KR102226714B1 - tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법 - Google Patents

tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102226714B1
KR102226714B1 KR1020150044399A KR20150044399A KR102226714B1 KR 102226714 B1 KR102226714 B1 KR 102226714B1 KR 1020150044399 A KR1020150044399 A KR 1020150044399A KR 20150044399 A KR20150044399 A KR 20150044399A KR 102226714 B1 KR102226714 B1 KR 102226714B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
coli
gene
teta
genome
oligonucleotide
Prior art date
Application number
KR1020150044399A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160116535A (ko
Inventor
이성국
유영신
Original Assignee
울산과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 울산과학기술원 filed Critical 울산과학기술원
Priority to KR1020150044399A priority Critical patent/KR102226714B1/ko
Publication of KR20160116535A publication Critical patent/KR20160116535A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102226714B1 publication Critical patent/KR102226714B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 본 발명은 tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 지놈 엔지니어링 이후 남게되는 불필요한 염기서열(scar sequence)이 없고 지놈 엔지니어링을 위한 플라스미드의 재조합이 필요 없으므로, 간단하게 대장균의 지놈 내로 이종 유전자를 도입하거나 특정 유전자를 제거하는데 유용하게 응용될 수 있다. 또한, 본 발명의 지놈 엔지니어링 방법은 테트라사이클린 내성 및 니켈염 민감성에 의해 높은 효율로 지놈 엔지니어링된 대장균을 선별할 수 있다.

Description

tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법{Method for genome engineering of E. coli by dual selection using tetA gene}
본 발명은 tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법에 관한 것이다.
지놈 엔지니어링으로 인해 기본적인 생물학적 현상을 이해하게 됨과 동시에, 진화를 통해서는 쉽게 생성될 수 없는 유용한 유기체를 제조할 수 있게 되었다. 대립형질 재조합(allelic recombination)에 의해 매개되는 지놈 엔지니어링 도구는 합성 생물학 및 대사 엔지니어링에서 그 유용성을 입증하였다(Burdett et al., P. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6765-6770 (2001); Mosberg et al., PLoS One 7 (2012)). 염색체 상의 다중 유전자좌(지놈 시퀀스)의 동시 편집은 목적하는 기능의 효과적인 진전을 야기하였으며(Esvelt and Wang, Mol. Syst. Biol. 9 (2013)), 지놈 엔지니어링에 특별한 도구가 된다. 상기 방법은, 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 마이코박테리움(Mycobacterium) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함하는 모델 유기체들의 목적하는 유전자좌를 변이시키기 위해 십여 년에 걸쳐 성공적으로 사용되어 온(Swingle et al., Bioeng Bugs 1, 263-266 (2010)), 파지 λ Red 리콤비네이즈 효소 β, γ 및 엑소(exo)(Poteete, Ferms Microbiology Letters 201, 9-14 (2001)) 단백질들에 의해 촉진된다.
다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering, MAGE)은 세포의 대규모 프로그래밍, 진화를 위한 합성 생물학 및 대사 엔지니어링 분야의 독립적 재조합공학(recombineering) 도구로서, 비-생존성 돌연변이의 축적을 허용하지 않는 지놈 엔지니어링 도구이다(Lajoie et al., Nucleic Acids Research 40, e170-e170 (2012)). 상기 방법은 24개의 유전자 성분들을 동시에 변이시킴으로써 라이코펜 생성 쪽으로 흐름을 이동시키기 위해 적용되어, 라이코펜 역가를 5배 증가시켰다(Wang et al., Nature 460, 894-898 (2009a)). 또한, MAGE를 사용하여, 대장균의 314개의 TAG 정지 코돈을 TAA 정지 코돈으로 치환시켜 비천연(non-canonical) 아미노산에 사용하기 위한 코돈 공간을 생성시켰다(Isaacs et al., Science 333, 348-353 (2011)). T7 프로모터를 12개 유전자좌 내에 동시 도입시켜 인디고 생성을 20% 증가시켰다(Wang et al., Nat. Methods 9, 591-593 (2012b)). 사상 최대의 MAGE 순환(110 주기)에 의해, His 표지(tag)가 대장균의 전체 번역 기구를 암호화하는 38개의 필수 유전자 내에 삽입되어, 고순도로 시험관내 번역 추출물의 용이한 재구축을 가능케 하였다(Wang et al., ACS Synthetic Biology 1, 43-52 (2012a)).
하지만, 적은 수의 유전자를 변형시키고자 할 경우 muts 유전자 제거를 통해 MMR(유전자 에러 수리 시스템; Mismatch Repair)을 제거하여야 하는데, 이때 야생형보다 200배 높게 돌연변이 발생될 수 있어 원하지 않은 돌연변이가 축적될 수 있다. 또한, MAGE에 의한 지놈 엔지니어링은 표현형이 없는 경우나 효율이 낮은 경우에는 지놈 엔지니어링 이후 선별에 어려움이 있다. 따라서, 전술한 문제점을 개선하고, 보다 간편하게 대장균의 지놈 엔지니어링을 수행할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.
테트라사이클린 저항성 유전자(tetA)는 박테리아 유전자와 분자유전학에서 다양하게 사용된다. tetA 유전자는 막단백질로 박테리아 세포로부터 항생제의 에너지 의존 유출을 매개한다(Tatyana et al., Plasmid 36, 112-115 (1996)). tetA의 발현은 박테리아가 테트라사이클린 저항성을 갖게 하지만, 과발현되는 경우 박테리아를 니켈염과 같은 독성이 있는 금속염에 민감하게 한다(Norihito et al., Nucleic Acids Research 37, e39 (2009)).
본 발명자들은 전술한 tetA 유전자의 특성을 이용한 tetA 유전자 발현 시스템을 개발하였고, 테트라사이클린 내성 및 니켈염 민감성을 통해 지놈 엔지니어링된 균주를 선별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Burdett et al., P. Natl. Acad. Sci. USA 98, 6765-6770 (2001) Mosberg et al., PLoS One 7 (2012) Esvelt and Wang, Mol. Syst. Biol. 9 (2013) Swingle et al., Bioeng Bugs 1, 263-266 (2010) Poteete, Ferms Microbiology Letters 201, 9-14 (2001) Lajoie et al., Nucleic Acids Research 40, e170-e170 (2012) Wang et al., Nature 460, 894-898 (2009a) Isaacs et al., Science 333, 348-353 (2011) Wang et al., Nat. Methods 9, 591-593 (2012b) Wang et al., ACS Synthetic Biology 1, 43-52 (2012a) Tatyana et al., Plasmid 36, 112-115 (1996) Norihito et al., Nucleic Acids Research 37, e39 (2009)
본 발명의 목적은 MMR 시스템의 제거없이 대장균의 지놈 내 타겟 유전자를 엔지니어링하고 상기 지놈 엔지니어링된 대장균을 간단하게 선별하는 대장균의 지놈 엔지니어링 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 프로모터; tetA 유전자; 및 대장균내 타겟 유전자와 상동인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 단계; (2) 상기 단계 (1)에서 제조된 폴리뉴클레오타이드를 λ-Red 리콤비네이즈가 발현된 대장균에 도입시켜 상동 재조합에 의해 지놈 내 타겟 유전자에 통합시키는 단계; (3) 상기 재조합된 대장균을 테트라사이클린이 함유된 배지에서 배양함으로써 테트라사이클린-내성 대장균을 1차 선별하는 단계; (4) 상기 선별된 대장균에 다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering; MAGE) 올리고뉴클레오타이드 또는 이종 유전자를 도입하여 상동 재조합에 의해 단계 (2)에서 통합된 폴리뉴클레오타이드를 치환하는 단계; 및 (5) 상기 재조합된 대장균을 니켈염을 함유하는 배지에서 배양함으로써 니켈염에 대해 민감성을 나타내지 않는 대장균을 2차 선별하는 단계를 포함하는, 대장균의 지놈 엔지니어링 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 대장균의 지놈 엔지니어링 방법은 지놈 엔지니어링 이후 남게되는 불필요한 염기서열(scar sequence)이 없고 지놈 엔지니어링을 위한 플라스미드의 재조합이 필요 없으므로, 간단하게 대장균의 지놈 내로 이종 유전자를 도입하거나 특정 유전자를 제거하는데 유용하게 응용될 수 있다. 또한, 본 발명의 지놈 엔지니어링 방법은 MMR 시스템이 작동하는 가운데 테트라사이클린 내성 및 니켈염 민감성에 의해 높은 효율로 지놈 엔지니어링된 대장균을 선별할 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 tetA 유전자와 니켈염을 이용한 이중선별 방법의 원리를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 본 발명의 이중선별 방법을 구체적인 도식으로 나타낸 것이다.
도 2는 tetA 유전자를 포함한 대장균 및 대조군으로서 야생형 대장균의 니켈염 농도에 따른 성장 속도를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 lacZ에 삽입된 tetA 유전자를 제거하기 위해 제작된 lacZ-MAGE 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 MAGE를 수행한 후, 대장균을 니켈염이 포함된 배지에서 배양한 다음, X-gal+IPTG가 포함된 배지에서 회복효율을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 상기 도에서 LacZ 0는 삽입(insertion)을 위해 만들어진 균주이고 LacZ 40은 치환(replacement)을 위해 만들어진 균주로서, LacZ 0-M9 및 LacZ 40-M9는 대조군으로서 유전자 회복을 위한 MAGE 이후 니켈이 함유되지 않은 M9-최소배지에서 성장한 균주를 가리키고, LacZ 0-Ni 및 LacZ 40-Ni는 MAGE 이후 니켈이 포함된 배지에서 성장한 균주를 가리킨다.
본 발명은 (1) 프로모터; tetA 유전자; 및 대장균내 타겟 유전자와 상동인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 단계; (2) 상기 단계 (1)에서 제조된 폴리뉴클레오타이드를 λ-Red 리콤비네이즈가 발현된 대장균에 도입시켜 상동 재조합에 의해 지놈 내 타겟 유전자에 통합시키는 단계; (3) 상기 재조합된 대장균을 테트라사이클린이 함유된 배지에서 배양함으로써 테트라사이클린-내성 대장균을 1차 선별하는 단계; (4) 상기 선별된 대장균에 다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering; MAGE) 올리고뉴클레오타이드 또는 이종 유전자를 도입하여 상동 재조합에 의해 단계 (2)에서 통합된 폴리뉴클레오타이드를 치환하는 단계; 및 (5) 상기 재조합된 대장균을 니켈염을 함유하는 배지에서 배양함으로써 니켈염에 대해 민감성을 나타내지 않는 대장균을 2차 선별하는 단계를 포함하는, 대장균의 지놈 엔지니어링 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 방법을 단계별로 상세히 설명한다.
<단계 1> tetA 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 제조
본 단계에서는, 프로모터; tetA 유전자; 및 대장균내 타겟 유전자와 상동인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제조한다.
본 단계에서 사용되는 tetA 유전자는 테트라사이클린 내성 유전자로서, 바람직하게는 상업적으로 이용가능한 플라스미드, 예를 들면 pBR322 등으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, tetA 유전자는 pBBR1MCS3 플라스미드를 주형으로 tetA 유전자의 상류 및 하류에 있는 서열들과 결합가능한 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 수득될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, tetA 유전자는 pBBR1MCS3을 주형으로 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 수득될 수 있다. 본 기술분야의 숙련자라면 사용된 주형을 바탕으로 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍 외에 적절한 프라이머를 사용하여 tetA 유전자를 수득할 수 있을 것이다.
본 단계에서 사용되는 프로모터는 전술한 tetA 유전자가 대장균의 지놈 내에 통합(삽입)되었을 때 tetA 단백질의 강한 발현을 유도하는 역할을 한다.
박테리아에서의 tetA 단백질의 발현은 박테리아에게 테트라사이클린 내성을 부여하며, tetA 단백질의 과발현은 박테리아에게 니켈염에 대해 민감성을 부여한다. 본 발명의 방법은 이러한 테트라사이클린 내성 및 니켈염 민감성을 이용하므로, 본 발명에 사용되는 프로모터는 tetA 단백질의 과발현을 유도하여 박테리아가 테트라사이클린 내성 및 니켈염 민감성을 갖도록 하는 프로모터인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 프로모터의 예로는 tetA 프로모터(예를 들어, pBR322로부터 수득될 수 있음), CP25 프로모터 또는 P3-BCD2 프로모터를 들 수 있으며, 바람직하게는, P3-BCD2 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 tetA 유전자의 5' 위치에서 tetA 유전자와 연결될 수 있다. 상기 프로모터와 tetA 유전자의 연결은 적절한 프라이머쌍을 이용한 PCR에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, P3-BCD2 프로모터를 사용하는 경우, 증폭된 tetA 유전자를 주형으로 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 일부의 프로모터를 연결한 후, 이를 주형으로 사용하여 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 7의 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 P3-BCD2 프로모터를 tetA 유전자에 연결할 수 있다. 상기 프라이머 외에도 본 기술분야의 숙련자라면 사용된 주형의 염기서열을 바탕으로 다양한 프라이머를 제작하여 사용할 수 있을 것이다.
본 단계에서 사용된 '대장균내 타겟 유전자와 상동인 올리고뉴클레오타이드'는 λ-Red 리콤비네이즈를 이용한 리콤비니어링(recombineering)에 의해 전술한 tetA 유전자를 대장균내 타겟 유전자 사이에 통합(삽입)하는 역할을 한다.
상기 '대장균내 타겟 유전자'는 대장균의 지놈 엔지니어링을 위한 대상이 되는 유전자로서, LacZ 등을 들 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
tetA 유전자를 상기 타겟 유전자의 사이에 삽입하기 위해서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 타겟 유전자의 상류에 있는 서열과 상동인 제1 올리고뉴클레오타이드 및 타겟 유전자의 하류에 있는 서열과 상동인 제2 올리고뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 및 제2 올리고뉴클레오타이드의 염기서열은 지놈 엔지니어링을 위해 선택된 타겟 유전자의 염기서열에 따라 달라진다.
상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오타이드는 tetA 유전자의 양 말단에 연결될 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 올리고뉴클레오타이드는 tetA 유전자의 5' 말단에 연결되고, 제2 올리고뉴클레오타이드는 tetA 유전자의 3' 말단에 연결될 수 있다. 구체적으로, 제1 올리고뉴클레오타이드는 tetA 유전자의 5' 말단에 연결된 프라이머에 연결되고, 제2 올리고뉴클레오타이드는 tetA 유전자의 3' 말단에 연결될 수 있다.
LacZ에 상동인 올리고뉴클레오타이드를 P3-BCD2-tetA(P3-BCD2 프로모터가 tetA에 연결된 형태)에 연결하는 경우, 상기 P3-BCD2-tetA를 주형으로 적절한 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 LacZ 상동 올리고뉴클레오타이드, P3-BCD2 프로모터, tetA 유전자 및 LacZ 상동 올리고뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드를 수득할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 단계에 사용되는 폴리뉴클레오타이드는 5'에서 3' 방향으로 대장균내 타겟 유전자와 상동인 제1 올리고뉴클레오타이드, 프로모터, tetA 유전자 및 대장균내 타겟 유전자와 상동인 제2 올리고뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.
전술한 tetA 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 구조는 예를 들어 도 1b의 단계 1에서 확인될 수 있다.
<단계 2> tetA 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 지놈 내 타겟 유전자로의 통합
본 단계에서는 상기 단계 (1)에서 제조된 폴리뉴클레오타이드를 λ-Red 리콤비네이즈가 발현된 대장균에 도입시켜 상동 재조합에 의해 지놈 내 타겟 유전자에 통합시킨다.
상기 'λ-Red 리콤비네이즈가 발현된 대장균'은 종래 λ-Red 리콤비네이즈를 발현하는 것으로 알려진 대장균이거나, 야생형 대장균을 λ-Red 리콤비네이즈를 발현하는 플라스미드로 형질전환하여 수득된 대장균일 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 'λ-Red 리콤비네이즈가 발현된 대장균'은 야생형 대장균 MG1655를 pSIM5 플라스미드(Datta 등, Gene 379, 109-115 (2006b)로 형질전환하여 수득한 대장균일 수 있다.
상기 단계에서, 단계 (1)에서 제조된 폴리뉴클레오타이드는 형질전환방법 등에 의해 λ-Red 리콤비네이즈가 발현된 대장균에 도입될 수 있다. 상기 도입된 폴리뉴클레오타이드는 λ-Red 리콤비네이즈를 이용한 상동 재조합(또는 리콤비니어링)에 의해 지놈 내 타겟 유전자 내로 통합(삽입)된다.
예를 들어, 프로모터; tetA 유전자; 및 대장균내 타겟 유전자와 상동인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 형질전환방법에 의해 λ-Red 리콤비네이즈가 발현된 대장균에 도입되는 경우, 상기 폴리뉴클레오타이드는 대장균내 타겟 유전자와 상동인 올리고뉴클레오타이드로 인해 타겟 유전자의 사이에 삽입될 수 있다.
전술한 단계 2는 예를 들어 도 1b의 단계 2에서 확인될 수 있다.
<단계 3> 테트라사이클린 -내성 대장균의 1차 선별
본 단계에서는 상기 재조합된 대장균을 테트라사이클린을 함유하는 배지에서 배양함으로써 테트라사이클린-내성 대장균을 1차 선별한다.
상기 1차 선별을 위한 배지는 10 내지 500 μg/ml의 테트라사이클린이 함유된 대장균 배양용 배지, 예를 들면 LB 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
단계 (2)에서 tetA 유전자가 함유된 폴리뉴클레오타이드가 지놈 내에 삽입된 균주는 테트라사이클린 내성을 나타내므로, 본 단계 (3)에서 테트라사이클린 내성 배지에서 배양함으로써, tetA 유전자가 함유된 폴리뉴클레오타이드가 대장균 지놈 내에 삽입된 균주를 선별할 수 있다.
전술한 단계 3은 예를 들어 도 1b의 단계 3에서 확인될 수 있다.
<단계 4> tetA 유전자를 함유한 폴리뉴클레오타이드의 치환
본 단계에서는, 상기 선별된 대장균에 다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering; MAGE) 올리고뉴클레오타이드 또는 이종 유전자를 도입하여 상동 재조합에 의해 단계 (2)에서 통합된 폴리뉴클레오타이드를 치환한다.
상기 과정은 종래 널리 알려진 MAGE 방법에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, MAGE 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 대장균 지놈 내 LacZ 유전자에 삽입된 tetA 유전자를 치환하는 경우, 상기 제조된 균주는 LacZ를 야생형으로 회복할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 MAGE 올리고뉴클레오타이드를 사용한 예만이 개시되어 있으나, 본 기술분야의 숙련자라면 MAGE 올리고뉴클레오타이드 대신에 이종 유전자를 사용하여도 동일한 효과를 얻을 수 있음을 인식할 것이다.
전술한 단계 4는 예를 들어 도 1b의 단계 4에서 확인될 수 있다.
<단계 5> 니켈염에 대한 민감성을 이용한 대장균의 2차 선별
본 단계에서는, 상기 재조합된 대장균을 니켈염을 함유하는 배지에서 배양함으로써 니켈염에 대해 민감성을 나타내지 않는 대장균을 2차 선별한다.
상기 2차 선별을 위해 사용될 수 있는 배지는 니켈염이 20 내지 50 μM의 양, 바람직하게는 50 μM의 양으로 포함된 대장균 성장 배지, 예를 들면 M9 배지일 수 있다.
단계 (4)에서 tetA 유전자가 MAGE 올리고뉴클레오타이드 또는 이종 유전자로 치환된 균주의 경우, tetA 유전자가 제거되어 니켈염에 대해 민감성을 나타내지 않는다. 따라서, tetA가 제거된 균주는 니켈염을 포함하는 배지에서 잘 성장하게 되므로, 본 단계에서는 이를 바탕으로 니켈염에 대해 민감성을 나타내지 않는 지놈 엔지니어링된 균주를 2차 선별할 수 있다.
전술한 단계 5는 예를 들어 도 1b의 단계 5에서 확인될 수 있다.
본 발명은 종래 대장균의 지놈 엔지니어링 방법이 가지고 있는 단점인 불필요한 염기서열의 잔존이나 선별의 어려움을 보완할 수 있고, tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의해 보다 높은 효율로 지놈 엔지니어링된 대장균을 선별할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
참고예 : 세균 균주, 배양 배지 및 성장 조건
하기 실시예에서 사용된 균주 및 플라스미드를 하기 표 1에 나타내었으며, 프라이머 및 올리고뉴클레오티드를 표 2에 나타내었다.
명칭 특성 입수처 또는 참고문헌
균주 E.coli MG1655 야생형 Blattner 등 Science 277, 5331, 1453-1474 (1997)
MG-pSIM5
 pSIM5 플라스미드를 갖는
MG1655		 하기 실시예에서 제조
플라스미드 pSIM5 ori101 ori; Cmr, Redβ,γ,Exo Datta 등, Gene 379, 109-115 (2006b)
pBBR1MCS3 REP ori; tcr Michael 등, Gene 166, 175-176 (1995)
명칭 서열 서열번호
프라이머 tetA-P1-lacZ 5' F TATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG CAATTCTCATGTTTGACAGC 1
tetA-P4-lacZ 3' R ATGGATTTCCTTACGCGAAATACGGGCAGACATGGCCTGCCCGGTTATTAATTCCGGGGATCCGTCGACCTCAGGTCGAGGTGGCCCGGC 2
P3-BCD2-tetA-1 gctGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAAAAATTTATTTGCTTATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAGGGCCCAAGTTCACTTAAAAAGGAGATCAACAATGAAAGCAAT 3
P3-BCD2-tetA-2 gctGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGGAGATCAACAATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGCTAAGGAGGTTTTCTAatgaaatctaacaatgcgctcatc 4
LacZ 40-P1 aggtcgccagcggcaccgcgcctttcggcggtgaaattatgtgtaggctggagctgcttc 5
LacZ 0-P4 acgtagtgtgacgcgatcggcataaccaccacgctcatcgATTCCGGGGATCCGTCGACC 6
P4 R CTGTCAAACATGAGAATTAA 7
올리고
뉴클레오티드		 LacZ MAGE ccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgt 8
실시예 1: tetA 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 제작
tetA 유전자가 대장균의 지놈상에서 강한 발현을 보이도록 하기 위해, tetA 유전자의 5' 말단에 항시적으로 강한 발현을 보이는 P3-BCD2 프로모터를 연결하였다.
구체적으로, pBBR1MCS3 플라스미드를 주형으로 정방향 프라이머로서 tetA-P1-lacZ 5' F(서열번호:1) 및 역방향 프라이머로서 tetA-P4-lacZ 3' R(서열번호: 2)을 이용하여 PCR을 수행함으로써 1187 bp의 tetA 유전자를 증폭시켰다. 이후, P3-BCD2 프로모터를 연결하기 위해, 상기 증폭된 tetA 유전자를 주형으로 정방향 프라이머로서 P3-BCD2-tetA-1(서열번호: 3) 및 역방향 프라이머로서 P4 R(서열번호: 7)을 이용하여 PCR을 수행함으로써 일부의 프로모터를 연결하였다. 그리고 나서, 이를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머로서 P3-BCD2-tetA-2(서열번호: 4) 및 역방향 프라이머로서 P4 R(서열번호: 7)을 이용하여 PCR을 수행함으로써 P3-BCD2 프로모터가 연결된 tetA 유전자('P3-BCD2-tetA')를 수득하였다.
이후, 야생형 대장균 내 지놈으로의 삽입을 위해, 상기 P3-BCD2-tetA의 양 말단에 타겟 유전자인 LacZ 유전자와 상동인 단편을 연결하였다. 구체적으로, P3-BCD2-tetA를 주형으로 정방향 프라이머로서 LacZ40-P1(서열번호: 5) 및 역방향 프라이머로서 LacZ 0-P4(서열번호: 6)를 이용하여 PCR을 수행하여 LacZ 상동 올리고뉴클레오타이드, P3-BCD2 프로모터, tetA 유전자 및 LacZ 상동 올리고뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드를 수득하였다.
실시예 2: tetA 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 이용한 대장균의 형질전환 및 테트라사이클린 내성 대장균의 1차 선별
tetA 유전자를 대장균 지놈 내에 삽입하기 위해, λ-Red 리콤비네이즈(rebombinase)를 발현하는 대장균을 제조하였다. 구체적으로, 야생형 균주인 MG1655를 pSIM5 플라스미드로 형질전환하여 λ-Red 리콤비네이즈를 발현하는 MG-pSIM5 균주를 제조하였다.
이후, 상기 MG-pSIM5 균주를 실시예 1에서 제조된 폴리뉴클레오타이드로 형질전환하였다. 상기 형질전환된 균주를 100 μg/ml 농도의 테트라사이클린을 함유된 LB 고체 배지에서 배양하여 테트라사이클린 내성 균주를 1차 선별하였다.
실시예 3: 2차 선별을 위한 최적의 니켈염 농도의 결정
실시예 2에서 선별된 균주를 0, 10, 20, 50, 70 및 100 μM 농도의 니켈염(NiCl2) 및 0.2% 농도의 글루코스가 함유된 1X M9 액체 배지에서 각각 배양하였다. 대조군으로 야생형 MG1655 균주를 사용하여 동일한 조건에서 배양하였다. 상기 배양 동안 균주의 성장 속도를 TECAN을 이용하여 측정하였다.
상기 성장 속도 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, tetA 유전자가 함유된 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 균주(파랑) 는 20 μM 및 50 μM 농도의 니켈염이 함유된 배지에서 성장이 저해되어 니켈염 민감성을 나타낸 반면, 대조군인 야생형 대장균(빨강)은 니켈염 민감성을 나타내지 않았다. 또한, 선별된 균주 및 야생형 대장균은 70 μM 및 100 μM의 농도의 니켈염이 함유된 배지에서 모두 성장 저해를 나타내었다.
50 μM 농도의 니켈염에서 tetA 유전자를 포함하는 대장균과 야생형 대장균의 성장 차이가 확연히 구분되는 것에 기초하여, 차후 니켈염의 민감도를 이용한 2차 선별을 위한 최적의 니켈염 농도를 50 μM로 정하였다.
실시예 4: tetA 유전자의 치환 및 니켈염을 이용한 2차 선별
실시예 2에서 선별된 대장균에서 lacZ 유전자 내에 통합된 tetA 유전자를 제거하고 lacZ 유전자를 야생형으로 회복시키고자 다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering; MAGE) 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 MAGE를 수행하였다. MAGE는 2회의 연속 주기 동안 수행하였다(Wang et al., Nature 460, 894-898 (2009b)).
간략하게, 실시예 2에서 선별된 대장균을 LB-클로람페니콜 배지에서 30℃에서 밤새 성장시킨 다음, 상기 배양물을 3 ml의 새로운 LB 배지를 이용하여 1:100의 중량비로 희석하고 30℃에서 OD600이 0.5가 될 때까지 대장균을 성장시켰다. 이후, 상기 대장균을 42℃에서 15분간 배양하여 λ 단백질의 발현을 유도한 다음, 대장균을 즉시 냉각시켰다. 상기 배양액 1 mL을 4℃에서 원심분리하여 세포를 수거하고, 4℃의 멸균된 증류수를 이용하여 2회 세척한 후 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포로 만들었다. 상기 세포를 0.5 μM의 lacZ-MAGE 올리고뉴클레오타이드(서열번호: 8)로 형질전환시키고, MAGE를 위해 1 mL의 1/2 농도의 NaCl을 가진 LB 중에서 회수하였다. 세포를 다음 회차의 MAGE를 위해 새 LB에 재접종하거나 또는 목적 재조합체를 선별하기 전에 3시간 동안 생장시켰다. 생장시킨 세포를 1X M9 0.2% 글루코스 배지로 1:100의 중량비로 희석하고, 50 μM의 니켈염을 넣어 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 대조군으로 니켈염을 넣지 않고 배양한 균주를 사용하였다. 상기 배양된 세포를 X-gal/IPTG 플레이트 상에 도말한 후, 청색을 띠는 균주를 2차 선별하였다.
시험예 1: LacZ 유전자를 이용한 tetA 효율 측정
상기 실시예 1, 2 및 4의 과정을 통해 수행된 tetA 유전자의 이중선별 방법의 효율을 확인하였다.
실시예 4에서와 같이 lacZ-MAGE를 사용한 MAGE 방법을 수행하고 니켈염을 이용한 선별방법을 사용하여 이중 선별방법의 효율을 확인하였다. 니켈염을 이용한 선별 효율은, MAGE 실시 이후 대장균을 니켈염이 포함된 M9-최소배지에서 배양하고, 상기 배양된 대장균을 다시 X-gal+IPTG가 포함된 LB 고체배지에 배양하여 생성된 청색 콜로니의 비율을 계수함으로써 산출하였다. 대조군의 경우 대장균을 니켈염이 포함되지 않은 M9-최소배지에서 배양하는 것만 달리하여 실험하였다.
상기 실험 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 LacZ 0는 삽입(insertion)을 위해 만들어진 균주이고 LacZ 40은 치환(replacement)을 위해 만들어진 균주로서, LacZ 0-M9 및 LacZ 40-M9는 대조군으로서 유전자 회복을 위한 MAGE 이후 니켈이 함유되지 않은 M9-최소배지에서 성장한 균주를 가리키고, LacZ 0-Ni 및 LacZ 40-Ni는 MAGE 이후 니켈이 포함된 배지에서 성장한 균주를 가리킨다.
도 3에서 보는 바와 같이, 니켈염에 의해 선별되지 않은 경우 회복율이 5% 미만으로 매우 낮은 반면, 니켈염을 이용하여 선별할 경우 회복율이 각각 90% 및 60% 이상으로 매우 높은 것으로 나타났다.
상기 결과는, 본 발명의 방법을 통해 지놈 엔지니어링된 균주를 보다 효과적으로 선별할 수 있음을 보여준다.
<110> UNIST ACADEMY-INDUSTRY RESEARCH CORPORATION <120> Method for genome engineering of E. coli by dual selection using tetA gene <130> FPD201503-0041 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tetA-P1-lacZ 5' F <400> 1 tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca ggaaacagct gtgtaggctg 60 gagctgcttc gcaattctca tgtttgacag c 91 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tetA-P4-lacZ 3' R <400> 2 atggatttcc ttacgcgaaa tacgggcaga catggcctgc ccggttatta attccgggga 60 tccgtcgacc tcaggtcgag gtggcccggc 90 <210> 3 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3-BCD2-tetA-1 <400> 3 gctgtgtagg ctggagctgc ttcgaaaaaa tttatttgct tattaatcat ccggctcgta 60 taatgtgtgg agggcccaag ttcacttaaa aaggagatca acaatgaaag caat 114 <210> 4 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P3-BCD2-tetA-2 <400> 4 gctgtgtagg ctggagctgc ttcgaaggag atcaacaatg aaagcaattt tcgtactgaa 60 acatcttaat catgctaagg aggttttcta atgaaatcta acaatgcgct catc 114 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LacZ 40-P1 <400> 5 aggtcgccag cggcaccgcg cctttcggcg gtgaaattat gtgtaggctg gagctgcttc 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LacZ 0-P4 <400> 6 acgtagtgtg acgcgatcgg cataaccacc acgctcatcg attccgggga tccgtcgacc 60 60 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P4 R <400> 7 ctgtcaaaca tgagaattaa 20 <210> 8 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LacZ MAGE <400> 8 ccgcgccttt cggcggtgaa attatcgatg agcgtggtgg ttatgccgat cgcgtcacac 60 tacgtctgaa cgtcgaaaac ccgaaactgt 90

Claims (5)

  1. (1) 프로모터; tetA 유전자; 및 대장균내 타겟 유전자와 상동인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 제조된 폴리뉴클레오타이드를 λ-Red 리콤비네이즈가 발현된 대장균에 도입시켜 상동 재조합에 의해 지놈 내 타겟 유전자에 통합시키는 단계;
    (3) 상기 재조합된 대장균을 테트라사이클린이 함유된 배지에서 배양함으로써 테트라사이클린-내성 대장균을 1차 선별하는 단계;
    (4) 상기 선별된 대장균에 다중 자동화 지놈 엔지니어링(multiplex automated genome engineering; MAGE) 올리고뉴클레오타이드 또는 이종 유전자를 도입하여 상동 재조합에 의해 단계 (2)에서 통합된 폴리뉴클레오타이드를 치환하는 단계; 및
    (5) 상기 재조합된 대장균을 니켈염을 함유하는 배지에서 배양함으로써 니켈염에 대해 민감성을 나타내지 않는 대장균을 2차 선별하는 단계
    를 포함하며,
    상기 프로모터가 P3-BCD2 프로모터인 것을 특징으로 하는, 대장균의 지놈 엔지니어링 방법
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 대장균내 타겟 유전자와 상동인 올리고뉴클레오타이드가 타겟 유전자의 상류에 있는 서열과 상동인 제1 올리고뉴클레오타이드 및 타겟 유전자의 하류에 있는 서열과 상동인 제2 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)의 폴리뉴클레오타이드가 5'에서 3' 방향으로 대장균내 타겟 유전자와 상동인 제1 올리고뉴클레오타이드, 프로모터, tetA 유전자 및 대장균내 타겟 유전자와 상동인 제2 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (5)의 니켈염이 배지 내에 20 내지 50 μM의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020150044399A 2015-03-30 2015-03-30 tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법 KR102226714B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150044399A KR102226714B1 (ko) 2015-03-30 2015-03-30 tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150044399A KR102226714B1 (ko) 2015-03-30 2015-03-30 tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160116535A KR20160116535A (ko) 2016-10-10
KR102226714B1 true KR102226714B1 (ko) 2021-03-11

Family

ID=57146048

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150044399A KR102226714B1 (ko) 2015-03-30 2015-03-30 tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102226714B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109385417A (zh) * 2017-08-03 2019-02-26 华东理工大学 体内dna无缝组装方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040092016A1 (en) 2000-08-14 2004-05-13 The Govt. Of The Usa As The Secretary Of The Dept. Of Health And Human Services Enhanced homologous recombination mediated by lambda recombination proteins

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101804145B1 (ko) * 2013-08-14 2017-12-04 울산과학기술원 대장균의 지놈 엔지니어링용 플라스미드 및 이를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040092016A1 (en) 2000-08-14 2004-05-13 The Govt. Of The Usa As The Secretary Of The Dept. Of Health And Human Services Enhanced homologous recombination mediated by lambda recombination proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEMS Microbiology letters, (2000), Vol.190, pp147-150.*
Nucleic Acids Research, (epub 2015.03), Vol. 43, No. 13, e83.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160116535A (ko) 2016-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240093241A1 (en) Crispr enabled multiplexed genome engineering
JP6473510B2 (ja) ビブリオで汎用される遺伝子ノックアウト用の自殺ベクターおよびその利用
CN108277231B (zh) 一种用于棒状杆菌基因组编辑的crispr系统
Ishikawa et al. A new simple method for introducing an unmarked mutation into a large gene of non-competent Gram-negative bacteria by FLP/FRT recombination
WO2019185751A1 (en) Inhibitors of crispr-cas associated activity
WO2015196430A1 (en) Expression of polypeptides involved in lysine decarboxylation, and methods and applications thereof
CN109554323B (zh) 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用
JP6754697B2 (ja) セントロメアｄｎａ配列を含むベクター及びその用途
KR102226714B1 (ko) tetA 유전자를 이용한 이중선별에 의한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법
CN109929788A (zh) 一种具有ccdB负筛作用的菌株及其构建方法
KR101765255B1 (ko) rnpA 유전자 발현감소를 통한 재조합단백질의 제조방법
Huo et al. Identifying amino acid overproducers using rare-codon-rich markers
WO2023076952A1 (en) Enzymes with hepn domains
KR101804145B1 (ko) 대장균의 지놈 엔지니어링용 플라스미드 및 이를 이용한 대장균의 지놈 엔지니어링 방법
JP3845697B2 (ja) 放射線抵抗性細菌／大腸菌シャトルベクター
JP6944697B2 (ja) 糸状菌におけるゲノム編集を用いる多段階による多重変異株の製造方法
JP4777969B2 (ja) ２種の染色体外エレメントを使用することによる原核細胞中での組換え遺伝子の生成
RU2018147085A (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANG или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANGPT1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-FGF1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HGF или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SDF1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-KLK4 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PDGFC или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK2, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
Gerlach et al. Site-directed mutagenesis using oligonucleotide-based recombineering
KR101970471B1 (ko) Ｃｔｘ 파지에 감염되고 콜레라 독소를 생산할 수 있는 비브리오 콜레라 균주
WO2023156585A1 (en) Systems, tools, and methods for engineering bacteria
KR20180055217A (ko) 목적단백질 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 균주 및 이의 제조방법
RU2018147083A (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген Cas9 для гетерологичной экспрессии этого целевого гена в клетках человека и животных при реализации различных методов геномного редактирования, способ получения и применения генотерапевтического ДНК-вектора, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-Cas9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
JP2005229950A (ja) 環状ｄｎａの増幅方法
KR101898973B1 (ko) 플라스미드 기반의 비브리오 콜레라 ｃｔｘ 파지 복제시스템

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right