CN101705238A - 纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因、蛋白及菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域的纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)编码基因、蛋白及菌株。纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列；该基因编码的蛋白质具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；本发明还提供了一种纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)SJTU1-4CGMCC NO.2801。本发明确定了纳豆芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶编码序列，即RocG基因，为将来研究酶的活性位点和通过定点突变改变发酵菌株GDH酶活从而生产出低氨纳豆奠定了基础，RocG基因缺失菌株的氨产量可降低50％。

Description

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因、蛋白及菌株

技术领域

本发明涉及生物技术领域的编码基因、蛋白及菌株，具体是纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶(GDH)编码基因、蛋白及菌株。

背景技术

纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)别名纳豆菌，属芽孢杆菌属(Bacillus)，是枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)的一个亚种。1905年，日本人池村将产生纳豆粘性物质的一种菌作为独立的纳豆菌提出。从其生理生化等诸多性质的研究来看，Smith等人认为纳豆菌与枯草杆菌是同物异名，因此在伯杰士的《细菌学鉴定手册》第六版中将纳豆菌归在枯草杆菌中。纳豆菌主要从自然界的稻、谷上面分离得到，通常为(0.7～0.8)μm×(2.0～3.0)μm，呈革兰氏阳性。生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。芽孢为椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。生长温度最高为45～55℃，最低为5～20℃，孢子耐热性强。

纳豆芽孢杆菌是日本纳豆的发酵菌，发酵后能产生多种独特的保健功效成份，例如纳豆激酶、多聚谷氨酸、维生素K₂等，纳豆已被证实具有溶解血栓、预防骨质疏松、抗氧化、抗菌、调节肠胃等生理预防和调节功能，除预防骨质疏松与大豆本身含有的异黄酮有关外，其他功能主要取决于发酵后产生的新物质。日本人将每年的7月10日定为纳豆节，甚至将纳豆称为国宝，但纳豆在中国市场却难觅身影。究其原因，主要是发酵过程中产氨，氨在产品中累积使其风味让国人难以接受。然而，当今世界，食疗越来越受到人们的认可和追捧，治未病的思想也开始成为各国政府对于国民健康的主导政策。因此作为一种功能性食品，如果能改良其风味，纳豆一定会有极大的市场需求。

微生物氨基酸代谢产氨主要有脱羧作用、转氨作用和联合脱氨基作用。我们的前期研究表明，纳豆芽孢杆菌代谢产氨的主要途径不是脱羧作用，而是联合脱氨基作用和转氨作用。作为生物尿素循环、联合脱氨的核心酶，谷氨酸脱氢酶为纳豆菌代谢产氨途径中的关键酶。

B.等在《Journal of Biological Chemistry》(生物化学杂志)2000年第275卷第50期39529～39542页发表了题为《A new class of glutamatedehydrogenases(GDH).Biochemical and genetic characterization of thefirst member，the AMP-requiring NAD-specific GDH of Streptomycesclavuligerus》(一种新型的谷氨酸脱氢酶：来源于棒状链霉菌的，第一个需要AMP的、NAD特异的谷氨酸脱氢酶的生物化学和遗传学性质)一文，文中对棒状链霉菌(S.clavuligerus NRRL-3585，ATCC27064)谷氨酸脱氢酶的酶学特征进行了研究，这对本专利中对谷氨酸脱氢酶酶活测定等提供了参考；

HAYDEN Bronagh M.等在《FEMS microbiology letters》(欧洲微生物学会联合会微生物学快报)2002年第211卷第1期37～41页发表了题为《Glutamatedehydrogenase of Halobacterium salinarum：evidence that the gene sequencecurrently assigned to the NADP⁺-dependent enzyme is in fact that of theNAD⁺-dependent glutamate dehydrogenase》(极端嗜盐菌Halobacteriumsalinarum的谷氨酸脱氢酶：目前认为是NADP⁺依赖型酶的基因序列实际上是编码NAD+依赖型谷氨酸脱氢酶)一文，研究了嗜盐菌Halobacterium salinarum(NRC36014)GDH的编码序列；

Kunst，F.等在《Nature》(自然)1997年第390卷第6657期249～256页发表了题为《The complete genome sequence of the gram-positive bacteriumBacillus subtilis》(革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的全基因序列)一文，报道了枯草芽孢杆菌编码4100个蛋白的编码基因共4,214,810个碱基对的全基因序列。

上述文献报道为纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因克隆的引物设计及基因测序后的同源性比较提供了依据，但纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因序列至今未见报道。

中国科学院过程工程研究所于2002.06.14已经申请了名称为：纳豆芽孢杆菌及其在制备具有血栓溶解性保健食品中的应用，专利号为：ZL 02121352.6。该专利描述了纳豆芽孢杆菌，已于2002年3月8日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC NO.0724；而且对该纳豆芽孢杆菌的性质特征进行了说明：菌株NLSSE为革兰氏阳性，不抗酸杆菌；好氧，有芽孢，芽孢中生、不膨大，在一个孢子囊细胞中，芽孢不多于一个，细胞壁化学组分中含有meso-DAP(内消旋二氨基庚二酸)，无特征性糖；菌株NLSSe为杆状，直或近直形，0.6～0.8x1.5～2.0urn，能运动，鞭毛周生；在五种天然有机培养基上生长良好，利用黄豆饼粉培养基形成较厚菌膜，菌落乳脂色，边缘光滑。但该菌株并没有表现出谷氨酸脱氢酶的活性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因、蛋白及菌株。本发明确定了纳豆芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶编码序列，即RocG基因，为将来研究酶的活性位点和通过定点突变改变发酵菌株GDH酶活从而生产出低氨纳豆奠定了基础，RocG基因缺失菌株的氨产量可降低50％左右；同时提供了该基因编码的蛋白以及含有该基因的一种纳豆芽孢杆菌株。

本发明通过以下技术方案实现，

本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因，其序列如SEQ ID NO：1所示。

所述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还涉及一种纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)SJTU1-4CGMCCNO.2801。

本发明首先进行纳豆芽孢杆菌的筛选和鉴定，然后提取筛选出的纳豆芽孢杆菌DNA，之后进行纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的克隆，最后得到基因功能，并对该基因进行表达和蛋白功能的验证。

本发明具有如下的有益效果：GDH是纳豆芽孢杆菌产氨途径中的关键酶，发酵18个小时后，纳豆中的氨含量可高达360mg/100g纳豆。本发明确定了纳豆芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶编码序列，即RocG基因，为将来研究酶的活性位点和通过定点突变改变发酵菌株GDH酶活从而生产出低氨纳豆奠定了基础，RocG基因缺失菌株的氨产量可降低50％；同时提供了该基因编码的蛋白以及含有该基因的一种纳豆芽孢杆菌株。

本发明所涉及的纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)SJTU1-4，已于2008年12月9日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，其保藏编号为CGMCC NO.2801，保藏期限为30年，保藏地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为不同引物PCR扩增产物电泳图；

图2为菌落PCR的方法筛选重组子实验结果图；

图3为RocG基因在E.coli中诱导表达的实验结果图。

具体实施方式

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

步骤一，纳豆芽孢杆菌的筛选和鉴定

1、纳豆芽孢杆菌的筛选

从日本料理店和上海浦东八百伴超市购买三种商品纳豆：极小粒纳豆，丸美屋株式会社生产；旭松纳豆一番，珠海西尾食品公司生产；水户の纳豆，オ一サト株式会社生产(水户牌纳豆，佐藤股份有限公司)。取纳豆10g，置于装有100ml灭菌的生理盐水的三角瓶中，轻轻摇晃10min后，取1ml悬浊液放于装有LB培养基25ml的250ml三角瓶中，于37℃下培养18小时，按10倍稀释法取样涂布于平板上，从平板上挑选出单菌落进行纳豆激酶活性的测定。

2、纳豆激酶活性的测定

(1)溶液配制：琼脂糖溶于0.1M磷酸盐缓冲液中，浓度为1％，沸水浴30min；

纤维蛋白原：溶于0.1M磷酸盐缓冲液中，浓度为1.25mg/ml，置于55℃恒温水浴中；凝血酶：按15BP/ml的浓度溶于上述缓冲液中。

(2)平板制作

琼脂糖与纤维蛋白原等量混合，每平皿中加入0.5ml凝血酶溶液，然后加入琼脂糖-纤维蛋白原混合液20ml，置于平面冷凝。再将平皿置于85℃烘箱中烘30min，冷却，用微量进样器在平皿上打孔。

(3)酶活测定

取尿激酶标准品适量，用0.01mol/L的PBS(pH值7.5)将尿激酶标准品配制为115，230，345，460，690(IU/ml)5个浓度梯度，将这5个浓度的尿激酶溶液和发酵收集的样品液，用微量进样器注入平板孔内，10μl/孔，37℃孵育18h，用游标卡尺测量每个溶圈的直径，计算出溶圈的面积，以尿激酶活力单位数为横坐标，溶圈面积为纵坐标，绘制标准曲线。根据样品溶圈面积，在标准曲线上找出相当于尿激酶的活力单位数。

3、菌种鉴定方法

预检试验：取纳豆激酶活性最高的菌种1-4进行平板划线培养，挑取单菌落，观察菌落形态，并进行革兰氏染色和镜检。此菌株的单菌落形态为中间隆起，边缘及表面光滑的乳白色菌落；革兰氏检验为阳性菌；镜检观察其形态为杆状。

菌种鉴定使用生物梅里埃(BioMerieux)公司生产的API 50CH鉴定试剂盒。

API 50CH试剂盒检测：选取初步鉴定过的单个菌落，在LB平板上恒温培养，平板数为3～4个，培养条件为37℃，18h。将所有培养平板上的菌落和菌苔用灭菌棉签全部转移到1ml无菌生理盐水中，制成浓的菌悬液。

吸取浓的菌悬液滴加到5ml无菌生理盐水中，调整浊度到麦氏浊度(McFarland)2，记录滴数n，打开一只API 50CH培养基，向其中滴加2n滴浓的菌悬液，摇匀，制成用于接种API 50CH试剂条的菌液。

将菌液依次加入API 50CH试剂条的试剂杯中，加培养基至杯口的下沿，排除其中的气泡，放入已加有蒸馏水的盛放试剂条的盒子中，37℃下培养48h。其中24h观察一次结果，48h再观察一次结果。通过两次观察的结果在API 50CH的数据库中查询菌种的鉴定结果，具体见表1。通过API 50CH数据库对鉴定结果的检索，菌种1-4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，即纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)SJTU 1-4CGMCC NO.2801。

表1菌种API50CH鉴定结果

％ID衡量为此菌种的可能性；T衡量菌种变异的指表，T值越接近1说明变异的程度越小。

步骤二，纳豆芽孢杆菌DNA提取

取培养至对数生长期的纳豆芽孢杆菌细胞1.5ml，室温下12,000r/min离心0.5min，弃去上清液。再在同一离心管中加上述细胞1.5ml，室温12,000r/min离心0.5min，弃去上清液。用等体积的无菌蒸馏水洗涤一次，12,000r/min离心0.5min，弃去上清液。加入446μL TE(10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH＝8.0)，24μL溶菌酶(20mg/ml)，37℃放置1h。再添加27.5ml SDS(10％)和2.5μL的蛋白酶K(20mg/ml)，培养至完全澄清(55℃，1h)。加入500μL的1∶1苯酚--氯仿∶异戊醇(24∶1)，颠倒混匀，静置，离心12,000r/min离心5min。

取上清液，加入500μL的氯仿-异丙醇(24∶1)，颠倒混匀后，于12000g离心5min，随后轻轻将上层水相移入另一支1.5ml小离心管中。加入2倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置2小时，沉淀DNA。用70％冷乙醇洗涤1次，于12000g离心5min，弃上清，风干。将DNA悬于无菌水或50μl TE缓冲液中溶解，-20℃保存待用。

步骤三，纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的克隆

1、引物设计

对不同来源GDH一级结构的研究发现，尽管GDH有不同类型，但共生梭菌、枯草芽孢杆菌和冰岛热棒菌等细菌GDH活性中心的氨基酸序列非常保守.查询NCBI网站GenBank中枯草芽孢杆菌的GDH编码基因(RocG)序列，利用Primer Premier5.0引物设计软件以下特异性引物，交由上海生工生物工程公司合成。

引物1：

(Sense primer)

5’TCGCCTGCAAGAGTATGGTAAG 3’  Tm：52.7℃，GC％50％

3’(305)AGCGGACGTTCTCATACCATTC(326)5’

(Anti-sense primer)

5’AGGTTTGATGCGTCGGGTAA 3’    Tm：53.0℃，GC％55％

3’(2069)TCCAAACTACGCAGCCCATT(2050)5’

引物2：

(Sense primer)

5’GCCTGCAAGAGTATGGTAAG 3’    Tm：60.07℃℃，GC％50％

3’(307)CGGACGTTCTCATACCATTC(326)5’

(Anti-sense primer)

5’GATAGTCCACAAGGTCCTCC 3’    Tm：60.4℃，GC％50％

3’(1971)CTATCAGGTGTTCCAGGAGG(1952)5’

引物3：

(Sense primer)

5’TATCGCCTGCAAGAGTATGG 3’    Tm：56.4℃，GC％50％

(Anti-sense primer)

5’AATGGGCTGCGTAGTTTG 3’      Tm：54.6℃，GC％50％

预计引物1的扩增片断为1750bp，引物2的扩增片断为1680bp，引物3的扩增片断为1680bp。

2、引物有效性鉴定

设置不同的PCR条件，分别加入引物1、引物2、引物3，根据扩增后琼脂糖凝胶电泳所得片断大小判断引物1、引物2、引物3的扩增有效性。反应体系如表2所示。

PCR参数设置：94℃下加热5分钟后，94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35轮，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10分钟，将混合物在使反应产物扩增充分。用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。不同引物PCR扩增产物电泳结果见图1。图中电泳泳道1～3的扩增引物分别为1，2，3时PCR产物的电泳图，M为200bp DNA分子量标准。结果显示引物1的扩增片断为1750bp，引物2的扩增片断为1680bp，目标DNA得到有效扩增。

表2

10×buffer	2.5μl
		MgCl2溶液(1.5mM)	1.5μl

10×buffer	2.5μl
		dNTP(2.0mM)	1.0μl
上下游引物(各10μM)	2.0μl
		Taq DNA聚合酶(2.5U)	0.5μl
模板(约1ng)	1.5μl
		补无菌水至	25μl

3、最佳模板DNA浓度摸索

将提取的DNA用TE分别稀释20倍和50倍，利用紫外可见分光光度计测算其核酸浓度，查阅相关文献得到PCR扩增反应最佳DNA模板浓度参考值，以此为依据稀释DNA，以得到最佳PCR扩增反应结果。

4、质粒DNA的连接、转化和筛选

在微量离心管中加入pMD19-T Simple Vector 1μl，聚合酶链式反应扩增产物2μl，加dH₂O至5μl。加入5μl(等量)的Solution I，在16℃反应30min。全量(10μl)加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30min，然后于42℃加热45s后，再在冰中放置1min。加入890μl SOC培养基，37℃振荡培养60min。

经转化扩增后的产物在Amp-LB平板上过夜生长，转化子形成白色单菌落。任意挑选白色单菌落，在引物2作用下PCR，扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳，观察条带片断大小鉴定重组子。菌落PCR的方法筛选重组子实验结果见图2。图中泳道1为大肠杆菌转化后挑选出的81号转化子在引物2条件下的扩增结果，泳道2为95号转化子在引物2条件下的扩增结果，M为200bp DNA分子量标准。从图中显示的结果可看出目标片段已经转化到大肠杆菌。

5、纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因测序

纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的测序由上海桑尼生物科技有限公司完成，得到基因的序列，全长为1275bp。将测序得到的序列使用NCBI的BLASTn工具进行比对分析，发现纳豆枯草芽胞杆菌的谷氨酸脱氢酶编码基因与BacillusSubtilis 168菌株的RocG基因的相似度为98％，与其他芽孢杆菌家族的RocG基因的相似度也在80～94％，因此可以确定已克隆的这段基因中含有纳豆枯草芽孢杆菌RocG基因。经ORF Finder和BLASTp工具分析，得到一段长达422个氨基酸残基的蛋白质序列，该序列与Bacillus Subtilis 168菌株的GDH的相似度亦为98％，与其他芽孢杆菌的GDH的相似度在50％以上，所以可以确定已克隆出纳豆芽孢杆菌中表达GDH的RocG基因。

表3为本发明的纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶与枯草芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因的碱基序列的同源比较(FASTA)表。

表3

98％Identity in 954 overlaps

Query  1       ATGGCGGCCGATCGAAACACCGGTCATACAGAAGGGGACAAACTTGATGTATTAAAATCG 60

               ||||| |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194739  ATGGCAGCCGATCGAAACACCGGTCATACAGAAGAGGACAAACTTGATGTATTAAAATCA 194680

Query  61      ACCCAAACCGTAATACATAAGGCTCTGGAAAAATTGGGATATCCCGAAGAGGTATACGAA 120

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194679  ACCCAAACCGTAATACATAAGGCTCTGGAAAAATTGGGATATCCCGAAGAGGTATACGAA 194620

Query  121     TTGTTAAAAGAGCCGATGAGATTATTAACGGTAAAAATACCTGTTCGTATGGACGACGGT 180

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct 194619   TTGTTAAAAGAGCCGATGAGATTATTAACGGTAAAAATACCTGTTCGTATGGACGACGGT 194560

Query 181      TCAGTTAAGATTTTCACAGGATATCGTGCGCGGCACAATGACTCTGTCGGTCCAACGAAA 240

               ||||| |||||||||||||||||||||  || ||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194559  TCAGTAAAGATTTTCACAGGATATCGT--GC-GCACAATGACTCTGTCGGTCCAACGAAA 194503

Query 241      GGCGGGATACGTTTTCACCCGAATGTAACAG-AAAA-A---G-A---GGTGAAGGCGCTT 291

               ||||||||||||||||||||||| ||||||| |||| |   | |   |||||||||||||

Sbjct  194502  GGCGGGATACGTTTTCACCCGAACGTAACAGAAAAAGAGGTGAAGGCGGTGAAGGCGCTT  194443

Query  292     TCAATTTGGATGAGTTTAAAATGCGGCATAATTGATCTTCCATATGGCGGTGGTAAAGGC  351

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194442  TCAATTTGGATGAGTTTAAAATGCGGCATAATTGATCTTCCATATGGCGGTGGTAAAGGC  194383

Query  352     GGAATTGTTTGTGATCCAAGGGATATGTCGTTTAGAGAGCTGGAGCGTCTGAGCAGAGGG  411

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194382  GGAATTGTTTGTGATCCAAGGGATATGTCGTTTAGAGAGCTGGAGCGTCTGAGCAGAGGG  194323

Query  412     TATGTCAGAGCGATCAGCCAAATTGTCGGCCCGACAAAAGACGTGCCGGCACCGGATGTA  471

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194322  TATGTCAGAGCGATCAGCCAAATTGTCGGCCCGACAAAAGACGTGCCGGCACCGGATGTA  194263

Query  472     TTTACAAACTCACAAATCATGGCTTGGATGATGGATGAGTATTCAAGAATTGATGAATTT  531

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194262  TTTACAAACTCACAAATCATGGCTTGGATGATGGATGAGTATTCAAGAATTGATGAATTT  194203

Query  532     AATTCGCCTGGATTTATTACAGGCAAACCGCTTGTGCTTGGCGGATCTCACGGGAGAGAA  591

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194202  AATTCGCCTGGATTTATTACAGGCAAACCGCTTGTGCTTGGCGGATCTCACGGGAGAGAA  194143

Query  592     TCTGCGACAGCAAATGGTGTTACCATCTGTATTAAAGAAGCGGCTAAGAAGAGAGGCATC  651

               |||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194142  TCTGCGACAGCAAAAGGTGTTACCATCTGTATTAAAGAAGCGGCTAAGAAGAGAGGCATC  194083

Query  652     GATATTAAAGGTGCGCGTGTCGTTGTCCAAGGCTTCGGAAACGCGGGAAGCTATTTGGCA  711

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194082  GATATTAAAGGTGCGCGTGTCGTTGTCCAAGGCTTCGGAAACGCGGGAAGCTATTTGGCA  194023

Query  712     AAATTTATGCATGATGCGGGGGCAAAAGTTGTCGGCATCTCAGATGCGTATGGCGGACTT  771

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  194022  AAATTTATGCATGATGCGGGGGCAAAAGTTGTCGGCATCTCAGATGCGTATGGCGGACTT  193963

Query  772     TATGATCCGGAAGGCCTTAATATCGATTGTTTACTCGACCGACGCGACAGCTTCGGTACC  831

               |||||||||||||||||| ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  193962  TATGATCCGGAAGGCCTTGATATCGATTATTTACTCGACCGACGCGACAGCTTCGGTACC  193903

Query  832     GTAACAAAGCTTTTCAACGATACCATTACCAACCAAGAGCTGCTGGAGCTGGATTGTGAT  891

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  193902  GTAACAAAGCTTTTCAACGATACCATTACCAACCAAGAGCTGCTGGAGCTGGATTGTGAT  193843

Query  892     ATTCTCGTTCCTGCTGCGATTGAAAATCAAATTACAGAAGAAAATGCCCATAATATTCGG  951

               |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||

Sbjct  193842  ATTCTCGTTCCTGCTGCGATTGAAAATCAAATTACAGAAGAAAATGCCCATAATATCCGG  193783

Query  952     GCTAAAATTGTCGTTGAAGCAGCGAACGGACCAACAACGCTTGAAGGAACAAAGATTCTT  1011

               |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||

Sbjct  193782  GCTAAAATTGTCGTTGAAGCAGCGAACGGACCAACAACGCTTGAAGGAACAAAAATTCTT  193723

Query  1012    TCAGACCGGGACATTCTGCTTGTACCAGACGTGCTGGCAAGTGCCGGTGGCGTAACAGTT  1071

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  193722  TCAGACCGGGACATTCTGCTTGTACCAGACGTGCTGGCAAGTGCCGGTGGCGTAACAGTT  193663

Query  1072    TCTTATTTTGAATGGGTTCAGAATAACCAAGGCTTCTACTGGAGTGAAGAAGAGGTAGAA  1131

               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  193662  TCTTATTTTGAATGGGTTCAGAATAACCAAGGCTTCTACTGGAGTGAAGAAGAGGTAGAA  193603

Query  1132    GAAAAATTAGAAAAAATGATGGTCAAATCATTTAACAATATTTATGAAATGGCTAACAAC  1191

               |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||

Sbjct  193602 GAAAAATTAGAAAAAATGATGGTCAAATCATTTAACAATATTTACGAAATGGCTAACAAC 193543

Query  1192   CGAAGAATTGACATGAGGCTCGCTGCATATATGGTCGGCGTTCGCAAAATGGCTGAAGCT 1251

              ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Sbjct  193542 CGAAGAATTGACATGAGGCTCGCTGCATATATGGTCGGCGTTCGCAAAATGGCTGAAGCT 193483

Query  1252   TCGCGTTTTAGAGGCTGGATATAA 1275

              ||||||||||||||||||||||||

Sbjct  193482 TCGCGTTTTAGAGGCTGGATATAA 193459

Query：纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的核酸序列

Sbjct：枯草芽孢杆菌168谷氨酸脱氢酶的核酸序列

表4为本发明的纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶与枯草芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

表4

98％ Identity in 427aa overlaps

Query  1    MAADRNTGHTEGDKLDVLKSTQTVIHKALEKLGYPEEVYELLKEPMRLLTVKIPVRMDDG 60

            MAADRNTGHTEDKLDVLKSTQTVIHKALEKLGYPEEVYELLKEPMRLLTVKIPVRMDDG

Sbjct  1    MAADRNTGHTEEDKLDVLKSTQTVIHKALEKLGYPEEVYELLKEPMRLLTVKIPVRMDDG 60

Query  61   SVKIFTGYRARHNDSVGPTKGGIRFHPNVTEKEVKA---LSIWMSLKCGIIDLPYGGGKG 117

            SVKIFTGYRA HNDSVGPTKGGIRFHPNVTEKEVKA   LSIWMSLKCGIIDLPYGGGKG

Sbjct  61   SVKIFTGYRA-HNDSVGPTKGGIRFHPNVTEKEVKAVKALSIWMSLKCGIIDLPYGGGKG 119

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            GIVCDPRDMSFRELERLSRGYVRAISQIVGPTKDVPAPDVFTNSQIMAWMMDEYSRIDEF

Sbjct 120   GIVCDPRDMSFRELERLSRGYVRAISQIVGPTKDVPAPDVFTNSQIMAWMMDEYSRIDEF 179

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            NSPGFITGKPLVLGGSHGRESATA GVTICIKEAAKKRGIDIKGARVVVQGFGNAGSYLA

Sbjct  180  NSPGFITGKPLVLGGSHGRESATAKGVTICIKEAAKKRGIDIKGARVVVQGFGNAGSYLA 239

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            KFMHDAGAKVVGISDAYGGLYDPEGL+ID LLDRRDSFGTVTKLFNDTITNQELLELDCD

Sbjct  240  KFMHDAGAKVVGISDAYGGLYDPEGLDIDYLLDRRDSFGTVTKLFNDTITNQELLELDCD 299

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            ILVPAAIENQITEENAHNIRAKIVVEAANGPTTLEGTKILSDRDILLVPDVLASAGGVTV

Sbjct  300  ILVPAAIENQITEENAHNIRAKIVVEAANGPTTLEGTKILSDRDILLVPDVLASAGGVTV 359

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            SYFEWVQNNQGFYWSEEEVEEKLEKMMVKSFNNIYEMANNRRIDMRLAAYMVGVRKMAEA

Sbjct  360  SYFEWVQNNQGFYWSEEEVEEKLEKMMVKSFNNIYEMANNRRIDMRLAAYMVGVRKMAEA 419

Query  418  SRFRGWI 424

            SRFRGWI

Sbjct  420  SRFRGWI 426

Query：纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列

Sbjct：枯草芽孢杆菌168谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列

步骤四，基因功能的鉴定

1、构建表达载体

设计酶切位点(EcoR I、Nhe I)，合成引物(加接头引物CGTACGG)。

F-CGTACGGCTAGCATGGCGGCCGATCGAAAC    ——nhel

R-CGCTAGGAATTCCGATTGGCATTTCACTTT    ——ECORI接头

PCR扩增后，将产物纯化。将目的基因和载体双酶切后，纯化酶切产物。将上述双酶切产物用T4连接酶与载体连接，转入DH5α，菌落PCR检测后，挑选阳性转化子送去测序。

2、诱导表达

重组表达质粒转化至E.Coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种于LB液体培养基(含Kan 50μg/ml)，次日按1％比例转接入新鲜的Kan-LB，37℃摇床培养3小时后，取菌液1ml在37℃继续培养做非诱导表达9小时，其余菌液加IPTG至终浓度为0.4mM，28℃培养9小时。

3、表达产物SDS-PAGE分析

诱导表达和非诱导表达的菌液各1ml，12000rpm离心1min，去上清，加50μl水重悬后，加入40μl的2×SDS上样缓冲液，混匀，再加入10μl的DTT，99℃干浴5min，取15μl进行SDS-PAGE电泳。浓缩胶和分离胶分别为5％和12％，浓缩胶电压为80V，分离胶电压为120V。电泳凝胶经考马斯亮兰快速染色液染色2小时，置脱色摇床上进行脱色。

10ml 12％的分离胶：H₂O 3.2ml，30％丙烯酰胺混合液4.0ml，1.5mol/lTris(pH8.8)2.6ml，10％SDS 0.1ml，10％过硫酸铵0.1ml，TEMED 0.004ml。

2ml 5％的积层胶：H₂O 1.4ml，30％丙烯酰胺混合液0.33ml，1.0mol/lTris(pH6.8)0.25ml，10％SDS 0.02ml，10％过硫酸铵0.02ml，TEMED 0.002ml。

5×Tris甘氨酸电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94.0g，10％SDS 50ml，定容至1000ml。

脱色液：125ml乙醇，40ml冰醋酸，加水至500ml。

4、GDH纯化

(1)超声破菌：

诱导培养后的细菌在4℃以10000rpm离心5min，收集菌体，PBS洗一遍，再用PBS重悬，置于冰浴中，超声破菌(350W，持续5s，间隔10s，共20次)，10000rpm离心10min，分别保留上清和沉淀，12％SDS-PAGE的分析结果见图3。

图中：

泳道1：0.2mM IPTG，诱导2h，上清；

泳道2：0.2mM IPTG，诱导2h，沉淀；

泳道3：0.2mM IPTG，诱导4h，上清；

泳道4：0.2mM IPTG，诱导4h，沉淀；

泳道5：0.4mM IPTG，诱导2h，上清；

泳道6：0.4mM IPTG，诱导2h，沉淀；

泳道7：0.4mM IPTG，诱导4h，上清；

泳道8：0.4mM IPTG，诱导4h，沉淀。

图中结果显示，超声破菌后，重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。

(2)包涵体的变性、纯化、复性

取100mL经适宜浓度IPTG诱导6h后的细菌培养物，8000×g离心5min，收集菌体，以PBS(pH＝7.2)洗涤菌体一次；

然后将菌体重悬于1/10体积的PBS中，超声波破碎至溶液不再粘稠(须冰上操作)；

5,000g离心15分钟，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。其他可溶蛋白部分位于上清中；

移去上清，每100ml培养物的沉淀重悬于10ml 1×结合缓冲液(含6M尿素)；

冰浴孵育1小时，彻底溶解包涵体。离心去除不溶成分；

将1ml 50％Ni-NTA His·Bind树脂悬液加到4ml细胞裂解液中，轻柔混匀(如旋转混合器200rpm)，室温结合15～60min；

将裂解液与Ni-NTA His·Bind树脂的混合物小心加入下端封闭的空色谱柱中；

除去柱下端封闭盖子，收集流出液(穿过峰)，用于SDS-PAGE分析；

以4ml buffer C(8M尿素，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris-CI，pH6.3)漂洗杂蛋白2次。保存漂洗组分用于SDS-PAGE分析；

以0.5ml buffer D(8M尿素，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris-CI，pH5.9)洗脱目的蛋白4次，再以0.5ml buffer E(8M尿素，0.1M NaH₂PO₄，0.01M Tris-Cl，pH4.5)洗4次，收集组分，并用SDS-PAGE分析。蛋白单体通常用buffer D即可洗脱，而多聚体、聚合物和含两个His·Tag标签的蛋白通常由buffer E洗脱；

收集的蛋白洗脱液中，加105μL 20％的PEG4000、210μL 50mmol/L的氧化型谷胱甘肽和210μL 100mmol/L的还原型谷胱甘肽，室温静置约2h；转至处理好的透析袋中，用TE(pH＝7.2)透析2～3天，每天换液5～7次。

5、蛋白浓度及GDH酶活测定

在25℃，取酶液与酶活测定液各1.5ml测定GDH催化辅酶NADP⁺还原所引起的光吸收值在340nm波长处的变化。

GDH活力测定：反应液中含0.1m Tris/HCl缓冲液(pH 9.0)，350mM L-谷氨酸，2mM NADP⁺，终体积为1ml；定义每分钟催化1μmol NADP⁺还原所需的酶量为一个酶活力单位(U)。对照为不含GDH的缓冲液。结果如表5所示。

酶活＝ΔOD₃₄₀×2/0.0618

蛋白浓度＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀

表5纯化前后GDH酶活比较

蛋白样	GDH酶活U	蛋白浓度mg/ml	GDH比活U/mg
				纯化前	3.8134	0.9564	3.9872
纯化后	2.0254	0.2150	9.4205

序列表

<110>上海交通大学

<120>纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因、蛋白及菌株

<160>2

<170>PatentIn Version 3.5

<210>1

<211>1275

<212>DNA

<213>纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)

<400>1

ttatatccag cctctaaaac gcgaagcttc agccattttg cgaacgccga ccatatatgc     60

agcgagcctc atgtcaattc ttcggttgtt agccatttca taaatattgt taaatgattt    120

gaccatcatt ttttctaatt tttcttctac ctcttcttca ctccagtaga agccttggtt    180

attctgaacc cattcaaaat aagaaactgt tacgccaccg gcacttgcca gcacgtctgg    240

tacaagcaga atgtcccggt ctgaaagaat ctttgttcct tcaagcgttg ttggtccgtt    300

cgctgcttca acgacaattt tagcccgaat attatgggca ttttcttctg taatttgatt    360

ttcaatcgca gcaggaacga gaatatcaca atccagctcc agcagctctt ggttggtaat    420

ggtatcgttg aaaagctttg ttacggtacc gaagctgtcg cgtcggtcga gtaaacaatc    480

gatattaagg ccttccggat cataaagtcc gccatacgca tctgagatgc cgacaacttt    540

tgcccccgca tcatgcataa attttgccaa atagcttccc gcgtttccga agccttggac    600

aacgacacgc gcacctttaa tatcgatgcc tctcttctta gccgcttctt taatacagat    660

ggtaacacca tttgctgtcg cagattctct cccgtgagat ccgccaagca caagcggttt    720

gcctgtaata aatccaggcg aattaaattc atcaattctt gaatactcat ccatcatcca    780

agccatgatt tgtgagtttg taaatacatc cggtgccggc acgtcttttg tcgggccgac    840

aatttggctg atcgctctga cataccctct gctcagacgc tccagctctc taaacgacat     900

atcccttgga tcacaaacaa ttccgccttt accaccgcca tatggaagat caattatgcc     960

gcattttaaa ctcatccaaa ttgaaagcgc cttcacctct ttttctgtta cattcgggtg    1020

aaaacgtatc ccgcctttcg ttggaccgac agagtcattg tgccgcgcac gatatcctgt    1080

gaaaatctta actgaaccgt cgtccatacg aacaggtatt tttaccgtta ataatctcat    1140

cggctctttt aacaattcgt atacctcttc gggatatccc aatttttcca gagccttatg    1200

tattacggtt tgggtcgatt ttaatacatc aagtttgtcc ccttctgtat gaccggtgtt    1260

tcgatcggcc gccat                                                     1275

<210>2

<211>424

<212>PRT

<213>纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)

<400>2

Met Ala Ala Asp Arg Asn Thr Gly Thr His Glu Gly Asp Lys Leu

 1               5                  10                  15

Asp Val Leu Lys Ser Thr Gln Thr Val Ile His Lys Ala Leu Glu

                 20                  25                  30

Lys Leu Gly Tyr Pro Glu Glu Val Tyr Glu Leu Leu Lys Glu Pro

                 35                  40                  45

Met Arg Leu Leu Thr Val Lys Ile Pro Val Arg Met Asp Asp Gly

                 50                  55                  60

Ser Val Lys Ile Phe Thr Gly Tyr Arg Ala Arg His Asn Asp Ser

                 65                  70                  75

Val Gly Pro Thr Lys Gly Gly Ile Arg Phe His Pro Asn Val Thr

                 80                  85                  90

Glu Lys Glu Val Lys Ala Leu Ser Ile Trp Met Ser Leu Lys Cys

                 95                 100                 105

Gly Ile Ile Asp Leu Pro Tyr Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ile Val

                110                 115                 120

Cys Asp Pro Arg Asp Met Ser Phe Arg Glu Leu Glu Arg Leu Ser

                125                 130                 135

Arg Gly Tyr Val Arg Ala Ile Ser Gln Ile Val Gly Pro Thr Lys

                140                 145                 150

Asp Val Pro Ala Pro Asp Val Phe Thr Asn Ser Gln Ile Met Ala

                155                 160                 165

Trp Met Met Asp Glu Tyr Ser Arg Ile Asp Glu Phe Asn Ser Pro

                170                 175                 180

Gly Phe Ile Thr Gly Lys Pro Leu Val Leu Gly Gly Ser His Gly

                185                 190                 195

Arg Glu Ser Ala Thr Ala Asn Gly Val Thr Ile Cys Ile Lys Glu

                200                 205                 210

Ala Ala Lys Lys Arg Gly Ile Asp Ile Lys Gly Ala Arg Val Val

                215                 220                 225

Val Gln Gly Phe Gly Asn Ala Gly Ser Tyr Leu Ala Lys Phe Met

                230                 235                 240

His Asp Ala Gly Ala Lys Val Val Gly Ile Ser Asp Ala Tyr Gly

                245                 250                 255

Gly Leu Tyr Asp Pro Glu Gly Leu Asn Ile Asp Cys Leu Leu Asp

                260                 265                 270

Arg Arg Asp Ser Phe Gly Thr Val Thr Lys Leu Phe Asn Asp Thr

                275                 280                 285

Ile Thr Asn Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Cys Asp Ile Leu Val

                290                 295                 300

Pro Ala Ala Ile Glu Asn Gln Ile Thr Glu Glu Asn Ala His Asn

                305                 310                 315

Ile Arg Ala Lys Ile Val Val Glu Ala Ala Asn Gly Pro Thr Thr

                320                 325                 330

Leu Glu Gly Thr Lys Ile Leu Ser Asp Arg Asp Ile Leu Leu Val

                335                 340                 345

Pro Asp Val Leu Ala Ser Ala Gly Gly Val Thr Val Ser Tyr Phe

                350                 355                 360

Glu Trp Val Gln Asn Asn Gln Gly Phe Tyr Trp Ser Glu Glu Glu

                365                 370                 375

Val Glu Glu Lys Leu Glu Lys Met Met Val Lys Ser Phe Asn Asn

                380                 385                 390

Ile Tyr Glu Met Ala Asn Asn Arg Arg Ile Asp Met Arg Leu Ala

                395                 400                 405

Ala Tyr Met Val Gly Val Arg Lys Met Ala Glu Ala Ser Arg Phe

                410                 415                 420

Arg Gly Trp Ile

            424

Claims (3)

1.一种纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因，其特征在于，其序列如SEQ IDNO：1所示。

2.如权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶编码基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种纳豆芽孢杆菌(Bacillus Natto)SJTU 1-4 CGMCC NO.2801。

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