CN103205481A - 提高金霉素产量的方法及其重组表达载体和基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提高金霉素产量的方法及其重组表达载体和基因工程菌，通过利用FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ构建重组表达载体，将重组表达载体转化至金色链霉菌（Streptomycesaureofaciens）中获得高产金霉素的基因工程菌株，获得的工程菌株通过超量表达FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ打破金霉素合成途径中氯代反应的瓶颈，从而提高金色链霉菌中金霉素的产量；该菌株的获得为提高金霉素产量、降低金霉素生产成本奠定了基础。

Description

提高金霉素产量的方法及其重组表达载体和基因工程菌

技术领域

    本发明属于生物技术领域，涉及通过FADH₂依赖型氯化酶基因和FAD还原酶基因联合应用提高金霉素产量的方法，还涉及含FADH₂依赖型氯化酶基因和FAD还原酶基因的重组载体和基因工程菌。 

背景技术

自上个世纪70年代，随着分子克隆技术的出现，以及对细胞生物学的深入研究，使基因工程技术成为遗传改造的常规手段。基因工程技术的应用在一定范围内克服了传统育种技术的随机性和盲目性，在改良工业菌种方面获得了巨大的成功。例如：在井冈霉素生物合成过程中，通过强启动子超量表达UDP-葡萄糖焦磷酸酶的方式增加糖基供体UDP-葡萄糖的供给，能够有效的提高井冈霉素的产量，并且能够显著地减少前体有效氧胺的大量积累（Zhou X et al Over-expression of UDP-glucose pyrophosphorylase increases validamycin A but decreases validoxylamine A production in Streptomyces hygroscopicus var. jinggangensis 5008. MetabolicEngineering，2011，13（6）：768-76）。 

金霉素（Chlortetracycline，aureomycin，氯四环素）作为第一个发现的四环素类抗生素，产生菌株为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens），但是金色链霉菌在发酵过程中不仅产生金霉素，还能够产生一定比例的四环素（约8%）。为了提高金霉素产量，通过遗传育种和优化发酵条件的方法，但是通过遗传育种获得的提高金霉素产量的能力有限。而金霉素与四环素的区别是前者比后者在C7位多一个氯原子，金霉素生物合成过程中，基因簇中的FADH₂依赖的氯化酶催化完成氯代反应（图1）。因此，氯代反应是否为金霉素生物合成的瓶颈步骤，是利用基因工程手段提高金霉素产量亟待解决的技术问题，为进一步提高金霉素的产量具有重要意义。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种FADH₂依赖型氯化酶基因和FAD还原酶基因的联合应用，打破金霉素合成途径中的限速步骤，获得高产金霉素的基因工程菌株。 

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案： 

FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ在金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）中提高金霉素产量的应用，所述FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ ID NO.3中第11-1687位所示，所述FAD还原酶基因ctcQ的核酸序列如SEQ ID NO.6中第11-586位所示。

本发明的可以应用于含金霉素合成途径的任意菌株中，优选为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3，保藏号为CCTCC NO: M 2013080。金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3为金河生物科技股份有限公司经过长期驯化和不断筛选获得适于工业生产的菌株，与常规的金色链霉菌菌株相比活性更高，产金霉素能力更强。 

本发明的目的之二在于提供含FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的基因工程菌，提供高产金霉素的菌株。 

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案： 

含有所述FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的基因工程菌。

优选的，所述工程菌为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）。 

更优选的，所述工程菌为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3，保藏号为CCTCC NO: M 2013080。 

本发明的目的之三在于提供含FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的重组表达载体，技术方案为： 

含有所述FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的重组表达载体。

本发明的目的之四载体提供重组表达载体的制备方法，技术方案为： 

所述重组表达载体的制备方法，由以下步骤制备：

a．用带酶切位点的引物克隆FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP，然后连接至pIB139载体强启动子PermE*下游，得到质粒pJTU4303；

b．用带酶切位点的引物克隆FAD还原酶基因ctcQ，然后连接至pIB139载体强启动子PermE*下游，得质粒pJTU4304，

c．将步骤b所得质粒pJTU4304进行酶切，切下含强启动子PermE*和FAD还原酶基因ctcQ的片段，然后连入线性化的质粒pJTU4303中，得到含FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的重组载体。

优选的，所述步骤a中，所述带酶切位点的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。 

优选的，所述步骤b中，所述带酶切位点的引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。 

优选的，所述步骤c是重组质粒pJTU4304用HindIII酶切，回收含强启动子PermE*和FAD还原酶基因ctcQ片段并将回收片段用Klenow I酶补平；同时用EcoRV线形化pJTU4303质粒，将补平的含强启动子PermE*和FAD还原酶基因ctcQ片段连接入线性化的pJTU4303质粒中，得重组表达载体。 

本发明的有益效果在于：本发明通过联合应用FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ，过表达FADH₂依赖型氯化酶和FAD还原酶，打破金霉素合成途径中的瓶颈步骤，将FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ构建重组表达载体，然后转化入金色链霉菌中，提高金霉素的产量，与原始菌株相比金霉素产量提高了18.89%，并且提高了金霉素组分的比例（金霉素/四环素提高了1-2%）；利用本发明的方法构建高产金霉素的菌株，制备方法简单，突破了遗传育种的瓶颈，为提高金霉素产量提供了新的思路。 

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明： 

图1为金霉素和四环素的化学结构。

图2 为pJTU4303质粒和pJTU4304质粒构建构流程图。 

图3为整合型质粒pJTU4305构建流程图。 

图4为金色链霉菌PCR检测；F3泳道为工业菌株阴性对照，pIB 泳道为空质粒pIB139空质粒对照；泳道1-12为基因工程菌。 

图5为金色链霉菌F3及金色链霉菌ZT03发酵产物HPLC检测结果（A：发酵液的提取液色谱检测图；B：金色链霉菌F3与金色链霉菌ZT03中金霉素含量检测结果）。 

菌种保藏

本发明中金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3是金河生物科技股份有限公司从金色链霉菌中经过长期驯化和不断筛选获得的适于工业生产的菌株，该菌株与常规金色链霉菌相比活性更高，产金霉素能力更强，金霉素产量达20g/L。将分离获得的金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 2013080，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2013年3月13日，分类命名为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。 

实施例1 

构建含FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的重组表达质粒，具体为整合型质粒。

根据FADH₂依赖的氯化酶基因ctcP序列（Genebank：I32939）设计扩增ctcP基因的PCR引物，并在上游引物的5’端引入NdeI酶切位点，下游引物的5’端引入NotI，具体引物如下： 

上游引物ctcPF：5'- ggaattccatatg accgacacaaccgc-3'（SEQ ID NO.1），下划线序列为NdeI位点，黑体为起始密码子；

下游引物ctcPR：5'-gcggccgcaagcttctacggcttgacccgcatcg-3'（SEQ ID NO.2），下划线序列为NotI位点，黑体为终止密码子。

然后以金色链霉菌F3基因组DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行PCR扩增，PCR体系为：0.1 μg 模板DNA，引物各50 pmol，4 μL DMSO， 2 μL Mg2⁺ ，5 μL dNTP，5 μL缓冲液和1个单位KOD DNA 聚合酶（TOYOTA），加入无菌水至50 μL；PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟； 95℃变性30 秒，60℃退火30 秒，68℃延伸36秒，32个循环；最后68℃后延伸5 分钟，获得如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，其中11-1678位为ctcP基因编码区。然后将PCR扩增产物用NdeI和NotI双酶切，酶切产物连入经NdeI和NotI双酶切的带红霉素抗性基因的pIB139载体中，得到质粒pJTU4303，构建流程如图2所示（pIB139质粒是含有红霉素抗性基因强启动子PermE*的链霉菌整合型质粒，发表于Wilkinson C.J.，Hughes-Tomas ZA，Martin CJ，Bohm I，Mironcnko T，Dcacon M，Wheaterofe M，Wirtz G，Staunton J，Leadlay PF. Increasing the efficiency of heterologous promoters in actinomycetes. J Mol Microb Biotech，2002，4（4）：417-426.）。 

根据FAD还原酶基因ctcQ（Genebank：I32939）设计引物序列，具体如下： 

上游引物ctcQF：5'-ggaattccatatgccccccgaacccctgtccc-3'（SEQ ID NO.4），下划线序列为NdeI位点；

下游引物ctcQR：5'-gcggccgcaagctttcagccctcggccgccagggtc-3'（SEQ ID NO.5），下划线序列为NotI位点。

按照与上述同样的方法扩增FAD还原酶基因ctcQ，获得如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，其中11-586位为ctcQ基因编码区。然后将PCR扩增产物用NdeI和NotI双酶切，将酶切产物连入经NdeI和NotI双酶切的带红霉素抗性基因的pIB139载体中，得到重组质粒pJTU4304，构建流程如图2所示。 

然后将重组质粒pJTU4304用HindIII酶切，回收1.9kb的含强启动子PermE*和ctcQ基因片段，并将回收片段用Klenow I酶补平黏性末端；同时用EcoRV线形化pJTU4303质粒，将补平的含强启动子PermE*和ctcQ基因片段连入线性化的pJTU4303质粒中，得到含FADH2依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的整合型质粒pJTU4305（图3）。 

实施例2 

将构建的整合型质粒pJTU4305通过大肠杆菌与链霉菌双亲之间的接合转移，转入金色链霉菌F3。具体步骤包括：将构建的整合型质粒pJTU4305通过42℃热激转入大肠杆菌ET12567（pUZ8002）中，挑选单克隆转化子接种LB液体培养基，该液体培养基中添加终浓度为25 μg/mL的氯霉素，50 μg/mL的卡那霉素和30 μg/mL的阿伯拉霉素（大肠杆菌ET12567（pUZ8002）发表于Paget，M.S.，Chamberlin，L.，Atrih, A.，Paget，M.S. et.al. Evidence that the extracytoplasmic function sigma factor σE is required for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3（2）.J. Bacteriol，1999，181：204-211.）。然后将阳性克隆子在37℃过夜培养，按体积分数为10%接种量转入5 mL含有相同抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃培养2-3小时后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次备用。将链霉菌孢子悬于5 mL TES缓冲液中，该缓冲液浓度为0.05 mol/L，pH 8.0；然后在50℃水浴中热激10分钟，冷却至室温后，按大肠杆菌：链霉菌孢子比例10⁸：10⁸等量混合涂布于SFM培养基平板上，吹干后置于30℃培养箱中培养16小时，用1 mL含有50 ng萘啶酮酸、30 ng阿伯拉霉素的无菌水覆盖平板，吹干后置于30℃培养箱中培养5-8天后挑选接合子单克隆。

实施例3 

挑取结合子单克隆，在含浓度为30 μg/mL的阿伯拉霉素的LB固体培养基上划单菌落，并在30℃培养箱中培养，待产孢后在无抗性的LB固体培养基上松弛，30℃培养6-7天后用20%甘油收集孢子。孢子用10^-4、10^-6、10^-8、10^-10浓度梯度稀释涂含阿伯拉霉素的平板，30℃培养3天后挑选单菌落个数合适的平板单菌落接种10.3%YEME液体培养基，然后提取基因组DNA进行PCR验证，验证引物序列如下：

上游引物M13F(-47): 5'-cgccagggttttcccagtcacgac-3'（SEQ ID NO.7）；

下游引物M13R(-48): 5'-agcggataacaatttcacacagga-3'（SEQ ID NO.8）。

检测结果如图4所示，即获得阳性克隆，命名为金色链霉菌ZT03。将金色链霉菌ZT03用含体积分数为20%甘油的燕麦平板保存（燕麦平板具体配方：3.4%(w/v)，MgSO₄ 0.005%，KH₂PO₄ 0.01%，(NH₄)₂HPO₄ 0.015%，终浓度为30 μg/mL的阿伯拉霉素）。 

实施例4

将保存的金色链霉菌ZT03接种于燕麦液体培养基中（终浓度为30 μg/mL的阿伯拉霉素），在30℃培养5-8天后用20%甘油收集孢子，将收集的孢子按体积百分比为1%的比例接种于30 mL种子培养基中，然后再30℃摇床培养24小时后按体积百分比为5%的接种量接种100 mL发酵培养基，容器为500 mL带弹簧的三角瓶，30℃摇床培养4-5天。

本实施例中使用的种子培养基配方为（w/v）：玉米淀粉4.0%，黄豆饼粉 2.0%，酵母粉 0.5%，蛋白胨 0.5%，碳酸钙 0.4%，硫酸铵 0.3%，氯化钠 0.2%，硫酸镁 0.025%，磷酸二氢钾 0.025%，高压灭菌。 

本实施例中使用的发酵培养基配方为（w/v）：玉米淀粉 8.0%，黄豆饼粉 4.0%，酵母粉 0.1%，蛋白胨 1.4%，玉米浆 0.8%，碳酸钙 0.7%，硫酸铵 0.35%，氯化钠 0.25%，硫酸镁 0.025%，分装之后按1.5 mL/30-35 mL体积比加入豆油，高压灭菌。 

实施例5

将实施例4中的发酵液用草酸酸化使pH值至1.5-2.0，然后在5000 rpm/min条件下离心10 min，收集上清液，得提取液，于-20℃避光冻存。

将制备的提取液进行HPLC检测，色谱条件为：安捷伦公司液相色谱仪，色谱柱为C18反向柱（5.0 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相A：0.02 M草酸/0.01 M 三乙基胺（TEA，pH2.0），流动相B：乙腈，流速为1.0 mL/min，柱温为25-28℃，检测波长360 nm，进样前用体积分数为20%乙腈等浓度洗脱，进样前样品用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，结果如图5A所示。由图5A可知，金霉素和四环素保留时间分别为8.5分钟和19.6分钟二者能够很好分离。 

将金色链霉菌F3和金色链霉菌ZT03在相同的条件下进行发酵，分离纯化发酵液，然后进行HPLC检测，检测结果如图5B所示。由图5B可知，与原始金色链霉菌F3相比，金色链霉菌ZT03，金霉素产量提高了18.89%，从原始菌株的20 g/L提高到23.78 g/L，金霉素组分的比例（金霉素/四环素）提高了1-2%。 

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 

<110>  金河生物科技股份有限公司；上海交通大学

<120>  提高金霉素产量的方法及其重组表达载体和基因工程菌

<160>  8

 

<210>  1

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增ctcP基因上游引物

<400>  1

ggaattccat atgaccgaca caaccgc     27

 

<210>  2

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增ctcP基因下游引物

<400>  2

gcggccgcaa gcttctacgg cttgacccgc atcg    34

 

<210>  3

<211>  1692

<212>  DNA

<213>  金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3

<220> 

<223> ctcP基因

<400>  3

ggaattccat atgaccgaca caaccgcgga tcagacgcgg cacggcgacc ggccgtacga   60

cgtcgtcatc atcggcagcg ggctgtcggg caccatgctc ggctcgatcc tcgccaagca  120   

cggcttccgg atcatgctgc tggacggtgc ccaccacccc cgcttcgccg tcggcgagtc  180   

caccatcggg cagacgctgg tggtgctgcg gctgatctcg gaccggtacg gggtgccgga  240   

gatcgccaac ctggcgagct tccaggacgt cctcgccaac gtcagcagtt cgcacgggca  300   

gaagagcaac ttcggcttca tgttccaccg ggacggcgag gagccggacc cgaacgagac  360   

cagccagttc cgcatcccct cgatcgtcgg caacgcggcc cacttcttcc gccaggacac  420   

cgactcctac atgttccacg ccgcggtgcg ctacggctgc gacgcccggc agtactaccg  480   

ggtggagaac atcgagttcg acgacggcgg ggtgaccgtc tccggcgcgg acggcagcac  540   

cgtccgggcc cgctacctgg tcgacgccag cggcttccgc tcgccgctgg cacggcagtt  600   

ggggctgcgg gaggagccga gccggctcaa gcaccacgcc cgctcgatct tcacccacat  660   

ggtcggagtg gacgcgatcg acgaccacgt ggacacgccg gccgagcttc gcccgccggt  720   

gccgtggaac gacgggacga tgcaccacat cttcgagcgc ggctggatgt ggatcatccc  780   

gttcaacaac caccccgggg ccaccaaccc gctgtgcagc gtcggcatcc agctcgacga  840   

gcgccgctac cccgcccggc cggacctgac gcccgaggag gagttctggt cccacgtgga  900   

ccgcttcccg gcggtgcagc ggcagttgaa gggcgcccgc agcgtgcgcg agtgggtgcg  960   

aacggaccgc atgcagtact cctcgagccg gacggtcggc gagcgctggt gcctgatgtc 1020   

gcacgcggcc ggcttcatcg acccgctctt ctcccgcggc ctgtccaaca cctgcgagat 1080   

catcaacgcg ctgtcctggc ggctgatggc cgcgctgcgc gaggacgact tcgcggtcga 1140   

gcgcttcgcc tacgtggagg aactggagca gggcctgctg gactggaacg acaagctggt 1200   

caacaactcc ttcatctcct tctcgcacta cccgctgtgg aactcggtct tccggatctg 1260   

ggcctcggcc agcgtgatcg gcggcaagcg catcctcaac gcactgacca ggaccaagga 1320   

gaccggcgac gacagccact gccaggcgct ggacgacaac ccgtacccgg gcctgtggtg 1380   

tccgctggac ttctacaagg aggccttcga cgagctcacc gagctgtgcg aggccgtgga 1440   

cgccggggac accacggccg aggaggccgc gcgggtgctg gagcagcggg tccgcgagtc 1500   

ggactggatg ctgccggccc tgggcttcaa cgaccccgac acccaccaca tcaacccgac 1560   

ggcggacaag atgatccgga tcgcggagtg ggccaccggt caccaccgcc cggagatccg 1620   

tgagctgctg gccgccagcg ccgaggaggt cagggcggcg atgcgggtca agccgtagaa 1680   

gcttgcggcc gc                                                     1692

 

<210>  4

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增ctcQ基因上游引物

<400>  4

ggaattccat atgccccccg aacccctgtc cc   32

 

<210>  5

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  扩增ctcQ基因下游引物

<400>  5

gcggccgcaa gctttcagcc ctcggccgcc agggtc   36

 

<210>  6

<211>  600

<212>  DNA

<213>  金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3

<220> 

<223> ctcQ基因

<400>  6

ggaattccat atgccccccg aacccctgtc cctgccgctg gacctggccc ccggcctggt  60

ggacggagac accttcctgt cgatcatggg cgccctgccg accggggtca ccgtggtgac  120

gaccctggga ccggacgggg agccgtacgg gttgacctgt tcggccgcct gcagcgtctc 180

caaggccccg cccctgttgc tggtctgcat caaccgcgac agccgggtgc tgaaggccct 240

cctggagcgc ggcgagttcg ccgtcaacgt gctgcgcggc ggaggggagt ccacgtccgc 300

gcgcttcgcc gcgcccgtgg acgaccgctt ccgggacgtc cggtgggagc cgggcagcgc 360

cggtggcgtg ccggtcatgt cggccgacgt cgtcgcgcac gccgagtgcc gggtcgccgc 420 

ggccctcgac gcgggagacc acaccatcgt gatcggcgcg gtggtggccg gcggcccccg 480

gcccgaggtg cccagcccgc tgatgtactg gcgccgctcc tacgcccgct ggccggtgga 540

ggaggatccg cggacggccg ccctgaccct ggcggccgag ggctgaaagc ttgcggccgc 600

    

<210>  7

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  PCR验证上游引物

<400>  7

cgccagggtt ttcccagtca cgac   24

 

<210>  8

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  PCR验证下游引物

<400>  8

agcggataac aatttcacac agga  24

 

Claims (10)

1.FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ在金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）中提高金霉素产量的应用，所述FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ ID NO.3中第11-1687位所示，所述FAD还原酶基因ctcQ的核酸序列如SEQ ID NO.6中第11-586位所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述金色链霉菌为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3，保藏号为CCTCC NO: M 2013080。

3.含有FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的基因工程菌，所述FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ ID NO.3中第11-1687位所示，所述FAD还原酶基因ctcQ的核酸序列如SEQ ID NO.6中第11-586位所示。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于：所述工程菌为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）。

5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于：所述工程菌为金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens）F3，保藏号为CCTCC NO: M 2013080。

6.含有FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的重组表达载体，所述FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ ID NO.3中第11-1687位所示，所述FAD还原酶基因ctcQ的核酸序列如SEQ ID NO.6中第11-586位所示。

7.权利要求6所述重组表达载体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

a．用带酶切位点的引物克隆FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP，然后连接至pIB139载体强启动子PermE*下游，得到质粒pJTU4303；

b．用带酶切位点的引物克隆FAD还原酶基因ctcQ，然后连接至pIB139载体强启动子PermE*下游，得质粒pJTU4304；

c．将步骤b所得质粒pJTU4304进行酶切，切下含强启动子PermE*和FAD还原酶基因ctcQ的片段并连入线性化的质粒pJTU4303中，得含FADH₂依赖型氯化酶基因ctcP和FAD还原酶基因ctcQ的重组载体。

8.根据权利要求7所述重组表达载体的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，所述带酶切位点的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

9.根据权利要求7所述重组表达载体的制备方法，其特征在于：所述步骤b中，所述带酶切位点的引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

10.根据权利要求7所述重组表达载体的制备方法，其特征在于：所述步骤c是重组质粒pJTU4304用HindIII酶切，回收含强启动子PermE*和FAD还原酶基因ctcQ片段并将回收片段用Klenow I酶补平；同时用EcoRV线形化pJTU4303质粒，将补平的含强启动子PermE*和FAD还原酶基因ctcQ片段连接入线性化的pJTU4303质粒中，得重组表达载体。

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