CN114574456A - 一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114574456A
CN114574456A CN202210271535.7A CN202210271535A CN114574456A CN 114574456 A CN114574456 A CN 114574456A CN 202210271535 A CN202210271535 A CN 202210271535A CN 114574456 A CN114574456 A CN 114574456A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
artificial sequence
ala
nitrite reductase
nitrite
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210271535.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114574456B (zh
Inventor
王永华
梁馨月
王方华
蓝东明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN202210271535.7A priority Critical patent/CN114574456B/zh
Publication of CN114574456A publication Critical patent/CN114574456A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114574456B publication Critical patent/CN114574456B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/25—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D3/00—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances
    • A62D3/02—Processes for making harmful chemical substances harmless or less harmful, by effecting a chemical change in the substances by biological methods, i.e. processes using enzymes or microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/02—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with a cytochrome as acceptor (1.7.2)
    • C12Y107/02001—Nitrite reductase (NO-forming) (1.7.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A62—LIFE-SAVING; FIRE-FIGHTING
    • A62D—CHEMICAL MEANS FOR EXTINGUISHING FIRES OR FOR COMBATING OR PROTECTING AGAINST HARMFUL CHEMICAL AGENTS; CHEMICAL MATERIALS FOR USE IN BREATHING APPARATUS
    • A62D2101/00—Harmful chemical substances made harmless, or less harmful, by effecting chemical change
    • A62D2101/40—Inorganic substances
    • A62D2101/45—Inorganic substances containing nitrogen or phosphorus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W10/00—Technologies for wastewater treatment
    • Y02W10/10—Biological treatment of water, waste water, or sewage

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Business, Economics & Management (AREA)
  • Emergency Management (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用，所述亚硝酸盐还原酶突变体是对植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶完整亲本序列基础上，删除蛋白序列中1‑16位氨基酸和533‑545位氨基酸且在原有亲本序列基础上通过突变引入二硫键所得，其氨基酸序列为SEQ ID NO:49，其对应编码基因序列为SEQ ID NO:50。本发明制备得到的亚硝酸盐还原酶突变体相比野生型酶蛋白酶活力分别提高10倍，且在该酶最适反应温度条件下的半衰期提高9倍，表达量提升2.5倍。在食品、环保等领域将具有广泛应用前景。

Description

一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
亚硝酸盐是自然界氮循环中的重要物质，广泛存在于土壤、水和植物中，是一种潜在的致癌物质。亚硝酸盐主要通过蔬菜食用进入人体，过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，孕妇过量摄入亚硝酸盐可导致胎儿畸形。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。在水产养殖中，亚硝酸盐会使鱼体内氧气减少从而影响鱼类的生理活动致其死亡。因此，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行。目前运用物理、化学方法降解亚硝酸盐仍具有成本高、见效慢、降解不彻底和二次污染等缺点。目前，生物降解能有效控制并降解亚硝酸盐，其中亚硝酸盐还原酶是生物降解过程发挥作用中的关键酶。
亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，简称为NIR)是一种脱氮反应中的关键酶，它脱氮过程有两种：(1)催化亚硝酸盐(NO2-)失去电子生成一氧化氮(NO)；(2)催化亚硝酸盐(NO2-)进行氨合并生成铵根离子(NH4 +)。NIR根据结构类型可以分为细胞色素cd1型和铜型，其编码基因分别为nirS和nirK。菌株皮氏罗尔斯顿氏菌、蜡状芽孢杆菌、胃幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌、乳酸菌和豌豆、玉米和玉米叶中均发现了NIRs。但野生菌中亚硝酸盐还原酶具有蛋白含量少、提取困难等缺点，难以进行规模化制备。目前，有大量报道利用基因工程技术得到重组表达的NIR。在对亚硝酸盐还原酶基因的克隆和表达的研究中，存在得到的酶蛋白表达量低、酶活力低、酶蛋白不稳定等问题，限制了其应用。
蛋白质理性设计是近年来新兴起的改变酶自身性质的有利工具，它建立在人们对酶结构与功能关系和催化机理的了解上，对选定的位点进行突变，从而优化酶分子的各种性质。随着结构生物学、分子动力学模拟等领域的发展，基于蛋白结构理性设计的蛋白质工程改造已经在很多酶中性质改造领域取得的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面。但由于蛋白空间结构的复杂性，即使存在多种设计方案，找到一种酶活较高，且稳定性又好，能够有应用降解亚硝酸盐的前景的酶突变体并不容易。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供可以重组表达并能得到较高酶活且稳定性较高的植物乳杆菌来源亚硝酸盐还原酶突变体。
解决上述技术问题的技术方案包括如下。
一种亚硝酸盐还原酶突变体，其是通过在氨基酸序列为SEQ ID NO:51的亲本序列基础上删除该序列中1-16位共计16个氨基酸和删除533-545位共计13个氨基酸，且在原有亲本序列基础上通过碱基突变引入两对二硫键所得。
在其中一些实施例中，所述亚硝酸盐还原酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:49所示，或其氨基酸构成包括如SEQ ID NO.49所示序列，且该序列存在一个或多个点突变，但生物活性不变。
本发明另一目的是提供一种编码上述亚硝酸盐还原酶突变体的基因。
在其中一些实施例中，编码上述亚硝酸盐还原酶突变体的基因为SEQ ID NO:50所示。
本发明的另一目的是提供一种插入有上述的编码亚硝酸盐还原酶突变体的基因的重组表达载体。
本发明的另一目的是提供一种含上述基因的重组基因工程菌。
本发明的另一目的是提供所述重组基因工程菌的制备方法，将上述亚硝酸盐还原酶突变体的基因克隆到表达载体pET-30a或pET-21a表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，获得重组基因工程菌。
在其中一些实施例中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)，SHuffle T7或Arctic Express(DE3)。
本发明的另一目的是提供所述亚硝酸盐还原酶突变体的应用。
所述的亚硝酸盐还原酶突变体应用于食品、环保领域的亚硝酸盐降解中。
本发明的另一目的是提供一种亚硝酸盐降解的方法，降解亚硝酸盐时所用酶为上述的亚硝酸盐还原酶突变体。
本发明的发明人选择以植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶蛋白为模板，在此基础上进行理性设计系列突变体。发明人凭借多年的对酶突变体的研究经验，对亚硝酸盐还原酶的突变体进行构建、设计，并进行了重组表达，最终筛选改造获得了一株表达量、酶活力及酶稳定性均较野生型有大幅提高的亚硝酸盐还原酶突变体，进一步提高了该酶的应用范围。
与现有技术相比，本发明所述亚硝酸盐还原酶突变体具有如下有益效果：
本发明以构建得到的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组亚硝酸盐还原酶。以Na2S2O4-MV法测定野生型和突变体的酶活。结果表明相比于野生型，本发明制备得到的亚硝酸盐还原酶突变体(突变体编号21)△1-16+△533-545+F84C-E367C+L479C-Q515C相比野生型酶蛋白活力提高10倍左右，且在该酶最适反应温度条件下的半衰期提高9倍左右，酶蛋白表达量提高2.5倍。为亚硝酸盐还原酶工业化生产奠定了基础，在食品、环保等领域具有广泛应用前景。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明亚硝酸盐还原酶突变体由氨基酸序列为SEQ ID No.51(GenBank：AKC01517.1)的植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶亲本序列基础上，设计删除蛋白序列中1-16位共计16个氨基酸和533-545位共计13个氨基酸，并且在此基础上通过在酶蛋白分子结构中引入二硫键所得。所述效果最好的亚硝酸盐还原酶突变体其氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示，其对应编码基因序列为SEQ ID NO:50所示。本发明将如SEQ ID NO.52所示的基因序列通过在序列上游引入NdeⅠ，下游引入XhoⅠ酶切位点并克隆到原核表达载体pET-30a(+)上，在重组大肠杆菌中进行了诱导表达，再利用亲和层析纯化得到高纯度的重组蛋白质。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：亚硝酸盐还原酶NIR野生型及其突变体重组表达载体及表达菌株构建
(1)编码野生型植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的全基因合成。参照SEQ ID No.51(GenBank：AKC01517.1)的植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶亲本序列，按照大肠杆菌表达密码子偏好性对编码该蛋白序列进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO:52所示；
SequenceNO.51:MSQSLWQRLFNHRQQTKQAVLILGSGRSGTSVMTKCVNLMGISLGTDNLLAPSKRINPKGYFENKDVINIHKSLGSRIRYRPAFKGYYDSPKIKKDRAALTTYLRNFFENEQYLAIKDPRMNDYIELWQRVLADVEVQPAEIVLLRNPMDVVNSNERAWHRDTTLAMRQWQVRTLLSLRDTDREHRILVTYEDLFGQTLTTLKRIATQFNLPWTSDEAALQAQIDDFIDPALQKSDSGENLADFEARTDVEPDVKALYLLGRQAAADPDYFASAEFQQRIDEMTDEYLAKYGALYRDFNVKINSKTFFVFGEDQAQVDQVNTTLRNGQVKMVGTEADSHEVAEDLSERLNNNTIAIQTYPLDYLVVEQKEALNNYLRKNAKRETLWGIGDAKNNEIVEMLTTVSAELGADTHNVVIADDLTAIIDERERRLAIQHLVRTLHAVEQPPYLVLMADELGTPASQSAVTAFIAAEPTKAAPLRDEQPDETFKLRTPLDMDEVAATLTVLCRRASQDEQQQAALNHFVSLNYDEILNVKGDQYANSVRN。
SequenceNO.52:ATGAGTCAAAGCTTATGGCAACGATTGTTTAATCACCGTCAACAAACGAAGCAGGCCGTATTAATTCTTGGGAGTGGCCGTTCCGGAACATCGGTAATGACTAAGTGTGTTAATTTGATGGGCATTTCTCTCGGGACTGATAACCTGCTGGCACCTAGTAAGCGGATCAATCCGAAAGGCTATTTTGAAAATAAAGATGTCATCAATATTCACAAGTCACTTGGAAGTCGCATCCGGTACCGGCCAGCCTTCAAGGGTTACTATGATAGCCCGAAGATTAAAAAGGACCGGGCGGCGTTAACCACGTATCTACGAAACTTTTTTGAGAATGAACAATATCTGGCGATTAAAGACCCACGGATGAATGATTATATTGAATTGTGGCAACGTGTTTTGGCTGACGTTGAGGTTCAGCCGGCTGAAATCGTCTTGCTACGTAATCCGATGGACGTGGTCAATTCGAATGAGCGCGCCTGGCACCGCGATACCACGCTCGCAATGCGTCAGTGGCAAGTCCGGACGTTGCTTTCATTACGTGATACCGACCGTGAGCACCGCATTTTAGTCACGTACGAAGATTTGTTTGGTCAGACGTTGACGACGTTGAAACGAATCGCGACCCAATTTAACTTACCGTGGACGAGCGACGAGGCGGCCCTCCAAGCGCAAATCGATGACTTCATCGATCCAGCACTCCAAAAGAGTGATAGCGGTGAAAATTTAGCTGATTTTGAAGCTCGAACGGACGTGGAACCCGATGTTAAGGCACTTTACTTACTAGGCCGTCAAGCTGCGGCTGACCCGGATTACTTTGCCTCGGCTGAATTTCAACAGCGCATCGACGAGATGACTGACGAGTATTTAGCCAAGTATGGCGCTTTATATCGGGACTTTAACGTCAAGATCAATAGCAAAACGTTCTTTGTATTCGGCGAAGATCAGGCCCAAGTTGATCAGGTCAACACGACTTTACGAAATGGTCAAGTCAAGATGGTCGGCACAGAAGCTGACAGTCATGAGGTTGCTGAAGATTTGAGCGAACGGTTGAATAATAATACGATTGCCATTCAGACGTACCCCTTGGACTATTTAGTGGTCGAGCAAAAGGAAGCCCTGAATAATTATCTCCGTAAAAACGCGAAACGCGAGACGTTATGGGGGATTGGGGATGCTAAAAACAATGAAATCGTTGAAATGTTAACGACGGTCAGTGCCGAGTTAGGTGCGGATACGCACAACGTGGTGATTGCAGATGACTTAACAGCCATCATTGATGAACGTGAGCGCCGATTAGCGATTCAACATTTAGTACGGACGTTGCACGCGGTTGAACAGCCACCATACTTGGTCCTGATGGCTGACGAACTGGGAACCCCTGCGTCGCAAAGTGCGGTGACGGCTTTTATTGCTGCTGAACCGACTAAGGCAGCACCATTACGAGACGAACAGCCGGACGAAACGTTCAAGCTGCGGACCCCGCTAGACATGGATGAGGTGGCGGCAACTTTAACAGCGTTGTGTCGACGTGCGAGTCAGGATGAGCAACAACAAGCCGCATTGAACCATTTTGTAAGTCTTAATTATGATGAAATTTTAAACGTGAAAGGTGATCAATATGCAAACAGTGTACGGAAT。
(2)将(1)所合成的NIR野生型基因用限制性内切酶NdeⅠ和XhoI分别对纯化的基因片段和质粒pET30a进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞，涂布于LB(含100μg/mL卡那霉素)平板。挑取阳性克隆通过菌落PCR及基因测序。采用质粒提取试剂盒提取获得野生型NIR的pET 30a-NIR重组质粒。
(3)采用重叠PCR方法构建本发明所述突变体，反应条件如下：
反应条件1：
Figure BDA0003553492740000071
其中突变体构建所用上游引物和下游引物序列为：
表1.构建突变体所用的引物列表
Figure BDA0003553492740000072
Figure BDA0003553492740000081
Figure BDA0003553492740000091
注：下划线序列为突变位点序列
PCR扩增条件：98℃，3min；98℃，15s；60℃，25s；72℃，130s；30个循环；72℃，2min。扩增产物使用内切酶进行模板消化。
用DpnⅠ酶切消化模板质粒，消化体系如下：
Figure BDA0003553492740000092
将DpnⅠ酶切消化体系置于37℃条件下，2h。将消化产物转化至E.coli Top10感受态细胞。涂布于LB(含100μg/mL卡那霉素)平板。挑取阳性克隆通过NdeⅠ和XhoI双酶切鉴定及基因测序，获得pET30a-NIR-突变体质粒。
(4)分别将(2)、(3)所得的重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞，所述大肠杆菌为BL21(DE3)，SHuffle T7或Arctic Express(DE3)任一即可。挑选阳性克隆并测序验证，即获得重组pET30a-NIR野生型及各突变体的大肠杆菌重组表达菌株。
实施例2：野生型NIR及其突变体重组表达菌株发酵及重组蛋白纯化
(1)将重组大肠杆菌亚硝酸盐还原酶NIR野生型及突变体表达菌株分别接种于含卡纳霉素100μg/mL的种子培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，
pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；
(2)将(1)中所述种子液按5％的接种量接种到LB液体发酵培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至终浓度5mM，于16℃，200r/min条件下诱导培养12h；
(3)将(2)中所得发酵液离心(8000rpm,20min)，收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液(pH6.8)重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心(10000rpm,20min)，取上清，即为制备得到的亚硝酸盐还原酶的粗酶液；
(4)将(3)中所得亚硝酸盐还原酶粗酶液，将离心所得上清液上样用缓冲液A(20mM咪唑、500mM NaCl、100mM pH为6.8的PBS溶液)预先平衡好的Ni2+-NTA层析柱，用含有40mM咪唑的缓冲液A进行杂蛋白去除。用缓冲液B(300mM咪唑，500mM NaCl、100mM pH为6.8的PBS溶液)洗脱目的蛋白。然后将洗脱目的蛋白继续上样脱盐柱G-25，用缓冲液C(500mM NaCl、100mM pH为6.8的PBS溶液)进行洗脱，收集洗脱样品即可得到高纯度目的蛋白样品。根据纯化后蛋白浓度测定结果可知，每升发酵野生型亚硝酸盐还原酶重组表达菌株经纯化后获得的酶蛋白为157mg,而△1-16+△533-545+F84C-E367C+L479C-Q515C突变体(突变体编号21)的每升发酵液最终纯化蛋白量为392.5mg，表达量较野生型表达量提高2.5倍。
实施例3：野生型亚硝酸盐还原酶NIR及突变体的酶活及半衰期测定
(1)NIR酶活性的测定：NIR活性测定采用Na2S2O4-MV法。利用甲基紫精作为人工电子供体使NIR催化NO2-还原为NO或NH3。亚硝酸盐还原酶的消耗可以通过反应液中总的亚硝酸盐量减去剩余的NO2-量得到。NO2-含量可用盐酸萘乙二胺法测定，即在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮反应，生成的重氮化合物又与盐酸萘乙二胺生成了紫红色偶氮化合物，可在538nm下显色测定。
(2)根据(1)的原理确定测定酶活反应体系500μL：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)50μL，0.1mol/L NaNO2 25μL，0.1mol/L甲基紫15μL，0.1mol/L Na2S2O4 80μL，酶液300μL。37℃水浴中反应10min，剧烈振荡终止反应(以磷酸缓冲液为空白)。取10μL用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐残留量。亚硝酸还原酶活力单位通过在37℃下，每分钟还原1μmol亚硝酸盐所消耗的酶量来表示。比活力用1mg蛋白质中酶的活力单位数来表示。分别测定野生型及突变体在最适反应温度条件下孵育不同时间(0～60min)后的残余酶活，实验重复三次，实验结果用相对酶活力表示，测定的最大酶活力定为100％，根据其失活曲线，能计算出其半衰期(t1/2)。
结果请见表2，实验表明，(突变体21)△1-16+△533-545+F84C-E367C+L479C-Q515C突变体的酶活力最高，且稳定性最好。其氨基酸序列如SEQ ID NO.49所示，其基因表达序列如SEQ ID NO.50所示。
表2.设计突变体重组表达情况及最适反应温度条件下半衰期和酶活性测定结果
Figure BDA0003553492740000121
Figure BDA0003553492740000131
注：表达情况栏中：“+”代表能够重组表达，“-”代表无法实现重组表达；t1/2栏中，“-”代表表达蛋白无活性。催化效率栏中，“-”代表未测定。
△1-16+△533-545+F84C-E367C+L479C-Q515C突变体的氨基酸序列和基因序列如下。
Sequence NO.49:
KQAVLILGSGRSGTSVMTKCVNLMGISLGTDNLLAPSKRINPKGYFENKDVINIHKSLGSRIRYRPACKGYYDSPKIKKDRAALTTYLRNFFENEQYLAIKDPRMNDYIELWQRVLADVEVQPAEIVLLRNPMDVVNSNERAWHRDTTLAMRQWQVRTLLSLRDTDREHRILVTYEDLFGQTLTTLKRIATQFNLPWTSDEAALQAQIDDFIDPALQKSDSGENLADFEARTDVEPDVKALYLLGRQAAADPDYFASAEFQQRIDEMTDEYLAKYGALYRDFNVKINSKTFFVFGEDQAQVDQVNTTLRNGQVKMVGTEADSHEVAEDLSERLNNNTIAIQTYPLDYLVVCQKEALNNYLRKNAKRETLWGIGDAKNNEIVEMLTTVSAELGADTHNVVIADDLTAIIDERERRLAIQHLVRTLHAVEQPPYLVLMADELGTPASQSAVTAFIAAEPTKAAPCRDEQPDETFKLRTPLDMDEVAATLTVLCRRASQDECQQAALNHFVSLNYDEIL
SequenceNO.50:AAGCAGGCCGTATTAATTCTTGGGAGTGGCCGTTCCGGAACATCGGTAATGACTAAGTGTGTTAATTTGATGGGCATTTCTCTCGGGACTGATAACCTGTTGGCACCTAGTAAGCGGATCAATCCGAAAGGCTATTTTGAAAATAAAGATGTCATCAATATTCACAAGTCACTTGGAAGTCGCATCCGGTACCGGCCAGCCTGCAAGGGTTACTATGATAGCCCGAAGATTAAAAAGGACCGGGCGGCGTTAACCACGTATCTACGAAATTTTTTTGAGAATGAACAGTATCTGGCGATAAAAGACCCACGGATGAATGATTATATCGAATTGTGGCAACGTGTTTTGGCTGACGTTGAGGTTCAGCCGGCTGAAATCGTCTTGCTACGTAATCCGATGGACGTGGTCAATTCGAATGAGCGCGCCTGGCACCGCGATACCACGCTCGCAATGCGTCAGTGGCAAGTCCGGACGTTGCTTTCATTACGTGATACCGACCGTGAGCACCGCATTTTAGTCACGTACGAAGATTTGTTTGGTCAGACGTTGACGACGTTGAAACGAATCGCGACCCAATTTAACTTACCGTGGACGAGCGACGAGGCGGCCCTCCAAGCGCAAATCGATGACTTCATCGATCCAGCACTCCAAAAGAGTGATAGCGGTGAAAATTTAGCTGATTTTGAAGCTCGAACGGACGTGGAACCCGATGTTAAGGCACTTTACTTACTAGGCCGTCAAGCTGCGGCTGACCCGGATTACTTTGCCTCGGCTGAATTTCAACAGCGCATCGACGAGATGACTGACGAGTATTTAGCCAAGTATGGCGCTTTATATCGGGACTTTAACGTCAAGATCAATAGTAAAACGTTCTTTGTATTCGGCGAAGATCAGGCCCAAGTTGATCAGGTCAACACGACTTTACGAAATGGTCAAGTCAAGATGGTCGGCACAGAAGCTGACAGTCATGAGGTTGCTGAAGATTTGAGCGAACGGTTGAATAATAATACGATTGCCATTCAGACGTACCCCTTGGACTATTTAGTGGTCTGCCAAAAGGAAGCCCTGAATAATTATCTCCGTAAAAACGCGAAACGCGAGACGTTATGGGGGATTGGGGATGCTAAAAACAATGAAATCGTTGAAATGTTAACGACGGTCAGTGCCGAGTTAGGTGCGGATACGCACAACGTGGTGATTGCAGATGACTTAACAGCCATCATTGATGAACGTGAGCGCCGATTAGCGATTCAACATTTAGTACGGACGTTGCACGCGGTTGAACAGCCACCATACTTGGTCCTGATGGCTGACGAACTGGGAACCCCTGCGTCGCAAAGTGCGGTGACGGCTTTTATTGCTGCTGAACCGACTAAGGCAGCACCATGCCGAGATGAACAACCGGACGAAACGTTCAAGCTGCGGACCCCGCTAGACATGGATGAGGTGGCGGCAACTTTAACAGTGTTGTGTCGACGTGCGAGTCAGGATGAATGCCAGCAAGCCGCATTGAACCATTTTGTAAGTCTTAATTATGATGAAATTTTA
实施例4亚硝酸盐还原酶突变体在降低油炸肉丸中亚硝酸盐残留量的应用效果评估。
由于亚硝酸盐赋予肉制品明亮的色泽和独特的风味，因此在肉制品生产加工过程中会常常加入亚硝酸盐，尤其市售的熏腌肉制品、油炸肉制品。因此，利用本发明所述亚硝酸还原酶(突变体21)进行简单的评估，发现其能降低肉制品中的亚硝酸盐，能够使亚硝酸盐残留量控制在较低的水平，同时保持肉制品的口感和品质，保证其安全性。
(1)原料处理：按照油炸肉丸加工常规工艺进行原料处理，即将牛肉经过去皮，剔除结缔组织和残余骨渣，将剔除肥肉的部分放在绞肉机中绞碎。
(2)腌制：按照油炸肉丸的常规工艺进行腌制，将处理过的原料按照原料重量加入100mg/kg亚硝酸盐和含有1％的食盐进行混合腌制发色，腌制时间为12h；
(3)斩拌：按照油炸肉丸常规工艺进行斩拌，然后加入斩拌辅助剂，1-10％冰水，20％木薯淀粉，1-2g/kg的胡椒粉，1.2％的料酒组成的混合调味剂加入斩拌机中斩拌，使肉糜均匀混。混合均匀后在加入重量百分比为0.5-3％的野生型亚硝酸盐还原酶或其突变体21(△1-16+△533-545+F84C-E367C+L479C-Q515C突变体)，继续斩拌均匀，静置1-2h，亚硝酸还原酶进行反应，降低油炸肉中亚硝酸盐残留量；
(4)油炸:将油温升高至150-180℃，将肉丸油炸3min后取出至室温冷却。
按照GB/T5009.33-2016标准规定的食品中硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法，即盐酸萘乙二胺法进行测定亚硝酸盐的残留量，未添加亚硝酸盐还原酶的样品测得的亚硝酸盐含量为28mg/kg，经过野生型亚硝酸还原酶处理的样品测得亚硝酸盐含量为22mg/kg，经过亚硝酸还原酶突变体21处理的样品测得亚硝酸盐含量为12mg/kg，远低于国标允许的30mg/kg，符合国家标准，大大降低了亚硝酸盐残留所带来的潜在危害。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcgggactg ataacctgtg cgcacctagt aagcggatc 39
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatccgctta ctaggtgcgc acaggttatc agtcccgag 39
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtaagcggat caatccgaaa ggctattttt gcaataaaga tgtcatcaat attcacaagt 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acttgtgaat attgatgaca tctttattgc aaaaatagcc tttcggattg atccgcttac 60
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggtcaattc gaatgagtgc gcctggcacc 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtgccaggc gcactcattc gaattgacca 30
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatccagcac tccaaaagtg tgatagcggt gaaaatt 37
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aattttcacc gctatcacac ttttggagtg ctggatc 37
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gactaaggca gcaccatgcc gagacgaaca gccg 34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggctgttcg tctcggcatg gtgctgcctt agtc 34
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgtgcgagt caggatgagt gccaacaagc cgcattgaac c 41
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggttcaatgc ggcttgttgg cactcatcct gactcgcacg t 41
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aacaagccgc attgaaccat tttgtaagtt gtaattatga tgaaatttta aacgtgaaag 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctttcacgtt taaaatttca tcataattac aacttacaaa atggttcaat gcggcttgtt 60
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccggacgaaa cgtgcaagct gcggacc 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtccgcagc ttgcacgttt cgtccgg 27
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
catttctctc gggactgatt gcctgctggc acctagta 38
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tactaggtgc cagcaggcaa tcagtcccga gagaaatg 38
<210> 19
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcggatcaat ccgaaaggct attttgaaaa ttgcgatgtc atcaatattc acaagt 56
<210> 20
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acttgtgaat attgatgaca tcgcaatttt caaaatagcc tttcggattg atccgc 56
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tggaagtcgc atccggtgcc ggccagc 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctggccggc accggatgcg acttcca 27
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggcgctttat atcgggactg taacgtcaag atcaatagc 39
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gctattgatc ttgacgttac agtcccgata taaagcgcc 39
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggtaccggcc agcctgcaag ggttactatg a 31
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcatagtaac ccttgcaggc tggccggtac c 31
<210> 27
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccccttggac tatttagtgg tctgccaaaa ggaagccctg aataatt 47
<210> 28
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aattattcag ggcttccttt tggcagacca ctaaatagtc caagggg 47
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccggacgaaa cgttctgcct gcggaccccg cta 33
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tagcggggtc cgcaggcaga acgtttcgtc cgg 33
<210> 31
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gccgcattga accattttgt aagtctttgt tatgatgaaa ttttaaacgt gaaagg 56
<210> 32
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cctttcacgt ttaaaatttc atcataacaa agacttacaa aatggttcaa tgcggc 56
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aacaagccgc attgaaccat tttgtaagtt gtaattatga tgaaatttta aacgtgaaag 60
<210> 34
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctttcacgtt taaaatttca tcataattac aacttacaaa atggttcaat gcggcttgtt 60
<210> 35
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggactttaac gtcaagatca atagctgcac gttctttgta ttcggcgaag atc 53
<210> 36
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gatcttcgcc gaatacaaag aacgtgcagc tattgatctt gacgttaaag tcc 53
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtgcggtgac ggcttttatt gcttgtgaac cgactaagg 39
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccttagtcgg ttcacaagca ataaaagccg tcaccgcac 39
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atcgggactt taacgtcaag atcaattgca aaacgttctt tg 42
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
caaagaacgt tttgcaattg atcttgacgt taaagtcccg at 42
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agccctgaat aattatctcc gtaaaaactg caaacgcgag acgttatgg 49
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccataacgtc tcgcgtttgc agtttttacg gagataatta ttcagggct 49
<210> 43
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ccgatggacg tggtctgttc gaatgagcgc gc 32
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gcgcgctcat tcgaacagac cacgtccatc gg 32
<210> 45
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacataa gcaggccgta ttaattct 58
<210> 46
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
agaattaata cggcctgctt atgtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa attatttc 58
<210> 47
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
attttgtaag tcttaattat gatgaaattt tactcgagca ccaccacca 49
<210> 48
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tggtggtggt gctcgagtaa aatttcatca taattaagac ttacaaaat 49
<210> 49
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Lys Gln Ala Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly Arg Ser Gly Thr Ser Val
1 5 10 15
Met Thr Lys Cys Val Asn Leu Met Gly Ile Ser Leu Gly Thr Asp Asn
20 25 30
Leu Leu Ala Pro Ser Lys Arg Ile Asn Pro Lys Gly Tyr Phe Glu Asn
35 40 45
Lys Asp Val Ile Asn Ile His Lys Ser Leu Gly Ser Arg Ile Arg Tyr
50 55 60
Arg Pro Ala Cys Lys Gly Tyr Tyr Asp Ser Pro Lys Ile Lys Lys Asp
65 70 75 80
Arg Ala Ala Leu Thr Thr Tyr Leu Arg Asn Phe Phe Glu Asn Glu Gln
85 90 95
Tyr Leu Ala Ile Lys Asp Pro Arg Met Asn Asp Tyr Ile Glu Leu Trp
100 105 110
Gln Arg Val Leu Ala Asp Val Glu Val Gln Pro Ala Glu Ile Val Leu
115 120 125
Leu Arg Asn Pro Met Asp Val Val Asn Ser Asn Glu Arg Ala Trp His
130 135 140
Arg Asp Thr Thr Leu Ala Met Arg Gln Trp Gln Val Arg Thr Leu Leu
145 150 155 160
Ser Leu Arg Asp Thr Asp Arg Glu His Arg Ile Leu Val Thr Tyr Glu
165 170 175
Asp Leu Phe Gly Gln Thr Leu Thr Thr Leu Lys Arg Ile Ala Thr Gln
180 185 190
Phe Asn Leu Pro Trp Thr Ser Asp Glu Ala Ala Leu Gln Ala Gln Ile
195 200 205
Asp Asp Phe Ile Asp Pro Ala Leu Gln Lys Ser Asp Ser Gly Glu Asn
210 215 220
Leu Ala Asp Phe Glu Ala Arg Thr Asp Val Glu Pro Asp Val Lys Ala
225 230 235 240
Leu Tyr Leu Leu Gly Arg Gln Ala Ala Ala Asp Pro Asp Tyr Phe Ala
245 250 255
Ser Ala Glu Phe Gln Gln Arg Ile Asp Glu Met Thr Asp Glu Tyr Leu
260 265 270
Ala Lys Tyr Gly Ala Leu Tyr Arg Asp Phe Asn Val Lys Ile Asn Ser
275 280 285
Lys Thr Phe Phe Val Phe Gly Glu Asp Gln Ala Gln Val Asp Gln Val
290 295 300
Asn Thr Thr Leu Arg Asn Gly Gln Val Lys Met Val Gly Thr Glu Ala
305 310 315 320
Asp Ser His Glu Val Ala Glu Asp Leu Ser Glu Arg Leu Asn Asn Asn
325 330 335
Thr Ile Ala Ile Gln Thr Tyr Pro Leu Asp Tyr Leu Val Val Cys Gln
340 345 350
Lys Glu Ala Leu Asn Asn Tyr Leu Arg Lys Asn Ala Lys Arg Glu Thr
355 360 365
Leu Trp Gly Ile Gly Asp Ala Lys Asn Asn Glu Ile Val Glu Met Leu
370 375 380
Thr Thr Val Ser Ala Glu Leu Gly Ala Asp Thr His Asn Val Val Ile
385 390 395 400
Ala Asp Asp Leu Thr Ala Ile Ile Asp Glu Arg Glu Arg Arg Leu Ala
405 410 415
Ile Gln His Leu Val Arg Thr Leu His Ala Val Glu Gln Pro Pro Tyr
420 425 430
Leu Val Leu Met Ala Asp Glu Leu Gly Thr Pro Ala Ser Gln Ser Ala
435 440 445
Val Thr Ala Phe Ile Ala Ala Glu Pro Thr Lys Ala Ala Pro Cys Arg
450 455 460
Asp Glu Gln Pro Asp Glu Thr Phe Lys Leu Arg Thr Pro Leu Asp Met
465 470 475 480
Asp Glu Val Ala Ala Thr Leu Thr Val Leu Cys Arg Arg Ala Ser Gln
485 490 495
Asp Glu Cys Gln Gln Ala Ala Leu Asn His Phe Val Ser Leu Asn Tyr
500 505 510
Asp Glu Ile Leu
515
<210> 50
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aagcaggccg tattaattct tgggagtggc cgttccggaa catcggtaat gactaagtgt 60
gttaatttga tgggcatttc tctcgggact gataacctgt tggcacctag taagcggatc 120
aatccgaaag gctattttga aaataaagat gtcatcaata ttcacaagtc acttggaagt 180
cgcatccggt accggccagc ctgcaagggt tactatgata gcccgaagat taaaaaggac 240
cgggcggcgt taaccacgta tctacgaaat ttttttgaga atgaacagta tctggcgata 300
aaagacccac ggatgaatga ttatatcgaa ttgtggcaac gtgttttggc tgacgttgag 360
gttcagccgg ctgaaatcgt cttgctacgt aatccgatgg acgtggtcaa ttcgaatgag 420
cgcgcctggc accgcgatac cacgctcgca atgcgtcagt ggcaagtccg gacgttgctt 480
tcattacgtg ataccgaccg tgagcaccgc attttagtca cgtacgaaga tttgtttggt 540
cagacgttga cgacgttgaa acgaatcgcg acccaattta acttaccgtg gacgagcgac 600
gaggcggccc tccaagcgca aatcgatgac ttcatcgatc cagcactcca aaagagtgat 660
agcggtgaaa atttagctga ttttgaagct cgaacggacg tggaacccga tgttaaggca 720
ctttacttac taggccgtca agctgcggct gacccggatt actttgcctc ggctgaattt 780
caacagcgca tcgacgagat gactgacgag tatttagcca agtatggcgc tttatatcgg 840
gactttaacg tcaagatcaa tagtaaaacg ttctttgtat tcggcgaaga tcaggcccaa 900
gttgatcagg tcaacacgac tttacgaaat ggtcaagtca agatggtcgg cacagaagct 960
gacagtcatg aggttgctga agatttgagc gaacggttga ataataatac gattgccatt 1020
cagacgtacc ccttggacta tttagtggtc tgccaaaagg aagccctgaa taattatctc 1080
cgtaaaaacg cgaaacgcga gacgttatgg gggattgggg atgctaaaaa caatgaaatc 1140
gttgaaatgt taacgacggt cagtgccgag ttaggtgcgg atacgcacaa cgtggtgatt 1200
gcagatgact taacagccat cattgatgaa cgtgagcgcc gattagcgat tcaacattta 1260
gtacggacgt tgcacgcggt tgaacagcca ccatacttgg tcctgatggc tgacgaactg 1320
ggaacccctg cgtcgcaaag tgcggtgacg gcttttattg ctgctgaacc gactaaggca 1380
gcaccatgcc gagatgaaca accggacgaa acgttcaagc tgcggacccc gctagacatg 1440
gatgaggtgg cggcaacttt aacagtgttg tgtcgacgtg cgagtcagga tgaatgccag 1500
caagccgcat tgaaccattt tgtaagtctt aattatgatg aaatttta 1548
<210> 51
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Met Ser Gln Ser Leu Trp Gln Arg Leu Phe Asn His Arg Gln Gln Thr
1 5 10 15
Lys Gln Ala Val Leu Ile Leu Gly Ser Gly Arg Ser Gly Thr Ser Val
20 25 30
Met Thr Lys Cys Val Asn Leu Met Gly Ile Ser Leu Gly Thr Asp Asn
35 40 45
Leu Leu Ala Pro Ser Lys Arg Ile Asn Pro Lys Gly Tyr Phe Glu Asn
50 55 60
Lys Asp Val Ile Asn Ile His Lys Ser Leu Gly Ser Arg Ile Arg Tyr
65 70 75 80
Arg Pro Ala Phe Lys Gly Tyr Tyr Asp Ser Pro Lys Ile Lys Lys Asp
85 90 95
Arg Ala Ala Leu Thr Thr Tyr Leu Arg Asn Phe Phe Glu Asn Glu Gln
100 105 110
Tyr Leu Ala Ile Lys Asp Pro Arg Met Asn Asp Tyr Ile Glu Leu Trp
115 120 125
Gln Arg Val Leu Ala Asp Val Glu Val Gln Pro Ala Glu Ile Val Leu
130 135 140
Leu Arg Asn Pro Met Asp Val Val Asn Ser Asn Glu Arg Ala Trp His
145 150 155 160
Arg Asp Thr Thr Leu Ala Met Arg Gln Trp Gln Val Arg Thr Leu Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Asp Thr Asp Arg Glu His Arg Ile Leu Val Thr Tyr Glu
180 185 190
Asp Leu Phe Gly Gln Thr Leu Thr Thr Leu Lys Arg Ile Ala Thr Gln
195 200 205
Phe Asn Leu Pro Trp Thr Ser Asp Glu Ala Ala Leu Gln Ala Gln Ile
210 215 220
Asp Asp Phe Ile Asp Pro Ala Leu Gln Lys Ser Asp Ser Gly Glu Asn
225 230 235 240
Leu Ala Asp Phe Glu Ala Arg Thr Asp Val Glu Pro Asp Val Lys Ala
245 250 255
Leu Tyr Leu Leu Gly Arg Gln Ala Ala Ala Asp Pro Asp Tyr Phe Ala
260 265 270
Ser Ala Glu Phe Gln Gln Arg Ile Asp Glu Met Thr Asp Glu Tyr Leu
275 280 285
Ala Lys Tyr Gly Ala Leu Tyr Arg Asp Phe Asn Val Lys Ile Asn Ser
290 295 300
Lys Thr Phe Phe Val Phe Gly Glu Asp Gln Ala Gln Val Asp Gln Val
305 310 315 320
Asn Thr Thr Leu Arg Asn Gly Gln Val Lys Met Val Gly Thr Glu Ala
325 330 335
Asp Ser His Glu Val Ala Glu Asp Leu Ser Glu Arg Leu Asn Asn Asn
340 345 350
Thr Ile Ala Ile Gln Thr Tyr Pro Leu Asp Tyr Leu Val Val Glu Gln
355 360 365
Lys Glu Ala Leu Asn Asn Tyr Leu Arg Lys Asn Ala Lys Arg Glu Thr
370 375 380
Leu Trp Gly Ile Gly Asp Ala Lys Asn Asn Glu Ile Val Glu Met Leu
385 390 395 400
Thr Thr Val Ser Ala Glu Leu Gly Ala Asp Thr His Asn Val Val Ile
405 410 415
Ala Asp Asp Leu Thr Ala Ile Ile Asp Glu Arg Glu Arg Arg Leu Ala
420 425 430
Ile Gln His Leu Val Arg Thr Leu His Ala Val Glu Gln Pro Pro Tyr
435 440 445
Leu Val Leu Met Ala Asp Glu Leu Gly Thr Pro Ala Ser Gln Ser Ala
450 455 460
Val Thr Ala Phe Ile Ala Ala Glu Pro Thr Lys Ala Ala Pro Leu Arg
465 470 475 480
Asp Glu Gln Pro Asp Glu Thr Phe Lys Leu Arg Thr Pro Leu Asp Met
485 490 495
Asp Glu Val Ala Ala Thr Leu Thr Val Leu Cys Arg Arg Ala Ser Gln
500 505 510
Asp Glu Gln Gln Gln Ala Ala Leu Asn His Phe Val Ser Leu Asn Tyr
515 520 525
Asp Glu Ile Leu Asn Val Lys Gly Asp Gln Tyr Ala Asn Ser Val Arg
530 535 540
Asn
545
<210> 52
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
atgagtcaaa gcttatggca acgattgttt aatcaccgtc aacaaacgaa gcaggccgta 60
ttaattcttg ggagtggccg ttccggaaca tcggtaatga ctaagtgtgt taatttgatg 120
ggcatttctc tcgggactga taacctgctg gcacctagta agcggatcaa tccgaaaggc 180
tattttgaaa ataaagatgt catcaatatt cacaagtcac ttggaagtcg catccggtac 240
cggccagcct tcaagggtta ctatgatagc ccgaagatta aaaaggaccg ggcggcgtta 300
accacgtatc tacgaaactt ttttgagaat gaacaatatc tggcgattaa agacccacgg 360
atgaatgatt atattgaatt gtggcaacgt gttttggctg acgttgaggt tcagccggct 420
gaaatcgtct tgctacgtaa tccgatggac gtggtcaatt cgaatgagcg cgcctggcac 480
cgcgatacca cgctcgcaat gcgtcagtgg caagtccgga cgttgctttc attacgtgat 540
accgaccgtg agcaccgcat tttagtcacg tacgaagatt tgtttggtca gacgttgacg 600
acgttgaaac gaatcgcgac ccaatttaac ttaccgtgga cgagcgacga ggcggccctc 660
caagcgcaaa tcgatgactt catcgatcca gcactccaaa agagtgatag cggtgaaaat 720
ttagctgatt ttgaagctcg aacggacgtg gaacccgatg ttaaggcact ttacttacta 780
ggccgtcaag ctgcggctga cccggattac tttgcctcgg ctgaatttca acagcgcatc 840
gacgagatga ctgacgagta tttagccaag tatggcgctt tatatcggga ctttaacgtc 900
aagatcaata gcaaaacgtt ctttgtattc ggcgaagatc aggcccaagt tgatcaggtc 960
aacacgactt tacgaaatgg tcaagtcaag atggtcggca cagaagctga cagtcatgag 1020
gttgctgaag atttgagcga acggttgaat aataatacga ttgccattca gacgtacccc 1080
ttggactatt tagtggtcga gcaaaaggaa gccctgaata attatctccg taaaaacgcg 1140
aaacgcgaga cgttatgggg gattggggat gctaaaaaca atgaaatcgt tgaaatgtta 1200
acgacggtca gtgccgagtt aggtgcggat acgcacaacg tggtgattgc agatgactta 1260
acagccatca ttgatgaacg tgagcgccga ttagcgattc aacatttagt acggacgttg 1320
cacgcggttg aacagccacc atacttggtc ctgatggctg acgaactggg aacccctgcg 1380
tcgcaaagtg cggtgacggc ttttattgct gctgaaccga ctaaggcagc accattacga 1440
gacgaacagc cggacgaaac gttcaagctg cggaccccgc tagacatgga tgaggtggcg 1500
gcaactttaa cagcgttgtg tcgacgtgcg agtcaggatg agcaacaaca agccgcattg 1560
aaccattttg taagtcttaa ttatgatgaa attttaaacg tgaaaggtga tcaatatgca 1620
aacagtgtac ggaat 1635

Claims (9)

1.一种亚硝酸盐还原酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:49所示。
2.一种编码权利要求1所述亚硝酸盐还原酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其为SEQ ID NO:50所示。
4.一种插入有包括权利要求2或3所述的编码亚硝酸盐还原酶突变体的基因的重组表达载体。
5.一种含权利要求2或3所述基因的重组基因工程菌。
6.一种权利要求5所述重组基因工程菌的制备方法，其特征在于，将权利要求2或3所述基因克隆到表达载体pET-30a或pET-21a表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，获得重组基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)，SHuffleT7或Arctic Express(DE3)。
8.权利要求1或2所述亚硝酸盐还原酶突变体的应用，其特征在于，所述的亚硝酸盐还原酶突变体在食品、环保领域亚硝酸盐降解中的应用。
9.一种亚硝酸盐降解的方法，其特征在于，降解亚硝酸盐时所用酶为权利要求1或2所述的亚硝酸盐还原酶突变体。
CN202210271535.7A 2022-03-18 2022-03-18 一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用 Active CN114574456B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210271535.7A CN114574456B (zh) 2022-03-18 2022-03-18 一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210271535.7A CN114574456B (zh) 2022-03-18 2022-03-18 一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114574456A true CN114574456A (zh) 2022-06-03
CN114574456B CN114574456B (zh) 2022-08-12

Family

ID=81777006

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210271535.7A Active CN114574456B (zh) 2022-03-18 2022-03-18 一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114574456B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6833447B1 (en) * 2000-07-10 2004-12-21 Monsanto Technology, Llc Myxococcus xanthus genome sequences and uses thereof
US20110135646A1 (en) * 2003-03-06 2011-06-09 Nationwide Children's Hospital, Inc. Genes of an Otitis Media Isolate of Nontypeable Haemophilus influenzae
US20120148615A1 (en) * 2004-05-14 2012-06-14 Vega Masignani Polypeptides from non-typeable haemophilus influenzae
CN102559715A (zh) * 2012-02-20 2012-07-11 上海应用技术学院 一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用
CN104169296A (zh) * 2012-03-13 2014-11-26 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
US20150203858A1 (en) * 2007-08-15 2015-07-23 British American Tobacco (Investments) Limited Production of plants with decreased nitrite content
CN107446940A (zh) * 2017-07-26 2017-12-08 华南理工大学 一种重组亚硝酸盐还原酶及其构建方法
CN107455650A (zh) * 2017-08-22 2017-12-12 华南理工大学 一种降解食品中亚硝酸盐的方法
CN110540980A (zh) * 2019-09-07 2019-12-06 华南理工大学 一种海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6833447B1 (en) * 2000-07-10 2004-12-21 Monsanto Technology, Llc Myxococcus xanthus genome sequences and uses thereof
US20110135646A1 (en) * 2003-03-06 2011-06-09 Nationwide Children's Hospital, Inc. Genes of an Otitis Media Isolate of Nontypeable Haemophilus influenzae
US20120148615A1 (en) * 2004-05-14 2012-06-14 Vega Masignani Polypeptides from non-typeable haemophilus influenzae
US20150203858A1 (en) * 2007-08-15 2015-07-23 British American Tobacco (Investments) Limited Production of plants with decreased nitrite content
CN102559715A (zh) * 2012-02-20 2012-07-11 上海应用技术学院 一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用
CN104169296A (zh) * 2012-03-13 2014-11-26 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
CN107446940A (zh) * 2017-07-26 2017-12-08 华南理工大学 一种重组亚硝酸盐还原酶及其构建方法
CN107455650A (zh) * 2017-08-22 2017-12-12 华南理工大学 一种降解食品中亚硝酸盐的方法
CN110540980A (zh) * 2019-09-07 2019-12-06 华南理工大学 一种海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRANDON J. REEDER等: "Strong modulation of nitrite reductase activity of cytoglobin by disulfide bond oxidation: Implications for nitric oxide homeostasis", 《NITRIC OXIDE》 *
HUANG,C.H.等: "Lactiplantibacillus plantarum strain TCI507 chromosome, complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
MAURO TISO等: "Human Neuroglobin Functions as a Redox-regulated Nitrite Reductase", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
唐阔等: "乳酸菌降解亚硝酸盐和反硝化细菌亚硝酸盐还原酶结构研究进展", 《中国调味品》 *
陈功: "《泡菜加工学》", 31 July 2018 *
陈思敏等: "蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化", 《食品科学》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114574456B (zh) 2022-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112725309B (zh) 一种中温下稳定的低温外切菊粉酶突变体MutP126R
CN107475229B (zh) 一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法
CN112646792A (zh) 一种热稳定性降低的低温外切菊粉酶突变体MutA122Δ5及应用
CN112980813A (zh) 低温改良的外切菊粉酶突变体MutS117G
CN108251391A (zh) 新型葡萄糖氧化酶突变体
CN108004220B (zh) 提高热稳定性的碱性蛋白酶BmP突变体及其基因和应用
CN108118037A (zh) 一种耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体
Mihara et al. Acid phosphatase/phosphotransferases from enteric bacteria
CN108118036A (zh) 新型葡萄糖氧化酶突变体
CN111172142A (zh) 一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体
CN114107266A (zh) 耐热性提高的蛋白酶突变体及其编码基因和应用
CN114574456B (zh) 一种亚硝酸盐还原酶突变体及其编码基因和应用
US7871803B2 (en) Gene encoding novel luciferase
CN113493799B (zh) 一株高产酸性乳糖酶的黑曲霉菌株
CN108251390A (zh) 一种葡萄糖氧化酶突变体
CN111944790A (zh) 中性蛋白酶基因、中性蛋白酶及其制备方法和应用
CN114736880B (zh) 酸稳定性提高葡萄糖氧化酶GoxM10的突变体D497N及其衍生突变体和应用
CN110117583B (zh) 热稳定和比活提高的植酸酶ecappa突变体及其基因和应用
CN109423483B (zh) 葡萄糖氧化酶突变体
CN115247158B (zh) 一种甘油磷酸氧化酶突变体及其筛选方法、制备方法和应用
CN107988177B (zh) 葡萄糖氧化酶突变体
CN113061593B (zh) 一种l-苹果酸脱氢酶突变体及其应用
CN108913677B (zh) 一种定点突变改造的碱性普鲁兰酶及其应用
WO2016175202A1 (ja) 耐熱性を有するキシラナーゼ
CN113699129B (zh) 一种热稳定性和催化活性提高的谷氨酰胺转氨酶变体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant