CN111961605A

CN111961605A - 从传统韩国富大豆酱(清曲酱)分离的具有高纤溶酶生产力的新型芽孢杆菌属物种

Info

Publication number: CN111961605A
Application number: CN202010356851.5A
Authority: CN
Inventors: 崔载烈; 梁宅镐; 金政贤; 金义中; 潘在龟; 韩程畯
Original assignee: Genofocus Co ltd; Jifu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Genofocus Co ltd; Jifu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2020-11-20
Also published as: KR20200126739A

Abstract

公开了一种从传统韩国富大豆酱(称为“清曲酱”)分离的具有高纤溶酶生产力的新型芽孢杆菌属物种及其用途。更具体地，公开了从清曲酱分离出的具有SEQ ID NO:1的16S rRNA的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK‑01、发酵起子或微生物剂，所述发酵起子或微生物剂包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品；使用所述菌株、所述发酵起子或所述微生物剂发酵的发酵食品；产生溶栓酶的方法，所述方法包括使所述菌株发酵；以及具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的纳豆激酶。

Description

从传统韩国富大豆酱(清曲酱)分离的具有高纤溶酶生产力的新型芽孢杆菌属物种

技术领域

本发明涉及一种从传统韩国富大豆酱(称为“清曲酱(cheonggukjang)”)分离的具有高纤溶酶生产力的新型芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)及其用途。

背景技术

血栓形成是这样一种病症，其由于细胞生长的中断以及由血管中积累的血栓(纤维蛋白)阻碍血液循环引起的功能障碍而导致各种类型的成人疾病。导致血栓形成的血栓由纤维蛋白原产生，所述纤维蛋白原由在伤口愈合时通过体内复杂的血液凝结级联机制激活的凝血酶转化成纤维蛋白。当正常产生时血栓附着在血管壁上，使血管变窄增加了血压，并且形成血栓的纤维蛋白组分具有强的粘性，从而产生停留在血液中的血细胞或血凝块。血栓存在于血液中并且阻碍血液流动或沿着血管移动，从而导致各种循环系统性成人疾病，例如脑血管疾病(中风、脑梗塞)和静脉疾病(深静脉血栓形成、肺梗塞、高血压)。

能够溶解血栓以促进血液循环的药剂可以分为两种类型：直接溶解血栓的溶栓酶，以及激活血液中的纤溶酶原以使得纤溶酶分解血栓的纤溶酶原激活剂。纤溶酶原激活剂具有一个缺点，其中当在体内给予时，产生抗纤溶酶物质作为对过量纤溶酶的免疫应答，这降低了溶栓作用。另外，其他当前使用的血栓形成药物包括链激酶、尿激酶、tPA(组织型纤溶酶原激活剂)等，但是这些药物是不经济的并且具有短的半衰期。另外，这些药物由于其高成本而具有经济负担过大而不能被普通大众广泛使用的问题，并且血液循环药剂及类似物具有不适合进行长期给予以及除尿激酶以外的血液循环药剂不适合进行口服给予的问题。

同时，纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)菌株最早由农业研究员Makoto Sawamura博士于1906年发现，并且于1968年在日本被批准为药物产品，在1990年被批准为动物药物，并在1996年被批准为食品添加剂。最近，纳豆枯草芽孢杆菌菌株已被用作保健食品并引起了关注。目前，纳豆一般是指通过使纳豆枯草芽孢杆菌细菌在煮过的豆类中繁殖而使得纳豆枯草芽孢杆菌细菌能够与豆类同时被消费的发酵食品。纳豆枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，并且通过发酵相应菌株获得的所需产品彼此是相似的。但是，在日本，对特定功能物质(如纳豆激酶和维生素K2)和发酵食品(如纳豆)进行了严格分类，并且只有使用政府认可的纳豆枯草芽孢杆菌细菌的产品才能被认可其质量和安全性(日本纳豆激酶组织(Japan NattokinaseOrganization)：j-nattokinase.org/kr)。

纳豆激酶是自1925年以来一直在日本进行研究的由纳豆枯草芽孢杆菌细菌产生的一种细胞外分泌酶，并且被如此命名是因为它在20世纪80年代被鉴定为具有分解纤维蛋白的能力，所述纤维蛋白是一种导致血栓的蛋白质(Sumi H.等人,Experientia 43:1110-1111,1987)。

除了直接分解纤维蛋白的作用外，已知纳豆激酶还具有激活原尿激酶(溶栓酶尿激酶的前体)并增加纤溶酶原激活剂(t-PA)的含量的效果。具有有效的溶栓活性的纳豆激酶已经以改善血栓为目的在世界范围内以各种产品的形式出售。在日本和美国，纳豆激酶作为保健功能食品被消费，但在韩国其消费少于那些国家。其有效性由于它的以下优点已经逐渐成为一个大议题：没有副作用，已经作为食品被长期消费，是生物友好的并且可以通过传统的简单廉价的制造过程容易地商业化。

在此技术背景下，作为努力寻找能够在低成本下以高效率产生溶栓酶的菌株的结果，诸位发明人从传统的韩国富大豆酱(清曲酱)中分离出新型的纳豆枯草芽孢杆菌菌株。诸位发明人将菌株命名为“纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01”，发现其具有高的溶栓酶生产能力，并且基于此发现完成了本发明。

此背景技术章节中公开的上述信息仅为加强理解本发明的背景而提供，并且因此其可不包含形成对本领域技术人员而言已经清楚的现有技术的信息。

发明内容

因此，已根据上述问题而做出本发明，并且本发明的一个目标是提供一种具有高溶栓酶生产能力的新型纳豆枯草芽孢杆菌菌株。

本发明的另一个目的是提供发酵起子(starter for fermentation)，所述发酵起子包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品。

本发明的另一个目的是提供微生物剂，所述微生物剂包含选自以下的至少一种：所述菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品。

本发明的另一个目的是提供使用菌株、发酵起子或微生物剂的发酵食品。

本发明的另一个目的是提供产生溶栓酶的方法，所述方法包括使菌株发酵。

根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供具有产生溶栓酶的能力的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株来实现。

根据本发明的另一个目的，提供了发酵起子，所述发酵起子包含选自以下的至少一种：纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品。

根据本发明的另一个目的，提供了微生物剂，所述微生物剂包含选自以下的至少一种：纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品。

本发明的另一个目的是提供使用纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、发酵起子或微生物剂的发酵食品。

本发明的另一个目的是提供产生溶栓酶的方法，所述方法包括使纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株发酵。

本发明的新型纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株具有比常规菌株显著更高的产生溶栓酶的能力，并且因此能够高效地产生溶栓酶并显著降低生产成本。另外，可以使用菌株通过简单的生产过程来制备对包括心血管疾病在内的各种成人疾病有效的食品组合物。

附图说明

根据结合附图的下文详细描述，将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，在附图中：

图1示出了由纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株以及KCCM 11315、12027、12511、12512、12513、41991和41992菌株生产的纳豆激酶的溶栓能力的比较。

具体实施方式

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所涉及领域的技术人员所理解的含义相同。通常，本文使用的术语是本领域中熟知的并且是通常使用的。

诸位发明人从传统的韩国富大豆酱(称为“清曲酱”)中鉴定并分离出具有比其他纳豆枯草芽孢杆菌菌株更高的产生溶栓酶的能力的新型纳豆枯草芽孢杆菌菌株，并且将其命名为菌株“纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01”。纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株于2019年4月23日在国内保藏在韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)(韩国典型培养物保藏中心(Korea Collection forType Culture)：KCTC)中(保藏号：KCTC 18770P)，并且于2020年4月2日进行国际保藏(保藏号：KCTC 14163BP)。

作为在纤维蛋白板上培养纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株和常规已知的七种纳豆枯草芽孢杆菌菌株(KCCM11315、KCCM12027、KCCM12511、KCCM12512、KCCM12513、KCCM41991、KCCM41992)的结果，发现了纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株具有比其他菌株更高的溶栓能力，这意味着纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株具有比其他纳豆枯草芽孢杆菌菌株更高的产生溶栓酶的能力。

因此，在一方面，本发明涉及具有产生溶栓酶的能力的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株。

如本文所用，术语“血栓(thrombi)(也称为“血栓(thrombus)”)”是指在体内局部凝结的血液组分凝块，所述血液组分凝块由血小板、纤维蛋白、红细胞和白细胞构成。血栓产生的原因尚未清楚地阐明，但由Virchow提出的三个原因是普遍已知的。第一个原因是对内皮的损伤。由于对子宫内膜的损伤、动脉硬化、感染性疾病等而形成血栓。第二个原因是血流速率的降低导致促凝结剂局部增加，从而导致形成血栓。第三个原因是血液凝结增加导致血栓的局部产生。

所产生的血栓干扰血管中的血液流动或者移动以阻碍向某些器官或血管的血液供应，从而导致血栓形成或栓塞。这些血栓形成和栓塞以循环系统性成人疾病的形式出现，所述循环系统性成人疾病例如为脑血管疾病(中风、脑梗塞)和静脉疾病(深静脉血栓形成、肺梗塞、高血压)。

如本文所用，术语“纤溶酶”是指能够溶解通过上文所述机制产生的血栓的酶。可以溶解血栓以促进血液循环的药剂可以分为两种类型，即直接溶解血栓的溶栓酶，以及激活血液中的纤溶酶原从而导致纤溶酶分解血栓的纤溶酶原激活剂。纤溶酶原激活剂具有一个缺点，其中当在体内给予时，产生抗纤溶酶物质作为对过量纤溶酶的免疫应答，这降低了溶栓作用。

在本文中“纳豆枯草芽孢杆菌”是指枯草芽孢杆菌的亚种，并且最早由农业研究员Makoto Sawamura博士于1906年发现，并且于1968年在日本被批准为药物产品，在1990年被批准为动物药物，并在1996年被批准为食品添加剂。最近，纳豆枯草芽孢杆菌菌株已被用作保健食品并引起了关注。

在由Nishito发表的文献(Nishito Y.等人,BMC Genomics.2010年4月16日；11:243.)以及由Kamada发表的文献(Kamada等人,PLoS One.2014年10月16日；9(10):e109999)中，通过纳豆基因组计划确定了纳豆枯草芽孢杆菌的全基因组序列，并且与密切相关的枯草芽孢杆菌菌株在基因组水平上进行了比较。在纳豆基因组浏览器(http://natto-genome.org)中发表了纳豆枯草芽孢杆菌的已鉴定的基因组序列和基因注释。

在本发明的一个实施方案中，确定了由本发明的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株生产的溶栓酶的溶栓活性。各自培养纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株和七种已知的纳豆枯草芽孢杆菌菌株，并且然后离心以去除菌株细胞，并且将上清液通过过滤器。已经通过过滤器的培养物对应于溶栓酶溶液，并且将溶栓酶溶液注入纤维蛋白板中以确定其溶栓活性。如图1所述，所述菌株具有优于其他纳豆枯草芽孢杆菌菌株的溶栓酶生产能力。

因此，本发明的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株具有比其他纳豆枯草芽孢杆菌菌株更高的溶栓酶生产力。

本发明的溶栓酶是纳豆激酶。纳豆激酶是由纳豆枯草芽孢杆菌细菌产生的细胞外分泌酶，并且此酶自1925年以来一直在日本进行研究，并且被如此命名是因为它在20世纪80年代被鉴定为具有分解纤维蛋白的能力，所述纤维蛋白是一种导致血栓的蛋白质(SumiH.等人,Experientia 43:1110-1111,1987)。除了直接分解纤维蛋白的作用外，已知纳豆激酶还具有激活原尿激酶(其是溶栓酶(尿激酶)的前体)并增加纤溶酶原激活剂(t-PA)的含量的效果。

在纳豆基因组计划中，纳豆激酶基因由aprN表示，在对比性菌株的直系同源物中，枯草芽孢杆菌由aprE表示，解淀粉芽孢杆菌由aprE表示，地衣芽孢杆菌由apr表示，并且短小芽孢杆菌由aprE1表示。纳豆枯草芽孢杆菌的aprN和枯草芽孢杆菌的aprE由相同数量的氨基酸构成，并且在381个氨基酸中仅在位置298处的一个氨基酸彼此不同。具有差异的在位置298处的氨基酸在纳豆枯草芽孢杆菌中为缬氨酸，但在枯草芽孢杆菌中为丙氨酸。然而，aprN可以是任何类型的纳豆激酶，并且本发明的纳豆激酶不限于此。

优选地，纳豆激酶具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但不限于此。

如本文所用，术语“清曲酱”是传统的韩国发酵食品，其是通过使用枯草芽孢杆菌将煮过的豆类发酵来分解大豆蛋白并且向其中添加葱、大蒜、红辣椒粉、盐等以赋予其耐存储性而生产的。在传统的大豆发酵食品中，清曲酱可以在最短的时期内生产，具有独特的风味，并且被公认为是消费大豆的最具营养和经济效益的方法。特别地，由于其诸如抗癌和增强免疫力的效果等有益作用(所述有益作用是基于包含在清曲酱发酵过程中涉及的各种细菌(包含枯草芽孢杆菌)所产生的酶的物质)，清曲酱作为超级食品吸引了大量的关注。

在本发明的一个实施方案中，将在传统韩国清曲酱中所包含的菌株在形态学上进行分离并培养至纯。使用PCR对纯粹分离的菌株进行分类，并且从纯粹分离的菌株获得16SrRNA核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和aprN核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，并且使用NCBI(国家生物技术信息中心(The National Center for Biotechnology Information)：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Blast检索程序以及在纳豆基因组计划(http://natto-genome.org)中注册的纳豆菌株的基因组信息比较同源性。通过16S rRNA核苷酸序列(SEQID NO:1)的同源性和对来自aprN核苷酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的分析鉴定纳豆枯草芽孢杆菌，其被命名为“纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01”。

因此，本发明的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株是从清曲酱分离的。

因此，在另一方面，本发明涉及发酵起子，其包含选自以下的至少一种：纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品。

如本文所用，术语“培养物”、“浓缩物”或“干燥产品”是指通过培养菌株获得的产物本身，或所述培养物的浓缩物或冷冻干燥产品，或通过从所述培养物中去除菌株获得的培养物上清液，并且所述术语可以与“培养物上清液”、“条件培养物”或“调节培养基”互换使用。

如本文所用，术语“发酵起子”意指包含选自以下的至少一种的药剂或组合物：包含在发酵中所涉及的细菌(如枯草芽孢杆菌)的微生物、其捣碎产物、其培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品。使用发酵起子以提供在发酵食品的生产期间添加的微生物，并且可以在发酵食品中生长或变成优势物种。当使用发酵起子生产发酵食品时，发酵食品的质量可以通过在发酵起子中所包含的微生物来保持一致，或者可以调节发酵的速度或步骤，或者可以制备实现特定目的的发酵食品。

在本发明中，发酵起子可以仅包含纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、或所述培养物的干燥产品，并且可以进一步包含但不限于其他具有生物功效的菌株、用于改善食品风味的添加剂、发酵增强剂、辅助物质等。

在另一方面，本发明涉及微生物剂，其包含选自以下的至少一种：纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品。

如本文所用，术语“微生物剂”意指通过适当的方法纯化具有特定功能的微生物并配制所述微生物或源自所述微生物的物质而获得的生物剂。

如本文所用，微生物剂可以包含本发明的菌株或源自所述菌株的物质，可以优选地包含具有溶栓活性的酶，并且更优选地可以包含纳豆激酶，但不限于此。

在另一方面，本发明涉及发酵食品，所述发酵食品使用了纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、本发明的发酵起子或本发明的微生物剂。

如本文所用，术语“发酵食品”是通过发酵生产的食品的通用术语，所述发酵通过微生物如霉菌、细菌和酵母的作用分解有机物质来合成新组分。

在本发明中，发酵食品可以通过使用纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、本发明的发酵起子或微生物剂进行发酵来生产，并且可以包括使用本发明菌株的发酵食品以及使用所述发酵食品生产的加工食品。

优选地，发酵食品可以选自酱和调味汁，例如豆饼(meju)(干的发酵大豆砖)、大酱(doenjang)(韩国大豆酱)、大豆酱、调味大豆酱、红辣椒酱、春酱(chunjang)(黑豆酱)、清曲酱(韩国发酵富大豆酱)、混合酱、韩国酱油、天然酿造的酱油和混合酱油，但不限于此。

在另一方面，本发明涉及产生溶栓酶的方法，所述方法包括使纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株发酵。

如本文所用，术语“发酵”意指在微生物的生长或代谢中通过微生物分解有机物质生产有用物质的过程，并且是指通过接种或添加包含细菌或其培养物的微生物、随后进行生长和培养来生产对人类有用的产品的过程。

本发明的方法可以包括在有机材料中接种菌株、培养物、细菌(起子)组合物等，随后生长并培养至发酵。另外，在发酵之后，所述方法可以包括分离由菌株生产的溶栓酶并将其浓缩。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对本领域技术人员明显的是，提供这些实施例仅用于举例说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：芽孢杆菌属菌株的纯粹分离

由于从传统的韩国市场上收集的清曲酱含有至少一种芽孢杆菌菌株，因此进行纯粹分离以获得所需的纳豆枯草芽孢杆菌菌株。

具体地，将清曲酱在无菌蒸馏水中连续稀释，并将所得稀释液涂布于包含TSB(1.7％胰蛋白胨)的2％琼脂培养基中，所述TSB补充有2％脱脂奶、0.3％大豆蛋白胨(Soytone)、0.25％葡萄糖、0.5％氯化钠和0.25％磷酸氢二钾(K₂HPO₄)并在37℃下培养24小时。枯草芽孢杆菌和与其相似的芽孢杆菌属物种分泌许多蛋白酶，因此通过由分解脱脂奶形成的透明区和形态学观察来鉴定芽孢杆菌属菌株，并且将各种分离的菌落在相同琼脂培养基中划线并且然后进行纯粹分离。

实施例2：纳豆枯草芽孢杆菌的选择和鉴定

为了对纯粹分离的菌株进行分类，使用PCR扩增16S rRNA和aprN核苷酸序列，并且基于所鉴定的核苷酸序列选择纳豆枯草芽孢杆菌。

具体地，从纯粹分离的菌株(基因组DNA提取试剂盒，RBC)分离基因组DNA以便扩增16S rRNA和aprN核苷酸序列，使用分离的基因组DNA作为模板、以及SEQ ID NO:4的27F和SEQ ID NO:5的1492R作为通用PCR引物获得16S rRNA核苷酸序列，并且使用与基因组序列中aprN的开放阅读框(ORF)的两侧结合的具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的引物获得aprN核苷酸序列。使用16S rRNA序列和通过上述实验获得的具有aprN ORF的核苷酸序列，通过NCBI(国家生物技术信息中心：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Blast检索程序以及在纳豆基因组计划(http://natto-genome.org)中注册的纳豆菌株的基因组信息比较同源性。通过16S rRNA核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的同源性和对来自aprN核苷酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的分析(381个总氨基酸和在位置298处为缬氨酸)选择纳豆枯草芽孢杆菌，并且将其称为“纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01”。所述菌株于2019年4月23日在国内保藏在韩国生物科学与生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscienceand Biotechnology)(韩国典型培养物保藏中心(Korea Collection for Type Culture)：KCTC)中(保藏号：KCTC 18770P)，并且于2020年4月2日进行国际保藏(保藏号：KCTC14163BP)。

实施例3：纳豆激酶活性的分析

确定了由本发明的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株生产的纳豆激酶的溶栓活性。作为对比性对照组，获得并使用在韩国微生物培养中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms，KCCM)注册为纳豆枯草芽孢杆菌的七种菌株。对照组的保藏编号对应于KCCM 11315、KCCM 12027、KCCM 12511、KCCM 12512、KCCM 12513、KCCM 41991、和KCCM41992。

具体地，将纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株和七种已知的纳豆枯草芽孢杆菌菌株各自在TSB培养基中于37℃下培养24小时。在培养之后，通过离心除去菌株细胞，并且将上清液通过0.2μm过滤器。已经通过过滤器的培养基对应于纳豆激酶的酶溶液，并且确定其溶栓活性。

为了确定其溶栓活性，将纤维蛋白原以0.3％溶解于0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，并且将3ml在相同的缓冲液中的1％琼脂糖溶液添加至3ml完全溶解的纤维蛋白原溶液中，然后混合。将所得混合物与60μl凝血酶混合，并且将所得物倒入皮氏培养皿(petridish)中，并允许其在室温下固化。用巴斯德(Pasteur)移液器创建一个直径为3mm的孔，以产生纤维蛋白板。将10μl的由八种菌株制备的纳豆激酶溶液中的每一种注入纤维蛋白板的样品孔中，并允许其在37℃下反应3小时，并且比较所得透明区的尺寸。发现当使用本发明的GFNK-01菌株培养物时的透明区尺寸显著大于当使用七种KCCM纳豆菌株培养物时的透明区尺寸(图1)。这意味着本发明的GFNK-01菌株具有比其他纳豆枯草芽孢杆菌菌株更高的纳豆激酶生产力。

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，提供本说明书是出于说明性目的以阐述优选实施方案，并且不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。

保藏编号

韩国国内保藏

保藏所名称：韩国典型培养物保藏中心

保藏号：KCTC 18770P

保藏日期：2019年4月23日

国际保藏

保藏所名称：韩国典型培养物保藏中心

保藏号：KCTC 14163BP

保藏日期：2020年4月2日

序列表

<110> 吉富生物科技有限公司

杰诺福克斯公司

<120> 从韩国传统大豆酱中分离的具有高纤溶酶生产力的新型芽孢杆菌属物种

<130> PF-B2406-CN

<150> KR 2019-0136271

<151> 2019-10-30

<160> 7

<170> PatentIn 版本 3.2

<210> 1

<211> 1350

<212> DNA

<213> 纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01 16S rRNA

<400> 1

aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg 60

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<210> 2

<211> 1146

<212> DNA

<213> 纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01：aprN

<400> 2

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gtgcttgatt caacaggaag cggccaatat agctggatta ttaacggcat tgagtgggcc 660

atttccaaca atatggatgt tatcaacatg agccttggcg gacctactgg ttctacagcg 720

ctgaaaacag tagttgataa agcggtttcc agcggtatcg tcgttgctgc cgcagccgga 780

aacgaaggtt catccggaag cacaagcaca gtcggctacc ctgcaaaata tccttctact 840

attgcagtag gtgcggtaaa cagcagcaac caaagagctt cattctccag cgtaggttct 900

gagcttgatg taatggctcc tggcgtgtcc atccaaagca cacttcctgg aggcacttac 960

ggcgcttata acggaacgtc catggcgact cctcacgttg ccggagcagc agcgctaatt 1020

ctttctaagc acccgacttg gacaaacgcg caagtccgtg atcgtttaga aagcactgca 1080

acatatcttg gaaactcttt ctactatgga aaagggttaa tcaacgtaca agcagctgca 1140

caataa 1146

<210> 3

<211> 381

<212> PRT

<213> 纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01：aprN蛋白质序列

<400> 3

Val Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu

1 5 10 15

Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met Ser

35 40 45

Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly

50 55 60

Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu

65 70 75 80

Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr

85 90 95

Val Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr

100 105 110

Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr

115 120 125

Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser

130 135 140

His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu

145 150 155 160

Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Ala Gly

165 170 175

Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro

180 185 190

Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn

210 215 220

Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser Thr Ala

225 230 235 240

Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala

245 250 255

Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly

260 265 270

Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser

275 280 285

Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ser Glu Leu Asp Val

290 295 300

Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr

305 310 315 320

Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

325 330 335

Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val

340 345 350

Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr

355 360 365

Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln

370 375 380

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 27F引物

<400> 4

agagtttgat catggctcag 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1492R引物

<400> 5

ggataccttg ttacgactt 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aprN上游区域引物

<400> 6

gacatttcag cataatgaac at 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> aprN下游区域引物

<400> 7

ggaacatcag gatgctgaca 20

Claims

1.一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)GFNK-01菌株，其具有产生溶栓酶的能力。

2.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株，其中所述溶栓酶是纳豆激酶。

3.根据权利要求2所述的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株，其中所述纳豆激酶具有SEQID NO:3的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株，其中所述菌株是从清曲酱分离的。

5.一种发酵起子，其包含选自以下的至少一种：根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品。

6.一种微生物剂，其包含选自以下的至少一种：根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、所述菌株的培养物、所述培养物的浓缩物、和所述培养物的干燥产品。

7.一种发酵食品，其使用根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株、根据权利要求5所述的发酵起子或根据权利要求6所述的微生物剂。

8.根据权利要求7所述的发酵食品，其中所述发酵食品选自豆饼(干的发酵大豆砖)、大酱(韩国大豆酱)、大豆酱、调味大豆酱、红辣椒酱、春酱(黑豆酱)、清曲酱(韩国发酵富大豆酱)、混合酱、韩国酱油、天然酿造的酱油和混合酱油。

9.一种产生溶栓酶的方法，所述方法包括使根据权利要求1至4中任一项所述的纳豆枯草芽孢杆菌GFNK-01菌株发酵。