pH7. 2) 、ァガラーゼ I Iの場合： 10mM 塩化カルシウムおよび 10 mM 塩化ナトリウムを含む 2 OmM T r i s— HC 1緩衝液（p H 7.

2) 〕を調製し、この溶液 180 μ 1を基質として、酵素溶液 20 μ 1と混合し、 50°Cで 5〜30分間、好ましくは 10分間反応させた後、沸騰水中または 75 °Cで 1分間加熱することによつて反応を停止させる。この反応溶液 30 μ 1を、内径 7. 8 mm、長さ 300mmの TSKg e l α - 2500 (東ソ一社製）なるカラムに供し、 70%ァセトニトリル溶液を溶離液とし、 0. 8ml /分の流速で溶出させた時の約 25分の保持時間を示すァガロテトラォース、または約 24分の保持時間を示すネオァガロテトラオースを定量し、 10分間当たり 1 μ mo 1のァガロテトラオースを生じる酵素量を 1単位 (1U) とする。

(2) 至適； H

ァガロースを基質とし、酢酸緩衝液（pH4. 5) 、リンゴ酸緩律 ί液 (ρΗ5.

5) 、酢酸緩衝液 (ρΗ6. 0、 6. 5) 、 T r i s— HC 1緩衝液 (pH7. 0、 7. 5、 8. 8) を用いて調製した反応液に酵素を作用させた結果より、了ガラーゼ I、ァガラーゼ I Iともに弱酸性から弱アルカリ性でァガロース分解活性を示すことが明らかとなった。

(3) 至適温度

本発明のァガラーゼ I Iは 45〜5 5 °Cの範囲で高い酵素活性を示し、さらに 50°Cの付近で最大活性を示す。また、本発明のァガラーゼ Iは 45〜70°Cの範囲で高い酵素活性を示し、さらに 5 5〜 6 5 °Cの付近で最大活性を示す。

(4) 熱安定性

48°C、 5 0°C、 5 5°C、 60°C、 6 5 °Cで一定時間処理した酵素標品の残存活性を測定した結果、ァガラーゼ I Iは 55°C、 10分間処理で 40%、ァガラーゼ Iは 60 °C、 10分処理で 1 00%、 20分処理で 100%、 30分処理で 98 %、 65 °C、 10分間処理で 100%、 20分処理で 9 5 %_s 30分間処理で 90 %、 6 0分間処理で 90 °/₀の活性を示した。

(5) C aイオン要求性

既知のァガラーゼは、その活性発現にカルシウムを必要とする。そこで、本発明のそれぞれのァガラーゼのカルシウムイオンの要求性について検討した結果、ァガラーゼ I Iは、カルシウムイオン非存在下で、カルシウム存在下の活性の 6 0 %、ァガラーゼ Iは、力ルシゥムィォン非存在下で、力ルシゥム存在下の活性の 1 00%の活性を有することが確認された。すなわち、ァガラーゼ I I 、ァガラーゼ I何れもカルシウムイオン非添加の状態で活性を示す。

また、本発明のァガラーゼ I Iは、 C a C 1 ₂存在下で安定化される。一方、マンガンイオン、マグネシウムイオンによっては影響を受けな、。

(6) 分子量 10〜 20 %ポリアクリルァミド濃度勾配ゲルを使用した S D S—ポリアクリルアミド電気泳動法（SDS— PAGE) により、ァガラーゼ I Iの分子量は約 117, 000、ァガラーゼ Iの分子量は、約 48, 000と推定された。

(7) エドマン分解法によるアミノ酸配列

ェドマン分解法により決定されたァガラーゼ I Iの N末端アミノ酸配列は G 1 u-Th r-I 1 e-V a 1— Le u— G l n~A 1 a— G l u— S e r_Ph e、また、ァガラーゼ Iの配列は A 1 a-A s p-X a a— A s p-G 1 y-V a 1— P r o - I 1 e-P r o-A 1 a- P r o- A 1 a-G 1 yであった。配列表の配列番号 2およぴ 1に、それぞれァガラーゼ I Iおよびァガラーゼ Iの N末端アミノ酸配列を示す。

なお、下記に示すようにァガラーゼ I I、ァガラーゼ Iをコードする遺伝子は共に単離されており、該遺伝子にコードされるアミノ酸配列も決定されている。ァガラーゼ I I、ァガラーゼ I遺伝子にコードされるァミノ酸配列を配列表の配列番号 23、 22にそれぞれ示す。配列番号 23に示されるァミノ酸配列のうちのアミノ酸番号 318〜 1089の 772アミノ酸からなるポリペプチドは、本発明の α—ァガラーゼ活性を示し、配列番号 22のァミノ酸配列のうちのァミノ酸番号 2；!〜 437の 41 7アミノ酸からなるポリペプチドは、それぞれ本宪明の βーァガラーゼ活性を示す。

本発明のァガラーゼは、微生物 ΝΑΒ 2— 1一 1 (FERM BP— 785 5) を培養し、該培養物から精製することができる。 NAB 2_1— :U¾、寒天資化性の細菌として海水中から分離されたものであって、下記の菌学的性質を有するものである。

[菌学的性質]

(1) 形態

人工海水（商品名ジャマリン S、ジャマリンラボラトリー社製）を調製し、これにペプトン（D I FCO社製）を 0. 3% (w/v) 、酵母エキス（D I FC O社製）を 0. 02% (w/v) 加えた後、 3Mの炭酸ナトリウムで pH7. 8 に調整した。これにァガロース LO 3 (宝酒造社製）を 0. 1% (w/v) となるよう加え、オートクレープを用いて滅菌操作を行った後、上記微生物を接種し、 37°C、 120 r pmで一 B免培養した。該培養液で生育した微生物は、グラム陰性の桿菌であり、また運動性を有し、べん毛は極毛である。また、好気性であり、塩類要求性である。

(2) 生育状態

人工海水（商品名ジャマリン S、ジャマリンラボラトリー社製）を調製し、これにペプトン（D I F CO社製）を 0. 3% (w/v) 、酵母エキス（D I FC O社製）を 0. 02% (w/v) となるよう加えた後、 3Mの炭酸ナトリウムで PH7. 8に調整した。これに寒天（ナカライテスタ社製）を 1. 5% (w/ v) となるようを加え、オートクレープした後に平板培地とした。この培地に上記の微生物を接種したところ、

( i ) 30〜 40 °Cで良好に生育する、

( i i) 菌体の生育に従って寒天ゲルは液化される、

(i i i) pH6. 0〜8. 0において旺盛に生育する、

ことが示された。

NAB2— 1— 1は、平成 13年 1月 103 (原寄託日）より、 0本国〒 30

5-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号 F ERM BP— 7855として寄託されている。

上記微生物について、菌株によって特異的な塩基配列をもつことが知られている 16 S リボゾーム RNA (16 S r RNA) をコードする遺伝子の塩基配列を解析することにより、その分類学上の位置に関する情報を得ることができる。すなわち、微生物 NAB 2_ 1 _ 1の菌株から染色体 DNAを抽出し、上記の遺伝子、またはその一部の領域を増幅可能なプライマーを使用した PC Rを実施する。増幅された DN A断片の塩基配列を決定し、該配列について G e n B a n k データベースを利用したホモロジ一検索を行うことにより、上記の領域において類似した塩基配列を有する微生物、すなわち分類学的に近縁に位置する微生物を知ることができる。

ブリツティン 'ォブ■ジャパニーズ■ソサイエティ■ォブ ·ミクロビアル ·ェコ口ジー (Bu l l e t i n o f J a p a n e s e S o c i e t y o f Mi c r o b i a l Ec o l o g y) 、第 10卷、第 31〜 42頁（199 5) に記載の方法により、微生物 NAB 2— 1一 1の 16 S リボソーム RNA 遺伝子由来の DN A断片を増幅した。なお、 PCRには上記文献に記載のプライマー 27 f および 1492 rを使用した（配列表の配列番号 32および 33に、それぞれプライマー 27 fおよぴプライマー 1492 rの塩基配列を示す）。得られた増幅 DNA断片の塩基配列を解析した結果、上記の領域に関して、本発明のァガラーゼを生産する微生物と最も高い相同性を持つものとして、 90%程度の相同性をもつ以下のものが見出された。

P s e u d o a l t e r omo n a s s p . KT 0812 A

Ae r omo n a s s c hu b e r t i i

また、本癸明のァガラーゼは、上記 NAB 2— 1一 1の他に、 NAB 2— 1一 1の自然的または人為的変異株、その他 NAB 2 _ 1— 1と同じ属に属する ί敷生物であって、本発明のァガラーゼの産生能を有する微生物から得ることが出来る。人為的変異株は、放射線、紫外線照射や変異誘起剤処理等公知の方法により取得することができる。

—般に、同じ属に属する微生物の 16 S r RN A遺伝子の塩基配列間の相同性は約 99%以上であることが知られている。従って、微生物 NAB 2— 1一 1 の 16 S r R N A遺伝子の塩基配列と 99 %以上相同な配列を有する微生物を微生物 NAB 2— 1一 1と同様に本発明において使用することができる。

上記微生物の培養に用いる培地には、当該微生物が利用し得る窒素源、無機物等を含み、寒天、ァガロース等を炭素源として含むものを用いることができる。寒天、ァガロースは、市販のものを用いることができる。窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン等が挙げられるが、好ましくは酵母エキス、ペプトンを用いる。これらの窒素源は寒天、ァガロース以外の炭素源としても使用できる。さらに、塩類としては、塩化ナトリゥム、クェン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチゥム、ホウ酸ナトリウム、ケィ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝酸アンモニゥム、リン酸水素ニナトリゥム等を組み合わせて用いることができる。特に好適には、人工海水であるジャマリン Sなる培地に、ペプトン、酵母ェキス、寒天またはァガロースを加えた培地を用いることができる。寒天またはァガロースの濃度は 0. 1〜2 . 0 %が好ましい。寒天またはァガロースの濃度を任意に変えることにより固体培地、液体培地を作り分けることが可能である力酵素生産を目的とする場合は濃度 0. 1〜0. 3 %の液体培養が好ましく、菌体の保存を目的とするときは濃度 1 . 2〜2. 0 %の固体培養が好ましい。なお、低融点ァガロースを液体培養に用いる場合には、 0 . 1〜1 . 0 %の濃度で使用することができる。

培養条件は、培地の組成によって多少異なるが、例えば、培養温度は 3 0〜4 0 °C、培地のp Hはp H 6 . 0〜8 . 0、培養時間は 1 2〜 4 8時間の条件で培養することが出来る。

以上のようにして培養中に産生された本発明の α—ァガラーゼ及び/または β —ァガラーゼは、菌体外に分泌されるので、培養終了後、菌体を遠心分離、濾過等の方法を用いて除去して培養液上清を得る。

得られた培養液上清を、真空濃縮法または限外濾過法を用いて濃縮した液状酵素として、あるいは凍結乾燥法、噴霧乾燥法等により粉状酵素として粗酵素標品を調製することができる。また、通常用いられる精製方法、例えば硫安塩析、溶媒沈澱法により本発明のひーァガラーゼ及び/またはーァガラーゼを部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等のカラムク口マトグラフィ一等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。

このようにして得られた培養液または種々の精製度の本発明の a—ァガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖である寒天またはァガロースを基質として反応させることにより、ァガロビオース、ァガロテトラオース、ァガ口へキサオース等のァガロオリゴ糖を製造することができる。

ァガロースは、 D _ガラクトースと 3， 6—アンヒドロー L一ガラクトースが交互に α—Ι , 3結合、 jS - 1 , 4結合を繰り返してなる多糖である。 j3—ァガラーゼは、このァガロースの] 3— 1， 4結合を力 [J7K分解する酵素である。該酵素によって生成する、還元末端に D—ガラクトースを有するオリゴ糖はネオァガロオリゴ糖と呼ばれ、ァガロオリゴ糖に見られるような生理活性を示さない。ァガロースのひ一 1 , 3結合を切断する一ァガラーゼを用いた場合には、還元末端が 3， 6—アンヒドロー L—ガラクトースであるァガロオリゴ糖を製造することが可能である。ひ一ァガラーゼは、これまでにァノレテロモナス ·ァガリリテイクス G J 1 B株由来、ビブリオ属細菌（J T O 1 0 7— L 4株）由来の 2種の酵素が知られている。ところが、アルテロモナス ·ァガリリテイクス G J 1 B株の生産するひ一ァガラーゼはァガ口へキサオース以下のオリゴ糖に作用することができず、一方、ビブリオ属細菌由来の α—ァガラーゼはァガロースを分角军することができない。すなわち、これらの α—ァガラーゼでは、ァガロースを原料としたァガロビオース、ァガロテトラオースの効率の良い生産は不可能である。また、本発明者らによって先に発見された国際公開第 0 0 Ζ 5 0 5 7 8号パンフレットに記載の一ァガラーゼは、ァガロース、ならびにァガ口へキサオース以上のァガロオリゴ糖に作用する酵素であるため、ァガロースに作用してァガロオリゴ糖を生成し、さらにこうして生じたァガ口へキサオース中の一ヶ所の一 1， 3結合を切断することも可能であり、従来の方法では殆ど生成されなかった 2糖と 4糖であるァガロビオースとァガロテトラオースを生成することが出来る。しかしながら、これらの酵素の反応至適温度は 4 0 °C付近である。ァガロースは通常使用される濃度である 1 % (w/ v ) の場合、 5 0 °Cであれば固形化しない力 4 0 °Cであれば固形化してしまう。即ち、従来の酵素を用いた場合、その反応至適温度ではァガロ^"スが高濃度で存在すると固形化してしまい、酵素反応は進まず、効率の良いァガロビオース、ァガロテトラオースの生産は困難であった。 —方、本発明の α—ァガラーゼは、反応至適温度が 5 0 °Cであり、了ガラーゼが固形化しない温度での反応が可能であり、効率の良いァガロオリゴ糖の製造が可能である。

本突明の α—ァガラーゼは、上記理化学的性質から明らかなように、ァガロース、ならびにァガ口へキサオース以上のァガロオリゴ糖に作用する、すなわち、ァガロースに作用してァガロオリゴ糖を生成し、さらにこうして生じたァガロォリゴ糖中の _α— 1 , 3結合を切断して、ァガロビオース、ァガロテトラオースのような低分子ァガロオリゴ糖を生成することが可能な酵素であると同時に、至適温度が高く、耐熱性にも優れる酵素であるため、本発明の α—ァガラーゼを用いることで、ァガロースの固形化による反応阻害を受けることなく、従来の方法では製造が困難であった 2糖と 4糖であるァガロビオースとァガロテトラオースを大量に得ることが可能となる。

従来公知の一ァガラーゼと本発明の α—ァガラーゼの基質特異性を表 1に示す。表中、 +はその基質を分解できることを、また、一は分解できないことをそれぞれ示す。表 1 ァガロースァガロァガロへキサオーステトラ才ースアルテロモナス ·ァガリリティ:タス +

G J 1 Β株

ビブリオ属細菌 + +

( J T O 1 0 7— L 4株）

ァガラーゼ 1— 7および + +

ァガラーゼ 4一 3

ァガラーゼ I I + +

本亮明の α—ァガラーゼを使用して生産されたァガロオリゴ糖はァガロビオース、ァガロテトラオースを含有するものであり、その使用目的に支障のない限りにおいてァガ口へキサオース以上のァガロオリゴ糖を含んでいてもよい。本発明の α—ァガラーゼを使用してァガロビオース、ァガロテトラオース、ァガ口へキサオースを生産するための原料としては、例えば、寒天、ァガロース、または寒天およびァガロース由来のオリゴ糖を使用すればよい。ひ一ァガラーゼを作用させる条件は、該酵素が活性を示すものであれば特に限定はないが、例えば、ァガラーゼ I Iの場合は ρ Η 6 . 0〜 8 . 0で、 4 5〜 5 5 °Cで作用させることが好ましい。また、反応液の組成も当該酵素の作用に適したものであれば特に限定はない。

本発明のひーァガラーゼによって生産されるオリゴ糖は、上記のように 6糖以下の重合度の低いオリゴ糖を中心とするが、反応条件等により重合度の異なるォリゴ糖を自由に製造することも可能である。このようにして得られたオリゴ糖を分離精製することにより、ァガロビオース、ァガロテトラオース、ァガ口へキサオースを単独で得ることも可能である。

上記のようにして得られた培養液または種々の精製度の本発明の i3—ァガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖である寒天またはァガロースに作用させることにより、寒天またはァガロースをネオアガロビオース、ネオァガロテトラオース、ネオアガ口へキサオース等のァガロオリゴ糖に分解することが出来る。

—ァガラーゼは、これまでに、 V i b r i o s p. JT0107-1, 4 (特開平 8— 38172号）、 P s e u d omo n a s a 1 t a n t i c a 〔M o r r i c e L. M. , e t a 1. ； Eu r. J . B i o c h em. ， 135, 553 _ 558 ( 1983 ) 〕由来の酵素等が知られているが、これらの反応至適温度は約 30°Cである。すなわち、これらの酵素をァガロースゲルからの核酸等の抽出に用いようとした場合、これらの酵素が活性を示す温度ではァガロースが固形化しているため、反応は進まず、実用に供することは出来ない。これらの酵素より反応至適温度が高いものとして、 F 1 a V o b a c t e r i um s p. s t r a i n NR 19 (米国特許第 5, 869, 3

10号）、 P s e u d omo n a s s p. N— 7 (特公平 7— 97987 号）、 V i b r i o s p. PO— 303 (特開平 8— 294389号）由来の酵素等が知られているが、これらの至適温度は 55 °C以下であり、低融点ァガロースゲルが融解する温度である 65°Cより低く、実用上問題を有している。一方、本明の βーァガラーゼは 50 °C〜 70 °Cの広い温度範囲で高い活性を示し、特に 55 °C〜 65 °Cで最大の活性を示すため、ァガロースゲルが十分融解した状態での反応が可能である。また、本発明の —ァガラーゼは、 65°C、 3 0分間処理した後の残存活性が 98 °/₀と耐熱性にも優れ、本発明の β—ァガラーゼを用いることで、ァガロースの固形化による阻害を受けることなく、従来の方法では困難であったァガロースゲルからの核酸等の効率の良い抽出が可能となる。本発明のひ一ァガラーゼ遺伝子とは、上記ひ一ァガラーゼ活性を有するポリべプチドをコ一ドする遺伝子であり、すなわち、ひーァガラーゼ活性を有するポリぺプチドのァミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸をいう。本発明の a— ァガラーゼ遺伝子としては、例えば、上記の微生物 NAB 2 - 1 - 1 (FERM B P- 7 8 5 5) 由来のァガラーゼ I Iをコードする塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。ァガラーゼ I Iをコードする遺伝子としては、例えば、配列表の配列番号 2 3のアミノ酸番号 3 1 8〜 1 08 9の 77 2アミノ酸残基からなるポリぺプチドをコ一ドする塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。

本発明の α—ァガラーゼ遺伝子は、上記したアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加または揷入が導入されたアミノ酸を有し、かつ α —ァガラーゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列を含む核酸をも包合する。

また、本発明の遺伝子には、配列表の配列番号 2 1の塩基番号 9 5 2〜3 2 6 7の 2 3 1 6塩基からなる塩基配列を有する遺伝子が包含され、さらに上記の塩基配列において 1個以上の塩基の置換、欠失、付加または挿入が導入された塩基配列を有し、かつ aーァガラーゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列を含む核酸をも包含される。

さらに、本発明の遺伝子は、上記の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつひーァガラーゼ活 1·生を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸も包合される。ハイブリダィゼーシヨンは、例えば、 1 9 8 9年、コールド 'スプリング 'ハーバー .ラボラトリー発行、 T. マニアテイス（T. Ma n i a t i s) ら編集、モレキュラー ·クローニング：ァ ·ラボラトリー ' マニュアル第 2版 (Mo l e c u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma n u a l , 2 n d e d. ) に記載の方法により実施することができる。上記ストリンジェントな条件としては、例えば、 6 X S S C (1 X S S Cの糸且成： 0. 1 5M 塩化ナトリウム、 0. 0 1 5M クェン酸ナトリウム、 Η 7. 0) 、 0. 5% SD S、 5 Xデンハルト、 1 0 Omg/m 1 ニシン精子 DNAを含む溶液中、プローブとともに 6 5°Cで一 B免保温するという条件があげられる。

本発明の ]3—ァガラーゼ遺伝子とは、上記一ァガラ一ゼ活'性を有するポリぺプチドをコードする遺伝子であり、すなわち、 i3—ァガラーゼ活性を有するポリぺプチドのァミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸をいう。本発明の β一ァガラーゼ遺伝子としては、例えば、上記の微生物 ΝΑ Β 2 - 1 - 1 ( F E RM Β Ρ - 7 8 5 5 ) 由来のァガラーゼ Iをコードする塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。ァガラーゼ Iをコードする遺伝子としては、例えば、配列表の配列番号 2 2のアミノ酸番号 2 1 ~ 4 3 7の 4 1 7アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。

本発明の ]3—ァガラ一ゼ遺伝子は、上記したアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加または揷入が導入されたアミノ酸を有し、かつ一ァガラーゼ活性を有するポリぺプチドをコ一ドする塩基配列を含む核酸をも包合する。

また、本発明の遺伝子には、配列表の配列番号 2 0の塩基番号 6 1〜1 3 1 1 の 1 2 5 1塩基からなる塩基配列を有する遺伝子が包含され、さらに上記した塩基配列において 1個以上の塩基の置換、欠失、付加または挿入が導入された塩基配列を有し、かつ J3—ァガラーゼ活性を有するポリぺプチドをコドする塩基配列を含む核酸をも包含される。

さらに、本発明の遺伝子は、上記の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ ]3—ァガラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含む核酸も包合される。ストリンジェントな条件としては、前記したものが例示される。

本発明のァガラーゼ遺伝子のクローユングは、例えば、以下のようにして行なうことが出来る。

ァガラーゼを生産する微生物よりゲノム D NAを調製する。ゲノム D NAは適当な公知の方法に従って調製でき、例えば、リゾチーム処理、プロテアーゼ処理、 R N a s e処理、フエノール処理、エタノール沈殿等の公知の操作を組合わせて調製することが出来る。このようにして得られたゲノム D NAを適当な公知の方法、例えば、超音波処理、制限酵素消化によって分解する。こうして得られた D NA断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドべクターに組み込み、組み換え D N A分子を作製する。ついで、該組み換え D N A分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。組み換え D NA 分子の作製、形質転換等の操作は、通常用いられる方法、例えば、上記したモレキュラー ·クローニング：ァ ·ラボラトリー 'マニュアル第 2版等に記載の方法から、使用するベクター、宿主に応じたものを選んで用いることが出来る。 'このようにしてァガラーゼ遺伝子を有する形質転換体を含むゲノムライブラリーが得られる。

つぎに、上記のゲノムライブラリーをスクリーニングし、ァガラーゼ遺伝子を有する形質転換体を選択する。当該形質転換体よりァガラーゼ遺伝子を単離することが出来る。スクリーニングの方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。

( 1 ) ァガラーゼ活性の発現を指標にしたスクリ一エング

ゲノムライブラリーを寒天プレート上で増殖させる。ァガラーゼ遺伝子を有する形質転換体は、ァガラーゼ活性を持つポリペプチドを発現し、そのァガラーゼ活性により寒天ゲルを溶解するので、寒天プレートの寒天ゲルを溶解するコロニ一またはプラークを選択する。

( 2 ) 抗体を用いたスクリーニング

ァガラーゼの粗酵素標品、部分精製酵素標品、精製酵素標品を前記した方法に従って調製し、これらの何れかを抗原として常法に従って抗ァガラーゼ抗体を調製する。

ゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたは-トロセルロースのフィルターに移し取る。発現された組み換えタンパク質はコロニー、プラークと共にフィルターに移し取られる。フィルター上の組み換えタンパク質と上記の抗ァガラーゼ抗体を反応させ、該抗体と反応するクローンを同定する。

抗体と反応するクローンの同定は、公知の方法に従って、例えば、抗ァガラーゼ抗体を反応させたフィルターを、パーォキシダーゼ結合二次抗体と反応させた後、発色基質とインキュベートし、発色を検出することによって行なうことが出来る。

なお、上記（1 ) 、 ( 2 ) の方法に用いるゲノムライブラリーの作製に、ベタターに組み込まれた D N A上の遺伝子が高発現されるような発現ベクターを用いた場合には、容易に目的の遺伝子を有する形質転換体を選択することが出来る。

( 3 ) D N Aプローブを用いたハイブリダィゼーシヨンによるスクリーニングゲノムライブラリーをプレート上で増殖させ、生育したコロニーまたはプラークをナイロンまたはニトロセルロースのフィルターに移し取り、変性処理により D N Aをフィルターに固定する。このフィルター上の D NAと標識プローブのハイブリダィゼーシヨンを常法に従って行レ、、該プローブとハイプリダイズするクローンを同定する。

本スクリーニングに用いられるプローブとしては、上記したァガラーゼのアミノ酸配列の情報をもとに作製したォリゴヌクレオチド、その他のァミノ酸配列の情報をもとに作製したオリゴヌクレオチド、またはこれらのァミノ酸配列の情報力ら作製したプライマーによって増幅した P C R断片等が挙げられる。これらのプローブの標識は特に限定はないが、例えば、ラジオアイソトープ標識、蛍光色素標識、ジゴキシゲニン標識、ビォチン標識等が挙げられる。

スクリ一ユングに用いるゲノムライブラリーとしては、以下の方法で作製したァガラーゼ遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリ一を使用しても良い。

ァガラーゼを生産する微生物のゲノム D NAを調製し、これを適当な制限酵素で消化してァガロースゲル電気泳動で分離した後、常法に従いナイ口ンまたは二トロセノレロースのフイノレターにプロッティングする。このフイノレター上の D N A と上記の標識プローブのハイプリダイゼーションを常法に従って行！/、、該プローブとハイプリダイズする D N A断片を検出する。このシグナルに対応する D N A 断片をァガロースゲルから抽出、精製する。

こうして得られた D NA断片を通常用いられている方法によってベクター、例えば、プラスミドベクターに組み込み、組み換え D N A分子を作製する。ついで該組み換え DN A分子を適当な宿主、例えば、大腸菌に導入し、形質転換体を得る。形質転換の方法は通常用いられる方法、例えば、モレキュラー.クローニング：ァ 'ラポラトリー 'マニュアル第 2版等に記載の方法から、使用するべクタ一に応じたものを選んで用いることが出来る。このようにしてァガラーゼ遺伝子を有する形質転換体が富化されたゲノムライブラリ一が得られる。

該ゲノムライブラリーを用いることにより、より効率の良いスクリーエングを行なうことが出来る。

上記（1 ) 〜（3 ) の方法は、何れも形質転換体をスクリーニングして目的に遺伝子をクローニングする方法であるが、 P C R法を用いることによって、形質転換体を利用することなく i n v i t r oでクロ一ユングを行なうことが出来る。

ァガラーゼを生産する微生物のゲノム D NAを調製し、これを鐯型として、ァガラーゼのァミノ酸配列の情報をもとに作製したプラィマー対を用いた P C Rを行ない、ァガラーゼ遺伝子を含む D NA断片を得ることが出来る。さらに、該断片をプローブとしたハイブリダィゼーシヨンや、該断片の塩基配列をもとに作製されたプライマーを用いた P C R等により、ァガラーゼ遺伝子の全長を得ることが出来る。このようにして得られた遺伝子の塩基配列は、公知の方法に従って決定することが出来る。該クローンがァガラーゼのポリペプチド全長をコードしていない場合は、解読された塩基配列をもとに新たなプローブを作製し、該プローブを用いてゲノムライブラリ一のスクリ一二ングを行い、新たなクローンを得る操作を繰り返すことにより、ァガラーゼのオープン' リーディング' フレーム ( o e n r e a d i n g f r a m e、以下 O R Fと示す）全体が解読される。その情報をもとに、例えばくァガラーゼをコードする O R F全体を含むクローンを作製することが出来る。

以上のようにして得られたァガラーゼをコードする遺伝子を適当な発現べクタ一に連結することにより、ァガラーゼ活性を有するポリべプチドを遺伝子工学的に大量に製造することが出来る。

以下に、本発明の遺伝子を取得する方法について、その概略を説明する。微生物 NA B 2— 1— 1を培養し得られた菌体をリゾチームで溶菌させた後、タンパク質除去、エタノール沈殿等の操作を施し、染色体 D N Aを得る。次に上記の NA B 2— 1一 1の染色体 D N Aを制限酵素で完全消化し、当該制限酵素と対応したアダプターを連結する。得られる染色体 D NAを鎵型とし、本発明のァガラーゼ Iまたは I Iの N末端アミノ酸配列、または内部アミノ酸配列をもとに作製されたプライマーと、当該アダプターの塩基配列に対応するプライマーを用いた P C Rを実施する。

このようにして得られた P C R産物の塩基配列を解析することにより、本発明のァガラーゼをコードする塩基配列を決定することが出来る。その全長が決定できなかった場合には、上記の操作を繰り返す力、染色体 D NAを鍀型としたプライマ一ウォーキングを行なえば良い。

ァガラーゼのァミノ酸酉己列から設計されたプライマーはミックスプライマーであっても良い。また、 N末端アミノ酸配列、内部アミノ酸配列のそれぞれから作製したプライマーを用い、 NA B 2—1ー 1の染色体D NAを鎵型としたP C R を行ない、得られる増幅産物の塩基配列から新たなプライマーを作製し、使用することも出来る。

このようにして得られたァガラーゼ I Iをコードする遺伝子は、 1 0 8 9個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする O R Fを有していた。該 O R Fの塩基配列を配列表の配列番号 2 1に、該 O R Fの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号 2 3に示す。なお、得られた遺伝子の塩基配列中にはァガラーゼ I Iの N末端アミノ酸配列 P 2部分に対応する塩基配列が存在し、その上流にシグナルぺプチド様配列を持った 2 6個のアミノ酸をコードする塩基配列、さらにその上流に S D様配列が見出された。

すなわち、配列表の配列番号 2 3に示されるアミノ酸配列は本発明のひ一ァガラーゼの一例である。また、該アミノ酸配列を先に決定されたァガラーゼ I Iの N末端ァミノ酸配列を比較することにより、ァガラーゼ I Iは配列表の配列番号 2 3に示されるアミノ酸配列のうちの 2 7〜1 0 8 9のアミノ酸配列からなるポリぺプチドであり、該ァミノ酸配列は配列表の配列番号 2 1の塩基配列のうちの

7 9〜3 2 7 0 (終止コドンを含む）にコードされることが示される。

なお、該 O R F内に推定 C a結合領域が 3力所（1 7 1〜1 8 4、 2 7 1〜2

8 3、 9 8 7〜9 9 9 ) に見出された。

また、ァガラーゼ Iをコードする遺伝子は、 4 3 8個のアミノ酸からなるポリぺプチドをコ一ドする O R Fを有していた。該 O R Fの塩基配列を配列表の配列番号 20に、該 OR Fの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号 22に示す。なお、得られた遺伝子の塩基配列中にはァガラーゼ Iの N末端ァミノ酸配列 P 1部分に対応する塩基配列が存在し、その上流に 20個のァミノ酸をコードする塩基配列、さらにその上流に SD様配列が見出された。

すなわち、配列表の配列番号 22に示されるアミノ酸配列は本発明のァガラーゼの一例である。また、該アミノ酸配列を、先に決定されたァガラーゼ Iの N末端ァミノ酸配列を比較することにより、ァガラーゼ Iは配列表の配列番号 22に示されるアミノ酸酉己列のうちの 21〜438のアミノ酸配列からなるポリべプチドであり、該ァミノ酸配列は配列表の配列番号 20の塩基配列のうちの 61〜 1 314 (終止コドンを含む）にコードされることが示される。

以上のようにして得られたァガラーゼ Iのアミノ酸配列と、公知の F 1 a V o b a c t e r i um s p . s t r a i n NR 19由来の βーァガラーゼのアミノ酸配列との相同性は 33%しかなく、本発明のァガラーゼ Iは、全く新規の配列であると考えられる。

本発明のァガラーゼをコードする遺伝子、例えば、上記のァガラーゼ I、ァガラーゼ I Iをコードする遺伝子を適当なベクターに連結して糸且換え DNA分子を作製することが出来る。また、当該組換え DN Α分子を適当な宿主に導入して形質転換体を作製することが出来る。当該形質転換体を培養することにより、培養物中に本明のァガラーゼが産生される。すなわち、該形質転換体を使用して、本発明のァガラーゼ、例えば、ァガラーゼ I、ァガラーゼ I Iを大量に製造することが可能となる。

また、公知の方法でァガラーゼをコ一ドする遺伝子に変異を導入することにより、変異を導入したァガラーゼを製造することも出来る。変異の導入方法としては特に限定はなく、例えばオリゴヌクレオチドダブルアンバー法〔H a s h i m o t o— Go t o h, T. , e t a 1. ； Ge n e, 152, 271 一 275 (1 995) 〕、 Ga e d d up l e x法 [Kr ame r, W. , e t a 1. ； N u c 1. Ac i d s Re s. , 12, 944 1 (1984) 、 Kr ame r, W. , e t a 1. ； Me t h o d s i n En z ymo 1 o g y, 154, 350 (1987) ) Kunk e l法〔： Kun k e l, T. A. ； P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, 82， 488 (1985) 、 Kunk e l , T. A. ； Me t h o d s i n En z ymo l o gy, 154, 367

(1 987) 〕等を用いることが出来る。

また、発現させようとするァガラーゼの N末端側にシグナル配列を付加したものをコードする遺伝子を発現させれば、目的のァガラーゼを形質転換体外に分泌させることが出来る。このようなシグナル配列に特に限定はなく、例えば 12列表の配列番号 22のァミノ酸番号 1〜 20で表されるァガラーゼ Iのシグナル配列が挙げられ、該シグナル配列は配列表の配列番号 22の塩基番号 1〜 60にコードされている。あるいは、配列表の配列番号 23のアミノ酸番号 1〜26で表されるァガラーゼ Iのシグナル配列が挙げられ、該シグナル配列は配列表の配列番号 21の塩基番号 1〜78にコードされている。

上記の組換え DN A分子の作製に使用されるべクターは、特に限定するものではなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター等を使用することが出来、組換え DN Aの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。ァガラーゼの生産を目的として組換え DNA分子を作製する場合には、プロモーターやその他の発現調節のための領域を含むベタターが好適である。そのようなプラスミドベクターとしては、特に限定はないが、例えば、 pKF l 9 k、 pT7B l u eT、 p E T 16 b等が挙げられる。また、形質転換体の作製に使用される宿主も、特に限定するものではなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、哺乳動物、魚類、昆虫等の培養細胞等を使用することが出来る。形質転換体の作製には、宿主に適したベタターで作製された組換え DN A分子が使用される。

以下に、ァガラーゼ Iを遺伝子工学的に製造する方法についてその概略を説明する。

例えば、配列表の配列番号 22のァミノ酸番号 21以降のポリぺプチドをコ一ドする塩基配列を含む DN A断片を適当なプラスミドベクター、例えば pKF l 9 k (宝酒造社製）、 pT7B 1 u e T (宝酒造社製）、又は； ET16 b (宝酒造社製）等に挿入したプラスミドを構築する。これらのプラスミドで形質転換した大腸菌、例えば大月菌 J M 109、大腸菌 B L 21 (DE3) p Ly s S等を適当な夜体培地中で培養し、必要に応じて I PTG等による誘導を行い、各プラスミド上の挿入 DNA断片にコードされているポリペプチドを発現させる。これらの形質転換体の発現する単位培養液あたりの β—ァガラーゼ活性は、通常、 ΝΑΒ2— 1— 1の培養液より高い値を示す。

また、ァガラーゼ I Iは、例えば配列表の配列番号 23のアミノ酸番号 27、 181、もしくは 318以降のポリペプチドをコードする塩基配列を含む DN A 断片を用い、上記のァガラーゼ Iと同様の方法によってァガラーゼ I Iを発現する形質転換体を遺伝子工学的に作製することが出来る。得られた形質転換体は、ひ一ァガラーゼ活性を発現し、力その単位培養液あたりの活性は、通常、 NA B 2- 1 - 1の培養液より高い。

以上のようにして遺伝子工学的に生産させた本発明のァガラーゼは、通常用いられる精製方法、例えば硫安塩析、溶媒沈澱法により本発明のァガラーゼを部分精製することができる。さらに、陰イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等のカラムクロマトグラフィ一等の公知の精製操作を組み合わせて、電気泳動的に単一バンドを示す精製酵素標品を得ることができる。

また、遺伝子工学的に生産させた本発明のァガラ一ゼが不溶化する場合には、公知の方法で可溶化し回収することが可能である。

このようにして得られた種々の精製度の本宪明の遺伝子組換え α—ァガラーゼを、紅藻類に含まれる多糖である寒天またはァガロースを基質として反応させることにより、ァガロビオース、ァガロテトラオース、ァガ口へキサオース、ァガロォクタオース等のァガロオリゴ糖を製造することができる。

例えば、 1% (w/v) ァガロースを基質として、 50°Cで 16時間反応させることで、上記ァガロオリゴ糖を製造することが出来る。

同様に、上記のようにして得られた種々の精製度の本発明の遺伝子組換え β - ァガラーゼを、核酸等の電気泳動に供したァガロースゲルに作用させることにより、ァガロースゲル中の核酸等の物質を効率よく抽出することが出来る。

例えば、 1% (w/v) 又は 3% (w/v) ァガロースゲル電気泳動を行った場合、所望の物質を含むァガロースゲルに本発明の遺伝子組換え ]3—ァガラーゼを 6 7°Cで 1 0分間作用させることで、ゲル中の物質を効率良く抽出することができる。

本発明のァガラーゼは、その OR Fの N末端側の 30%までを欠失させることより、熱安定性を向上させることが出来る。欠失させる領域は ORFの例えば 1 0°/₀、 20%等、 30%までであれば特に限定はない。例えば、ァガラーゼ I I の場合、 N末端側から 2 9. 1 %、すなわち 3 1 7アミノ酸を欠失させることにより、その熱安定性を向上させることが出来る。また、該熱安定性の向上は、力ルシゥムの存在下において特に顕著である。

熱安定性向上のための N末端側の欠失方法についても特に限定はなく、プロテァーゼ処理によっても良く、また遺伝子工学的手法を用いても良!/、。

実施例

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

活性測定法

本発明のァガラーゼの精製を行なうにあたって、本酵素の精製品又は部分精製品の活性測定は、ァガロース LO 3 (宝酒造社製）を基質として酵素反応を行つた後、生じたァガロテトラオースまたはネオァガロテトラオースの量を高速液体クロマトグラフィーを用いて定量することにより行った。以下にその操作の詳細を示す。

0. 2% (w/v) または 0. 5% (w/v) のァガロース溶液 [ァガラーゼ Iの場合： 1 OmM 塩化ナトリゥムを含む 2 OmM T r i s— HC 1緩衝液 (p H7. 2) 、ァガラーゼ I Iの場合： 1 0mM 塩化カルシウムおよび 1 0 mM 塩化ナトリウムを含む 2 OmM T r i s _HC 1緩衝液（ p H 7.

2) ] を調製し、この溶液 1 80 lを基質として、酵素溶液 20 1と混合し、 50°Cで 5〜30分間、好ましくは 1 0分間反応させた後、沸騰水中または 7 5でで 1分間加熱することによつて反応を停止させる。この反応溶液 3 0 μ 1を内径 7. 8 mm、長さ 300111111の丁31^8 6 1 α - 2500 (東ソ一社製）なるカラムに供し、 70% ァセトニトリル溶液を溶離液として 0. 8 m 1 /分の流速で溶出させた時の約 25分の保持時間を示す酵素反応によって生じたァガロテトラオース又は約 24分の保持時間を示すネオァガロテトラオースを定量し、 10分間当たり l / mo 1のァガロテトラオース又はネオァガロテトラオースを生じる酵素量を 1単位 (1U) とする。

実施例 2

ΝΑΒ 2-1-1由来のァガラーゼの生産

10 Oralの人工海水（商品名ジャマリン S、ジャマリンラボラトリー社製）を調製し、これにペプトン（D I FCO社製）を 0. 3% (w/v) 、酵母ェキス（D I F CO社製）を 0. 02% (w/v) となるようそれぞれ加えた後、 3 Mの炭酸ナトリウムで； H 7. 8に調整した。これを 500m 1容の三角フラスコに移し、 Nu s i e V e GTGァガロース（宝酒造社製） 0. 4 gをカロえ、オートクレープを用いて滅菌操作を行った後、 NAB 2— 1— 1を接種し、 3 7°C、 120 r p mで一 B免培養した。得られた培養液を前培養液とした。

本培養は、以下の手順で行った。 5 , 000ml容のジャーファーメンタ一容器に人工海水（商品名ジャマリン S、ジャマリンラボラトリ一社製） 3, 00 0m lを調製し、これにペプトン (D I F CO社製）を 0. 3% (w/v) 、酵母エキス（D I FCO社製）を 0. 02% (w/v) となるようそれぞれ加え、 pH7. 8に調整した後、 Nu s i e V e GTGァガロース（宝酒造社製） 1 2 gを加え、オートクレープを用いて滅菌操作を行った。これに上記の前培養液

30m lを接種し、 37°C、 250 r p mで 18時間培養し、 8, 000Xg、 20分間の遠心分離により菌体を除いた約 3， 000mlの上清を回収した。これより以降の操作は 4 °C以下で行った。

上記上清を透析膜（三光純薬社製）に添加し、約 500 gのポリエチレンダリコール中に二晚浸漬させることにより、約 10倍に濃縮し、得られた 300ml の濃縮液は、緩衝液 I [1 OmM 塩化カルシウムおよび 1 OmM 塩化ナトリゥムを含む 20mM Tr i s— HC 1緩衝液 (pH7. 2) ] で透析を行い脱塩を行った。

この透析液を予め緩衝液で平衡化した陰ィオン交換樹脂である D E A E To y o p e a r 1 65 OM (東ソ一社製）を充填したカラム (φ 2. 0 cmX 1 2 cm) に負荷し、約 1 20 m 1の緩衝液 Iで洗浄し、その非吸着画分及び洗浄画分の約 40 Omlをァガラーゼ I画分として回収した。その後 1 OmMから 1 , 000 mMの塩化ナトリゥムへの直線濃度勾配法（総溶出量 400m l ) で溶出させ、塩化ナトリウム濃度が 30 OmMから 60 OmMの間に溶出してくる約 1 6 Om 1をァガラーゼ I I画分として回収した。

得られたァガラーゼ I、ァガラーゼ I I両画分を緩衝液 I I [1 OmM 塩化カノレシゥム、 1 OmM 塩化ナトリウム、 5% グリセロール、および ImM PMSFを含む 20mM T r i s— HC 1緩衝液（p H 7. 2) ] に対して透析して脱塩を行った。

ァガラーゼ I I画分についてさらに以下の精製を行った。透析後のァガラーゼ I I画分を 25m lの QAE To y o p e a r l 550C (東ソ一社製）を充填したカラム (φ 2. 0 cmX 8. O cm) に負荷し、この場合は塩化ナトリゥムの 10 mMから 800 mMの直線濃度勾配法（総溶出量 250m l) により溶出させ、 50 OmM前後で溶出する画分約 7 Om 1を得た。この画分を緩衝液 I Iで透析し、遠心限外濾過膜 C ENTR I PREP— 10 (アミコン社製）を用いて約 1 m 1に濃縮した。これを緩衝液 I Iで平衡化した S e p h a d e x G— 100 (フアルマシア社製）を充填したカラム 0. 8 cmX 50 c m) を用いたゲル濾過に供し、約 2 Om 1のァガラーゼ I I画分を得た。これを再度限外濾過膜で約 1 m 1まで濃縮した。

この精製タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ S D S ) を含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動したところ、ほぼ単一に精製されており、全活十生は約 1 5 0Uであった。

ァガラーゼ I画分についてはさらに以下の精製を行った。

前に述べた透析済みのァガラーゼ I画分約 40 Om 1を、予め緩衝液 I Iで平衡化した CM To y o p e a r l 650 (東ソ一社製）を充填したカラム ( 2. 0 cmX 9. 5 cm) に吸着させ、 10mMから 1， 00 OmMの塩化ナトリゥムへの直線濃度勾配法（総溶出量 300m l) で溶出させ、塩化ナトリゥム濃度が 30 OmMまでに溶出してくる約 9 Om 1のァガラーゼ Iの画分を回収した。この画分を 1. 0M 硫酸アンモ-ゥムを含む緩衝液 I Iでー晚透析後、同緩衝液で平衡ィ匕した 30mlの Bu t y l To y o p e a r l 650 M (東ソ一社製）を充填したカラム（φ 2. 0 cmX 9. 5 cm) に負荷した。 1. 0Mから 0Mまでの硫酸アンモェゥム濃度の勾配（総溶出量 300ml) で溶出させ、 30 OmM以降のァガラーゼ I画分（約 6 Om 1 ) を回収した。ァガラーゼ I Iの場合と同様にこの画分を緩衝液 I Iに対して透析し、遠心限外濾過膜 CENTR I PREP— 10 (アミコン社製）を用いて約 1 m 1に濃縮した。この精製タンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（SDS) を含むポリアクリルアミドゲルで電気泳動したところ、ほぼ単一に精製されており、得られた全活性は約 310Uであった。

実施例 3

酵素の諸性質の検討

[ァガラーゼ I及ぴァガラーゼ I Iの反応物の同定]

20μ 1の 0. 5% (w/v) のァガロース溶液 [ァガラーゼ I ： 10 mM 塩化ナトリウムを含む 2 OmM Tr i s— HC 1緩衝液 (pH7. 2) 、ァガラーゼ I I ： 1 OmM 塩化カルシウムおよび 1 OmM 塩化ナトリウムを含む

2 OmM Tr i s—HC l緩衝液 (pH7. 2) ] をァガラーゼ I、ァガラーゼ I Iの精製酵素で切断し、その切断産物を溶離液として 70 % ァセトニトリルを用いたゲル濾過カラム（東ソ一社製、 TSKg e l α- 2500) に供した。その結果、ァガラーゼ Iについては主に約 24分、約 28分にピークが見られ、これは標準物質の保持時間からそれぞれネオァガロテトラオース、ネオァガ口へキサオースと考えられた。また、ァガラーゼ I I切断産物は主に約 22分、約 25分、約 29分の保持時間のところにピークが見られ、これは標準物質の保持時間からそれぞれァガロビオース、ァガロテトラオース、ァガ口へキサオースと考えられた。さらにこの反応生成物をクロ口ホルム：メタノール：酢酸 =3 ：

3 ： 1の組成から成る展開溶媒で薄層クロマトグラフィーに供し、 2回展開することで確認した。なおこの際にはァガロビオース（R f O. 76) 、ァガロテトラオース（R fi!O. 50) 、ァガ口へキサオース（R fftO. 33) の 3種類のァガロオリゴ糖、及ぴネオアガロテトラオース（1 £値0. 59) 、ネオアガ口へキサオース（R iO. 41) の 2種類のネオァガロオリゴ糖をコント口ールとした。その結果、ァガラーゼ I反応物はネオァガロオリゴ糖、ァガラーゼ I I反応物はァガロオリゴ糖と同じ位置にオルシノール硫酸による発色物が確認された。これらのことからァガラーゼ Iはァガロース分子中の D—ガラクトースと 3， 6—アンヒドロ一L—ガラクトースとの間の ]3— 1， 4結合をカロ水分角し、ネオァガロオリゴ糖を生産するーァガラーゼであり、ァガラーゼ I Iはァガロース分子中の α— 1 , 3結合を加水分解し、ァガロオリゴ糖を生産する a—ァガラーゼであることが判明した。

[C aイオン要求性]

ァガラーゼ I溶液、ァガラーゼ I I溶液をカルシウムを含まない緩衝液 [ 10 mM 塩化ナトリウムおよび lmM EDTAを含む 20mM T r i s— HC 1緩衝液 (pH7. 2) ] で一晩透析した後、 0. 2% (w/v) ァガロース溶液 [10mM 塩化ナトリウムおよび ImM £0丁を含む20111]^ T r i s— HC 1緩衝液 (pH7. 2) ] を添加し、 50°Cで 10分間反応させた。了ガラーゼ Iについては沸 J3騫水中で 1分間、またァガラーゼ I Iについては 75°C で 1分間カロ熱することにより、反応を停止させた。その後活性測定を行ない、通常のカルシウムを含んだ緩衝液中で反応させた場合の活性を 100%とした場合、ァガラーゼ Iは約 100%、ァガラーゼ I Iは約 60%であった。

圆温度]

酵素の失活が抑制され、速やかに反応が進む温度はァガラーゼ Iが 50〜 6

5°Cであり、ァガラーゼ I Iが 45〜55°Cであった。

[熱安定性]

本酵素溶液を 48°C、 50°C、 5 5°C、 60°C、 65 °Cで一定時間加熱した後、 0. 2% (w/v) ァガロース溶液 [ァガラーゼ Iの場合： 1 OmM 塩化ナトリウムを含む 20mM T r i s— HC 1緩衝液（p H 7. 2) 、ァガラーゼ I

Iの場合： 10mM 塩化カルシウムおよび 1 OmM 塩化ナトリウムを含む 2 OmM T r i s—HC l緩衝液 (pH7. 2) ] を添加し、 50°Cで 10分間反応させ、ァガラーゼ Iについては沸騰水中で 1分間加熱することにより、またァガラーゼ I Iについては 75 °Cで 1分間加熱することにより、反応を停止させた。その後活性測定を行い、通常の 50°Cで 10分間反応させた場合の活性を 1 00 %とした場合、ァガラーゼ Iは 65 °C、 60分間で約 85 %、ァガラーゼ I Iは 55 °C、 10分間で約 40 %であつた。

[分子量]

分子量は S D S—ポリアクリルアミド電気泳動法で測定した。 SDS—ポリアクリルアミド電気泳動法では、常法に従って、 S D Sを含むポリアクリルアミドの濃度が 10〜20%のゲルで、分子量マーカー（バイオラッド社製、分子量 200, 000のミオシン、 1 16, 250の |3—ガラクトシダーゼ、 97， 4 00のフォスフオリラーゼ b、 66， 200のゥシ血清アルブミン、 45, 0 00のォブァノレプミン、 31， 000のカノレポニックアンヒドラーゼ、 21, 5

00のトリプシンインヒビター、 14， 400のリゾチーム）とともに電気泳動を行い、移動度から分子量を求めたところ、ァガラーゼ Iについては約 48， 0 00、ァガラーゼ I Iについては約 1 17， 000であった。

[ァミノ末端アミノ酸配列]

ァガラーゼ I、ァガラーゼ I Iのァミノ末端ァミノ酸配列をェドマン分解法により決定した。それぞれ約 10 pmo 1相当の酵素タンパクを含むァガラーゼ I およびァガラーゼ I Iの精製酵素標品溶液を 10〜 20% ポリアクリルアミド濃度勾配ゲルを用いた S D S— P A G Eに供した。泳動終了後、ゲル上で分離された酵素をプロプロット（アプライドバイオシステムズ社製）なる膜にブロッテイングし、酵素が吸着した部分の膜をプロテインシークェンサ一（G1000A、ヒューレット 'パッカード社製）を用いて分析した。この結果、決定された両酵素のアミノ末端ァミノ酸配列はァガラーゼ I (P 1、配列番号 1 ) が A 1 a -A s p— Xa a— As p— G 1 y— Va 1一 P r o— I l e_P r o— A l a— P r o-A 1 a— G l y、またァガラーゼ I I (P 2、配列番号 2) は G 1 u— T h r— I l e—Va l— L e u—G l n— A 1 a -G l u-S e r-Ph eであつた。

[部分アミノ酸配列の決定]

精製されたァガラーゼ I、 I Iそれぞれ 2 nmo 1を用いて、システィン残基のカルボキシルメチル化を行い、リジルェンドぺプチダーゼで消化し、得られた消化物からぺプチド断片を HP LCで分離精製した。カラムは ^Bo n d a s p h a r e C 8 (ウォーターズ社製）を用い、溶出液は A液： 0. 1% TFA、 B液： 80%ァセトェトリルを含む 0. 1% TFAを使用した。溶出は流速 0. 5m 1/分で 50分間で B液の割合を 0〜100 %まで直線的に増加させることによって行い、 214 nmで検出し、分取した。各ペプチド画分についてァミノ酸配列分析を行い、ァガラーゼ Iについては部分アミノ酸配列 P I 3 (配列番号 3) 、 P I 4 (配列番号 4) 、ァガラーゼ I Iについては P I I 5 (配列番号 5) 、 P I I 6 (配列番号 6) 、 P I I 7 (配列番号 7) を決定した。

実施例 4

ァガロオリゴ糖の製造

2 m 1の反応用緩衝液 [ 10 mM 塩化カルシゥムおよび 10 mM 塩化ナトリウムを含む 20mM T r i s _HC 1緩衝液（pH7. 2) ] に1. 0% (w/v) になるようにァガロース LO 3を加え、さらに約 1. 0Uのァガラーゼ I I精製標品を加えて 50 °Cで 16時間反応させた。反応終了後、反応液を 0. 22 μ mフィルター（ミリポア社製）で濾過した。この反応液を実施例 1記載の本発明の酵素の活性測定において使用したものと同条件の高速液体ク口マトダラフィ一により分析し、生成したァガロオリゴ糖を確認した。この結果、反応液中にァガロビオース、ァガロテトラオース、ァガ口へキサオースが検出され、上記酵素反応により、これらの低分子ァガ口オリゴ糖が生成していることが確認された。

実施例 5

ネオァガロオリゴ糖の製造

2 m 1の反応用緩衝液 [ 10 mM 塩ィ匕ナトリゥムを含む 20 mM Tr i s — HC 1緩衝液 (pH7. 2) ] に 1. 0% (w/v) になるようにァガロース L03をカロえ、さらに約 1. 0Uのァガラーゼ I精製標品を加えて 65 °Cで 16 時間反応させた。反応終了後、反応液を 0. 22μπιフィルター（ミリポア社製）で濾過した。この反応液を実施例 1記載の本発明の酵素の活性測定において使用したものと同条件の高速液体ク口マトグラフィ一により分析し、生成したネオアガロオリゴ糖を確認した。この結果、反応液中にネオァガロテトラオース、ネオァガ口へキサオースが検出され、上記酵素反応により、これらの低分子ネオァガロオリゴ糖が生成していることが確認された。

実施例 6

ァガラーゼ Iを用いたァガロースゲルからの核酸の回収

DNA分子量マーカーであるえ一 H i n d I I I (宝酒造社製）を 1 μ g分、

1. 0% (w/v) S e a P l a qu e G T Gァガロースゲルで電気泳動した。分離した約 4. 4 k b pと約 6. 6 k b pの大きさの DNA断片をゲルごと切り出し、 1. 5m 1容エツペンドルフチューブに入れた。そこに lm 1の反応緩衝液 [50mM 塩化ナトリウムを含む 2 OmM T r i s—HC 1緩衝液（： H 7. 2) ] を添加し、室温で 10分間放置した。その後、緩衝液を廃棄して、ゲルのみを残し、 67 °Cで 5分間保温することによりゲルを融解させた。そこに精製したァガラーゼ I酵素 1. 0Uを加え、さらにそのまま 10分間保温した。エツペンドルフチューブを氷中に入れ、ァガロースゲルが完全に溶解したことを確認した後、常法に従ってエタノール沈殿させ、 DNA断片を回収した。これと同じ方法で DN A分子量マーカーである 100 b pラダーマーカー（宝酒造社製）についても 3. 0% (w/v) Nu s i e v e GTGァガロースゲルからの DNA回収を行った。なお、この際には 400b p、 500 b pの DNA断片を回収した。表 2に DNAの回収率につき市販の P s e u d o a 1 t e r omo n a s a t l a n t i c a由来の ]3—ァガラーゼ（宝酒造社製）との比較を行つた結果を示す。

市販のーァガラーゼを使用した場合、ァガロースゲルを融解させた後、酵素が働くことが出来る温度にまで温度を下げ、その後酵素を添加しなければならず、又反応温度が低いため、長時間反応させる必要があり、操作の所要時間は長くなる。

一方、本発明のァガラーゼ Iを使用した場合は、ァガロースゲルを融解させた後、直ちに酵素を添加することができ、かつ温度を下げることなく高い温度のままで反応を行うことが出来、所要時間は短くてすむ。表 2 回収率 (%) *

マ¹ "~力¹ ~ Γ lE7ΤjΙiΓlΪΤ7 7し *に¾- .Τ Λ

JJ J A ,刀フ ~ 1 p一 ,カフ—i? 断片の大きさ (市販品） λ -Η i n d I I I 4. 4 k b p 78 51

6. D k b p 86 55

100 b pラダー 400 b p 84 32

500 b p 81 45

操作の所要時間 * * 約 30分約 3時間

*回収された DNA量/アプライした DNA量 X100

* *ェタノ一ル沈微までの時間実施例 7

NAB 2- 1 - 1株からの染色体 DN Aの調製

人工海水（商品名ジャマリン S、ジャマリンラボラトリ一社製）を 1リツトル調製し、ペプトン（D I FCO社製）を 0. 3% (w/v) 、酵母エキス（D I FCO社製）を 0. 02% (w/v) となるよう加えた後、 3Mの炭酸ナトリウムで pH7. 8に調整し、これに寒天（ナカライテスタ社製）を 0. 1% (w/ V) になるように加え、オートクレープを用いて滅菌操作を行った。 2mlの培地にァガラーゼ生産菌株である NAB 2— 1— 1をグリセロールストツクより 1

0 μ 1を植菌し、 37 °Cでー晚培養した。得られた培養液の 1 m 1を 100 m 1 の同培地へ植菌し、同じく 37°Cで一 B免培養し、 8， 000 X g_s 10分間遠心することにより菌体を回収した。その菌体を 10mlの緩衝液 A [ 100 mM N a C 1および 1 OmM EDTA (pH8. 0) を含む 10 OmM T r i s —HC l緩衝:液 (pH8. 0) ] に懸濁し、 0. 25mlのリゾチーム溶液 (2

Omg m 1 ) を添加、 37 °C、 1時間ィンキュベートした。次に 2. 5 m 1の 5. 0 % SD S含有緩衝液 Aを加えた後、 60 で 20分間振とうしながらィンキュペートし、 1. 5m 1のプロテアーゼ K溶液（2 Omg/m 1 ) を添加した。その後、 37 °Cで一晩インキュベートし、その溶液に対してほぼ等量のフエノールを加えて室温で約 1 0分間穏やかに振とうした。 2， 000 X g、 1 0 分間遠心し、その上清を冷エタノールに移し、染色体 DNAをガラス棒で卷き取つた。染色体 DN Aを卷き取った後の溶液に、再びほぼ等量のフエノールを加え、同様の操作を行なつて再度染色体 D N Aを巻き取つた。得られた染色体 D N Aを 1 0 μ 1の緩衝液 Aに懸濁し、ここに 50 μ 1の RN a s e A溶液（1 Omg/ m 1 ) を添力 IIした後、 3 7でで 1 0分間ィンキュペートした。この溶液から染色体 DN Aをエタノール沈澱により回収し、 5 m lの緩衝液 B [1 40 mM N a C Iおよび ImM EDTA (pH7. 5) を含む 20mM T r i s—HC l 緩衝液 (p H7. 5) ] に懸濁し、同緩衝液で一晩透析し、約 5. Omgの染色体 DNAを得た。その純度を OD 260 nmZ280 nmで検定したところ、両方共に約 1. 8であり、以下のァガラーゼ I、ァガラーゼ I Iのクローユングに使用した。

実施例 8

ァガラーゼ I遺伝子のクローニング

実施例 3で明らかにされたァガラーゼ Iの N末端側のァミノ酸配列 P 1 (配列番号 1) により、配列表の配列番号 8、 9で表わされる混合プライマー 1、 2をデザインし、 DN A合成機で合成し、精製した。すなわち配列番号 8、 9で表わされる混合プライマー 1、 2はそれぞれアミノ酸配列 P 1のアミノ酸番号 4〜1 0、 4〜1 3のアミノ酸配列に対応している。これらのプライマーを用いて LA PGR i n v i t r o c l o n i n g k i t (宝酒造社製）によりァガラーゼ I遺伝子のクローニングを行なつた。

一次 PC R反応は以下のように行なった。実施例 7で調製した染色体 DN Aを制限酵素 B amH Iで完全消化し、その末端に B amH Iアダプターを DNAラィゲーシヨンキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その一部を 0. 5 m 1容 PCR用チューブにとり、 5 μ 1の 1 0 X LA PGR b u f f e r , 8 μ

1の dNTP混合液、 1 μ 1の混合プライマー 1、 Ι μ ΐのプライマー C I (L A PGR i n v i t r o c l o n i n g k i t (宝酒造社製）に添付のプライマー）、 0. 5 μ 1の T a K a R a LA T a qをカロえ、滅菌水をカロえて 5 0 μ 1としたものを用いた。この溶液に 5 0 μ 1のミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラ一（宝酒造社製）により反応を行なった。反応条件は 94°Cで 2分間変性を行なった後、 94°Cで 1分間（変性） →50°Cで 2分間（プライマーのアニーリング） →72°Cで 2分間（合成反応）のサイクルを 30サイクル行なった。

次にこの反応液をテンプレートとして用い、 2次 PC Rを行なった。 1次 PC

R後の反応液 1 μ 1をテンプレートとし、混合プライマー 2とプライマー C 2

(LA PGR i n v i t r o c l o n i n g k i t (宝酒造社製）に添付のプライマ一）の組み合わせで 1次 P C Rと同様の条件で P C Rを行なった後、上層のミネラルオイルを除去し、次いで 5 1を 1. 0%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムプロミドで DNAを染色し、増幅産物の確認を行なつた。その結果、約 0. 8 k bの DN Αフラグメントが確認され、該 DNAフラグメントを ]3 Nと命名した。

この増幅フラグメント i3Nをァガロースヶレより切り出し、 pT7B 1 u eベクタ一に連結し、大腸菌 JM109を形質転換した。該形質転換体を用いて、増幅フラグメント Nの末端領域の塩基配列をジデォキシチェーンターミネータ一法にて決定し、 N末端側の領域から配列番号 10、 11に示されるプライマー 3、 4を、 N末端側と異なる端の領域より、配列番号 12、 13に示すプライマー 5、 6をデザインし、 DN A合成機で合成し精製した。これらのプライマーを利用して LA PGR i n v i t r o c l o n i n g k i t (宝酒造社製）により同様の操作を行なうことにより ]3 N上流と下流の DNA断片をクローユングした。なおこの際のプライマーのァエーリング条件は 55°Cで 1分間行なった。すなわち上流領域はプライマー 3、 4を利用して、約 0. 6 kbの DNAフラグメントを得、得られた DNAフラグメントを ]3UNとし、またプライマー 5、 6を用いて jSNの下流側の約 1. 3 k bの DN Aフラグメントを )3。とした。 β UN、 C共に; pT7B 1 u eベクター（ノバジェン社製）に連結し、ジデォキシチェーンターミネータ一法で塩基配列を決定した。これら) 3N、 )3 UN, の D Ν Αフラグメントの塩基配列を解析し、重ねあわせた結果、 438個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする O R Fが見出された。

該 O R Fの塩基配列を配列表の配列番号 20に、該 O R Fの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号 22に示す。なお UN中にァミノ酸配列 P 1部分の塩基配列が存在し、またアミノ酸配列 P 1より上流に 20個のアミノ酸をコードする塩基配列が存在し、そのさらに上流に SD様配列が見出された。なお、実施例 3で明らかにされた N末端アミノ酸配列 P 1は、配列番号 2 2の 2 1〜 3 3番目のアミノ酸に相当する配列であった。また、実施例 3で明らかにされた部分アミノ酸配列 P I 3 (配列番号 3) 、 P I 4 (配列番号 4) は、それぞれ配列表の配列番号 2 2の 26 5〜 2 7 2番目、 36 7〜3 76番目のァミノ酸に一致した。

実施例 9

ァガラーゼ I I遺伝子のクロー-ング

実施例 3で明らかにされたァガラーゼ I Iの N末端側のァミノ酸配列 P 2 (配列番号 2) 、 P I 1 6 (配列番号 6) により、お互いに異なる鎖にハイブリダィズするように配列表の配列番号 1 4、 1 5で表わされる混合プライマー 7、 8をデザインし、 DN A合成機で合成し、精製した。

すなわち配列番号 14で表わされる混合プライマー 7はアミノ酸配列 P 2のァミノ酸番号 1〜 8に、配列番号 1 5で表される混合ブライマ一 8はァミノ酸配列 P I I 6のアミノ酸番号 2〜1 0をコードする DNAの相補鎖に対応している。これらのプライマーを用いて LA PGR i n v i t r o c l o n i n g k i t (宝酒造社製）によりァガラーゼ I I遺伝子のクローユングを行なつた。

—次 PC R反応は以下のように行なった。実施例 7で得られた NAB 2- 1 - 1の染色体 DNA 1 011 _§を0. 5m 1容 PCRチューブにとり、 5 1の 1 O X LA PGR b u f f e r、 8 μ 1の dNTP混合液、それぞれ 40 p mo 1分の混合プライマー 7及び 8、 0. 5 μ 1の T a Ka R a LA T a q を加え、滅菌水を加えて 5 0 ί 1とした。この溶液に 50 μ 1のミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラ一（宝酒造社製）により反応を行なった。反応条件は 94でで 2分間変性を行なった後、 94 で 1分間

(変性） → 50でで 2分間（プライマーのァエーリング） →7 2 で 2分間（合成反応）のサイクルを 30サイクル行なった。上層のミネラルオイルを除去し、次いで 5 1を 1. 0%ァガロースゲノレ電気泳動に供し、ェチジゥムブ口ミドで DNAを染色し、増幅産物の確認を行なった。その結果、約 600 b pの DNA フラグメントが確認され、該 DNAフラグメントを αΝと命名した。

この増幅フラグメント αΝをァガロースゲより切り出し、 pT7B 1 u eベクタ一に連結し、大腸菌 JM109を形質転換した。該形質転換体を用いて、増幅フラグメント αΝの末端領域の塩基配列をジデォキシチェーンターミネータ一法にて決定し、 Ν末端側の領域から配列番号 16、 17に示されるプライマー 9、 10を Ν末端側と異なる端の領域より、配列番号 18、 19に示すプライマー 1 1、 12をデザインし、 DN Α合成機で合成し精製した。これらのプライマーを利用して L A PGR i n v i t r o c l o n i n g k i t (宝酒造社製）により同様の操作を行なうことにより、 a N上流と下流の DN A断片をクロ一ユングした。

その際の P C R反応は以下のように行なった。実施例 7で調製した N A B 2 - 1-1染色体 DNAを制限酵素 B a mH Iで完全消化し、その末端に B a mH I アダプターを DNAライゲーシヨンキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その一部を 0. 5m 1容 P CR用チューブにとり 5 μ 1の 10 X LA P CR b u f f e r, 8 μ 1の dNTP混合液、 Ι μ ΐのプライマー 9、 1 μ 1のプライマ一 C l、 0. 5 1の丁&1：&1 & LA T a qを力 Bえ、滅菌水を力 tlえて 50 μ 1としたものを用いた。この溶液に 50 μ 1のミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラ一（宝酒造社製）により反応を行なつた。反応条件は 94 °Cで 2分間変性を行なつた後、 94 で 1分間（変性） → 5 0°Cで 2分間 (プライマーのァニーリング) →72°Cで 3分間（合成反応）のサィクルを 30サイクル行なつた。

次にこの反応液をテンプレートとして用い、 2次 PCRを行なった。 1次 PC R後の反応?夜 1 1をテンプレートとし、プライマー 10とプライマー C 2の組み合わせで 1次 P C Rと同様の条件で P C Rを行なった後、上層のミネラルォィルを除去し、次いで 5 i 1を 1. 0%ァガロースゲル電気泳動に供し、ェチジゥムプロミドで DNAを染色し、増幅産物の確認を行なった。その結果、約 50 0 b pの DNAフラグメントが確認され、該 DNAフラグメントをひ UNと命名 Lた Γ

同様にしてプライマー 11、 12を用いて得られたの下流側の約 2 k の DNAフラグメントを a Cとした。 ctUN、 C共に p T 7 B 1 u eベクター（ノバジェン社製）に連結し、ジデォキシチェーンターミネータ一法で塩基配列を決定した。これら Q;N、 aUN、ひ Cの DNAフラグメントの塩基配列を解析し、重ねあわせた結果、 1089個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする OR Fが見出された。

該 O R Fの塩基配列を配列表の配列番号 21に、該 O R Fの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号 23に示す。なお aUN中にァミノ酸配列 P 2部分の塩基配列が存在し、またアミノ酸配列 P 2より上流にシグナノレぺプチド様配列をもった 26個のアミノ酸をコードする塩基配列が存在し、そのさらに上流に S D様配列が見出された。

なお、ァミノ酸配列 P 2は、配列番号 23の 27〜 36番目のァミノ酸に相当する配列であった。また、実施例 3で明らかにされた部分アミノ酸配列 P I I 5 (配列番号 5) 、 P I I 6 (配列番号 6) 、 P I I 7 (配列番号 7) は、それぞれ配列表の配列番号 23の 129〜138番目、 640〜649番目、 738〜 747番目のアミノ酸に一致した。

また、推定 C a結合領域が、配列表の配列番号 23の 171〜 184番目、 2 71〜283番目、 987〜999番目の 3力所に見出された。

実施例 10

ァガラーゼ Iを発現するプラスミドの構築

プライマー 13 (配列番号 24) は制限酵素 E c oR Iの認識配列を塩基番号 12〜17に持ち、さらにアミノ酸配列（配列番号 22) のアミノ酸番号 21〜 27に相当する塩基配列を塩基番号 19〜38に持つ合成 DNAである。これと制限酵素 P s t Iの認識配列を塩基番号 11〜 16にもち、染色体上のァガラーゼ Iの読み枠から約 300 b p下流の相補鎖にハイブリダィズするプライマー 1 4 (配列番号 25) を用いて、以下のように PCRを行った。 0. 5ml容 PC R用チューブにプライマー 13、 14を l O pmo 1ずつ、テンプレートとして NAB 2— 1 _ 1株由来の染色体 DNA 10ng、 5 / lの Ι ΟΧΕχ T a q緩衝液、 8 μ 1の dNTP混合液、 0. 5μ 1の TaKaRa Ex T a qを加え、滅菌水を加えて 5 1とした。これを自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラ一（宝酒造社製）にセットし、 94 °Cで 2分間変性を行った後、 94°C で 1分間→ 55 °Cで 2分間→ 72でで 2分間のサイクルを 25サイクノレ行つた。この PCR産物をエタノール沈澱により濃縮、脱塩し、制限酵素 Ec oR I (宝酒造社製）及び P s t I (宝酒造社製）で二重消化し、 1. 0%ァガロース電気泳動によりその Ec oR I— P s t I消化物を抽出精製した。この精製したものと同酵素で消化した PUC 18 (宝酒造社製）を混合し、 DNAライゲーシヨンキット（宝酒造社製）を用いて連結した。その後、ライゲーシヨン反応液 1 Ομ 1を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、その形質転換体を 1. 5% (w/ v) 濃度の寒天を含む LB培地（アンピシリン 50 x gZm l含む）上で生育させた。白色を呈したコロニーからプラスミドを調製し、 DNAシークェンシングを行ない、正しく PC R産物が挿入されたプラスミドを選択し、これを pNB l 01と命名した。 p NB 101は、ァガラーゼ Iのァミノ酸配列（配列番号 2 2) のアミノ酸番号 21〜437のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。プラスミド p NB 101で形質転換された大腸菌は、 E s c h e r i c h i a c o 1 i JM109/pNB 101と命名され、平成 13年 1月 10日（原寄託日）より、曰本国〒 305— 8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号 FER M B P— 7854として寄託されている。

この pNB 101を導入した形質転換体を 2. 5mlの LB液体培地（アンピシリン 50 μ g/m 1を含む）に植菌し、 37 °Cで一晚培養した。この一部を新たに 2. 5mlの同培地に植菌し、 37 °Cで対数増殖期まで培養した。ここで I ?丁0を終濃度1. OmMになるように添加し、培養温度を 20°Cにしてさらに 2時間培養して目的タンパク質を発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、 150 μ 1の細胞破砕溶液 [1 OmM 塩化ナトリゥムを含む 20 mM T r i s—HC l緩衝液 (pH7. 2) ] に再懸濁した。超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄みの抽出液と沈澱とに分離した。それぞれを試料としてァガロースを基質とした；8—ァガラーゼ活性を測定したところ、上清抽出液に活性が確認された。なお、この活性は 100m lの培養液当たりの活性で比較した場合、野性株である NAB 2— 1—1のもつ活性の約 25倍であつた。

実施例 11

ァガラーゼ Iの p ET 16 bを用いた発現系

実施例 10に準じた条件で、ァガラーゼ Iのァミノ酸配列（配列番号 22 ) のアミノ酸番号 21〜27に相当する塩基配列を塩基番号 20〜39にもち、さらに制限酵素 N d e Iの認識配列を塩基番号 14 ~ 19にもつプライマー 15 (配列番号 26 ) と制限酵素 X h o Iの認識配列を塩基番号 12〜 17にもち、染色体 DNA上のァガラーゼ Iの読み枠から約 300 b p下流の相捕鎖にハイブリダィズするプライマー 16 (配列番号 27) を用いて、 NAB 2— 1—1株の染色体 DNAをテンプレートとして用いた PCRを行った。その増幅断片をエタノール沈澱により濃縮後、 Nd e I (宝酒造社製）及び Xh o I (宝酒造社製）切断し、抽出精製した。これを同酵素で切断した pET l 6 b (宝酒造社製）に連結し、これを pNB 201と命名した。： NB 201は、ァガラーゼ Iのアミノ酸配列（配列番号 22) のァミノ酸番号 21〜 437のァミノ酸配列をコ一ドするプラスミドである。

この pNB 201で大腸菌 B L 21 (DE 3) p L y s Sを形質転換して得られた形質転換体を用いて、実施例 10と同様に βーァガラーゼの活性を測定したところ、その抽出液に活性が確認された。これは 100m 1の培養液当たりの活性で比較した場合、 NAB 2— 1一 1のもつ活性の約 50倍であった。

実施例 12

ァガラーゼ I Iを発現するプラスミドの構築

プライマー 17 (配列番号 28) は制限酵素 Ec oR Iの認識配列を塩基番号 10〜15に持ち、さらにァガラーゼ I Iのアミノ酸配列（配列番号 23) のァミノ酸番号 27〜33に相当する塩基配列を塩基番号 17〜37に持つ合成 DN Aである。これと制限酵素 B a mH Iの認識配列を塩基番号 11〜 16にもち、なおかつ染色体上のァガラーゼ I Iの読み枠から約 250 b p下流とハイプリダィズするプライマー 18 (配列番号 29) を用いて PCRを行った。この PCR にはプライマー 17、 18を10 1110 1ずっ、テンプレートとして野生株である NAB 2— 1— 1由来の染色体 DNA 10 n gを用いた。 Ex T a q (宝酒造社製）を用いた反応系で、条件は 94 °Cで 2分間変性を行つた後、 94でで 1分間→ 50でで 2分間→ 72 °Cで 3分間のサイクルを 30サイクノレ行つた。この P C R産物をエタノール沈澱により濃縮し、制限酵素 E c oR I (宝酒造社製）及び B amHI (宝酒造社製）で二重消化し、 1. 0%ァガロース電気泳動により、その Ec oR I— B amHI消化物を抽出精製した。実施例 10と同様にして pUC 18とのハイプリッドプラスミドを作製し、大腸菌 JM109を形質転換した。このハイブリッドプラスミドを pNAl 01と命名した。 pNAl 01は、ァガラーゼ I Iののアミノ酸配列（配列番号 23) のァミノ酸番号 27 〜1089のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。

プラスミド p NA 101で形質転換された大腸菌は、 E s c h e r i c h i a c o l i JM109/pNAl 01と命名され、平成 13年 1月 10日（原寄託 S) より、日本国〒 305— 8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号 FER M BP— 7853として寄託されている。

この p NA 101を導入した形質転換体について、細胞破碎液中に 1 OmM 塩化カルシウムを含む以外は実施例 10と同様にして a—ァガラーゼ活性を測定したところ、その抽出液に活性が存在した。これは 100mlの培養液当たりの活性で比較した場合、野性株である NAB 2-1- 1のもつ活性の約 15倍であつた。

実施例 13

ァガラーゼ I Iの欠失タンパク質の活性

遺伝子工学的手法により、以下に示す改変タンパク質を作製し、それぞれについて α _ァガラーゼ活性を確認した。

プライマー 19 (配列番号 30) は、ァガラーゼ I Iのアミノ酸配列（配列番号 23 ) のァミノ酸番号 181〜 188に相当する塩基配列を塩基番号 19 ~ 4 0にもち、さらに制限酵素 E c oR Iの認識配列を塩基番号 12〜 17にもつ。これとプライマー 18 (配列番号 29) を用いて、 NAB 2— 1— 1の染色体 DNAをテンプレートとした PCRを行い、実施例 12と同様にして pUC 18 へ連結し、大腸菌 JM109を形質転換した。 D N Aシークェンシングにより連結部分の配列を確認して、得られたハイブリッドプラスミドを pNA201 dとした。これから発現されるタンパク質は、ァガラーゼ I Iのアミノ酸配列（配列番号 23) のアミノ酸番号 180番目までが欠失したものである。即ち、 pNA 201 dはァガラーゼ I Iのァミノ酸配列（配列番号 23) のァミノ酸番号 18

1〜 1089のアミノ酸配列をコードするプラスミドである。これを細胞破碎液中に 1 OmM 塩化カルシウムを含む以外は実施例 10と同様にして I PTGで発現誘導させ、活性を測定したところ、その抽出液に a—ァガラーゼの活性が存在した。これは 100 m 1培養液当たりの活性で比較した場合、 N A B 2— 1— 1のもつ活性の 2倍程度であつた。

プライマー 20 (配列番号 31) は、ァガラーゼ I Iのアミノ酸配列（配列番号 23 ) のァミノ酸番号 318〜 325に相当する塩基配列を塩基番号 19〜 4 0にもち、さらに制限酵素 E c o R Iの認識配列を塩基番号 12〜 17にもつ。これとプライマー 18 (配列番号 29) を用いて NAB 2— 1— 1の染色体 DN Aをテンプレートとした P CRを行い、 pUC 18とのハイブリッドプラスミド

(pNA3 O l d) を作製した。この pNA301 dを導入した大腸菌 JM10 9力らは、ァガラーゼ I Iのアミノ酸配列（配列番号 23) のアミノ酸番号 31 7までのペプチドが欠失したタンパク質が発現される。即ち、 pNA301 dはァガラーゼ I Iのァミノ酸配列（配列番号 23 ) のアミノ酸番号 318〜 108 9のァミノ酸配列をコ一ドするブラスミドである。これを細胞破碎液中に 10 m

M 塩化カルシゥムを含む以外は実施例 10と同様にして活性を確認したところ、その抽出液にひーァガラーゼの活†生が存在した。これは 100ml培養液当たりの活性で比較した場合、 NAB 2— 1— 1のもつ活性の約 15倍であった。またこの pNA301 dを導入した形質転換体からの抽出液を、まったくカルシウムを含まない緩衝液 [1 OmM 塩化ナトリウムおよび ImM EDTA (pH7.

2) を含む 20mM Tr i s— HC 1緩衝液 (pH7. 2) ] で透析した後、 0. 2%ァガロース溶液 [1 OmM 塩化ナトリウムおよび ImM EDTA (ρΗ7. 2) を含む 2 OmM T r i s _HC 1緩衝液（ p H 7. 2) ] を反応させたところ、カルシウムを含んだ緩衝液中と同様に切断活性を示した。実施例 14

Ag a r AC E酵素（プロメガ社製）との比較プロメガ社から発売されている ma r i n e F l a v o b a c t e r i urn 由来 l3—ァガラーゼである A g a r ACE酵素と本発明のァガラーゼ Iにっき、その酵素化学的性質を比較検討した。

熱溶解した 1. 0% (w/v) Nu S i e V e GTGァガロース [20mM T r i s _HC 1緩衝液（pH7. 3) ] (FMC社製） 40 μ 1に、 Ι Ο μ Ι のァガラーゼ Iまたは A g a r AC E酵素（プロメガ社製）（添付のデータシートより 0. 29ユニット分）を添加し、 45°C、 50°C、 5 5°C、 60°C、 6 5°Cで 10分間反応させた。この際、予め両酵素の活性を実施例 1に記載の方法で測定しておき、各々の反応において酵素活性量が同じになるようにそれぞれの酵素を添加した。反応後、実施例 1に記載の方法で酵素活性を算出した。最大酵素活性を 1 00 %とした場合の相対値で表した結果を表 3に示した。この結果から明らかなようにァガラーゼ Iの至適温度は 50 °C〜 6 5 °Cであり、 A g a r A CE酵素は 45°C〜50°Cであった。表 3

相対活性 (%)

45°C 50°C 55。C 60°C 65°C 70°C ァガラーゼ I 8 9 9 7 100 100 100 9 5

A g a r ACE 100 98 84 2 5 1 1 0 [耐熱性]

60°Cまたは 65 °Cで各時間保温したァガラーゼ Iもしくは Ag a r ACE酵素（添付のデータシートより 0. 29ユニット分） 10 μ 1を、あらかじめ熱融解した 1. 0% (w/v) Nu S i e V e GTGァガロース [2 OmM T r i s _HC l緩衝液 (pH7. 3) ] (FMC社製） 0 μ 1に添カロした。なおこの際、上記と同様に、各々の反応における酵素活性量は同一とした。その後、ァガラーゼ Iについては 55°Cで 10分間、 Ag a r ACE酵素については 4 5°Cで 10分間反応させ、これを実施例 1に記載の方法で酵素活性を算出し、非カロ熱時の活性を 100 %とした場合の相対値で表した結果を表 4に示した。この結果から明らかなようにァガラーゼ Iでは、 65°C、 30分間保温でほぼ 10 0%の活性を維持しているのに対し、 Ag a r ACE酵素は 65°Cで 10分間保温するとほぼ完全に失活した。表 4 残存活性 (%)

保温時間（分) 0 0 20 30 ァガラーゼ I

( 60。C) 00 00 00 98 ( 65 °C) 00 00 95 90

Ag a r ACE

( 60。C) 00 81 48 2 ( 65 °C) 00 3 0 0 実施例 15

カルシウムによる酵素の熱安定性の変化

実施例 1 1記載の p N A 101、又は実施例 13に記載の p N A 301 dで形質転換した大腸菌 JM109を 2. 5m 1の LB液体培地（アンピシリン 50 μ g/m 1を含む) に植菌し、 37 °Cで一 B免培養した。次に、この培養液の一部を 100 m 1の同培地に植菌し、 37 °Cで対数増殖期まで培養した。ここで I P TGを終濃度 1. OmMとなるように添加し、培養温度を 20°Cにして更に 2 時間培養し、目的のタンパク質の発現を誘導した。その後、菌体を遠心分離により回収し、 5m lの細胞破碎溶液 [1 OmM 塩ィ匕ナトリウムおよび 1 mM 塩化カルシウムを含む 2 OmM Tr i s— H C I緩衝液 (ρΗ7. 2) ] に懸濁した。超音波により菌体を破碎し、遠心分離により上澄みを回収し、該上澄みの aーァガラーゼ活性を測定後、両サンプルの容積あたりの酵素活性が同じになるよう細胞破砕溶液で希釈した。このようにして得られた各々の酵素の抽出液を、カルシウムを含む緩衝液 A [ 10 mM 塩化ナトリウムおよび 10 mM 塩化力ルシゥムを含む 20mM Tr i s— HC 1緩衝液 (pH7. 2) ] 、または力ルシゥムを含まない緩衝液 B [1 OmM 塩化ナトリウムおよび ImM EDT A (pH7. 2) を含む 2 OmM Tr i s _HC 1 (pH7. 2) ] で一 B免透析した。それぞれの酵素液 20 /1 1を 55°C、 50°Cで 10分間保温後、 18 0 μ 1の 0. 2 %ァガロース溶液 ( 10 mM 塩化ナトリゥムを含む 20 mM Tr i s— HC 1緩衝液 (pH7. 2) ) と反応させ、残存するァガラーゼ活性を実施例 1に記載の方法で測定した。結果を表 5に示す。

なお、対照として、 NAB 2— 1— 1より得られた天然型ァガラーゼ I Iを用いた。表 5

残存活性 (%) *

処理温度 50°C 55。C

A B A B

天然型ァガラーゼ I I 100 56 42 10

NAl 01 100 60 45 15 pNA3 O l d 100 58 70 12

*各々の酵素の 50°C、緩衝液 Aでの残存活性を 100とした実施例 15

ァガラーゼ I Iの欠失タンパク質の活性

遺伝子工学的手法により、以下に示す改変タンパク質を作製し、それぞれについて a—ァガラーゼ活性を確認、した。

プライマー 21 (配列番号 34) は、ァガラーゼ I Iのアミノ酸配列（配列番号 23) のァミノ酸番号 290〜 297に相当する塩基配列を塩基番号 19〜 4

0にもち、さらに制限酵素 E c oR Iの認識配列を塩基番号 12〜 17にもつ。このプライマー 21とプライマー 18 (配歹 (J番号 29) を用いて、 NAB 2— 1一 1の染色体 DN Aをテンプレートとした PC Rを行い、実施例 12と同様にして: p U C 18へ連結し、大腸菌 JM109を形質転換した。 D N Aシークェンシングにより連結部分の配列を確認して、得られたハイブリッドプラスミドを！） NA401 dとした。これから発現されるタンパク質は、ァガラーゼ I Iのアミノ酸配列（配列番号 23) のァミノ酸番号 289番目までが欠失したものである。即ち、 pNA401 dはァガラーゼ I Iのアミノ酸配列（配列番号 23) のアミノ酸番号 290〜 1089のァミノ酸配列をコードするプラスミドである。実施例 13で得られた： N A 301 d、又は上記した p N A 401 dで形質転換した大腸菌 JM109を 2. 5 m 1の LB液体培地（アンピシリン S OAi gZml を含む）に植菌し、 37°Cで一晚培養した。次に、この培養液の一部を 10 Om

1の同培地に植菌し、 37 °Cで対数増殖期まで培養した。ここで I PTGを終濃度 1. OmMとなるように添加し、培養温度を 20 °Cにして更に 2時間培養し、目的のタンパク質の発現を誘導した。その後、菌体を遠心分離により回収し、 5 m 1の細胞破碎溶液 [ 10 mM 塩化ナトリゥムおよび 10 mM 塩化カルシゥムを含む 20mM Tr i s— HC 1緩衝液 (pH7. 2) ] に懸濁した。超音波により菌体を破碎し、遠心分離により上澄みを回収し、該上澄みのひ一ァガラーゼ活性を測定後、両サンプルの容積あたりの酵素活性が同じになるよう細胞破砕溶液で希釈した。それぞれの酵素液 20 μ 1を 55°C、 60°Cで 10分間保温後、 180 μ 1の 0. 2 %ァガロース溶液 ( 10 mM 塩ィ匕ナトリウムを含む 2 OmM Tr i s—HC l緩衝液 (pH7. 2) ) と反応させ、残存するひ一ァガラーゼ活性を実施例 1に記載の方法で測定した。結果を表 6に示す。この結果より、 pNA401 dは pNA301 dと同等もしくはそれ以上の耐熱性を有することが明らかとなった。

なお、対照として、 NAB 2— 1— 1より得られた天然型ァガラーゼ I Iを用いた。表 6 残存活性 (%) *

処理温度 55°C 60。C

天然型ァガラーゼ I I 42 0

pNA3 O l d 70 31

pNA401 d 79 39

*各々の酵素の 50°Cでの残存活性を 100とした _c また、 I PTGによる誘導条件を 37°Cで一 B免行い、同様にして超音波により菌体を破砕し、遠心分離により上澄みを回収した。該上澄みのタンパク質量を定量し、同じタンパク質量となるように SDS— PAGEに供した。また上澄み回収時の沈殿を細胞破碎溶液に懸濁し、同様にして S D S— P A G Eに供した。その結果、 pNA401 dにおいては該誘導条件で上澄みに回収される目的タンパク質が天然型、 pNA301 dに比べて多いことが明らかとなった。即ち、 pN A401 dで形質転換した大腸菌 JM109で発現誘導される α—ァガラーゼ変異体は可溶化しゃすレ、ことが示された。産業上の利用の可能性

本発明により、新規なァガラーゼが提供される。本発明のァガラーゼは、従来知られていたァガラーゼょりも至適温度が高く、また耐熱性にも優れていること力、高温での反応が可能であり、ァガロースが高濃度で存在する場合でも、固形化することなく反応させることができるという優れた効果を有する。

本発明のァガラーゼを用いることにより、重合度が低く、還元末端に 3， 6- アンヒドロー L—ガラクトースを有するァガロオリゴ糖、たとえばァガロビオース、ァガロテトラオース、または、非還元末端に 3， 6—アンヒドロー Lーガラクトースを有するネオァガロオリゴ糖、たとえばネオアガロビオース、ネオァガロテトラオースをァガロースから直接、力つ効率よく生産することが可能となる。また、本発明のァガラーゼを用いることにより、ァガロースゲルからの核酸等の抽出を効率よく行なうことが出来る。本発明のァガラーゼを使用して製造されたァガロオリゴ糖は、アポトーシス誘発作用、制ガン作用、各種の抗酸化作用、免疫調節作用、抗アレルギー作用等の生理活性を有しており、医薬品、飲食品の分野で有用である。

また、本発明によりァガラーゼのアミノ酸および塩基配列が初めて明らかとなり、ァガラーゼ活†生を有するポリぺプチドをコ一ドする遺伝子を提供することが可能となった。また該遺伝子を用いるァガラーゼ活を有するポリべプチドのェ業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。

さらに、該遺伝子を用いる遺伝子工学的製造方法においてはァガラーゼの誘導生産のために培地にァガロースを添加する必要がないため培養時の手間を省くことが出来、また酵素精製も容易であると考えられる。

さらにまた、本発明により、初めてァガラーゼ遺伝子が提供されたことにより、該遺伝子の情報をもとにして、そこにコードされる組換えポリぺプチドぉよび該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片、ァガラーゼに特異的にハイブリダイズするプローブゃブラィマーが提供される。配列表フリーテキスト

SEQ ID o : l : N -" terminal amino acid sequence of agarase I

SEQ ID No :2 : N - terminal amino acid sequence of agarase II

SEQ ID No : 3 : Partial amino acid sequence of agarase I

SEQ ID No :4: Partial amino acid sequence of agarase I

SEQ ID No :5 : Partial amino acid sequence of agarase II

SEQ ID No :6 : Partial amino acid sequence of agarase II

SEQ ID No:7 : Partial amino acid sequence of agarase II

SEQ ID No :8 : PCR primer 1

SEQ ID No :9 : PCR primer 2

SEQ ID No：10： PCR primer 3

SEQ ID No : 11 : PCR primer 4

SEQ ID No : 12： PCR primer 5

SEQ ID No : 13 : PCR primer 6 SEQ ID No：14： PCR primer 7

SEQ ID No :15: PCR primer 8

SEQ ID No :16: PCR primer 9

SEQ ID No: 17: PCR primer 10

SEQ ID No: 18: PCR primer 11

SEQ ID No :19: PCR primer 12

SEQ ID No :20: Nucleotide sequence of ORF in agarase I

SEQ ID No :21: Nucleotide sequence of ORF in agarase II

SEQ ID No :22: Amino acid sequence of agarase I

SEQ ID No :23: Amino acid sequence of agarase II

SEQ ID No :24： PCR primer 13

SEQ ID No :25: PCR primer 14

SEQ ID No :26: PCR primer 15

SEQ ID No :27: PCR primer 16

SEQ ID No :28: PCR primer 17

SEQ ID No :29: PCR primer 18

SEQ ID No :30： PCR primer 19

SEQ ID No :31: PCR primer 20

SEQ ID No :32: Designed oligoucleotide primer for amplifying DNA fragment from 16S ribosoraal

SEQ ID No :33： Designed oligoucleotide primer for amplifying DNA fragment from 16S ribosomal

SEQ ID No.34： PCR primer 21

Claims

請求の範囲

1. 配列表の配列番号 22に示されるァミノ酸配列のうちのァミノ酸番号 21 ~437の 417残基からなるアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列に 1個以上のァミノ酸の置換、欠失、付加もしくは揷入の少なくとも 1つが導入されたァミノ酸酉 S列を含む、 D—ガラクトースと 3， 6—アンヒドロー L—ガラクトースとの間の一 1， 4結合を加水分解する活性を有することを特徴とするァガラーゼ。

2. 微生物 NAB 2— 1— 1 (FERM BP— 7855) より得ることのできる請求項 1記載のァガラーゼ。

3. 請求項 1記載のァガラーゼをコードする遺伝子。

4. 微生物 NAB 2— 1— 1 (FERM BP— 7855) より得ることのできる請求項 3記載の遺伝子。

5. 配列表の配列番号 20に示される塩基配列のうちの塩基番号 61〜 131 1の 1251塩基からなる塩基配列、または該 1251塩基からなる塩基配列に

1個以上の塩基の置換、欠失、付加もしくは揷入の少なくとも 1つが導入された塩基配列を含む請求項 3記載の遺伝子。

6. 請求項 3記載の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ D—ガラタト一スと 3， 6—アンヒドロー L一ガラクトースとの間の ]3— 1， 4結合を力 R7_R分解する活性を有するァガラーゼをコードする遺伝子。

7. 以下のいずれかの遺伝子を含む,袓換え DN A分子：

( a ) 配列表の配列番号 22に示されるァミノ酸配列のうちのァミノ酸番号 21 〜437の 417残基からなるアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列に 1個以上のァミノ酸の置換、欠失、付加もしくは揷入の少なくとも 1つが導入されたァミノ酸配列を含む、 D—ガラクトースと 3， 6—アンヒドロー L—ガラクトースとの間の ]3— 1， 4結合を加水分解する活性を有することを特徴とするァガラーゼをコードする遺伝子；または

(b) (a) の遺伝子とストリンジェントな条件でハイプリダイズすることができ、かつ D—ガラクトースと 3， 6—アンヒドロー L一ガラクトースとの間の ;3 一 1， 4結合を加水分解する活性を有するァガラーゼをコ一ドする遺伝子。

8. 請求項 7記載の組換え D N A分子を有する形質転換体。

9. 微生物 NAB2— 1—1 (FERM BP— 7855) を培養する工程、および培養物から該ァガラーゼを採取する工程を包含することを特徴とする請求項 1記載のァガラーゼの製造方法。

10. 請求項 8記載の形質転換体を培養する工程、および該培養物からァガラーゼを採取する工程を包含することを特徴とするァガラーゼの製造方法。

1 1. 請求項 1記載のァガラーゼによりァガロースゲルを分解する工程を包含することを特徴とするァガロースゲルよりの物質の抽出方法。

12. 請求項 11のァガロースゲルよりの物質の抽出方法に使用されるキットであって、請求項 1記載のァガラーゼを含有することを特徴とするキット。

1 3. 配列表の配列番号 23に示されるァミノ酸配列のうちのァミノ酸番号 3 18〜1089の 772残基からなるアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列に 1個以上のァミノ酸の置換、欠失、付加もしくは揷入の少なくとも 1つが導入されたアミノ酸配列を含む、 3, 6—アンヒドロ一 L一ガラクトースと D—ガラクトースとの間のひ _ 1 , 3結合をカロ水分解する活性を有することを特徴とするァガラーゼ。

14. 微生物 NAB 2—1— 1 (FERM BP— 7855) より得ることのできる請求項 13記載のァガラーゼ。

15. 請求項 13記載のァガラーゼをコードする遺伝子。

16. 微生物 NAB2— 1—1 (FERM BP— 7855) より得ることのできる請求項 15記載の遺伝子。

1 7. 配列表の配列番号 21に示される塩基配列のうちの塩基番号 952〜3 267の 2316塩基からなる塩基配列、または該 2316塩基からなる塩基配列に 1個以上の塩基の置換、欠失、付カ卩もしくは挿入の少なくとも 1つが導入された塩基配列を含む請求項 15記載の遺伝子。

18. 請求項 15記載の遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができ、かつ 3， 6—アンヒドロー L一ガラクトースと D—ガラクトースとの間の一 1 , 3結合を加水分解する活性を有するァガラーゼをコ一ドする遺伝子。

19. 以下のいずれかの遺伝子を含む組換え DN A分子：

( a ) 配列表の配列番号 23に示されるァミノ酸配列のうちのァミノ酸番号 31 8〜1089の 772残基からなるアミノ酸配列、もしくは該アミノ酸配列に 1 個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは揷入の少なくとも 1つが導入されたアミノ酸酉己列を含む、 3， 6_アンヒドロー L—ガラクトースと D—ガラタトースとの間のひ一 1， 3結合を加水分解する活性を有することを特徴とするァガラーゼをコ一ドする遺伝子；

( b ) (a) の遺伝子とストリンジェントな条件でハイプリダイズすることができ、かつ 3， 6—アンヒドロー L一ガラクトースと D—ガラクトースとの間のひ一 1， 3結合を加水分解する活性を有するァガラーゼをコ一ドする遺伝子。

20. 請求項 19記載の組換え DNA分子を有する形質転換体。

21. 微生物 NAB 2— 1—1 (FERM BP— 7855) を培養する工程、および培養物から該ァガラーゼを採取する工程を包含することを特徴とする請求項 13記載のァガラーゼの製造方法。

22. 請求項 20記載の形質転換体を培養する工程、および該培養物からァガラーゼを採取する工程を包含することを特徴とするァガラーゼの製造方法。

23. 請求項 13記載のァガラーゼによりァガロースを分解する工程、および該分解物よりァガロオリゴ糖を採取する工程を包含することを特徴とするァガロオリゴ糖の製造方法。

24. ァガラーゼの N末端側の 30 %までのポリぺプチドを欠失させる工程を包含することを特徴とする請求項 13記載のァガラーゼの熱安定性の向上方法。

25. 配列番号 23に示されるァミノ酸配列のァガラーゼの N末端側の 30 % までのポリぺプチドを欠失させることを特徴とする請求項 24記載のァガラーゼの熱安定性の向上方法。

26. D—ガラクトースと 3' 6—アンヒドロ一 L一ガラクトースとの間の ]3 一 1， 4結合を加水分解する活性を有し、かつ反応至適温度が 55〜 65 °Cであることを特徴とするァガラーゼ。

27. 3， 6—アンヒドロ一 L一ガラクトースと D—ガラクトースとの間の一 1， 3結合を加水分解する活性を有し、かつ反応至適温度が 4 5〜 5 5 °Cであることを特徴とするァガラーゼ。