JP2018085962A - L−リシンα−オキシダーゼの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a) 配列番号1に記載される塩基配列からなる核酸
(b) 配列番号1に記載される塩基配列と80%以上の同一性を有し、且つL-リシンα-オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸。
項2.項1に記載の核酸を含む発現ベクター。
項3.項1に記載の核酸が導入された形質転換体。
項4.宿主が大腸菌である、項3に記載の形質転換体。
項5.以下の工程を含む、L-リシンα-オキシダーゼの製造方法:
(1) 項3又は4に記載の形質転換体を液体培地で培養し、培養物からL-リシンα-オキシダーゼを回収する工程。
項6.以下の工程を含む、L-リシンα-オキシダーゼの製造方法:
(1) 配列番号2に記載される塩基配列をコドン最適化したコドン最適化核酸が導入された形質転換体を液体培地で培養し、培養物からL-リシンα-オキシダーゼを回収する工程であって、該形質転換体はL-リシンα-オキシダーゼのプレ配列を切断するペプチダーゼを有しない、工程。
項7.更に以下の工程を含む、項5又は6に記載の製造方法:
(2) 工程(1)で得られたL-リシンα-オキシダーゼをペプチダーゼ処理する工程。
項8.以下の(c)又は(d)のタンパク質を含む抗腫瘍剤:
(c) 配列番号3に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) 配列番号3に記載されるアミノ酸配列において、1〜50個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つL-リシンα-オキシダーゼ活性を有するタンパク質。
(a) 配列番号1に記載される塩基配列からなる核酸
(b) 配列番号1に記載される塩基配列と80%以上の同一性を有し、且つL-リシンα-オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸。
L-リシン + O2 + H2O→α-ケト-ε-アミノカプロン酸+ NH3 + H2O2
(1) 上記形質転換体を液体培地で培養し、培養物からL-リシンα-オキシダーゼを回収する工程。
(2) 工程(1)で得られたL-リシンα-オキシダーゼをペプチダーゼ処理する工程。
(c) 配列番号3に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) 配列番号3に記載されるアミノ酸配列において、1〜50個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つL-リシンα-オキシダーゼ活性を有するタンパク質。
[使用菌株及びベクター]
プラスミド構築などの形質転換体の宿主菌には大腸菌Escherichia coli TOP10及びEscherichia coli BL21(DE3)を使用した。発現用ベクターにはpCold IVを用いた。
組換え大腸菌の培養には、以下の培地を使用した。
・2×YT培地[1.6%ポリペプトン、1%酵母エキス、0.5% NaCl (1.5%寒天粉末)]
・SOC培地[2%ペプトン、0.5%酵母エキス、0.05%塩化ナトリウム/100 mlに対し、オートクレーブ済み1 Mグルコースを2 ml添加し、使用直前に1 M塩化マグネシウム1 ml、1 M硫酸マグネシウム1 mlを加えた]
組換えプラスミドを保有するE. coliを培養する際は、50 mg/mlアンピシリン(Amp)を終濃度50μg/mlとなるように添加した。E. coli BL21を培養するときは50 mg/ml カナマイシン(Kan)を終濃度50μg/mlとなるように添加した。
・核酸の定量法
スペクトラムの測定にはUV-1200を使用し、2本鎖DNAの濃度はOD260=1.0のとき50μg/mlとして求めた。RNAの濃度はOD260=1.0のとき40μg/mlとして求めた。また、純度はOD260/OD280=1.7から2.0が好ましいとした。
LysOXの配列の増幅には大腸菌用にコドンの最適化を行った配列においてはKOD-Plus-(東洋紡社)を使用した。
プラスミド構築はGeneArt(登録商標) Seamless Cloning and Assembly (サーモフィッシャー サイエンティフィック社)を使用し、相同組換えによるインサート導入を行った。
コンピテントセルを氷上で解凍し、コンピテントセルの液量の10分の1容量までのライゲーション反応液を添加し、軽く懸濁した後、氷上で30分静置した。これに、SOC培地を500μl添加し、37℃で1時間インキュベートした後、遠心(14,000 rpm,1分間)した。100μl程度残るように上清を除去し、菌体をピペッティングにより懸濁をし、LBプレート(抗生物質含有)にスプレッドして、37℃で一晩培養した。
組換え体のインサートの確認にはコロニーからのプラスミドDNA精製が不要で、形質転換後、生えてきたコロニーから直接PCRを行うコロニーダイレクトPCR法を用いた。
プラスミド抽出はバイオラッド社のQuantum Prep Plasmid Mini Prep Kitを使用した。培養液を集菌後、上清を廃棄した。200μlのResuspension Solutionに再懸濁し、250μlのLysis Solutionを加えてゆるやかに懸濁後、250μlのNeutralization Solutionを添加し、ゆるやかに懸濁後、12,000×gで5分間遠心を行った。上清をスピンフィルターへと回収し、200μlのQuantum Matrixを加えて懸濁し、12,000×gで30秒間遠心を行い、流出液を廃棄した。洗浄として、500μlのWater Bufferを加え、12,000×gで30秒間遠心し流出液を廃棄、これを2回繰り返した。スピンフィルターを1.5 mlチューブへと移し、100μlの滅菌水を添加し、12,000×gで1分遠心後、溶出液を精製プラスミド溶液とした。
タンパク質定量はブラッドフォードの方法に基づくバイオラッド社のプロテインアッセイキットを使用した。1.6 mlの酵素溶液に対して0.4 mlのアッセイ試薬を添加し、10〜15分室温で反応後、595 nmの吸収をUV 1200 (島津製作所社)で測定した。BSAを用いて作製した検量線よりタンパク質濃度を算出した。
酵素反応は70 mMカリウムリン酸バッファー(pH7.4)中、50 mM L-リシン及び300 U/mlカタラーゼの存在下で行った。酵素溶液(0.01〜0.3 U/ml) 0.1 ml,0.1 Mカリウムリン酸バッファー(pH7.4) 0.7 ml及び300 U/mlカタラーゼ0.1 mlを混合し30℃で5分間プレインキュベートした。酵素反応開始は0.5 M L-リシンを0.1 ml添加することで行い、30℃で10分間反応を行った。酵素反応停止は、25%TCAを0.1 ml添加することで行い、反応停止後に1 M酢酸バッファー(pH5.0)を2 ml及び0.1%MBTHを0.8 ml添加し、50℃で30分間インキュベートした。反応液を冷却後316 nmの吸光度を測定した。
本培養を終えた培地を遠心分離し、菌体を回収し、3倍量の破砕緩衝液(pH7.4)に懸濁し、破砕機によって菌体破砕を行った。これを20-65%飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、氷中で30分間撹拌後、沈殿を回収した。沈殿をできるだけ少量の20 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.4)に懸濁し、透析した。
(1) コドンの最適化
LysOXの塩基配列は大腸菌では見られないレアコドンを多く含むため、発現量が抑えられていることが推測された。このため、LysOXのコドンの最適化を図った。大腸菌用にコドンの最適化を行ったDNA配列を配列番号1に示す。また、前駆体配列と成熟体配列との2種類を調製した。
pCold IVプラスミドベクターのNdeI-EcoRIサイトへの挿入を行うため、前もってTAクローニングされたpET24a-LysOX(full3)を鋳型にしてインサート[LysOX(full3),(mature3)]の増幅を行った。使用したプライマーを以下の表1に示す。
LysOX (full3):大腸菌用にコドンを最適化したプレ配列を含む前駆体の塩基配列
LysOX (mature3):大腸菌用にコドンを最適化したプレ配列が除かれた成熟体の塩基配列
pCold IV-LysOX(full3,mature3)を用いてE. coli BL21(DE3)を形質転換させた物を5 mlの2YT(Amp)培地で37℃,16時間,230 rpmで前培養した後、5 mlの2×YT培地(Amp)で本培養を2時間,180 rpmで行った。15℃,30分間静置(コールドショック)し、終濃度1 mMの イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を添加し、15℃で24時間,180 rpmで誘導を行った。培養終了後、菌体を集菌し、超音波菌体破砕を行い、粗酵素溶液とし遠心分離により可溶性画分に分けた。可溶性画分について活性測定を行った。活性測定の結果を表2に示す。
[使用菌株及び使用培地]
・使用菌株:E. coli BL21/pCold IV-LysOX(full3)
・使用培地:2×YT培地(Amp final 50μg/ml)[1.6%ポリペプトン、1%酵母エキス、0.5% NaCl]
・ペプチダーゼである、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus) 由来ペプチダーゼ(SGP)、トリプシン及びキモトリプシンはシグマ-アルドリッチ社の製品を使用した。
・DEAE-トヨパール 650 M、Butyl-トヨパール 650 Mの各担体は東洋紡社から購入した。
前培養:2×YT培地(Amp, final 50 μg/mL) 5 mL, 37℃, 18時間, 230 rpm
本培養:2×YT培地(Amp, final 50 μg/mL) 120 mL + 前培養液 1.2 mL, 220 rpm, 30℃, O.D.600=0.4以上になるまで培養。
コールドショック:振盪培養停止後、30分間,15℃で冷却。その後、IPTG(終濃度1 mM)を添加。
低温誘導:15℃, 48時間, 180 rpm
集菌:遠心分離(4℃, 6000 rpm, 25分間)
洗浄:集菌菌体を、20 mM KPB (pH 7.4)で懸濁し、その後遠心(7000 rpm, 20分間)。
菌体破砕:洗浄後、洗浄バッファーを捨て、新たに破砕バッファーを添加して懸濁し、ソニケーターを用いて懸濁液を破砕(40分間)。破砕後、7000 rpm, 30分, 4℃で遠心し、上清を回収。
硫安分画:菌体破砕液上清に硫安を65%飽和になるように添加。30分間静置後、7800 rpm, 20分, 4℃で遠心。
透析:沈殿を20 mM KPB (pH 7.4)で溶かし、外液に20%飽和硫安・20 mM KPB (pH 7.4)を用いて透析。
精製:透析後のサンプルをButyl-トヨパール 650 M、DEAE-トヨパール 650 M及びゲル濾過セファデックス S300を用いて精製
精製酵素を処理する各種ペプチダアーゼ(1.トリプシン、2.キモトリプシン、3.SGP)の1 mg/ml溶液を作製した。精製酵素(LysOX前駆体)をタンパク質濃度が2.0 mg/mlになるよう希釈し、希釈した精製酵素に1/50量の各種ペプチダアーゼを添加した。また、コントロールとしてペプチダーゼを添加しない物も作製した。30℃, 4時間インキュベートした後、終濃度1 mMになるようにEDTA及びPMSF(ジメチルスルホキシドで溶解させた物)を添加し、酵素反応を停止させた。
試験例1と同様に行った。
酵素分解を行ったサンプルについて、タンパク質濃度測定、LysOX活性測定(MBTH法)、及びSDS-PAGEを行った。その結果を表3及び図1に示す。
1.ペプチダーゼ未処理 MDNVD
2.トリプシン処理 AE
3.キモトリプシン処理 AE
4.SGP処理 AEE
次のサンプル(1)〜(3)を以下の試験で使用した。
(1) LysOX前駆体原液(上記で調製及び精製した物)
(2) SGP処理LysOX(30℃,3時間)
(3) T.virideフスマ培養LysOX
(2) SGP処理したLysOX成熟体
LysOX前駆体原液を1.5倍希釈し、以下の処理を行った。処理液は更に2倍希釈されるので、最終的に前駆体タンパク質濃度は3 mg/ml程度に調整したことになった。
100μL LysOX前駆体原液の1.5倍希釈液
100μL 0.02M KPB, pH7.4
10μL 10 mg/mL SGP
トリコデルマ・ビリデY244-2株をフスマ培養した培養物から精製したLysOX 100 U/mlを4倍希釈し、アミノ酸23種類について活性を測定した。
1.電極法による活性測定
ハンザテック社製酸素電極(酸素電極がセルの底に密着)のジャケットに恒温水を循環させて電極チャンバー全体を30℃に保ち、電極セルに1 mlの10 mMアミノ酸基質溶液(0.1 M KPB, pH7.4)を入れて密閉した。酸素濃度を示す電極からの信号が安定した後、チャンバーセルの蓋の細い穴から10μlのLysOX被験酸素液をインジェクションして、密閉セル内の10 mMアミノ酸基質溶液(0.1 M KPB, pH7.4)中に含まれている酸素(30℃で0.23μmol/ml)の減少速度を測定した。
各サンプルとDTT+Ez溶液(アトー社)を1:1の割合で混合し(計20μL)、 100℃、5分間加熱、冷却・遠心後、全量(20μL)をアプライした。希釈バッファーは0.02 M KPB, pH7.4を使用した。
サンプル(1)〜(3)の活性測定の結果を以下の表に示す。
次のサンプル(i)〜(ii)を以下の試験で使用した。
(i) LysOX前駆体原液
(ii) SGP添加(30℃, 3時間, SGP処理)
SGP添加
700μL LysOX前駆体原液の10倍希釈液
700μL 0.02M KPB, pH7.4
70μL 1 mg/mL SGP
各サンプルの活性測定の結果を表5及び図3に示す。
<方法>
・MTSアッセイ法による細胞生存率の測定
大腸菌形質転換体由来LysOX前駆体及びペプチダーゼ処理して作製したLysOX成熟体の抗腫瘍性を調べるため、ヒト腫瘍細胞株としてA431(ヒト扁平上皮がん細胞株)及びMDA-MB-231(ヒト乳線癌細胞株)の2種類を用い、ウォータージャケット型CO2/マルチガスインキュベータ(アステック社)で培養した。
がん細胞A431細胞株及びMDA-MB-231細胞株に対するLysOX前駆体及びLysOX成熟体の細胞毒性を調べた結果を図4に示す。LysOX前駆体及びLysOX成熟体ともに10.0 mU/mlの濃度で添加した際に、両がん細胞に対して顕著な細胞毒性を示した。
Claims (8)
- 以下の(a)又は(b)の核酸:
(a) 配列番号1に記載される塩基配列からなる核酸
(b) 配列番号1に記載される塩基配列と80%以上の同一性を有し、且つL-リシンα-オキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸。 - 請求項1に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項1に記載の核酸が導入された形質転換体。
- 宿主が大腸菌である、請求項3に記載の形質転換体。
- 以下の工程を含む、L-リシンα-オキシダーゼの製造方法:
(1) 請求項3又は4に記載の形質転換体を液体培地で培養し、培養物からL-リシンα-オキシダーゼを回収する工程。 - 以下の工程を含む、L-リシンα-オキシダーゼの製造方法:
(1) 配列番号2に記載される塩基配列をコドン最適化したコドン最適化核酸が導入された形質転換体を液体培地で培養し、培養物からL-リシンα-オキシダーゼを回収する工程であって、該形質転換体はL-リシンα-オキシダーゼのプレ配列を切断するペプチダーゼを有しない、工程。 - 更に以下の工程を含む、請求項5又は6に記載の製造方法:
(2) 工程(1)で得られたL-リシンα-オキシダーゼをペプチダーゼ処理する工程。 - 以下の(c)又は(d)のタンパク質を含む抗腫瘍剤:
(c) 配列番号3に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(d) 配列番号3に記載されるアミノ酸配列において、1〜50個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つL-リシンα-オキシダーゼ活性を有するタンパク質。
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