CN102895364A - 一种具有治疗糖尿病功效的中药活性成分 - Google Patents

Abstract

本发明为栀子苷作为GLP-1受体激动剂发挥保护胰岛β细胞作用，属于中药学、内分泌学和分子药理学相结合的领域，是具体涉及栀子苷通过特异性激活胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）信号通路，从而促进胰岛β细胞生存，进而实现其降糖功效。本发明采用降糖中药栀子活性成分栀子苷培养小鼠原代胰岛β细胞，能显著促进β细胞增殖，抑制其凋亡，同时降低高糖或炎症因子环境下β细胞凋亡率。通过siRNA实验降低GLP-1R在β细胞表达，栀子苷对β细胞的保护作用被抑制。本发明揭示了栀子苷作为GLP-1R激动剂，通过特异性激活GLP-1R通路实现保护胰岛细胞作用，阐明栀子治疗糖尿病的分子药理机制，为中医药治疗糖尿病提供理论依据。

Description

一种具有治疗糖尿病功效的中药活性成分

技术领域

本发明属于中药学、内分泌学和分子药理学相结合的领域，具体涉及中药栀子的活性成分栀子苷（geniposide），栀子苷作为一种胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）激动剂，通过特异性激活GLP-1R信号通路，通过保护胰岛细胞生存，进而达到实现降低糖尿病模型小鼠血糖水平的功效，在此基础上可进一步开发出含栀子苷的治疗糖尿病的药物。

背景技术

近年来糖尿病（Diabetes Mellitus），尤其是2型糖尿病（Type 2Diabetes Mellitus,T2DM）已成为与心血管疾病，肿瘤并列的发病率和死亡率最高的三大非传染性疾病之一。β细胞衰竭是糖尿病致病机制的核心环节，是糖尿病发生、发展的病理生理基础，β细胞再生及功能修复成为近年来糖尿病研究领域的重要方向。

栀子：别名黄栀子、山栀、白蟾，是茜草科植物栀子的果实。目前，栀子的果实是传统中药，属卫生部颁布的第l批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用，在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。栀子中含有40余种生理活性物质,其中为国内外所公认的中药栀子有效成分为环烯醚萜类物质。栀子所含的环烯醚萜类物质包括栀子苷、京尼平苷、羟异栀子苷、栀子苷酸等,其中活性成分最高的是栀子苷和京尼平苷。栀子苷的化学式：

近年来肠促胰素（incretin）的发现极大地拓宽了人们对2型糖尿病发病和治疗的理念，开辟了全新的研究空间。肠促胰素是一类肠源性激素，包括胰高血糖素样肽1（GLP-1）、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）等。其中GLP-1是近年来2型糖尿病治疗新靶点。GLP-1在肠道L细胞内合成并分泌，通过与其受体结合激活下游信号通路，主要生理作用是刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰高血糖素分泌，从而降低餐后血糖。GLP-1对β细胞的直接保护作用备受关注，它能够上调胰岛素基因表达，直接减少β细胞凋亡，促进β细胞增殖再生，促进胰岛素合成作用，有益于改善β细胞功能。然而，内源性GLP-1和GIP的半衰期很短，通常在数分钟内就会被体内二肽基肽酶4（DPP-4）降解。GLP-1受体激动剂，DPP-4抑制剂的研发成为治疗T2DM的新策略。基于GLP-1的药物近年来在我国陆续进入临床应用。目前已在中国上市的GLP-1受体激动剂如艾塞那肽和利拉鲁肽，DPP-4抑制剂类有例如西格列汀、沙格列汀及维格列汀。基于GLP-1效应的新药研发依旧是目前糖尿病治疗药物研发热点。

发明内容

本发明要解决的技术问题：

已知中药栀子能用于糖尿病的治疗，但是其作用机制一直未被揭示，本发明则通过大量的研究，解决了如下长期困惑了糖尿病治疗领域的问题：中药栀子的降糖功效是通过其活性成分栀子苷，而栀子苷则是潜在的一种GLP-1受体激动剂，具有保护胰岛β细胞、降低血糖功效的特性。本发明解决了长期以来学术界一直对栀子治疗T2DM作用机理未知的技术问题，在作用机理明确以后，即可以在进一步的工业化生产中大规模的生产出含栀子苷的治疗2型糖尿病特效药物。

本发明采用的技术方案：

一种来源于中药栀子的具有治疗糖尿病功效的药物，其有效成分为从中药栀子提取出的栀子苷，将栀子苷作为GLP-1受体激动剂，通过特异性激活GLP-1R信号通路的途径来保护胰岛β细胞，从而实现降低体内血糖水平的功效。

本发明的有益效果：

中国糖尿病患者最新数量已近1亿，是世界上糖尿病患者人数最多的国家。现有治疗药物存在各种不足：例如促进胰岛素分泌剂磺脲类易发生低血糖、双胍类轻者有消化道胃肠反应重者乳酸性酸中毒、α葡萄糖苷酶抑制剂不宜用于胃肠道功能紊乱者、胰岛素增敏剂有全身水肿的副作用故心力衰竭者慎用。而中医药治疗糖尿病历史悠久，疗效确切，价格便宜，服用安全，因此本发明对从天然中药中寻找出新型抗糖尿病活性化合物具有重要意义。

附图说明

图1为栀子苷对糖尿病模型小鼠的降糖作用（con对照组，con/gen对照+栀子苷组，diabetes糖尿病模型组，diab/gen糖尿病+栀子苷组）。

图2为显微镜下纯化后培养的小鼠胰岛细胞团。

图3为分离纯化培养的小鼠胰岛β细胞在不同培养条件下增殖与凋亡比例（5.5=5.5mM葡萄糖，33.3=33.3mM葡萄糖，ILIF=IL-1β+IFN-γ）。

图4为scramble siRNA及siGLP-1R处理的Ins1细胞中GLP-1R基因及下游信号通路主要成员Akt激活表达水平的比较。

图5为栀子苷分别刺激scramble siRNA及siGLP-1R处理的小鼠胰岛细胞增殖与凋亡比例数据图。

具体实施方式

实施例

1.2型糖尿病模型动物降糖作用实验：

采用SPF级C57/BL6小鼠，重量18-20克，随机分为4组，每组6只。动物实验分组情况见表1。

表1.动物实验分组设计（为单次实验设计数量，共重复3次）

分别为对照组（con，普通饲料喂养，PBS空白给药），对照给药组（con/gen,普通饲料喂养，栀子苷给药100mg/kg），糖尿病模型组（diabetes，采用高脂饲料HFD（（hige fat diet,63.47%热量来源于脂肪））喂养8周后，腹腔注射streptozotocin（STZ）链脲霉素30mg/kg造模，PBS空白对照）。糖尿病模型治疗组（diab/gen，同为HFD喂养，STZ造模，栀子苷给药100mg/kg）。造模后每天监测血糖水平，一周后确定糖尿病模型小鼠血糖显著升高，模型成功后，从第7天开始隔日给药直至21天，同时继续监测血糖水平。血糖检测结果数值见表2，血糖变化曲线图见图1（栀子苷对糖尿病模型小鼠的降糖作用，con对照组，con/gen对照+栀子苷组，diabetes糖尿病模型组，diab/gen糖尿病+栀子苷组）。

表2.动物实验小鼠血糖检测结果（单位：mg/dl）

（*表示糖尿病模型栀子苷给药与不给药组比较，p<0.05,具有显著差异）

可以明显看到，采用HFD饲料+低剂量链脲霉素注射方法能够显著诱导模型小鼠血糖持续升高，与普通饲料对照组小鼠相比较具有显著性差异（P<0.05），表明糖尿病小鼠模型成功。而栀子苷给药治疗组能够有效降低糖尿病模型小鼠的血糖水平，与PBS对照组相比较效果显著（P<0.05），表明栀子苷具有良好的降糖作用。而在普通饲料喂养小鼠中，栀子苷给药对小鼠的血糖无影响，表明栀子苷对正常血糖调节没有副作用，不会造成低血糖，具有较好的安全性。

2.细胞培养：

大鼠胰腺癌细胞系INS-1细胞培养基为RPMI1640（含11mM葡萄糖，100U/ml抗生素，10%胎牛血清，1mM丙酮酸钠，50uM巯基乙醇及10mM HEPES）。

3.小鼠胰岛细胞分离及培养：

采用SPF级C57/BL6小鼠，分离方法来自德国不莱梅大学Maedler教授实验室。小鼠颈椎脱臼法处死，通过胆管向胰腺灌注预冷的胶原酶消化液（2mg/ml）约2ml，分离胰腺放入50mlFalcon离心管（预留2ml胶原酶消化液），37℃水浴振荡消化15分钟，当观察到胰腺组织已被分解为糜状，加入30ml预冷的HBSS终止消化，HBSS洗涤两次，4℃每次1200rpm离心2min。组织沉淀加入13ml的Histopaque 1119，振荡重悬沉淀，然后小心加入12ml预冷培养基，保持溶液界面清晰。4℃，2500rpm离心25min，离心设定无加速无骤停。离心结束后，可以看到溶液界面上分布的云状白色小颗粒，即为分离的胰岛。小心吸出胰岛细胞团，培养基洗涤两次后置于5%二氧化碳细胞培养箱中培养。细胞培养基为RPMI1640（含11mM葡萄糖，100U/ml抗生素，10%胎牛血清）。纯化的胰岛见图2（显微镜下纯化后培养的小鼠胰岛细胞团）。

4.小鼠胰岛细胞增殖及凋亡检测：

栀子苷具有体外保护胰岛细胞生存的作用，实验结果如表3,表4及图3（为分离纯化培养的小鼠胰岛β细胞在不同培养条件下增殖与凋亡比例，其中5.5=5.5mM葡萄糖，33.3=33.3mM葡萄糖，ILIF=IL-1β+IFN-γ）所示，其能够保护糖尿病环境下的胰岛细胞存活。培养的小鼠胰岛细胞栀子苷给药浓度为50mM，高糖培养条件为含33.3mM葡萄糖，细胞炎症因子培养条件为IL-1β浓度为2ng/ml,IFN-γ浓度为1000U/ml。培养3天后细胞用4%的多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100破膜后进行后续染色实验。细胞增殖实验采用Ki67及胰岛素染色，计数Ki67表达阳性β细胞比例作为细胞增殖比率（Ki67是一种细胞增殖期间表达的核蛋白,可作为标记细胞增殖状态的抗原）。而细胞凋亡实验采用TUNEL试剂盒及胰岛素染色进行检测，计数TUNEL标记阳性β细胞比例作为凋亡比率。两组实验均采用DAPI染色标记细胞核。DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。细胞染色计数结果见表3，统计计算结果见表4及图3，可以看到高浓度葡萄糖或细胞炎症因子条件下，小鼠胰岛β细胞增殖被抑制，而凋亡比例升高，表明高糖和炎症因子均损害β细胞的生存（P<0.05,具有显著差异）。栀子苷能够显著保护β细胞的生存，促进β细胞增殖，而凋亡比例减少（表4，P<0.05,具有显著差异）。

表3.小鼠胰岛β细胞增殖与凋亡的细胞染色计数结果

表4.小鼠胰岛β细胞增殖与凋亡的比例

（*表示栀子苷给药与相应的不给药组比较，p<0.05,具有显著差异）

5.GLP-1R基因的RNA干扰（small interfering RNA）实验：siGLP-1R及scramble siRNA购于Ambion公司。GLP-1R抗体购自Abcam公司，p-Akt抗体及actin抗体购于cellsignal公司。

细胞转染实验方法：实验采用6孔板培养中的INS-1细胞及分离培养的小鼠胰岛细胞，INS-1细胞用于信号通路检测，小鼠胰岛细胞用于进行β细胞增殖及凋亡检测。

siGLP-1R及scramble siRNA的转染终浓度为50nM，转染试剂采用Lipofectamine2000和Opti-MEM(均购自Invitrogen公司)。转染混合液的配置方法为：将含有siGLP-1R或scramblesiRNA的Opti-MEM混合溶液500ul（浓度为100nM），和含有3ul Lipofectamine2000的Opti-MEM的溶液500ul振荡混合均匀，室温下放置30min，然后吸去细胞培养基，PBS洗涤一次，加入配置好的1000ul转染混合液，放置在细胞培养箱中6-8h后，吸去转染混合液，加入完全细胞培养基2ml培养3天。

转染后收集INS-1细胞，检测GLP-1R,p-Akt（磷酸化Akt）及actin这三种分子的表达水平变化，其中Akt是GLP-1R信号通路下游的重要分子，当GLP-1R信号通路被激活，Akt被磷酸化激活，从而进一步激活下游通路最终实现促进胰岛β细胞增殖及功能的作用，因此Akt磷酸化水平的增加是GLP-1R通路激活的一个标志。actin是一种最常用的内参蛋白，用来显示各个样品蛋白总量是否一致，避免由于样品蛋白总量不一致造成的误差。

栀子苷的作用依赖于GLP-1R信号通路。如图4（scramble siRNA及siGLP-1R处理的Ins1细胞中GLP-1R基因及下游信号通路主要成员Akt激活表达水平的比较）所示，在培养的大鼠胰腺癌细胞株INS-1细胞中，栀子苷50mM能够显著增加GLP-1受体下游分子Akt的磷酸化水平（标志着GLP-1R信号通路的激活），而当采用siRNA干扰技术，显著降低GLP-1R的表达水平，可以看到栀子苷丧失了对Akt的激活作用，同时栀子苷对小鼠胰岛β细胞促进增殖，抑制凋亡的保护作用也无法实现，见图5（栀子苷分别刺激scramble siRNA及siGLP-1R处理的小鼠胰岛细胞增殖与凋亡比例数据图）。

实验结果见图4，可以看出siGLP-1R能够显著有效的干扰降低GLP-1R的表达，而scramble siRNA对GLP-1R表达无改变。与对照组scr（scramble siRNA）相比较，栀子苷能够显著增加p-Akt的水平，而当GLP-1R表达被siGLP-1R干扰降低后，栀子苷对Akt的活化作用也同时被抑制，表明栀子苷的作用依赖于GLP-1R的表达，是通过激活GLP-1R实现。

而siGLP-1R及scramble siRNA转染后的小鼠胰岛β细胞增殖及凋亡检测进一步证实了这一结论。如图5所示，与对照scr相比较，栀子苷能够显著促进小鼠胰岛β细胞增殖并抑制凋亡（均有显著差异，p<0.05），而在siGLP-1R转染的细胞中，栀子苷丧失了对β细胞的保护作用，表明栀子苷促进β细胞增殖及抑制凋亡的作用依赖于GLP-1R。

总结：本发明首次考察了栀子苷具有保护胰岛细胞生存作用，从全新的角度阐明了栀子苷降糖功效的作用机理。本发明的有益效果是为中医药治疗糖尿病提供了现代分子生物学的理论依据，揭示了栀子治疗糖尿病的分子机制，更为重要的是，我们发现栀子苷的作用是依赖于GLP-1信号通路实现的，栀子苷能够激活GLP-1受体通路，当GLP-1R表达被降低，栀子苷的作用也被抑制。我们首次提出栀子苷作为可能的新型小分子天然化合物GLP-1激动剂开发利用的可能性及可行性，将填补我国在此研究开发领域的空白。栀子苷是天然小分子GLP-1受体激动剂，是一种天然提取物，作用直接，机制明确，且理化性质稳定，与市场上已有多肽类GLP-1类药物相比较，具有使用安全、保存容易、不易降解等优点。

Claims (1)

1.一种来源于中药栀子的具有治疗糖尿病功效的药物，其有效成分为从中药栀子提取出的活性成分栀子苷，其特征为将栀子苷作为GLP-1受体激动剂，通过特异性激活GLP-1R信号通路的途径来保护胰岛β细胞，从而实现降低体内血糖水平的功效。

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