CN102559715A - 一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主以及利用该转化体生产该基因的表达产物及其应用。即以金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌、布鲁氏杆菌;大肠杆菌的亚硝酸盐还原酶基因为参考，进行引物设计，用植物乳杆菌提取的基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因片段，将该片的连接到pET-32a（+）表达载体中，再转入大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，经IPTG诱导后，进行植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶(NiRL)蛋白表达，从而获得植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白。

Description

一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主以及利用该转化体生产该基因的表达产物及其应用。

背景技术

亚硝酸盐还原酶是一类催化亚硝酸盐还原的酶。亚硝酸盐广泛存在于腌制或新鲜食物以饲料中。食品中亚硝酸盐的过量，会使血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，降低血液的载氧能力，造成高铁血红蛋白血症，对人体造成严重危害。亚硝酸盐还可在人体内与仲胺、叔胺和氨基化合物反应形成强致癌物亚硝胺化合物，从而诱发消化系统癌变。鉴于食品中超标亚硝酸盐污染可引起食品安全问题，人们正在努力寻找有效控制或降解亚硝酸盐的方法，生物酶法消除食品亚硝酸盐是一条可行的途径。

迄今，有不少报道认为植物乳酸菌具有降解亚硝酸盐的能力，并推测植物乳酸菌降解亚硝酸盐与所含的亚硝酸盐还原酶有关。然而，目前植物乳酸菌亚硝酸盐还原酶的基因及其基因编码的酶蛋白序列还未见研究报道。

参考文献

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发明内容

本发明的目的之一为了解决上述的问题而提供一种人工合成的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因；

本发明的目的之二提供了一种由上述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因编码的蛋白质。

本发明的目的之三是提供含有上述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因转化而成的质粒。

本发明的目的之四在于提供了一种含有上述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因转化的质粒的重组大肠杆菌。

本发明的技术原理

以金黄色葡萄球菌, 铜绿假单胞菌、布鲁氏杆菌;大肠杆菌等的亚硝酸盐还原酶基因为参考，进行引物设计，用植物乳杆菌提取的基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因片段，将该片的连接到pET-32a（+）表达载体中，再转入大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，经 IPTG 诱导后，进行植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶(NiRL)蛋白表达，获得植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白。

本发明的技术方案

一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1的多核苷酸；

含有上述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因的重组质粒。

上述的重组质粒优选为pET-32a（+）- NiRL质粒，其中所用的载体pET-32a（+）还可以采用常用的其他pET 、pKK223-3或 pHT载体替代。

当选用PET载体时，可以选用大肠杆菌或枯草杆菌表达，当选用pKK223-3载体时要用大肠杆菌JM105表达，而当选用pHT载体时要用枯草杆菌表达系统。

所述的重组质粒转化而成的重组微生物，所述的重组微生物为重组大肠杆菌或重组枯草杆菌，且所述的重组大肠杆菌优选为E.coliBL21（DE3）或JM105。

利用上述的重组大肠杆菌或重组枯草杆菌生产的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶，该还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明的技术效果

本发明通过以金黄色葡萄球菌, 铜绿假单胞菌、布鲁氏杆菌;大肠杆菌等的亚硝酸盐还原酶基因为参考，进行引物设计，用植物乳杆菌提取的基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因片段，将该片的连接到pET-32a（+）表达载体中，再转入大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，经 IPTG 诱导后，进行植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶(NiRL)蛋白表达，从而获得了一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白。

另外，所得的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白可以用于处理肉腌制品或饲料中过量的亚硝酸盐残留，也可以用于植物乳酸菌亚硝酸盐还原酶的分子结构等理论研究。

附图说明

图1、PCR扩增产物鉴定图, 其中M：DNA分子量标准，1：PCR扩增产物，2：阴性对照；

图2、重组质粒双酶切鉴定图，其中M：DNA分子量标准，1：双酶切重组质粒；

图3、PCR产物鉴定图，其中M：DNA分子量标准；1：PCR扩增产物，2：阴性对照；

图4、重组蛋白诱导表达后菌体全蛋白SDS-PAGE电泳检测，其中M：低分子量蛋白标准；1：诱导后重组菌体全蛋白；2：诱导后非重组菌体全蛋白；

图5、实施例4含有植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白提取液的酶活性测定结果；

图6、实施例4无植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白提取液的酶活性测定的阴性对照。

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明的实质，仅仅是对本发明的技术方案进行说明，以便本领域技术人员进一步理解本发明。

本发明所用的蛋白胨、牛肉膏和酵母粉抽提物购自英国Oxoid公司；

IPTG、Ampicillin购自上海生工生物公司；

回收试剂盒购自BIOMIGA公司；

Taq DNA 聚合酶、high ligation连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、Hind III均购自Fermentas公司；

其他化学试剂均为国产分析纯。

本发明所用的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）购自中国微生物菌种保藏中心（保藏编号CCTCC NO 22708）；

本发明所用的大肠杆菌E.coli TG1、E.coli BL21（DE3）及质粒pET-32a（+）由本实验室保存。

本发明所用的设备：

TGL-160冷冻离心机为上海恒科仪器有限公司 ；

SHP-150s生化培养箱HWS12电热恒温水浴、酶标仪为美国Thermo Fisher公司；

SYQ-DSX-280型灭菌锅、Tan Gis 1000凝胶电泳图成像系统为上海天能科技有限公司；

SUB_Cell GT电泳仪为美国BIO-RAD公司；

SG412压力蒸汽式灭菌锅为上海华线医用仪器有限公司。

本发明最终所得的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的酶活测定方法：参照GENMED公司细菌亚硝酸盐还原酶总活性比色测定法进行。

实施例 1

一种人工合成的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1，该序列通过如下方式获得：

（1）、PCR引物设计

以金黄色葡萄球菌, 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、布鲁氏杆菌;大肠杆菌Escherichia coli的亚硝酸盐还原酶基因为参考，设计出PCR引物即：上游引物为5’GCGGATCCATGAGTCAAAGCTTATG3’（BamHⅠ），见SEQ ID NO:3，下游引物为5’CCGCTCGAGTTAATTCCGTACACTG3’（XhoⅠ），见SEQ ID NO:4，并人工合成；

（2）、植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的提取

①、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（保藏编号CCTCC NO 22708）培养物5000r/min,离心15min，弃上清，取沉淀（菌体）0.05g置1.5ml EP中，加1ml TE缓冲液，使沉淀悬浮均匀后，于12000r/min，离心10 min，弃上清，再加入1ml TE 缓冲液，使沉淀重悬， 13000r/m，离心10min；重复上述步骤2次，收集沉淀；

②、沉淀物中加入200μl TE缓冲液，使沉淀悬浮均匀后，加入300μl溶菌酶溶液，混匀，于37℃保温1h，再加入10μl蛋白酶K溶液和200μl 5% SDS，混匀，55℃保温30min。取去置于冰浴中冷却2min, 于12000r/m，离心10min，将上清液转移至另一个灭菌的EP管中；

③、加入与上清液等体积的饱和酚，使之混匀，于12000rpm离心10min,将上清液转移至另一洁净的EP管中，再加入等体积的酚-氯仿，使之混匀，12000r/m离心5min，将上清液转入另一洁净的EP管中，加入等体积的氯仿，使之混匀，12000r/m离心10min，将上清液转入另一洁净的EP管中；

④、加入上清液0.1倍体积的5mol/L NaCl 溶液和2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀， 0℃下放置1h；

⑤、于12000r/m离心10min，弃上清液，向沉淀中加入1ml 70%乙醇，轻轻混匀洗涤沉淀，12000r/m，离心10min，弃上清；

重复该步骤⑤一次，弃上清并吸干；

⑥、沉淀于37℃放置5min，使残留乙醇挥发，沉淀用50μl TE悬浮均匀，即得到植物乳杆菌基因组DNA提取物，样品置-20℃保存待用；

（3）、目的基因的扩增

以实施例1中步骤（2）的⑥提取的植物乳杆菌基因组DNA为模板，采用PCR方法 扩增目的基因片段，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性45s，61℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，得PCR扩展的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA；

用1%琼脂糖电泳检测目的基因PCR产物；电泳检测结果如图1，在1600附近有一条明显的DNA条带，即为上述所得的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA。

实施例 2

含有实施例1所得的PCR扩展的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的重组表达载体的构建，步骤如下：

将实施例1所得的PCR扩展的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA与pET-32a（+）表达载体连接，室温反应30 min，然后80℃保温10 min，冷却至4℃，得到连接产物，连接反应体系如下：

再将上述的连接产物转化TG1细胞，即获得重组质粒pET-32a（+）-NirL；

获得的重组质粒pET-32a（+）-NirL用PCR和双酶切方法鉴定，pET-32a（+）-NirL重组载体双酶切鉴定图见图2所示，从图2中可以看出构建好的载体经BamHⅠ和XholⅠ分别在GGATCC、CTCGAG位点双酶切成功；

pET-32a（+）-NirL重组载体PCR鉴定结果如图3所示，从图3中可以看出构建好的载体经NirL基因序列的上、下游引物PCR扩增成功；

用DNA测序仪常规方法测定重组质粒的序列，测序结果表明该重组质粒构建成功，并命名为pET-32a（+）-NirL；

将重组质粒pET-32a（+）- NiRs经双酶即BamH和XhoⅠ分别在5’—AAGCTT--3’和5’--CTCGAG--3’）位点切割，获得5.9kb的载体片段和与目的片段大小相符的基因片段，如图2所示，图中M：DNA分子量标准；1：双酶切重组质粒。

由此可以判断重组质粒pET-32a（+）- NiR构建成功。

实施例 3

将实施例2构建好的表达载体pET-32a（+）- NiRs质粒，转入BL21（DE3）感受态细胞中，获得重组大肠杆菌，其具体步骤如下：

①、取连接产物5 μL，加到200 μL E.coli TG1感受态细胞悬液中，轻轻混匀，冰上放置30 min；

②、42℃水浴热激90 sec，迅速取出置冰上冷却5 min；

③、加入800 μL 37℃预热的LB液体培养基，混匀后37℃水浴1 h，使细菌恢复正常生长状态；

④、4000 r/m离心10 min，弃800 μL上清，取剩余的200 μL菌液均匀涂布于LB固体培养基平板上，37℃正面向上放置30 min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养8-12 h；

⑤、挑取单克隆培养后用PCR鉴定，阳性克隆培养物即为构建成功的含有植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因转化的pET-32a（+）-NiRL质粒的重组大肠杆菌E.coliBL21（DE3）。

实施例 4

利用实施例3所得的重组大肠杆菌进行植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的诱导表达，具体如下：

将实施例3所得的阳性克隆培养物以2%接种量接种LB培养基（50mg/ml氨苄青霉素），37℃摇床培养至对数生长期（OD600=0.6~1.0）时，加入终浓度为1mmol/l的IPTG进行诱导，37℃、220rpm摇床培养诱导4h后，得反应液，离心收集菌体，进行亚硝酸盐还原酶的提取，具体步骤如下：

将细菌培养液用8000r/m离心收集菌体，每克湿菌加入10ml于4℃预冷1h的溶液A，冰浴超声波破碎菌体20min，每超声1秒停2秒，超声后取出15000r/m离心15min，取上清即得到植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白提取液，于4℃保存；

其中溶液A配制方法如下：分别称取8g NaCl，0.2g KCl，1.44gNa₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，加入800ml蒸馏水溶解，再加入8.32g乙二胺四乙酸，用HCl调节pH值至7.4，再加入500μl吐温-20，1ml TritonX-100及4g聚乙烯吡咯烷酮，混匀后加蒸馏水定容至1L，即得溶液①。

同时设立空白对照组，即将非重组载体pET-32a（+）按实施例3的方法，转入BL21（DE3）细胞获得空白对照组菌株，同时按本实施例的诱导表达过程进行诱导表达。对空白对照组及重组菌组的菌体蛋白进行相同条件的超声破碎和离心收集后，经10%分离胶的SDS-PAGE检测，其电泳图见图4。图中 M为低分子量蛋白标准；1为诱导后重组菌体的全蛋白；2为诱导后非重组菌体的全蛋白。从图4中可见，与非重组菌体全蛋白相比，在诱导后重组菌体全蛋白中出现一个新的蛋白条带，即重组菌中目的蛋白植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶已成功诱导表达。

上述所得的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的酶活测定，步骤如下：

（1）、溶液配制

配制0.002g/mL NaNO₂； 0.29MNaHCO₃；再以0.29MNaHCO₃为溶剂配

制10mg/mL Na₂S₂O_{4 ，}

（2）、吸取1.5ml上述10mg/mL Na₂S₂O_{4 ，}溶液于1mL带盖试管中，再加入0.005g甲基紫精和0.004gNADPH，混匀后，盖好，该试剂为用于酶活测定的反应液，于-20℃冰箱冻存备用；

（3）、吸取25μl 0.002g/mL NaNO₂溶液至96孔板对应孔中；

依次加入150μl植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白提取液（即实施例4所得的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白提取液）、25μl上述步骤（2）所得的酶活测定的反应液，迅速吹打混匀，于600nm波长下检测其0min到15min内，（每隔30s为测试点）吸光值；

所测数据结果见图5，阴性对照的酶活测定结果见图6，（阴性对照的酶活测定方法以150μl蒸馏水代替植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白提取液，其他操作与植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白提取液测定相同）；

从图5及图6的对照中可以看出，本发明所得的植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶蛋白提取液具有明显的活性。

上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

以下是本发明中出现的核苷酸和氨基酸序列的总结

SEQ ID NO:1是植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因的碱基序列；

SEQ ID NO:2 是植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3 是PCR上游引物；

SEQ ID NO:4 是PCR下游引物。

SEQUNCE LISTING

〈110〉上海应用技术学院

〈120〉一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用

〈160〉4

＜210＞1

＜211＞545

＜212＞PRT

＜213＞人工序列

＜400＞1

Met Ser Gln Ser Leu Trp Gln Arg Leu Phe Asn His Arg Gln Gln

5 10 15

Thr Lys Gln Ala Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly Arg Ser Gly Thr

20 25 30

Ser Val Met Thr Lys Cys Val Asn Leu Met Gly Ile Ser Leu Gly

35 40 45

Thr Asp Asn Leu Leu Ala Pro Ser Lys Arg Ile Asn Pro Lys Gly

50 55 60

Tyr Phe Glu Asn Lys Asp Val Ile Asn Ile His Lys Ser Leu Gly

65 70 75

Ser Arg Ile Arg Tyr Arg Pro Ala Phe Lys Asp Tyr Tyr Asp Ser

80 85 90

Pro Lys Ile Lys Lys Asp Arg Ala Ala Leu Thr Thr Tyr Leu Arg

95 100 105

Asn Phe Phe Glu Asn Glu Gln Tyr Leu Ala Ile Lys Asp Pro Arg

110 115 120

Met Asn Asp Tyr Ile Glu Leu Trp Gln Arg Val Leu Ala Asp Val

125 130 135

Glu Val Gln Pro Ala Glu Ile Val Leu Leu Arg Asn Pro Met Asp

140 145 150

Val Val Asn Ser Asn Glu Arg Ala Trp His Arg Asp Thr Thr Leu

155 160 165

Ala Met Arg Gln Trp Gln Val Arg Thr Leu Leu Ser Leu Arg Asp

170 175 180

Thr Asp Arg His Glu Arg Ile Leu Val Thr Tyr Glu Asp Leu Phe

185 190 195

Gly Gln Thr Leu Thr Thr Leu Lys Arg Ile Ala Thr Gln Phe Asn

200 205 210

Leu Pro Trp Thr Ser Asp Glu Ala Ala Leu Gln Ala Gln Ile Asp

215 220 225

Asp Phe Ile Asp Pro Ala Leu Gln Lys Ser Asp Ser Gly Glu Asn

230 235 240

Leu Ala Asp Phe Glu Ala Arg Thr Asp Val Lys Pro Asp Val Lys

245 250 255

Ala Leu Tyr Leu Leu Gly Arg Gln Ala Ala Ala Asp Pro Asp Tyr

260 265 270

Phe Ala Ser Ala Glu Phe Gln Gln Arg Ile Asp Glu Met Thr Asp

275 280 285

Glu Tyr Leu Ala Lys Tyr Gly Ala Leu Tyr Arg Asp Phe Asn Val

290 295 300

Lys Ile Asn Ser Lys Thr Phe Phe Val Phe Gly Glu Asp Gln Ala

305 310 315

Gln Val Asp Gln Val Asn Thr Thr Leu Arg Asn Asp Gln Val Lys

320 325 330

Met Val Gly Thr Glu Ala Asp Ser His Glu Val Ala Glu Asp Leu

335 340 345

Ser Glu Arg Leu Asn Asn Asn Thr Ile Ala Ile Gln Thr Tyr Pro

350 355 360

Leu Asp Tyr Leu Val Val Glu Gln Lys Glu Ala Leu Asn Asn Tyr

365 370 375

Leu Arg Lys Asn Ala Lys Arg Glu Thr Leu Trp Gly Ile Gly Asp

380 385 390

Ala Lys Asn Asn Glu Ile Val Glu Met Leu Thr Thr Val Ser Ala

395 400 405

Glu Leu Gly Ala Asp Thr His Asn Val Val Ile Ala Asp Asp Leu

410 415 420

Thr Ala Ile Thr Asp Glu Arg Glu Arg Arg Leu Ala Ile Gln His

425 430 435

Leu Val Arg Thr Leu His Ala Val Glu Gln Pro Pro Tyr Leu Val

440 445 450

Leu Met Ala Asp Glu Leu Gly Thr Pro Ala Ser Gln Ser Ala Val

455 460 465

Thr Ala Phe Ile Ala Ala Glu Pro Thr Lys Ala Ala Pro Leu Arg

470 475 480

Asp Glu Gln Pro Asp Glu Thr Phe Lys Leu Arg Thr Pro Leu Asp

490 495 485

Met Asp Glu Val Ala Ala Thr Leu Thr Ala Leu Cys Arg Arg Ala

500 505 510

Ser Gln Asp Glu Gln Gln Gln Ala Ala Leu Asn His Phe Val Ser

515 520 525

Leu Asn Tyr Asp Glu Ile Leu Asn Val Lys Gly Asp Gln Tyr Ala

530 535 540

Asn Ser Val Arg Asn

545

＜210＞2

＜211＞1638

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞2

ATGAGTCAAA GCTTATGGCA ACGATTGTTT AATCACCGTC AACAAACGAA GCAGGCCGTA 60 TTAATTCTTG GGAGTGGCCG TTCCGGAACA TCGGTAATGA CTAAGTGTGT TAATTTGATG 120 GGCATTTCTC TCGGGACTGA TAACCTGCTG GCACCTAGTA AGCGGATCAA TCCGAAAGGT 180 TATTTTGAAA ATAAAGATGT CATCAATATT CACAAGTCAC TTGGAAGTCG CATCCGGTAC 240 CGGCCAGCCT TCAAGGATTA CTATGATAGC CCGAAGATTA AAAAGGACCG GGCGGCGTTA 300 ACCACGTATC TACGAAACTT TTTTGAGAAT GAACAGTATC TGGCGATAAA AGACCCACGG 360 ATGAATGATT ATATTGAATT GTGGCAACGT GTTTTGGCTG ACGTTGAGGT TCAGCCGGCT 420 GAAATCGTCT TGCTACGTAA TCCGATGGAC GTGGTCAATT CGAATGAGCG CGCCTGGCAC 480 CGTGATACCA CGCTCGCAAT GCGTCAGTGG CAAGTCCGGA CGTTGCTTTC ATTACGTGAT 540 ACCGACCGTG AGCACCGCAT TTTAGTCACG TACGAAGATT TGTTTGGTCA GACGTTGACG 600 ACGTTGAAAC GAATCGCGAC CCAATTTAAC TTACCGTGGA CGAGCGACGA GGCGGCACTC 660 CAAGCGCAAA TCGATGACTT CATCGATCCA GCACTCCAAA AGAGTGATAG CGGTGAAAAT 720 TTAGCTGATT TTGAAGCTCG AACGGACGTG AAACCCGATG TTAAGGCACT TTACTTACTA 780 GGCCGTCAAG CTGCGGCTGA CCCGGATTAC TTTGCCTCGG CTGAATTTCA ACAGCGCATC 840 GACGAGATGA CTGACGAGTA TTTAGCCAAG TATGGCGCTT TATATCGGGA CTTTAACGTC 900 AAGATCAATA GTAAAACGTT CTTTGTATTC GGCGAAGATC AGGCCCAAGT TGATCAGGTC 960 AACACGACTT TACGAAATGA TCAAGTCAAG ATGGTCGGCA CAGAAGCTGA CAGTCATGAG 1020 GTTGCTGAAG ATTTGAGCGA ACGGTTGAAT AATAATACGA TTGCCATTCA GACGTACCCC 1080 TTGGACTATT TAGTGGTCGA GCAAAAGGAA GCCCTGAACA ATTATCTCCG TAAAAACGCG 1140 AAACGCGAGA CGTTATGGGG GATTGGGGAT GCTAAAAACA ATGAAATCGT TGAAATGTTA 1200 ACGACGGTCA GTGCCGAGTT AGGTGCGGAT ACGCATAACG TGGTGATTGC AGATGACTTA 1260 ACGGCCATCA CTGATGAACG TGAGCGCCGA TTAGCGATTC AACATTTAGT ACGGACGTTG 1320 CACGCGGTTG AACAGCCACC ATACTTGGTC CTGATGGCTG ACGAACTGGG AACCCCTGCG 1380 TCGCAAAGTG CGGTGACGGC TTTTATTGCT GCTGAACCGA CTAAGGCAGC ACCATTACGA 1440 GACGAACAGC CGGACGAAAC GTTCAAGCTG CGGACCCCGC TAGACATGGA TGAGGTGGCG 1500 GCAACTTTAA CAGCGTTGTG TCGACGTGCG AGTCAGGATG AGCAACAACA AGCCGCATTG 1560 AACCATTTTG TAAGTCTTAA TTATGATGAA ATTTTAAACG TGAAAGGTGA TCAATATGCA 1620 AACAGTGTAC GGAATTAA 1638

＜210＞3

＜211＞24

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞3

GCGGATCCAT GAGTCAAAGC TTAT 24

＜210＞4

＜211＞25

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞4

CCGCTCGAGT TAATTCCGTA CACTG 25

Claims (7)

1.一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其特征在于该基因的序列为SEQ ID NO:1。

2.含有如权利要求1所述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因的重组质粒。

3.如权利要求2所述的重组质粒为pET-32a（+）- NiRL质粒。

4.利用如权利要求2或3所述的重组质粒转化而成的重组微生物。

5.如权利要求4所述的重组微生物，其特征在于所述的重组微生物为重组大肠杆菌或重组枯草杆菌。

6.如权利要求5所述的重组微生物，其特征在于所述的重组大肠杆菌优选为含有重组质粒为pET-32a（+）- NiRL的 E.coliBL21（DE3）或JM105。

7.利用如权利要求6所述的重组微生物生产的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶，其特征在于该还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

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