CN107455650A - 一种降解食品中亚硝酸盐的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降解食品中亚硝酸盐的方法，在食品酱汁中加入亚硝酸盐还原酶，在27～37℃静止反应6～12h后，再用有机酸调节pH至2.0～5.5，再在20～37℃静止反应4～12h；所述亚硝酸盐还原酶基因来自于可食用细菌。本发明采用先粗酶液后有机酸降解亚硝酸钠的方法，比单一使用有机酸或亚硝酸盐还原酶的效果好。用盐酸萘乙二胺法测定体系中亚硝酸盐的浓度，计算亚硝酸钠的降解率达到90％以上。本发明能应用于降解pH大于5.0的高亚硝酸盐食品，例如泡菜。

Description

一种降解食品中亚硝酸盐的方法
技术领域
本发明属于降解亚硝酸盐的技术领域，具体涉及一种亚硝酸盐还原酶和有机酸协同降解食品中亚硝酸盐的方法。
背景技术
亚硝酸盐广泛存在于食品保鲜领域，尤其是熏腌制品。腌制食品(酸菜、腊肉、鱼干等)具有特殊风味与质构，深受人们的喜爱。硝酸盐与亚硝酸盐本身有防腐的作用，在肉制品加工中还具有发色的功能，因此在熏腌制食品中被广泛使用。但是硝酸盐在硝酸盐还原酶的作用下会生成亚硝酸盐，导致熏腌制食品中有过量的亚硝酸盐残留，亚硝酸盐对人体产生极大的危害。
亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，广泛存在与各类食品中的有机酸能够有效降解亚硝酸盐。常见的有机酸主要有苹果酸、柠檬酸、Vc、乳酸及乙酸等，其中乳酸和乙酸主要存在于发酵食品中，而苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、丙酸主要存在于蔬菜中。邹辉等(邹辉，刘晓英，陈义伦，等.泡菜(白菜)腌制过程中有机酸对亚硝酸盐含量的影响[J].食品与发酵工业，2013，39(11)：29-32)的研究表明，对亚硝酸盐降解能力大小依次：柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、丙酸。
有机酸对亚硝酸盐的降解作用主要通过调节反应液的pH来研究其对亚硝酸盐的降解。亚硝酸盐的含量在泡菜腌制过程中呈现先上升后下降的趋势，亚硝峰出现的时间及峰值的大小与泡菜发酵过程中的菌种、发酵时间、食盐浓度及卤汁的pH值有关。有机酸(除Vc外)溶液pH＞4.0时，降解率都不超过20％。
除了有机酸外，反硝化细菌中的亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase，简称NiR)是反硝化作用的关键酶和限速酶，能够将亚硝酸盐还原为NH4 +或N2在生物氮循环中起着重要作用。但在pH低于5.0时，NiR酶活较低，不能显著降解体系中的亚硝酸盐含量。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的是提供一种亚硝酸盐还原酶和有机酸协同降解食品中亚硝酸盐的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种降解食品中亚硝酸盐的方法，在食品酱汁中加入亚硝酸盐还原酶，在27～37℃静止反应6～12h后，再用有机酸调节pH至2.0～5.5，再在20～37℃静止反应4～12h；所述亚硝酸盐还原酶基因来自于可食用细菌。
所述的亚硝酸盐还原酶是从有降解活性的可食用细菌，或从含有亚硝酸盐还原酶基因的重组菌中提取的粗酶液。
所述的可食用细菌是干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus caseisubsp.Rhamnosus)6013，或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMDL9010，或蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)LJ01。
所述粗酶液的总酶活为3000～4000U。
所述粗酶液的添加量为100～500μL/mL。
所述重组菌为重组大肠杆菌BL21。
所述的有机酸为苹果酸、Vc、柠檬酸、丁二酸、乙酸、乳酸其中的一种或两种以上。
所述有机酸的浓度为0.1～0.5mol/L。
一种降解食品中亚硝酸盐的方法，具体包括如下步骤：
(1)从可食用细菌中提取粗酶液
将活化种子液以2％的体积分数接种至含有100μg/mL NaNO2的LB液体培养基中，于30℃和180r/min摇床培养24h后，将培养基离心10min(8000r/min，4℃)后，弃去上清液后，用无菌水洗后离心10min(8000r/min，4℃)，清洗和离心重复2次得含NiR的细胞并称重，将收集的细胞悬浮于50mM HEPES缓冲液(pH 7.4，5mmol/LDTT，0.2％胰蛋白酶抑制剂)，成为终浓度为200g/L(湿菌体重/缓冲液)的菌悬液，在冰浴环境下进行超声破碎(35％，10min，2s停2s)，离心20min(8000r/min，4℃)后，上清液为含有天然NiR的粗酶液。
所述的食用细菌为干酪乳杆菌LCR6013或植物乳杆菌DMDL9010或蜡样芽胞杆菌LJ01。
(2)从重组大肠杆菌BL21中提取粗酶液
①培养菌液：将实验室保存的重组大肠杆菌BL21菌种接种到含50～100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃和180rpm下震荡培养6～20h得到种子液；将种子液按1％～2％接种量接种到含50～100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃和180rpm下震荡培养。震荡培养过程中每30min检测一次OD600，当OD600≈0.6～0.8(对数生长期)时，加入终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG进行诱导表达，于16～37℃和180rpm下震荡培养4～20h后，得培养液。
②粗蛋白的提取：离心收集步骤①中培养液菌体，提取粗蛋白液，其具体步骤如下：将上述发酵液于8000～12000rpm离心5～10min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于8000～12000rpm离心5～10min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100mL培养液得到的菌泥中加入10mL于4℃预冷的缓冲液A(20mM Tris、500mM NaCl、pH7.5)混匀，高压破碎菌体3～5次，压力为1000～1500ba，水温4～6℃，超声破碎后，在4℃、8000～12000rpm离心30～50min，取其上清液，即为含有重组蛋白亚硝酸盐还原酶(NiR)的粗蛋白液，于4℃保存备用。
所述的重组菌大肠杆菌BL21中含有的NiR的编码基因来自干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus casei subsp.rhamnosus 6013，或植物乳杆菌Lactobacillus plantarumDMDL9010，或蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus LJ01。
(3)粗酶液和有机酸协同降解亚硝酸盐：取步骤(1)或(2)中所得的粗酶液100～500μL，加入亚硝酸钠溶液，使其初始浓度为100～600μg/mL，反应体系为1mL，在27～37℃静止反应6～12h后，用0.1～0.5mol/L苹果酸或柠檬酸或乳酸或乙酸或维生素C溶液调节pH至2.0～5.5，用蒸馏水补至总体积为5mL在20～37℃静止反应4～12h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐含量，计算亚硝酸盐的降解率＝(亚硝酸钠的初始浓度—反应后亚硝酸钠的剩余浓度)/亚硝酸钠的初始浓度。
本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：
(1)本发明采用先有机酸后粗酶液降解亚硝酸钠的方法，比单一使用有机酸或亚硝酸盐还原酶的效果好。
(2)本发明在相对低的温度和有机酸浓度，而高亚硝酸盐浓度的条件下降解率达到90％以上。
(3)本发明粗酶液中含有高酶活的亚硝酸盐还原酶，能够和有机酸协同降解高浓度的亚硝酸钠。
(4)本发明能应用于降解pH大于5.0的高亚硝酸盐食品，例如泡菜(在其发酵后期应用)。
所述的干酪乳杆菌鼠李糖亚种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC6013，命名为Lactobacillus casei subsp.rhamnosus LCR 6013(简称LCR6013)。
所述的乳杆菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.5172，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，该保藏证明已在中国专利CN102978134A中提交。
所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)LJ01的保藏信息：蜡样芽孢杆菌LJ01于2014年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏号CGMCC No.9360；该保藏证明已在中国专利CN104212739A中提交。
附图说明
图1是牛血清白蛋白标准曲线。
图2是亚硝酸盐的标准曲线。
图3是粗酶液蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图4是亲和层析纯化后NIR蛋白质的SDS-PAGE电泳图。
图5是不同的温度对降解亚硝酸盐的影响。
图6是不同初始亚硝酸盐浓度下对亚硝酸盐降解率的影响。
图7是不同初始亚硝酸盐浓度下对降解亚硝酸盐的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。
实施例1亚硝酸盐还原酶(重组的NiR)与苹果酸协同降解亚硝酸钠的筛选过程。
(1)从重组大肠杆菌BL21中提取粗酶液
①培养菌液：将实验室保存的重组大肠杆菌BL21菌种(含有干酪乳杆菌LCR6013的亚硝酸盐还原酶基因)接种到含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃和180rpm下震荡培养8h得到种子液；将种子液按2％接种量接种到含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃和180rpm下震荡培养。震荡培养过程中每30min检测一次OD600，当OD600≈0.6(对数生长期)时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导表达，于30℃和180rpm下震荡培养4h后，得培养液。
②粗蛋白的提取：离心收集步骤①中培养液菌体，提取粗蛋白液，其具体步骤如下：将上述发酵液于8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于8000rpm离心10min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100mL培养液得到的菌泥中加入10mL于4℃预冷的缓冲液A(20mM Tris、500mM NaCl、pH7.5)混匀，高压破碎菌体3次，压力为1000ba，水温5℃，超声破碎后，在4℃、12000rpm离心40min，取其上清液，即为含有重组蛋白亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,简称NiR)的粗蛋白液，于4℃保存备用。
(2)重组大肠杆菌BL21的粗酶液纯化
利用亲和层析柱Ni Sepharose 6Fast Flow(GE公司)纯化蛋白，纯化操作如下：
①装柱：将25mL用20％酒精浸泡的填料倒入玻璃柱中，待填料压好之后用5倍柱体积的蒸馏水冲洗，速度约2mL/min。
②预平衡柱：用5～10倍柱体积的于4℃预冷的缓冲液A(20mM Tris、500mM NaCl、pH7.5)平衡填料，速度约2mL/min。
③上样：步骤(1)中所得的粗蛋白液30～50mL。
④洗脱杂蛋白：用于4℃预冷的缓冲液A(20mM Tris、500mM NaCl、pH7.5)冲洗填料，速度约1mL/min，收集洗脱液，同时用酶标仪检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值达到基线。
⑤收集纯化蛋白：用于4℃预冷的缓冲液B(20mM Tris、500mM NaCl、pH7.5)洗脱填料，速度约1mL/min，收集洗脱液，同时用酶标仪检测洗脱液在280nm处的吸光值，直至吸光值达到基线。
⑥透析和浓缩：将所有蛋白液装入到透析袋中，用封口夹封口，浸泡在缓冲液C(20mM Tris、pH7.5)中，每1h更换一次缓冲液，更换6～7次。然后将透析袋取出，置于PEG20000的粉末中进行浓缩，直到透析袋内溶液的体积浓缩到5～8mL，收集得到的浓缩溶液，即为高浓度的蛋白溶液。
(3)酶活的测定
①牛血清白蛋白标准曲线绘制：分别吸取浓度为100μg/mL的牛血清白蛋白溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.80，1.00mL(相当于0，10,20,40,60,80,100μg牛血清白蛋白)于试管中，分别加蒸馏水1.00，0.90，0.80，0.60，0.40，0.20，1.00mL于试管中，各加5mL的考马斯亮蓝染料，摇匀，放置6min，在595nm波长测定吸光值。
②粗酶液的蛋白质含量测定：吸取2mL粗酶液用蒸馏水稀释至100mL，吸取稀释的粗酶液1.0mL，实验平行三组进行，用测定标准曲线的而方法测定其595nm波长处的吸光值，与标准曲线对照，算出粗酶液的蛋白质含量。
③纯化酶液的蛋白质含量测定：吸取1mL纯化酶液用蒸馏水稀释至100mL，吸取稀释的粗酶液0.5mL，实验平行三组进行，用测定标准曲线的而方法测定其595nm波长处的吸光值，与标准曲线对照，算出粗酶液的蛋白质含量。
④粗酶液以及纯化酶液中的酶活性对比：各取粗酶液和纯化的酶液300μL，加入200μL的亚硝酸钠(反应体系浓度为200μg/mL)，其中纯化酶液需要加入80μL的细胞色素C，另一组纯化酶液不加细胞色素C，粗酶液同样也不加。分别补充蒸馏水至1mL，与37℃恒温箱中反应36h，取出吸取200μL的反应液用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐含量，加入2mL对氨基苯磺酸溶液(4g/L)，混匀，静置5min，后再加入1mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，加水至刻度，混匀，静置15min，用1cm比色杯，以零管调零点，于538nm处测其吸光值，根据标准曲线计算出亚硝酸盐的残留浓度。标准曲线的制备：吸取1mL的亚硝酸盐标准使用液(1mg/mL)于250mL容量瓶中，滴加蒸馏水，稀释致刻度线。吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL(相当于0、2、4、8、12、16、20μg)稀释液于25mL比色管中，加入2mL对氨基苯磺酸溶液(4g/L)，混匀，静置5min，后再加入1mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，加水至刻度，混匀，静置15min,用1cm比色杯，以零管调零点，于538nm处测其吸光值，绘制标准曲线。并计算酶活。
其中：NiR的酶活单位：在反应体系每分钟每毫克蛋白质降解亚硝酸钠的纳克(ng)数为一个酶活单位(U)。
酶活计算公式如下：Activity(U)＝m/(M·t)，其中m为降解的亚硝酸钠的质量，单位为ng；M为反应物中酶蛋白质的质量，单位为mg；t为反应时间，单位为min。
牛血清白蛋白的标准曲线如图1所示，牛血清白蛋白的标准曲线线性方程为y＝0.005x+0.00881，R2为0.9956，线性良好。测定粗酶液的蛋白浓度为1.384mg/mL，纯化的酶液的浓度0.1424mg/mL。
亚硝酸盐的标准曲线如图2所示，亚硝酸盐的标准曲线线性方程为y＝0.0215+0.0028，R2为0.9994，线性良好。对比粗酶液、纯化酶液以纯化酶液(含细胞色素C)降解亚硝酸盐的效果，纯化酶液对亚硝酸盐没有降解作用，需要辅蛋白细胞色素C才有活性，粗酶液没有加细胞色素C却有活性，由此可以推断从重组大肠杆菌BL21中提取的亚硝酸盐还原酶的粗酶液含有辅蛋白，其纯化酶液需要加入辅蛋白才有活性，活性对比结果如表1所示。
表1亚硝酸盐还原酶的酶活比较
(4)NiR和电子供体蛋白的分子量测定
将收集得到的粗酶液和纯化的酶液分别加入5×蛋白质样品加样缓冲液(1:1，v/v)，100℃水浴10min。利用浓度为12.5％的SDS-PAGE蛋白电泳进行检测，分析蛋白大小及蛋白溶液的纯度。
图3为粗酶液蛋白的SDS-PAGE电泳图，图4为亲和层析纯化后NiR蛋白质的SDS-PAGE电泳图。由图3和图4对比看出，重组大肠杆菌BL21中亚硝酸盐还原酶分子量约为60KD。加入纯化酶液中细胞色素C分子量为13KD，而在图3的左下角的箭头所指的蛋白带约13KD，结合图4的结果看，含有NiR的粗酶液中含有分子量为13KD的辅蛋白，与细胞色素C有共同的功能，与亚硝酸盐还原酶结合，使其有活性。
(5)不同温度对粗酶液降解亚硝酸盐的影响：取粗酶液300μL，再加入200μL亚硝酸钠溶液(反应液中亚硝酸盐浓度为200μg/mL)，补充蒸馏水至反应液的总体积为1mL，实验平行三组。分别放置在17、22、27、32、37、42、47℃反应36h后取出，吸取200μL反应后的样液，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐含量，计算亚硝酸盐降解率＝(亚硝酸钠的初始浓度—反应后亚硝酸钠的剩余浓度)/亚硝酸钠的初始浓度。
不同温度对粗酶液降解亚硝酸盐的影响如图5所示，亚硝酸盐的降解率先随温度的升高而增大，在37℃到达峰值97.77％后，随温度升高而降低，最后降到零。反应温度在27-37℃范围时，亚硝酸盐有较高的降解率(89.83％，96.29％和97.77％)，对亚硝酸盐具有很好的降解效果。由此可以看出，亚硝酸盐还原酶的适宜反应温度范围为27-37℃，最佳反应温度是37℃，反应温度超过37℃，酶的活性急剧下降，到47℃时，已经失去酶活，由此可以推断亚硝酸盐还原酶不是耐高温的酶。
(6)不同亚硝酸盐初始浓度对亚硝酸盐降解的影响：取300μL粗酶液，分别加入亚硝酸钠溶液(1mg/mL)0、50、100、200、300、400、500、600μL，使得溶液的亚硝酸盐浓度为0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600μg/mL，补充蒸馏水至反应液的总体积为1mL，37℃反应36h后取出，吸取200μL反应后的样液，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐含量，并计算亚硝酸盐的降解率(同5)。
不同亚硝酸盐初始浓度对亚硝酸盐降解的影响如图6、图7所示。在酶液一定时，粗酶液降解亚硝酸盐的降解率随初始亚硝酸盐的浓度增大而减少，但是降解的量是随初始亚硝酸盐的增大先是呈线性增大后增大缓慢，到达峰值(500，386.70)后，又下降的趋势。初始亚硝酸盐浓度在50-400μg/mL时，酶降解亚硝酸盐的降解率都超过89.23％，达到较好的降解效果。初始亚硝酸盐浓度在600μg/mL时，降解量并没有趋于平稳而是下降，可以初步推断高浓度的亚硝酸盐会对亚硝酸盐还原酶催化降解有一定的抑制作用。因为粗酶液在初始亚硝酸盐浓度在500μg/mL时，可以将亚硝酸盐500μg/mL降到113.30μg/mL，降解量高达386.70μg/mL。
(7)含有重组NiR的粗酶液和苹果酸协同降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液500μL，加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为600μg/mL，反应体系为1mL，在27℃静止反应6h后，用0.3mol/L苹果酸分别调节pH至2.0、2.5、3.0，用蒸馏水补至总体积为5mL，分别在20℃静止反应12h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率＝(亚硝酸钠的初始浓度—反应后亚硝酸钠的剩余浓度)/亚硝酸钠的初始浓度，依次为95.2％、96.7％、98.8％。
实施例2亚硝酸盐还原酶(天然的NiR)与维生素C协同降解亚硝酸钠的筛选过程。
(1)从干酪乳杆菌LCR6013中提取粗酶液
将活化种子液以2％的体积分数接种至含有100μg/mL NaNO2的LB液体培养基中，于30℃和180r/min摇床培养24h后，将培养基离心10min(8000r/min，4℃)后，弃去上清液后，用无菌水洗后离心10min(8000r/min，4℃)，清洗和离心重复2次得含NiR的细胞并称重，将收集的细胞悬浮于50mM HEPES缓冲液(pH 7.4，5mmol/LDTT，0.2％胰蛋白酶抑制剂)，成为终浓度为200g/L(湿菌体重/缓冲液)的菌悬液，在冰浴环境下进行超声破碎(35％，10min，2s停2s)，离心20min(8000r/min，4℃)后，上清液为含有天然NiR的粗酶液。
(2)含有天然NiR的粗酶液和维生素C协同降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液100μL，反应体系为1mL，亚硝酸钠的初始浓度为100μg/mL，在37℃静止反应12h后，用0.1mol/L维生素C溶液分别调节pH至3.5、4.0、4.5，用蒸馏水补至总体积为5mL，在37℃静止反应6h后，用盐酸萘乙二胺法测定体系中亚硝酸盐的浓度几乎为0，计算亚硝酸钠的降解率均达到100％。
实施例3亚硝酸盐还原酶(重组的NiR)与柠檬酸协同降解亚硝酸钠的筛选过程。
(1)重组大肠杆菌BL21中提取粗酶液
①培养菌液：将实验室保存的重组大肠杆菌BL21菌种(含有蜡样芽胞杆菌LJ01的亚硝酸盐还原酶基因)接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃和180rpm下震荡培养12h得到种子液；将种子液按1.5％接种量接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃和180rpm下震荡培养。震荡培养过程中每30min检测一次OD600，当OD600≈0.7(对数生长期)时，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG进行诱导表达，于16℃和180rpm下震荡培养20h后，得培养液。
②粗蛋白的提取：离心收集步骤①中培养液菌体，提取粗蛋白液，其具体步骤如下：将上述发酵液于8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于8000rpm离心10min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100mL培养液得到的菌泥中加入10mL于4℃预冷的缓冲液A(20mM Tris、500mM NaCl、pH7.5)混匀，高压破碎菌体3次，压力为1000ba，水温4℃，超声破碎后，在4℃、12000rpm离心40min，取其上清液，即为含有重组蛋白亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,简称NiR)的粗蛋白液，于4℃保存备用。
(2)粗酶液和柠檬酸协同降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液300μL，反应体系为1mL，加入亚硝酸钠溶液，使其初始浓度为350μg/mL，在30℃静止反应8h后，用0.5mol/L柠檬酸溶液分别调节pH至4.5、5.0、5.5，用蒸馏水补至总体积为5mL，在30℃静止反应4h后，用盐酸萘乙二胺法测定体系中亚硝酸盐的浓度，并计算并计算亚硝酸盐的降解率依次为92.5％、93.3％、94.8％。
实施例4亚硝酸盐还原酶(天然的NiR)与丁二酸协同降解亚硝酸盐的筛选过程。
(1)从蜡样芽胞杆菌LJ01中提取粗酶液
将活化种子液以2％的体积分数接种至含有100μg/mL NaNO2的LB液体培养基中，于30℃和180r/min摇床培养24h后，将培养基离心10min(8000r/min，4℃)后，弃去上清液后，用无菌水洗后离心10min(8000r/min，4℃)，清洗和离心重复2次得含NiR的细胞并称重，将收集的细胞悬浮于50mM HEPES缓冲液(pH 7.4，5mmol/LDTT，0.2％胰蛋白酶抑制剂)，成为终浓度为200g/L(湿菌体重/缓冲液)的菌悬液，在冰浴环境下进行超声破碎(35％，10min，2s停2s)，离心20min(8000r/min，4℃)后，上清液为含有天然NiR的粗酶液。
(2)含有天然NiR的粗酶液和丁二酸协同降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液400μL，加入亚硝酸钠溶液，使其初始浓度为500μg/mL，反应体系为1mL，在27℃静止反应12h后，用0.2mol/L丁二酸分别调节pH至2.5、3.0、3.5，用蒸馏水补至总体积为5mL，在27℃静止反应10h后，用盐酸萘乙二胺法测定体系中亚硝酸盐的浓度，并计算亚硝酸盐的降解率依次为93.8％、94.3％、97.1％。
实施例5亚硝酸盐还原酶(重组的NiR)与乙酸协同降解亚硝酸盐的筛选过程。
(1)重组大肠杆菌BL21中提取粗酶液
①培养菌液：将实验室保存的重组大肠杆菌BL21菌种(含有植物乳杆菌DMDL9010的亚硝酸盐还原酶基因)接种到含80μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃和180rpm下震荡培养9h得到种子液；将种子液按2％接种量接种到含80μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃和180rpm下震荡培养。震荡培养过程中每30min检测一次OD600，当OD600≈0.8(对数生长期)时，加入终浓度为0.6mmol/L IPTG进行诱导表达，于28℃和180rpm下震荡培养15h后，得培养液。
②粗蛋白的提取：离心收集步骤①中培养液菌体，提取粗蛋白液，其具体步骤如下：将上述发酵液于8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，用无菌水重悬，于8000rpm离心10min离心弃上清，以此清洗两次，收集得到菌泥。每100mL培养液得到的菌泥中加入10mL于4℃预冷的缓冲液A(20mM Tris、500mM NaCl、pH7.5)混匀，高压破碎菌体3次，压力为1000ba，水温5℃，超声破碎后，在4℃、12000rpm离心40min，取其上清液，即为含有重组蛋白亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,简称NiR)的粗蛋白液，于4℃保存备用。
(2)含有重组NiR的粗酶液和乙酸协同降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液200μL，加入亚硝酸钠溶液，使其初始浓度为200μg/mL，反应体系为1mL，在30℃静止反应8h后，用0.4mol/L乙酸分别调节pH至4.0、4.5、5.0，用蒸馏水补至总体积为5mL，在25℃静止反应6h后，用盐酸萘乙二胺法测定体系中亚硝酸盐的浓度，并计算亚硝酸盐的降解率依次为91.8％、93.1％、96.2％。
实施例6亚硝酸盐还原酶(天然的NiR)与乳酸协同降解亚硝酸盐的筛选过程。
(1)从植物乳杆菌DMDL9010中提取粗酶液
将活化种子液以2％的体积分数接种至含有100μg/mL NaNO2的LB液体培养基中，于30℃和180r/min摇床培养24h后，将培养基离心10min(8000r/min，4℃)后，弃去上清液后，用无菌水洗后离心10min(8000r/min，4℃)，清洗和离心重复2次得含NiR的细胞并称重，将收集的细胞悬浮于50mM HEPES缓冲液(pH 7.4，5mmol/LDTT，0.2％胰蛋白酶抑制剂)，成为终浓度为200g/L(湿菌体重/缓冲液)的菌悬液，在冰浴环境下进行超声破碎(35％，10min，2s停2s)，离心20min(8000r/min，4℃)后，上清液为含有天然NiR的粗酶液。
(2)含有天然NiR的粗酶液和乳酸协同降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液350μL，加入亚硝酸钠溶液，使其初始浓度为400μg/mL，反应体系为1mL，在30℃静止反应10h后，用0.3mol/L乳酸分别调节pH至3.0、3.5、4.0，用蒸馏水补至总体积为5mL，在30℃静止反应8h后，用盐酸萘乙二胺法测定体系中亚硝酸盐的浓度，并计算并计算亚硝酸盐的降解率依次为92.7％、95.9％、98.6％。
对比实施例1
(1)从重组大肠杆菌BL21中提取粗酶液：同实施例1。
(2)仅用该含有重组NiR的粗酶液降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液500μL，加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为600μg/mL，反应体系为1mL，在27℃静止反应6h后，用蒸馏水补至总体积为5mL，在20℃静止反应12h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率仅为28.7％。
(3)仅用0.3mol/L苹果酸降解亚硝酸盐：加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为600μg/mL，用0.3mol/L苹果酸分别调节pH至2.0、2.5、3.0，用蒸馏水补至总体积为5mL，分别在20℃静止反应12h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率依次为27.2％、35.9％、36.8％。
对比实施例2
(1)从干酪乳杆菌LCR6013中提取粗酶液：同实施例2。
(2)仅用该含有天然NiR的粗酶液降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液100μL，反应体系为1mL，亚硝酸钠的初始浓度为100μg/mL，在37℃静止反应12h后，用蒸馏水补至总体积为5mL，在37℃静止反应6h后，用盐酸萘乙二胺法测定体系中亚硝酸盐的浓度，并计算亚硝酸钠的降解率为达到34.3％。
(3)仅用0.1mol/L维生素C降解亚硝酸盐：加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为100μg/mL，用0.1mol/L苹果酸分别调节pH至3.5、4.0、4.5，用蒸馏水补至总体积为5mL，分别在37℃静止反应6h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率依次为32.5％、40.1％、44.7％。
对比实施例3
(1)从重组大肠杆菌BL21中提取粗酶液：同实施例3。
(2)仅用该含有重组NiR的粗酶液降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液300μL，加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为350μg/mL，反应体系为1mL，在30℃静止反应8h后，用蒸馏水补至总体积为5mL，在30℃静止反应4h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率仅为26.4％。
(3)仅用0.5mol/L柠檬酸降解亚硝酸盐：加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为350μg/mL，用0.5mol/L柠檬酸分别调节pH至2.0、2.5、3.0，用蒸馏水补至总体积为5mL，分别在30℃静止反应4h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率依次为26.6％、29.8％、30.1％。
对比实施例4
(1)从蜡样芽胞杆菌LJ01中提取粗酶液：同实施例4。
(2)仅用该含有天然NiR的粗酶液降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液400μL，反应体系为1mL，亚硝酸钠的初始浓度为500μg/mL，在27℃静止反应12h后，用蒸馏水补至总体积为5mL，在27℃静止反应10h后，用盐酸萘乙二胺法测定体系中亚硝酸盐的浓度，并计算亚硝酸钠的降解率为达到41.2％。
(3)仅用0.2mol/L丁二酸降解亚硝酸盐：加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为400μg/mL，用0.2mol/L丁二酸分别调节pH至2.5、3.0、3.5，用蒸馏水补至总体积为5mL，分别在27℃静止反应10h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率依次为40.8％、44.6％、45.1％。
对比实施例5
(1)从重组大肠杆菌BL21中提取粗酶液：同实施例5。
(2)仅用该含有重组NiR的粗酶液降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液200μL，加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为200μg/mL，反应体系为1mL，在30℃静止反应8h后，用蒸馏水补至总体积为5mL，在25℃静止反应6h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率仅为36.7％。
(3)仅用0.4mol/L乙酸降解亚硝酸盐：加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为200μg/mL，用0.4mol/L乙酸分别调节pH至4.0、4.5、5.0，用蒸馏水补至总体积为5mL，在25℃静止反应6h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率依次为22.4％、41.3％、41.5％。
对比实施例6
(1)从植物乳杆菌中提取粗酶液：同实施例6。
(2)仅用该含有天然NiR的粗酶液降解亚硝酸盐：取步骤(1)中所得的粗酶液350μL，反应体系为1mL，亚硝酸钠的初始浓度为400μg/mL，在30℃静止反应10h后，用蒸馏水补至总体积为5mL，在30℃静止反应8h后，，用盐酸萘乙二胺法测定体系中亚硝酸盐的浓度，并计算亚硝酸钠的降解率为达到35.2％。
(3)仅用0.2mol/L丁二酸降解亚硝酸盐：加入亚硝酸钠溶液，使其终浓度为400μg/mL，用0.3mol/L乳酸分别调节pH至3.0、3.5、4.0，用蒸馏水补至总体积为5mL，分别在30℃静止反应8h后，用盐酸萘乙二胺法测定亚硝酸盐的含量，并计算亚硝酸盐的降解率依次为34.6％、37.8％、39.1％。

Claims (8)

1.一种降解食品中亚硝酸盐的方法，其特征在于，在食品酱汁中加入亚硝酸盐还原酶，在27～37℃静止反应6～12h后，再用有机酸调节pH至2.0～5.5，再在20～37℃静止反应4～12h；所述亚硝酸盐还原酶基因来自于可食用细菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的亚硝酸盐还原酶是从有降解活性的可食用细菌，或从含有亚硝酸盐还原酶基因的重组菌中提取的粗酶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的可食用细菌是干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.Rhamnosus)6013，或植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)DMDL9010，或蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)LJ01。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述粗酶液的总酶活为3000～4000U。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述粗酶液的添加量为100～500μL/mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述重组菌为重组大肠杆菌BL21。
7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的方法，其特征在于，所述的有机酸为苹果酸、Vc、柠檬酸、丁二酸、乙酸、乳酸其中的一种或两种以上。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述有机酸的浓度为0.1～0.5mol/L。
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