CN111647544A - 产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建方法 - Google Patents

产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建方法 Download PDF

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杨蔚楠
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Abstract

本发明涉及一种产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建方法，属于生物医药技术领域。所述基因工程菌株通过将金霉素产生菌中的参与金霉素合成C6位甲基化相关基因ctcK基因采用基因工程方法进行突变得到。本发明通过构建同源交换质粒，转入金霉素产生菌进行DNA同源重组的方法，将金霉素合成过程中负责甲基化步骤的ctcK基因用壮观霉素抗性基因替代，从而中断C6位的甲基化，得到产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌。该菌株的去甲基金霉素产量为16.8mg/L，去甲基四环素产量为50.7mg/L，而这两种产物为米诺环素和替加环素的合成前体，因此利用该菌株进行工业生产具有很好的应用前景。

Description

产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建 方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种基因工程菌株及构建方法，尤其涉及一种产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建方法。
背景技术
四环素类抗生素是一类具有四并苯核心结构的广谱抗生素，可以抑制细菌蛋白质的合成，对常见的革兰氏阴性、阳性致病菌以及立克次体、支原体、衣原体、非典型分枝杆菌和阿米巴原虫等都有较好的效果。包括第一代四环素类抗生素四环素(tetracycline,TC)、金霉素(chlortetracycline,CTC)和土霉素(oxytetracycline,OTC)，它们分别由主要产金霉素的金黄色链霉菌(Streptomyces aureofacines)和产土霉素的龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)发酵产生，因广谱、使用方便、经济等特点广泛应用于医药、畜牧和水产业，全球市场需求巨大。由于细菌耐药性的出现，20世纪70年代开始应用半合成技术对四环素和土霉素进行化学修饰，得到了性能更好的第二代四环素类抗生素，如强力霉素和米诺环素。2005年美国食品药品管理局(FDA)批准替加环素上市，以此为代表的甘氨酰环素类抗生素被称为第三代四环素，是在第二代四环素的基础上合成的。
在化学半合成的四环素类抗生素中，米诺环素是抗菌作用最强的四环素类抗生素，临床上可用于治疗痤疮等，同时也具有抗炎症和自身免疫病，以及神经保护的作用，应用前景广泛。替加环素可用于临床治疗复杂皮肤及软组织感染(cSSSIs)和复杂腹腔内感染(cIAIs)，对抗万古霉素耐药肠球菌(VRE)、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)等耐药菌，都有很好的抗菌效果。而它们在化学合成过程中的共同前体是去甲基金霉素(demeclocycline,DMCTC)和去甲基四环素(demecycline,DMTC)。目前，国内外对去甲基金霉素的研究相对较多，主要集中于分离和测定方法的改进、菌株诱变选育以及发酵培养基优化等。如专利文献CN103642886A中记载了一种利用金色链霉菌发酵生产去甲基金霉素的培养基和培养方法，其培养基组成中含有鱼油、糖蜜混合物、蚯蚓粉混合物、蛋白胨等，其去甲基金霉素的产量同国内常规发酵水平相比，提高了10％以上。
近年来随着分子遗传学和化学生物学研究的深入，可以利用代谢工程(metabolicengineering)特异性地对天然产物的生物合成途径进行遗传改造，由此获得可发酵产生所需抗生素及其衍生物的基因工程菌株。与化学合成相比，利用发酵的方式生产目的代谢产物可以有效地降低生产成本，减少环境污染。
经对现有技术文献检索，未发现通过敲除甲基转移反应相关基因改变该菌种次级代谢物组份和产量的相关技术报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株的构建方法。本发明的方法中将C6位甲基化相关基因进行了基因敲除，从而获得发酵时产生去甲基金霉素和去甲基四环素的菌种，采用这样的菌种发酵可以直接获得目标产物，节约了生产成本，简化了工艺流程，避免了工业污染。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株，所述基因工程菌株通过将金霉素产生菌中的参与金霉素合成C6位甲基化相关基因采用基因工程方法进行突变得到；所述金霉素合成C6位甲基化相关基因为甲基转移酶ctcK基因。
优选地，所述突变包括去除或取代。
优选地，所述取代具体为：将甲基转移酶ctcK基因取代为壮观霉素抗性基因。
优选地，所述基因工程菌株为金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013080。
第二方面，本发明提供了一种根据前述的基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
A、构建包含完整CTC合成基因簇的柯斯质粒17G4；
B、将柯斯质粒17G4通过λ-Red介导的大肠杆菌进行基因重组，使其中的甲基转移酶基因ctcK突变，得到柯斯质粒pYWN-K；
C、将柯斯质粒pYWN-K转入金霉素产生菌中，进行DNA同源重组，即得所述的基因工程菌株。
优选地，步骤A中，所述柯斯质粒17G4的具体构建方法为：利用CopyControlTMFosmid Library Production试剂盒构建Streptomyces aureofaciens F3基因组文库，并根据氯代酶基因设计探针，筛选基因组文库，即获得包含完整金霉素生物合成基因簇的柯斯质粒17G4。
优选地，步骤B中，所述将柯斯质粒17G4通过λ-Red介导的大肠杆菌进行基因重组的具体步骤如下：
B1、以质粒pIJ778为模板，用引物KTAR-P1和KTAR-P2PCR扩增具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段，其上、下游各包含39bp的同源臂；
B2、通过电转化将柯斯质粒17G4导入大肠杆菌E.coli BW25113/pKD46感受态细胞中，得到E.coli BW25113/17G4电转化感受态细胞；
B3、将步骤B1获得的具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段电转入包含柯斯质粒17G4的E.coli BW25113/17G4电转化感受态细胞中，并在其中表达的λ-Red重组酶介导下，具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段与柯斯质粒17G4发生同源重组，将17G4上的ctcK基因片段替换为具有转移起始位点ori T的壮观霉素抗性基因片段。
优选地，步骤B1中，所述引物KTAR-P1和KTAR-P2的碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
优选地，步骤C中，所述将柯斯质粒pYWN-K转入金霉素产生菌中的具体步骤如下：
C1、将柯斯质粒pYWN-K转化携带质粒pUZ8002的大肠杆菌，然后在氯霉素、壮观霉素和卡那霉素存在下过夜培养，再转接培养后，收集并洗涤菌体；
C2、将金霉素生产菌孢子进行热激和预萌发处理后，与步骤C1获得的菌体等量混合，然后接种到培养基上培养，进行细菌双亲接合转移；
C3、培养一定时间后，用含萘啶酮酸和壮观霉素的无菌水覆盖培养基，培养7～10天后，得到转移接合子，即为所述的基因工程菌株。
优选地，所述金霉素生产菌为金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013080。
第二方面，本发明提供了一种前述的基因工程菌株生产去甲基金霉素和去甲基四环素的方法，包括以下步骤：
将基因工程菌株接种到含有壮观霉素的燕麦平板上，培养5-8天后，接种至10.3％TSBY培养基中摇床培养，再接种到发酵培养基中摇床培养4-5天，即得。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明通过构建同源交换质粒，转入金黄色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)F3进行DNA同源重组，将金霉素合成过程中负责C6位甲基化步骤的甲基转移酶ctcK基因的片段用壮观霉素抗性基因替代，从而中断C6位甲基化步骤。
2、本发明的方法成功地进行了甲基转移酶ctcK基因敲除，得到产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌，该菌株的去甲基金霉素产量为16.8mg/L，去甲基四环素产量为50.7mg/L，而去甲基金霉素和去甲基四环素为米诺环素和替加环素的合成前体，因此利用该菌株进行工业生产可以有效节约生产成本，具有很好的应用前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为去甲基四环素与去甲基金霉素的化学结构；
图2为突变株YWN-K构建示意图和突变株YWN-K基因组的PCR验证；
图3突变株YWN-K(ΔctcK)和野生型菌株F3(WT)发酵产物HPLC检测结果；
图4突变株YWN-K发酵产物Q-TOF检测结果，其中上图为去甲基四环素，下图为去甲基金霉素。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例中，所述的大肠杆菌E.coli ET12567(pUZ8002)发表于《Paget,M.S.,Chamberlin,L.,Atrih,A.,Paget,M.S.et.al.Evidence that the extracytoplasmicfunction sigma factorσE is required for normal cell wall structure inStreptomyces coelicolor A3(2).J.Bacteriol,1999,181:204-211》；
所述的金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3已经于2013年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072；保藏编号为CCTCC NO：M 2013080(该菌株已记载在专利文献CN 103233034A中)。
以下实施例中使用的质粒以及试剂均可以通过公开的市售渠道获得。
实施例1、同源交换质粒的构建
用于导入宿主并和染色体发生同源重组以便获得目标突变，具体为利用CopyControlTM Fosmid Library Production试剂盒构建Streptomyces aureofaciens F3基因组文库，根据氯代酶基因设计探针确定柯斯质粒17G4包含完整金霉素合成基因簇，将柯斯质粒17G4通过大肠杆菌中表达的λ-Red重组酶系统基因重组，将其中的甲基转移酶ctcK基因突变掉，得到质粒pYWN-K。具体步骤如下：
1)以质粒pIJ778作为模板，用引物KTAR-P1/KTAR-P2扩增具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段(序列如SEQ ID NO.5所示)，回收得到1490bp的PCR产物，该PCR产物为具有转移起始位点ori T，上、下游各包含39bp同源臂的壮观霉素抗性基因片段。
2)利用CopyControlTM Fosmid Library Production试剂盒构建Streptomycesaureofaciens F3基因组文库，并根据氯代酶基因设计探针，筛选基因组文库，即获得包含完整金霉素生物合成基因簇的柯斯质粒17G4(见图2)。链霉菌的遗传操作通常参照常规条件，如采用Kieser,T.,Bibb,M.J.,Butter,M.J.,Chater,K.F.,Hopwood,D.A.,2000.Practical Streptomyces Genetics.JohnInnesCentre,NorwichResearchPark,Colney,Norwich,NR47UH,England.中描述的条件。
3)通过电转化将柯斯质粒17G4导入大肠杆菌E.coli BW25113/pKD46感受态细胞中，得到E.coli BW25113/17G4电转化感受态细胞。
4)将步骤1)回收的1490bp的PCR产物用电转化导入E.coli BW25113/17G4电转化感受态细胞中，在其中表达的λ-Red重组酶系统介导下，PCR产物上39bp与ctcK基因待替换片段上、下游序列一致的同源臂与17G4重组，双交换之后将ctcK基因672bp的片段(序列如SEQ ID NO.6所示)替换为具有转移起始位点ori T的壮观霉素抗性基因片段，得到包含ctcK突变的金霉素合成基因簇的柯斯质粒pYWN-K。
KTAR-P1,5'-GGCTGACGCCCTGGGCGAGGAGCCGGCCGGCGCGGCCGAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3'(SEQ ID NO.1)
KTAR-P2,5'-CTGCCGTCCACCAGGTTCTCGACCACGATCACCCGGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'(SEQ ID NO.2)
实施例2、把用于和染色体发生同源重组的质粒导入野生型宿主
通过大肠杆菌与链霉菌双亲之间的接合转移，将所构建的柯斯质粒pYWN-K转入金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3中。ctcK突变的柯斯质粒pYWN-K必须在辅助质粒pUZ8002的协助下才能通过接合转移导入到受体金黄色链霉菌细胞中。具体方法如下：
1)柯斯质粒pYWN-K首先转化大肠杆菌E.coli ET12567(携带pUZ8002)，获得的含柯斯质粒pYWN-K的大肠杆菌E.coli ET12567在氯霉素、壮观霉素和卡那霉素存在下过夜培养，然后按照1/10接种量转接培养2.5小时，收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体2次备用。
2)作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理：将链霉菌孢子悬浮于TES缓冲液(3ml，0.05mol/L，pH8.0)中，在50℃水浴中热激10min，冷却至室温后加入等体积2×孢子预萌发培养基(Difco酵母粉1％，Difco酪蛋白氨基酸1％，CaCl2 0.01mol/L)，37℃摇床(250rpm)培养2.5小时，离心收集孢子，用LB洗涤一次并重新均匀悬浮于适量的LB培养基中。
3)将步骤2)处理后的链霉菌孢子按108：108(即1:1)与步骤1)得到的菌体(含有柯斯质粒pYWN-K的大肠杆菌细胞)等量混合后涂在SFM平板(2％琼脂糖，2％甘露醇，2％黄豆饼粉，pH7.2)上培养，进行细菌双亲接合转移。
4)培养20小时后用含萘啶酮酸(抑制大肠杆菌的生长)和壮观霉素(导入质粒pYWN-K带有此抗性)的1ml无菌水覆盖平板(终浓度：萘啶酮酸50μg/mL；壮观霉素50μg/mL)，置30℃培养7-10天后即可看到转移接合子，即得待筛选和验证的金色链霉菌突变株YWN-K，构建示意图如图2的左图所示。
实施例3、突变株的筛选和验证
从覆盖板上挑选单个转移接合子接种到壮观霉素抗性的燕麦平板(燕麦3.4％(w/v)，琼脂1.6％，MgSO4 0.005％，KH2PO4 0.01％，(NH4)2HPO4 0.015％，壮观霉素终浓度50μg/mL)上进一步确认抗性，并放大平板培养。以在燕麦平板上可以正常生长的备选株的总DNA作为PCR模板；引物KYZ-P1和KYZ-P2用于突变株YWN-K的筛选，原始出发菌株(金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3)DNA作为对照。其结果显示：正确的突变株YWN-K的ctcK基因672bp的序列被具有转移起始位点ori T的壮观霉素抗性基因片段置换(片段长度1490bp，包含两端各39bp的同源臂，因此实际与ctcK发生置换的长度为1412bp)，PCR产物大小为2110bp，而原始出发菌株的PCR产物大小为1370bp，从而最终确证了目标突变的正确性，如图2的右图所示。
KYZ-P1,5'-ACGGACGCCTCGGTGTACGTG-3'；(SEQ ID NO.3)
KYZ-P2,5'-CATCTGACCCCGCTCCCCTTC-3'；(SEQ ID NO.4)
实施例4、突变菌株的发酵培养、抗生素的分离纯化及产物检测
将金黄色链霉菌F3和实施例3获得的突变株YWN-K分别进行发酵培养，具体步骤为：将菌株用20％甘油保存孢子接种燕麦平板，其中加入终浓度为50μg/mL的壮观霉素。5-8天后用20％甘油收集孢子，取适量接种50mL 10.3％TSBY培养基，容器为250mL带弹簧的三角瓶，30℃摇床培养24小时后按5％接种量接种100mL发酵培养基，容器为500mL带弹簧的三角瓶，30℃摇床培养4-5天。
10.3％TSBY培养基配方为(w/v)：酵母提取物0.5％，胰豆蛋白胨3.0％，蔗糖10.3％，115℃高压灭菌。
发酵培养基配方为(w/v)：玉米淀粉8.0％，黄豆饼粉4.0％，酵母提取物0.1％，胰蛋白胨1.4％，玉米浆0.8％，碳酸钙0.7％，硫酸铵0.35％，氯化钠0.25％，硫酸镁0.025％，分装之后按1.5mL/100mL体积比加入大豆油，121℃高压灭菌。
所得发酵液用草酸酸化，调节pH至1.5-2.0，5000rpm/min离心10min，收集上清液于-20℃避光冻存，以备下一步检测。
发酵产物的HPLC分离鉴定在安捷伦公司Aglient 1100series上进行，分离柱为Aglient TC-C18反向柱(5.0μm,4.6×250mm)；流动相A为0.2％甲酸，流动相B为乙腈。样品经过0.45μm水相滤膜过滤后上样，用20％乙腈等浓度洗脱,流速为0.6mL/min，柱温保持室温，检测波长360nm，金霉素和四环素的保留时间分别为22.6min和12.4min，去甲基金霉素和去甲基四环素保留时间分别为17.6min、10.9min，它们均能很好的分离，如图3所示。
将出发菌株金黄色链霉菌F3和获得的突变株YWN-K同时进行发酵，分离纯化发酵液，同批次进行HPLC检测。如图3所示，发酵结果表明，金色链霉菌突变株YWN-K不产金霉素和四环素，但是积累了去甲基金霉素和去甲基四环素(结构如图1所示)，其中去甲基金霉素产量为16.8mg/L，去甲基四环素产量为50.7mg/L。
高分辨率的分子质量检测是利用安捷伦公司的Agilent 1200series LC/MSDtrap system配合6530精确质量四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪进行的，采用电喷雾离子源，m/z质量范围100-1000，正离子模式。
通过Q-TOF对发酵产物进行检测，进一步确证了积累的产物为去甲基金霉素和去甲基四环素，结果见图4，其中的上图为去甲基四环素，下图为去甲基金霉素。
综上所述，本发明通过构建同源交换质粒，转入金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)F3进行DNA同源重组，将金霉素合成过程中负责C6位甲基化步骤的甲基转移酶ctcK基因中672bp的片段用具有转移起始位点ori T的壮观霉素抗性基因替代，从而中断C6位甲基化步骤，本发明的方法成功地进行了甲基转移酶基因敲除，得到产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌，该菌株能够用于工业生产，为米诺环素和替加环素的合成提供原料。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建方法
<130> KAG43725
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KTAR-P1
<400> 1
ggctgacgcc ctgggcgagg agccggccgg cgcggccgaa ttccggggat ccgtcgacc 59
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KTAR-P2
<400> 2
ctgccgtcca ccaggttctc gaccacgatc acccggctgt gtaggctgga gctgcttc 58
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KYZ-P1
<400> 3
acggacgcct cggtgtacgt g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KYZ-P2
<400> 4
catctgaccc cgctcccctt c 21
<210> 5
<211> 1490
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KTAR-P1和KTAR-P2扩增得到的具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段
<400> 5
ctgccgtccac caggttctcg accacgatca cccggctgtg taggctggag ctgcttcgaagttcctatac tttctagaga 80
ataggaactt cggaatagga acttcatgag ctcagccaat cgactggcga gcggcatcttatttgccgac taccttggtg 160
atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcgatcttcttctt gtccaagata 240
agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc ggcaggcgct ccattgcccagtcggcagcg acatccttcg 320
gcgcgatttt gccggttact gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc actacatttcgctcatcgcc agcccagtcg 400
ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcaggaaccggatcaa agagttcctc 480
cgccgctgga cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct tttgtcagca agatagccagatcaatgtcg atcgtggctg 560
gctcgaagat acctgcaaga atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgcttagctggata acgccacgga 640
atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact tctacagcgc ggagaatctc gctctctccaggggaagccg aagtttccaa 720
aaggtcgttg atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc cttacggtca ccgtaaccagcaaatcaata tcactgtgtg 800
gcttcaggcc gccatccact gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcgagatggcgctc gatgacgcca 880
actacctctg atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg cttccctcat gacattgcactccaccgctg atgacatcag 960
tcgatcatag cacgatcaac ggcactgttg caaatagtcg gtggtgataa acttatcatccccttttgct gatggagctg 1040
cacatgaacc cattcaaagg ccggcatttt cagcgtgaca tcattctgtg ggccgtacgctggtactgca aatacggcat 1120
cagttaccgt gagctgcatt ttccgctgca taaccctgct tcggggtcat tatagcgattttttcggtat atccatcctt 1200
tttcgcacga tatacaggat tttgccaaag ggttcgtgta gactttcctt ggtgtatccaacggcgtcag ccgggcagga 1280
taggtgaagt aggcccaccc gcgagcgggt gttccttctt cactgtccct tattcgcacctggcggtgct caacgggaat 1360
cctgctctgc gaggctggcg ggaacttcga agttcctata ctttctagag aataggaacttcgaactgca ggtcgacgga 1440
tccccggaat tcggccgcgc cggccggctc ctcgcccagg gcgtcagcc 1490
<210> 6
<211> 672
<212> DNA
<213> Streptomyces aureofaciens F3
<220>
<223> ctcK基因被替换的片段
<400> 6
gctggcccgg gccgtgaacg cggacccgga caccctgcag cggctgctgc gcgccctggcctgctacggc gtgttcgccg 80
agcagccgga cggtcggtac gtgcacaccg gcgcctcccg gctgctgcgc gaggacaccccgcgcagcct gaaggacatg 160
gtgctctggg gcaccgagcc gtggacctgg gagctgtggg gccacctcga cgaggcggtgcgcaccggca aggccgtctt 240
ccccgagctg cacggcatgg acttcttcga ccacctgcac gcccactccc ccgagtcggcggccgtgttc gaccgggcga 320
tgacccagtc cagtcggctc tccgcgctcg cgctggccga ccggctggac ctcggcggggtcggcacggt ggtggacatc 400
gccggtggcc aggggcacgt gctggccacc ctgctggagc gcaaccccgg tctgcgcggcaccctgctgg acctgcccga 480
ggtcgtctcc ggggccgacg cccggctgca accgggcggt gcgctggccg ggcgcgccacgctgctcggc ggcgactgcc 560
ggcgggagat cccggtgcag gccgacgtct acctgctgaa gaacatcctg gagtgggacgacgagagcac cgtcctgacg 640
ctgcgcaacg tcgtccgggc ggctgctccg gg 672

Claims (10)

1.一种产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株通过将金霉素产生菌中的参与金霉素合成C6位甲基化相关基因采用基因工程方法进行突变得到；所述金霉素合成C6位甲基化相关基因为甲基转移酶ctcK基因。
2.根据权利要求1所述的产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株，其特征在于，所述突变包括去除或取代。
3.根据权利要求1所述的产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株，其特征在于，所述取代具体为：将甲基转移酶ctcK基因取代为壮观霉素抗性基因。
4.根据权利要求1所述的产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013080。
5.一种根据权利要求1所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、构建包含完整CTC合成基因簇的柯斯质粒17G4；
B、将柯斯质粒17G4通过大肠杆菌中表达的λ-Red重组酶系统进行基因重组，使其中的甲基转移酶基因ctcK突变，得到柯斯质粒pYWN-K；
C、将柯斯质粒pYWN-K转入金霉素产生菌中，进行DNA同源重组，即得所述的基因工程菌株。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤A中，所述柯斯质粒17G4的具体构建方法为：利用CopyControlTMFosmid Library Production试剂盒构建Streptomyces aureofaciens F3基因组文库，并根据氯代酶基因设计探针，筛选基因组文库，即获得包含完整金霉素生物合成基因簇的柯斯质粒17G4。
7.根据权利要求5所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤B中，所述将柯斯质粒17G4通过大肠杆菌中表达的λ-Red重组酶系统进行基因重组的具体步骤如下：
B1、以质粒pIJ778为模板，用引物KTAR-P1和KTAR-P2 PCR扩增具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段，其上、下游各包含39bp的同源臂；
B2、通过电转化将柯斯质粒17G4导入大肠杆菌E.coli BW25113/pKD46感受态细胞中，得到E.coli BW25113/17G4电转化感受态细胞；
B3、将步骤B1获得的具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段电转入包含柯斯质粒17G4的E.coli BW25113/17G4电转化感受态细胞中，并在其中表达的λ-Red重组酶介导下，具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段与柯斯质粒17G4发生同源重组，将17G4上的ctcK基因片段替换为具有转移起始位点ori T的壮观霉素抗性基因片段。
8.根据权利要求5所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤C中，所述将柯斯质粒pYWN-K转入金霉素产生菌中的具体步骤如下：
C1、将柯斯质粒pYWN-K转化携带质粒pUZ8002的大肠杆菌，然后在氯霉素、壮观霉素和卡那霉素存在下过夜培养，再转接培养后，收集并洗涤菌体；
C2、将金霉素生产菌孢子进行热激和预萌发处理后，与步骤C1获得的菌体等量混合，然后接种到培养基上培养，进行细菌双亲接合转移；
C3、培养一定时间后，用含萘啶酮酸和壮观霉素的无菌水覆盖培养基，培养7～10天后，得到转移接合子，即为所述的基因工程菌株。
9.根据权利要求5或8所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述金霉素生产菌为金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013080。
10.一种根据权利要求1所述的基因工程菌株生产去甲基金霉素和去甲基四环素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将基因工程菌株接种到含有壮观霉素的燕麦平板上，培养5-8天后，接种至10.3％TSBY培养基中摇床培养，再接种到发酵培养基中摇床培养4-5天，即得。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113549580A (zh) * 2021-08-02 2021-10-26 金河生物科技股份有限公司 一株金色链霉菌及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965429A (en) * 1995-06-07 1999-10-12 American Cyanamid Company Strain for the production of 6-demethyltetracycline, method for producing the strain and vector for use in the method
CN103205481A (zh) * 2013-04-02 2013-07-17 金河生物科技股份有限公司 提高金霉素产量的方法及其重组表达载体和基因工程菌
CN103233034A (zh) * 2013-04-23 2013-08-07 上海交通大学 产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法
CN110656122A (zh) * 2019-07-30 2020-01-07 中国科学院微生物研究所 一种提高去甲四环素产量的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965429A (en) * 1995-06-07 1999-10-12 American Cyanamid Company Strain for the production of 6-demethyltetracycline, method for producing the strain and vector for use in the method
CN103205481A (zh) * 2013-04-02 2013-07-17 金河生物科技股份有限公司 提高金霉素产量的方法及其重组表达载体和基因工程菌
CN103233034A (zh) * 2013-04-23 2013-08-07 上海交通大学 产生四环素单一组分的基因工程菌株的构建方法
CN110656122A (zh) * 2019-07-30 2020-01-07 中国科学院微生物研究所 一种提高去甲四环素产量的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
林龙镇等: "金霉素生物合成基因 ctcK 的研究", 《湖南师范大学自然科学学报》, vol. 40, no. 1, 31 January 2017 (2017-01-31), pages 37 - 43 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113549580A (zh) * 2021-08-02 2021-10-26 金河生物科技股份有限公司 一株金色链霉菌及其应用
CN113549580B (zh) * 2021-08-02 2022-08-16 金河生物科技股份有限公司 一株金色链霉菌及其应用

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