CN109554323B - 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用 - Google Patents

一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109554323B
CN109554323B CN201811522585.8A CN201811522585A CN109554323B CN 109554323 B CN109554323 B CN 109554323B CN 201811522585 A CN201811522585 A CN 201811522585A CN 109554323 B CN109554323 B CN 109554323B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
gene
strain
escherichia coli
mutator
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811522585.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109554323A (zh
Inventor
王松太
郭书奎
周鑫鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Bioengineering Institute
Original Assignee
Wuhan Bioengineering Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Bioengineering Institute filed Critical Wuhan Bioengineering Institute
Priority to CN201811522585.8A priority Critical patent/CN109554323B/zh
Publication of CN109554323A publication Critical patent/CN109554323A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109554323B publication Critical patent/CN109554323B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法与应用。该增变菌株通过编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ被敲除、插入失活或突变而丧失其DNA复制过程中校正功能而获得的。本发明通过利用λ‑Red重组酶方法，对编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基具的基因dnaQ进行敲除，获得了DNA复制过程中校正功能丧失的增变菌株，该菌株的突变能力为野生型的25000倍，是高效的基因诱变手段。同时减少筛选优良性状的工作时间成本，提高科研工作和工程菌选育的效率。

Description

一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术工程领域，具体涉及通过大肠杆菌danQ基因被敲除、插入失活或因突变而丧失其校正功能，导致DNA复制的突变率增大的基因增变菌株；以及将该增变菌株应用于诱变目标基因以达到筛选优良性状的目的和该菌直接用于选育具有特定性状的突变体。
背景技术
微生物菌种在自然条件下发生突变的频率较低，且突变幅度不大，基因结构一般很难发生改变，因此在生产和研究中为了获得具有特定性状的菌株，往往需要对微生物进行诱变育种。微生物诱变育种是指在人为条件下利用物理、化学或生物等因素，诱发微生物体产生突变，通过筛选，培育微生物新菌株的方法。最常见的诱变方法为物理诱变、化学诱变和生物诱变。随着生命科学发展以及学科交叉的深入，诱变育种技术得到不断发展和创新，从而为筛选更多高效菌种提供了技术上的可行性和便利。
DNA聚合酶Ⅲ是大肠杆菌染色体DNA复制的主要酶，它由α、β、γ、δ、ε等亚基组成，其中α亚基具有5'→3'的DNA聚合酶活性，ε亚基具有3'外切酶活性，负责DNA复制过程中的校对功能，可提高聚合酶Ⅲ复制DNA的保真性。DNA聚合酶III的ε亚基由dnaQ基因编码。现有技术还没有将dnaQ基因突变的菌株用作增变菌株进行生物诱变。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基因增变菌株，通过大肠杆菌dnaQ基因被敲除、插入失活或因突变而丧失其校正功能，导致DNA复制的突变率增大，因此dnaQ基因突变的菌株可以用作增变菌株进行生物诱变，提高基因突变的频率，减少筛选优良性状的工作时间成本。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株，该菌株是通过编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ被敲除、插入失活或突变而丧失其DNA复制过程中校正功能而获得的。
优选地，上述基因增变菌株是通过利用λ-Red重组酶方法，对编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ进行敲除，使之丧失其DNA复制过程中校正功能而获得的。
进一步地，上述λ-Red重组酶方法构建大肠杆菌基因dnaQ敲除的基因增变菌株的方法，包括以下步骤：
(1)设计引物：
用于同源重组的引物为dnaQtetR和dnaQtetA；设计原则是5'端为dnaQ基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列(加下划线)，重组体的检测所用引物为EdnaQU及EdnaQD，这些引物的序列如下所示：
dnaQtetR：
ACACGCCAGATCGTTCTCGATACCGAAACCACCGGTATGATTAAGACCCACTTTCACAT(SEQ IDNO:1)；
dnaQtetA：
TTATGCTCGCCAGAGGCAACTTCCGCCTTTCTTCTGCACCCTAAGCACTTGTCTCCTG(SEQ ID NO:2)；
EdnaQU：CTACCTGTTTAAGCATCTC(SEQ ID NO:3)；
EdnaQD：GTCAACGGTTTTTCTCATC(SEQ ID NO:4)；
(2)含tetRA基因的DNA片段的扩增：
以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac(Tet+，Kan+，购自武汉淼灵生物科技有限公司)的DNA为模板，dnaQtetR及dnaQtetA为引物进行PCR扩增，获得两端分别与dnaQ基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetRA的DNA片段。将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化。
(3)感受态细胞的制备：
将含有pKD46质粒的DH5α菌株在含有20μg/mL Amp的LB培养基中30℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20μg/mL Amp的LB中30℃下震荡培养，当OD600达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用。
(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定
将胶回收的DNA片段(100ng)与80μL感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10min后，用2300V电击，电击后迅速加入800μL LB培养液，30℃下震荡培养30min后在20μg/mL的四环素平板上涂板，37℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用EdnaQU和EdnaQD引物对这些菌落进行菌落PCR鉴定，有四环素抗性基因tetRA的DNA片段的菌落即为大肠杆菌基因dnaQ敲除的基因增变菌株。
获得大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株，还可以通过部分敲除dnaQ基因或在dnaQ基因中插入外源DNA片段来实现。部分敲除dnaQ基因引物设计原则是先确定要敲除的序列，引物的5'端为待敲除序列相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列；插入外源DNA序列使dnaQ基因失活的引物设计原则是先确定插入外源DNA的位置，引物的5'端为待插入位置相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列。用来敲除、替换或插入的基因片段，除了可以选用四环素抗性基因tetRA的DNA片段外，还可以选择其它抗性基因片段，如氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、甲氧西林抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因等抗性基因；或者其它便于筛选的标记基因如绿色/红色荧光蛋白基因等。
第二方面，提供上述大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株在基因诱变筛选中的应用，具体为将外源DNA导入所述增变菌株的感受态细胞中进行诱变。
第三方面，提供上述大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株在选育具有特定性状的突变体中的应用，具体为直接以所述增变菌株为选育对象，对其因基因突变而产生的具有特定性状的突变体进行选育。
本发明相对于现有技术的优势在于：
1、本发明通过利用λ-Red重组酶方法，对编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基具的基因dnaQ进行敲除，获得了DNA复制过程中校正功能丧失的增变菌株，在培养过程中自身的基因就会不断的发生基因突变，该菌株的突变能力为野生型的25000倍，出现一些新的性状，可直接用于选育具有特定性状的突变体。
2、本发明的增变菌株可以提高基因突变的频率，该菌由于丧失了修复功能，将外源的DNA导入该菌中进行突变，是高效的基因诱变手段。减少筛选优良性状的工作时间成本，提高科研工作和工程菌选育的效率。
附图说明
图1PCR产物切胶回收电泳检测；
M：DL5000DNA标样；1：四环素抗性基因胶回收产物。
图2菌落PCR鉴定图；
M：DL5000DNA标样；1：对照；2-5：实验组。
图3A潜在的tsr突变体(T)的筛选；
图3B野生型tsr(pjc3)及tsr突变体tsr-M309I和tsr-E436K在甲基修饰系统缺失菌株uu2610中的功能。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】利用λ-Red重组酶方法对编码大肠杆菌DNA聚合酶IIIε亚基的基因dnaQ进行敲除
(1)设计引物：
用于同源重组的引物为dnaQtetR和dnaQtetA；设计原则是5'端为dnaQ基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列(加下划线)，重组体的检测所用引物为EdnaQU及EdnaQD。这些引物的序列如表1所示，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
表1本发明所用的引物
Figure BDA0001903598040000041
(2)含tetRA基因的DNA片段的扩增：
以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac的DNA为模板，dnaQtetR及dnaQtetA为引物进行PCR扩增，获得两端分别与dnaQ基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetRA的DNA片段。将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化，如图1所示。
(3)感受态细胞的制备：
将含有pKD46质粒的DH5α菌株在含有20μg/mL Amp的LB培养基中30℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20μg/mL Amp的LB中30℃下震荡培养，当OD600达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用。
(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定
将胶回收的DNA片段(100ng)与80μL感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10min后，用2300V电击，电击后迅速加入800μL LB培养液，30℃下震荡培养30min后在20μg/mL的四环素平板上涂板，37℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用EdnaQU和EdnaQD引物对这些菌落进行菌落PCR鉴定，有四环素抗性基因tetRA的DNA片段的菌落即为大肠杆菌基因dnaQ敲除的基因增变菌株，如图2所示。
【实施例2】dnaQ突变体的功能分析
分别挑取野生型DH5α和【实施例1】经过EdnaQU及EdnaQD引物PCR鉴定的dnaQ突变体37℃下在5mL LB培养基中200r/min震荡过夜培养，之后分别离心收集细胞，浓缩至1ml，梯度稀释，然后取100μl涂布于LB固体平板和含萘啶酸的LB固体平板(萘啶酸浓度为30ug/ml)，37℃培养18h后，观察菌落的生长状况并记录各平板上的菌落数(CFU)。将在萘啶酸平板上的菌落数与在LB平板上的菌落数之比作为抗萘啶酸的突变率，每个样品进行3个重复。
将野生型DH5α及【实施例1】的dnaQ突变体在LB培养液中37℃过夜震荡培养。过夜培养液梯度稀释后，取相同量的稀释液在LB平板和含30μg/mL萘啶酸的LB平板上涂板，37℃过夜培养。不同稀释倍数下DH5α及dnaQ突变体在LB平板及萘啶酸平板上的菌落数如表2及表3所示。萘啶酸可以与DNA旋转酶结合，抑制其活性，干扰DNA复制，抑制细胞正常分裂，因此野生型大肠杆菌在萘啶酸平板上不能形成菌落。当DNA旋转酶上与萘啶酸结合的氨基酸发生突变时，可使其不与萘啶酸结合而失去对萘啶酸的敏感性，在萘啶酸平板上长出菌落。用萘啶酸平板上出现的菌落数与LB平板上出现的菌落数之比作为其抗萘啶酸的突变率。dnaQ突变菌株在LB平板上的数量减少，与野生型相比机会差一个数量级，表明dnaQ插入替换失活后，因DNA复制过程中校正功能丧失，突变率提高，而影响了细菌正常的代谢、生长及分裂等活动。虽然dnaQ突变体在LB平板上菌落数减少，但其在萘啶酸平板上的菌落数明显增多，增加了近4个数量级。根据表2、3的数据，经过换算得出，野生型DH5α的抗萘啶酸的突变率为6.7×10-9，而dnaQ突变菌株的抗萘啶酸突变率为1.7×10-4。dnaQ突变体抗萘啶酸的突变率约是野生型抗萘啶酸突变率的25000倍，可以用作诱变菌株。
表2野生型DH5α和敲除dnaQ基因的DH5α在LB平板上形成的CFU结果
Figure BDA0001903598040000061
表3野生型DH5α和敲除dnaQ基因的DH5α在含萘啶酸的LB平板上形成的CFU结果
Figure BDA0001903598040000062
注：NA表示CFU数值太大，不可分析。
【实施例3】丝氨酸受体蛋白基因tsr的增变试验
将含有丝氨酸受体蛋白基因tsr的质粒pJC3利用热击的方法转化到【实施例1】的dnaQ突变体的感受态细胞中，在含100ug/ml氨苄的LB平板上涂板，37℃下过夜培养。挑取不同的菌落分别接种到1ml的LB液体培养基中，37℃过夜震荡培养后取10ul培养液在含有30ug/ml萘啶酸的平板上涂板，并在37℃下过夜培养，选取在萘啶酸平板上产生抗性菌落数最多的原菌落提取质粒，作为tsr突变库。
将突变库质粒用热击法转化到甲基修饰系统CheR、CheB以及所有趋化性受体均被敲除的菌株uu2610(△MCPs△CheRCheB)中。将转化后的细胞在含有5μg/ml氨苄、5μM IPTG的半固体培养基(每升含5g蛋白胨、5gNaCl、2g琼脂)上用移液枪划线，划线时使枪头没入培养基约1cm，30℃下培养16小时后在划线的某些位置会出现一些小突起，并在周围形成趋化性环。用牙签在这些突起的边缘挑取菌细胞，在含有100ug/ml氨苄的LB平板上划线，37℃下过夜培养，挑取单菌落，在泳动平板上检验其趋化性。若有趋化性环，则从该菌落中提取质粒并进行测序。
根据上述方法，我们筛选出了2个tsr突变体，测序鉴定后表明它们分别为tsr-M309I和tsr-E436K。如图3所示，Tsr蛋白的309位蛋氨酸突变为异亮氨酸或436位谷氨酸突变为赖氨酸后能够使甲基修饰系统缺失的菌株uu2610在半固体培养基上产生趋化性环，因此获得了不依赖甲基修饰的tsr突变体，而野生型tsr不能使uu2610获得趋化性。
除了用野生型tsr做为起始模板进行诱变外，我们还用甲基化状态不同的tsr基因为起始模板进行诱变，以同样的筛选方法获得了大量的不依赖甲基修饰系统的tsr突变体，它们均能使甲基修饰系统CheR和CheB趋化性受体蛋白基因都已经敲除的大肠杆菌获得趋化性，而用未经诱变的tsr进行同样的筛选无法得到功能相同的突变体。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 武汉生物工程学院
<120> 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acacgccaga tcgttctcga taccgaaacc accggtatga ttaagaccca ctttcacat 59
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttatgctcgc cagaggcaac ttccgccttt cttctgcacc ctaagcactt gtctcctg 58
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctacctgttt aagcatctc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcaacggtt tttctcatc 19

Claims (1)

1.一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株在选育不依赖甲基修饰的丝氨酸受体蛋白基因tsr突变体中的应用，其特征在于，所述增变菌株是通过λ-Red重组酶方法将编码大肠杆菌DNA聚合酶III ε亚基的基因dnaQ敲除而丧失其在DNA复制过程中校正功能而获得的，具体包括以下步骤：
（1）设计引物：
用于同源重组的引物为dnaQtetR和dnaQtetA; 设计原则是5'端未加下划线的核苷酸为dnaQ基因的同源区，3'端加下划线的核苷酸为四环素抗性基因tetRA的同源序列，重组体的检测所用引物为EdnaQU及EdnaQD，这些引物的序列如下所示：
dnaQtetR：
ACACGCCAGATCGTTCTCGATACCGAAACCACCGGTATGATTAAGACCCACTTTCACAT（SEQ ID NO:1）；
dnaQtetA：
TTATGCTCGCCAGAGGCAACTTCCGCCTTTCTTCTGCACCCTAAGCACTTGTCTCCTG（SEQ ID NO:2）；
EdnaQU：CTACCTGTTTAAGCATCTC（SEQ ID NO:3）；
EdnaQD：GTCAACGGTTTTTCTCATC（SEQ ID NO:4）；
（2）含tetRA基因的DNA片段的扩增：
以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac的DNA为模板，dnaQtetR及dnaQtetA为引物进行PCR扩增，获得两端分别与dnaQ基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetRA的DNA片段；将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化；
（3）感受态细胞的制备：
将含有pKD46质粒的DH5α菌株在含有20 µg/mL Amp的LB培养基中30 ℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20 µg/mL Amp的LB中30 ℃下震荡培养，当OD600 达到0.6时加入0.2%的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4 ℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用；
（4）电转及目的菌株的筛选与鉴定
将胶回收的100 ng DNA片段与80 µL感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10 min后，用2300V 电击，电击后迅速加入800 µL LB培养液，30 ℃下震荡培养30 min后在 20 µg/mL的四环素平板上涂板，37 ℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用 EdnaQU和EdnaQD引物对这些菌落进行菌落PCR鉴定，有四环素抗性基因tetRA的DNA片段的菌落即为大肠杆菌基因dnaQ敲除的基因增变菌株。
CN201811522585.8A 2018-12-13 2018-12-13 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用 Active CN109554323B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811522585.8A CN109554323B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811522585.8A CN109554323B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109554323A CN109554323A (zh) 2019-04-02
CN109554323B true CN109554323B (zh) 2021-11-30

Family

ID=65869775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811522585.8A Active CN109554323B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109554323B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110283767A (zh) * 2019-06-21 2019-09-27 武汉生物工程学院 一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法
CN110358812B (zh) * 2019-06-25 2022-12-27 武汉生物工程学院 一种用于λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法
CN116606875A (zh) * 2023-04-20 2023-08-18 黑龙江金象生化有限责任公司 一种基因增变菌株及其在耐热性色氨酸生产菌株筛选中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544313A (zh) * 2016-12-09 2017-03-29 济南大学 一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株及构建方法和应用
CN107805619A (zh) * 2017-09-01 2018-03-16 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544313A (zh) * 2016-12-09 2017-03-29 济南大学 一种缺失sahn基因的大肠杆菌MG1655菌株及构建方法和应用
CN107805619A (zh) * 2017-09-01 2018-03-16 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genome replication engineering assisted continuous evolution (GREACE) to improve microbial tolerance for biofuels production;Luan等;《Biotechnology for Biofuels》;20131231;第6卷;1-11 *
Luan等.Genome replication engineering assisted continuous evolution (GREACE) to improve microbial tolerance for biofuels production.《Biotechnology for Biofuels》.2013,第6卷 *
Mutational specificity of a proof-reading defective Escherichia coil dnaQ49 mutator;Reinhard Piechocki等;《Mol Gen Genet》;19861231;第202卷;162-168 *
Red 重组介导大肠杆菌外膜蛋白 A 缺失突变菌株的构建及生物学特性初步研究;杨汐静等;《华西医学》;20171231;第32卷(第12期);1895-1899 *
利用λRed 重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因;李晔等;《生物技术通报》;20141231(第9期);171-177 *
基因组突变提高大肠杆菌丙酮酸生产;史晓荣;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20180415(第04期);A006-272 *
大肠杆菌无痕重组的策略与应用;刘陆罡等;《中国生物工程杂志》;20141231;第34卷(第8期);88-96 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109554323A (zh) 2019-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109554323B (zh) 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用
US7303906B2 (en) Competent bacteria
KR20150115009A (ko) 아코니트산수화 효소 유전자와(또는) 그 조절요소를 개조한 세균 발효를 통한 l-리신 생산방법
KR101215245B1 (ko) 비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템
CN106029879A (zh) 具有提高的l-苏氨酸生产能力的微生物以及使用其生产l-苏氨酸的方法
WO2022156188A1 (en) Method for producing target dna sequence and cloning vector
US20240093212A1 (en) Bacterial continuous evolution system, orthogonal error-prone dna polymerase, and continuous evolution method
WO2014092345A1 (ko) 푸자리시딘 생산 균주 및 이를 이용한 푸자리시딘의 대량 생산방법
CN112608911B (zh) 一种rna聚合酶突变体及其应用
CN111254143B (zh) 具有优良胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用
JP5778426B2 (ja) アミノ酸生合成のための組成物及び方法
CN112079903B (zh) 一种错配结合蛋白的突变体及其编码基因
CN114672525A (zh) N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成方法及其应用
Chen et al. Multiple-copy-gene integration on chromosome of Escherichia coli for beta-galactosidase production
JP2011512796A5 (zh)
CN110591993A (zh) 一种基于盐酸刺激的哈维弧菌同源重组基因敲除的方法
KR102226714B1 (ko) tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법
CN117402846B (zh) L-丙氨酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用
CN115716868B (zh) 转录因子MrPigB突变体及其应用
US20240132923A1 (en) Recombinant microorganism and a method for itaconic acid production
JP4495429B2 (ja) ロドコッカス属細菌の形質転換方法
JP2001526536A (ja) 高形質転換性細菌細胞及びその製造方法
KR100567612B1 (ko) 바이오틴 생합성 유전자를 함유하는 dna단편 및 그의 용도
CN116949108A (zh) L-谷氨酰胺外运蛋白、其突变体及其应用
CN116622755A (zh) 一种辅助大肠杆菌自适应进化的基因编辑质粒载体、构建方法、工程菌及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant