CN109652355A - 一种降糖纳豆芽孢杆菌及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于糖尿病防治制剂技术领域，具体涉及一种降糖纳豆芽孢杆菌及制备方法和应用。本发明将SEQ ID NO.1所示的GLP‑1基因序列克隆入载体中，然后转化入纳豆芽孢杆菌，制备出能够表达胰高血糖素养肽‑1(GLP‑1)的降糖纳豆芽孢杆菌。本发明利用纳豆芽孢杆菌产生芽孢，是对人类安全的益生菌，纳豆芽孢杆菌的芽孢可以抵抗胃酸，使其到达小肠生长，在乳糖诱导下，插入的GLP‑1基因表达，分泌到肠道内，人体吸收后，促进胰岛细胞分泌胰岛素，达到II型糖尿病的作用；该菌易于大规模生产，成本低，更加经济适用。
Description
技术领域
本发明属于糖尿病防治制剂技术领域，具体涉及一种降糖纳豆芽孢杆菌及制备方法和应用。
背景技术
糖尿病已经被列为继心脑血管疾病和肿瘤之后的第三大杀手。随着生活模式、饮食结构改变，全球糖尿病患病率呈急剧上升的趋势。预计到2030年，世界糖尿病患病人数将增至3.66亿人，糖尿病将成为很多家庭和社会的一个沉重负担。
Ⅱ型糖尿是最为常见的类型，Ⅱ型糖尿病患者的病因是多方面的，一些病人是由于胰岛素分泌量的不足，然而有些糖尿病人体内胰岛素不仅不缺乏反而高于正常，其病因是对胰岛素不敏感(即胰岛素抵抗)，Ⅱ型糖尿病患者中绝大多数人不可避免的要用药物来治疗。针对病因的不同，口服降糖药可分为三类：第一类为磺酰胺脲类，如优降糖、糖适平、达美康、美吡达等；磺酰脲类能够刺激胰岛分泌胰岛素，但胰岛素分泌多了以后，可以引起低血糖，低血糖对患者而言也是一个更不可忽视的危险因素，而且部分药物具有较大的副作用，如可引起肝功能损伤。第二类为双胍类，如降糖灵和二甲双胍。双胍类药并不刺激胰岛素分泌，它刺激机体在细胞水平上提高胰岛素的利用，它针对的是对胰岛素不敏感的病人，但对于胰岛素分泌不足的糖尿病患者而言，其发挥的作用就很有限，而且还有乳酸性酸中毒等不良反应。第三类药是a糖苷酶抑制剂，如拜糖平。这类药的作用是减少人体对饮食中糖的吸收，因为吸收减少，从而减缓血糖升高。但该药的副作用包括胃肠反应，而且其用药量不好把握，服用后易发生低血糖反应，届时就要口服或静脉注射葡萄糖。
为了开发新的降糖药物，近年来对胰高血糖素养肽-1(GLP-1)研究进展很快，并用其治疗Ⅱ型糖尿病已经取得了较好的疗效。GLP-1以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减少胰岛α细胞分泌胰高血糖素(glucagon)，从而降低血糖。正常人在进餐后，肠促胰素开始分泌，其中的GLP-1促进胰岛素分泌，以减少餐后血糖的波动。但Ⅱ型糖尿病患者的“肠促胰素效应”受损，主要表现为进餐后GLP-1浓度升高幅度较正常人有所减少，而其GLP-1促进胰岛素分泌以及降血糖的作用并无明显受损，因此GLP-1及其类似物是治疗Ⅱ型糖尿病的一个重要靶点。
GLP-1主要通过以下几个方面发挥降糖作用：①作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌，并可刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制胰岛β细胞凋亡，增加胰岛β细胞数量。②作用于胰岛α细胞，强烈地抑制胰高血糖素的释放，并作用于胰岛δ细胞，促进生长抑素的分泌，生长抑素又可作为旁分泌激素参与抑制胰高血糖素的分泌。GLP-1具有葡萄糖浓度依赖性降糖作用。作为一种肠源性激素，GLP-1是在营养物质特别是碳水化合物的刺激下才释放入血，其促胰岛素分泌作用呈葡萄糖依赖性。所以GLP-1具有葡萄糖浓度依赖性降糖作用，即只有在血糖水平升高的情况下，GLP-1才发挥降糖作用；而在血糖水平正常时，则不会使其进一步降低。GLP-1的这种葡萄糖浓度依赖性降糖特性是其临床应用安全性的基础与保障，从而免除了人们对现有糖尿病治疗药物及方案可能造成患者严重低血糖的担心。
然而，现有技术中的药物作用机制单一，主要目的仅仅是降糖。
发明内容
本发明的目的是提供一种降糖纳豆芽孢杆菌及制备方法和应用，制备的纳豆芽孢杆菌能生产纳豆激酶、维生素K、GLP-1等多重药效因子，可从多重因素着手降糖，降糖效果良好。
本发明提供的一种降糖纳豆芽孢杆菌，所述降糖纳豆芽孢杆菌中携带有如SEQ IDNO.1所示的第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列。
本发明还提供了一种所述的降糖纳豆芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
S1，合成如SEQ ID NO.1所示的第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列；
S2，将所述第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列克隆入表达载体中，构建成GLP-1重组表达载体；
S3，将GLP-1重组表达载体转化到纳豆芽孢杆菌细胞中，获得能够表达GLP-1的降糖纳豆芽孢杆菌。
优选的，上述降糖纳豆芽孢杆菌的制备方法，S2中所述表达载体为PHT-31。
优选的，上述降糖纳豆芽孢杆菌的制备方法，S2的具体步骤如下：
将如SEQ ID NO.1所示的GLP-1基因序列经Xho I和Not I双酶切，得到含有能够表达GLP-1的目的基因片段；将所述表达载体PHT-31经Xho I和Not I双酶切，得到载体片段，备用；
将目的基因片段与载体片段连接，得到GLP-1重组表达载体。
优选的，上述降糖纳豆芽孢杆菌的制备方法，S3中所述纳豆芽孢杆菌细胞为纳豆芽孢杆菌细胞BNCC157034。
本发明还提供了一种所述的降糖纳豆芽孢杆菌在制备治疗Ⅱ型糖尿病制剂中的应用。
优选的，按照以下方法制备治疗Ⅱ型糖尿病制剂：
将所述降糖纳豆芽孢杆菌接种于用蒸汽高压灭菌的不含有乳糖的普通肉汤培养液，37℃培养16～24小时，3000～4000rpm离心30分钟，收取沉淀，-50～-20℃冰冻干燥，得到可直接食用的纳豆芽孢杆菌菌粉；纳豆芽孢杆菌菌粉中按比例加入乳糖，使其菌落数量达108CFU/g以上，所含乳糖占纳豆芽孢杆菌菌粉总质量的5-50％。
优选的，向所述纳豆芽孢杆菌菌粉中添加食品原料，制成具有降血糖功效的保健食品；或者向所述纳豆芽孢杆菌菌粉中添加淀粉或糊精，并按照药剂学工艺制备成片剂或粉剂。
优选的，按照以下方法制备治疗Ⅱ型糖尿病制剂：利用所述降糖纳豆芽孢杆菌发酵生产具有降血糖功效的纳豆。
与现有技术相比，本发明提供的降糖纳豆芽孢杆菌及制备方法及其应用，至少具有以下有益效果：
鉴于糖尿病患者往往是中老年居多，多种病同时存在，而单一治疗效果不佳。为克服目前糖尿病药物作用机制单一的问题。本发明从胰岛细胞修复、胰岛素刺激释放、胰岛素增敏和直接起胰岛素的作用等全方位考虑，利用基因技术构建表达重组GLP-1纳豆芽孢杆菌，并解决天然GLP-1极易被体内的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解，其血浆半衰期不足2分钟的缺点，针对DPP-Ⅳ降解GLP-1的识别位点在第二位氨基酸A，将其改为不被酶识别G，在不影响生物活性的同时，延长半衰期。
本发明制备的纳豆芽孢杆菌能生产纳豆激酶、维生素K、GLP-1等多重药效因子。本发明提供的降糖纳豆芽孢杆菌及其制备方法，实现了多种药效因子的有效组合，利用胰高血糖素样肽-1促进胰岛细胞分泌胰岛素，葡萄糖耐量因子减低胰岛素抵抗，增进胰岛素的敏感性等治疗糖尿病。降糖纳豆芽孢杆菌易于大规模生产，成本低，而且制剂方便，安全性高。
本发明提供的降糖纳豆芽孢杆菌具有降糖、稳糖的效果，可应用于降低血糖，稳定血糖的药物或制剂制备，在给药后血糖能够大幅度下降，实验表明口服纳豆芽孢杆菌以乳糖作为诱导因子，在肠道表达促进GLP-1，体内降糖、稳糖效果明显。
本发明制备的降糖纳豆芽孢杆菌可用于稳定和降低糖尿病血糖的辅助口服制剂。
附图说明
图1是尿激酶(UK)反应18h后的纤溶圈；
其中，A-E分别为添加100U/ml、200U/ml、400U/ml、600U/ml、800U/ml的标准尿激酶溶液；F为粗酶液。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的试验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
实施例1
本发明提供了一种降糖纳豆芽孢杆菌，所述降糖纳豆芽孢杆菌是在纳豆芽孢杆菌中转化了如SEQ ID NO.1所示的第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列。
实施例2
基于同一种发明构思，本发明还提供了一种所述降糖纳豆芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
S1，合成第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列，该基因序列用于编码胰高血糖素养肽-1(GLP-1)，第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaa gctgccaaggagttcattgcttggctggtgaaaggccgagcggccgcat-3’，其中下划线部分为第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列，5’端含有Xho I酶切序列和信号肽末端序列，3’端与第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列末端序列中含有Not I酶切序列；
胰高血糖素养肽-1(GLP-1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：HXEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR；
S2，将如SEQ ID NO.1所示的GLP-1基因序列克隆入表达载体PHT-31(购自November公司)中，构建成GLP-1重组表达载体；具体步骤如下：
将如SEQ ID NO.1所示的GLP-1基因序列经Xho I和Not I双酶切，得到含有能够表达GLP-1的目的基因片段；将所述表达载体PHT-31经Xho I和Not I双酶切，取长序列片段作为载体片段，备用；
将目的基因片段与载体片段连接，得到GLP-1重组表达载体。
连接体系如下：载体片段3μl、目的基因片段12μl、10×T4-Ligase buffer 3μl、T4DNA Ligase 2μl；总体积20μl；16℃连接过夜(≥12h)。
S3，将GLP-1重组表达载体转化到纳豆芽孢杆菌细胞中，获得能够表达GLP-1的降糖纳豆芽孢杆菌，具体如下：
S31，制备纳豆芽孢杆菌感受态细胞，参考文献“转天蚕素B及串高Met和Lys纳豆芽孢杆菌工程菌的构建”，所用菌种编号为BNCC157034，购自中国微生物菌种保藏中心。
S32，转化
将GLP-1重组表达至于纳豆芽孢杆菌感受态细胞中，200r/min，37℃培养105h，之后取100μL菌液涂布于含氯霉素的LB平板上，倒置于37℃培养箱中过夜培养，并经筛选鉴定后得到能够表达GLP-1的降糖纳豆芽孢杆菌。
利用上述方法制备的降糖纳豆芽孢杆菌，是在乳糖操纵子调控下，无乳糖时不表达，只有用乳糖诱导时才表达，即可以实现肠道中纳豆芽孢杆菌所携带的第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列，在乳糖诱导下，在肠道内表达GLP-1。
在本发明具体实施方式中，第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列采用人工合成方法，或者是基于以下引物并采用融合PCR的方法拼接而成的：
GLP-F1:5’-tactcgagaaaagacatggtgaagggacctttaccagtg-3’，如SEQ ID NO.3所示，
GLP-R1:5’-tccaaataagaacttacatcactggtaaaggtccc-3’，如SEQ ID NO.4所示，
GLP-R2:5’-tccttggcagcttggccttccaaataagaacttac-3’，如SEQ ID NO.5所示，
GLP-R3:5’-accagccaagcaatgaactccttggcagcttggcc-3’，如SEQ ID NO.6所示，
GLP-R4:5’-atgcggccgctcggcctttcaccagccaagcaatg-3’，如SEQ ID NO.7所示。
基于同一种发明构思，本发明还提供了一种利用所述降糖纳豆芽孢杆菌制备治疗Ⅱ型糖尿病制剂的方法。所做制剂特征为含有纳豆杆菌所产生的纳豆激酶、维生素k、GLP-1等，可用于预防血栓形成和骨质疏松，可以降糖。
实施例3
一种利用所述降糖纳豆芽孢杆菌制备治疗Ⅱ型糖尿病制剂的方法：
将利用实施例2制备的降糖纳豆芽孢杆菌接种于用蒸汽高压灭菌的不含有乳糖的普通肉汤培养液，37℃培养16～24小时，3000～4000rpm离心30分钟，收取沉淀，-50～-20℃冰冻干燥，得到可直接食用的纳豆芽孢杆菌菌粉。纳豆芽孢杆菌菌粉中按比例加入乳糖，使其菌落数量达108CFU/g以上，所含乳糖占纳豆芽孢杆菌菌粉总质量的5-50％。
向所述纳豆芽孢杆菌菌粉中添加食品原料，制成具有降血糖功效的保健食品；或者向所述纳豆芽孢杆菌菌粉中添加淀粉或糊精，并按照药剂学工艺制备成片剂或粉剂。
实施例4
利用实施例2制备的降糖纳豆芽孢杆菌发酵生产具有降血糖功效的纳豆。
为了验证本发明的效果，我们进行了如下试验：
一、Ⅱ型糖尿病小鼠模型的治疗实验：
Ⅱ型糖尿病小鼠16只，每只体重在40g±20g，分为二组，每组八只，第一组为乳糖阳性对照组，第二组为纳豆芽孢杆菌实验组。16只小鼠在实验前一天禁食4小时后测量血糖，记录数据。
喂饲方法如下：
纳豆芽孢杆菌实验组：每只鼠每日口服滴喂5g/100ml乳糖2滴、实施例2制备的纳豆芽孢杆菌菌液(1010CFU/ml)1滴。
乳糖阳性对照组：每只鼠每日口服滴喂55g/100ml乳糖2滴。
其余正常饮食饮水。
表1是Ⅱ型糖尿病小鼠模型的治疗实验结果
从上表1可以看出纳豆芽孢杆菌实验组给药30天后血糖值降到了正常值的水平，说明本发明实施例2的纳豆芽孢杆菌具有明显的降糖作用。
二、降糖纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶的测定
接种实施例2制备的纳豆芽孢杆菌于含3g/100ml豆粕的营养肉汤培养基中，200rpm/min、37℃摇床发酵36h。测定发酵终pH，或调整发酵终pH为8.7。发酵液3200g离心20min，取上清液即为粗酶液。用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性，以尿激酶作为阳性对照品。图1尿激酶(UK)反应18h后的纤溶圈，其中，A-E分别为添加100U/ml、200U/ml、400U/ml、600U/ml、800U/ml的标准尿激酶溶液；F为粗酶液。从图1可以看出，本发明制备的纳豆芽孢杆菌可有效表达出纳豆激酶，且制备的纳豆芽孢杆菌发酵液中纳豆激酶活性较高。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 西安培华学院
<120> 一种降糖纳豆芽孢杆菌及制备方法和应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tactcgagaa aagacatggt gaagggacct ttaccagtga tgtaagttct tatttggaag 60
gccaagctgc caaggagttc attgcttggc tggtgaaagg ccgagcggcc gcat 114
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
20 25 30
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tactcgagaa aagacatggt gaagggacct ttaccagtg 39
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tccaaataag aacttacatc actggtaaag gtccc 35
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccttggcag cttggccttc caaataagaa cttac 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
accagccaag caatgaactc cttggcagct tggcc 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgcggccgc tcggcctttc accagccaag caatg 35
Claims (9)
1.一种降糖纳豆芽孢杆菌，其特征在于，所述降糖纳豆芽孢杆菌中携带有如SEQ IDNO.1所示的第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列。
2.根据权利要求1所述的降糖纳豆芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，合成如SEQ ID NO.1所示的第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列；
S2，将所述第二位氨基酸定点突变的GLP-1基因序列克隆入表达载体中，构建成GLP-1重组表达载体；
S3，将GLP-1重组表达载体转化到纳豆芽孢杆菌细胞中，获得能够表达GLP-1的降糖纳豆芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的降糖纳豆芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，S2中所述表达载体为PHT-31。
4.根据权利要求3所述的降糖纳豆芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，S2的具体步骤如下：
将如SEQ ID NO.1所示的GLP-1基因序列经Xho I和Not I双酶切，得到含有能够表达GLP-1的目的基因片段；将所述表达载体PHT-31经Xho I和Not I双酶切，得到载体片段，备用；
将目的基因片段与载体片段连接，得到GLP-1重组表达载体。
5.根据权利要求1所述的降糖纳豆芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，S3中所述纳豆芽孢杆菌细胞为纳豆芽孢杆菌细胞BNCC157034。
6.根据权利要求1所述的降糖纳豆芽孢杆菌在制备治疗Ⅱ型糖尿病制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，按照以下方法制备治疗Ⅱ型糖尿病制剂：
将所述降糖纳豆芽孢杆菌接种于用蒸汽高压灭菌的不含有乳糖的普通肉汤培养液，37℃培养16～24小时，3000～4000rpm离心30分钟，收取沉淀，-50～-20℃冰冻干燥，得到可直接食用的纳豆芽孢杆菌菌粉；纳豆芽孢杆菌菌粉中按比例加入乳糖，使其菌落数量达108CFU/g以上，所含乳糖占纳豆芽孢杆菌菌粉总质量的5-50％。
8.根据权利要求6所述的降糖纳豆芽孢杆菌，其特征在于，向所述纳豆芽孢杆菌菌粉中添加食品原料，制成具有降血糖功效的保健食品；或者向所述纳豆芽孢杆菌菌粉中添加淀粉或糊精，并按照药剂学工艺制备成片剂或粉剂。
9.根据权利要求6所述的降糖纳豆芽孢杆菌，其特征在于，按照以下方法制备治疗Ⅱ型糖尿病制剂：利用所述降糖纳豆芽孢杆菌发酵生产具有降血糖功效的纳豆。
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