CN110283767A - 一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法 - Google Patents
一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法。属于生物技术工程领域，具体涉及利用λ‑Red重组酶方法，对编码大肠杆菌趋氧性受体基因aer进行敲除，使之丧失趋氧性，构建一个大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失菌株模型。用于研究细菌的侵染过程，治理病害；为治理环境污染，净化污水提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于生物技术工程领域，具体涉及通过大肠杆菌aer基因被敲除而丧失趋氧受体基因，致使该菌丧失对氧气的趋化性功能。
背景技术
趋化性是细菌调控对外界环境做出适应性反应的感受系统之一，有运动能力的细菌对浓度不同的化学物质做出反应，使之趋向有利的环境，或逃避有害与不利的环境。趋氧性(或者能量趋性)是趋化性的一种，是一种能引导细菌自动定位并移动于某处，从而使它们可以达到最佳胞内氧水平。这种趋氧性是通过呼吸链完成的，由此可见趋氧性传感器对各类细菌的生命活动极为重要。运动型细菌大多具有这种趋氧性，并且趋氧性在细菌的生命周期中具有重要的生物学功能。大肠杆菌中编码趋氧性受体基因是aer。研究细菌的趋化性，构建大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失模型，对研究控制细菌的侵染过程，治理病害；治理环境污染，净化污水；以及研究治疗癌症等疾病都有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株，利用λ-Red重组酶方法，对编码大肠杆菌趋氧性受体基因aer进行敲除，使之丧失趋氧性，构建一个大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失菌株模型。用于研究细菌的侵染过程，治理病害；为治理环境污染，净化污水提供理论依据。
本发明的另一目的是提供制备上述大肠杆菌菌株的方法。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株的制备方法，包括以下步骤：
(1)设计引物：
用于同源重组的引物为Aer-tet-R和Aer-tet-F；设计原则是5'端为aer基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列(加下划线)，重组体的检测所用引物为JC-Aer-R及JC-Aer-F，这些引物的序列如下所示：
Aer-tet-R:ATCAGGCATTGTGCTCCAACCGCCCGGATCCGGCATACCGACTAAGCA CTTGTCTCCTG；
Aer-tet-F:CAAGAAGTTAACAACCATATAACCTGCACAGGACGCGAACTTAAGACC CACTTTCACA；
JC-Aer-R:AAGATGCGCCAGCATCGC；
JC-Aer-F:GGCCGACATAAACTCTGA；
(2)含tetRA基因的DNA片段的扩增：
以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac(Tet+，Kan+，购自武汉淼灵生物科技有限公司)的DNA为模板，Aer-tet-R和Aer-tet-F为引物进行PCR扩增，获得两端分别与aer基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetRA的DNA片段。将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化。
(3)感受态细胞的制备：
将含有pKD46质粒的MG1655菌株在含有20μg/mL Amp的LB培养基中30℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20μg/mL Amp的LB中30℃下震荡培养，当OD600达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用。
(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定
将胶回收的DNA片段(100ng)与80μL感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10min后，用2200V电击，电击后迅速加入1000μL LB培养液，30℃下震荡培养30min后在20μg/mL的四环素平板上涂板，37℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用JC-Aer-R及JC-Aer-F引物对这些菌落进行菌落PCR鉴定，有四环素抗性基因tetRA的DNA片段的菌落即为大肠杆菌基因aer敲除的菌株。
获得大肠杆菌趋氧受体基因aer敲除菌株，还可以通过部分敲除aer基因或在aer基因中插入外源DNA片段来实现。部分敲除aer基因引物设计原则是先确定要敲除的序列，引物的5'端为待敲除序列相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列；插入外源DNA序列使aer基因失活的引物设计原则是先确定插入外源DNA的位置，引物的5'端为待插入位置相邻的同源区，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列。用来敲除、替换或插入的基因片段，出来可以选用四环素抗性基因tetRA的DNA片段外，还可以选择其它抗性基因片段，如氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、甲氧西林抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因等抗性基因；或者其它便于筛选的标记基因如绿色/红色荧光蛋白基因等。
第二方面，提供上述制备方法获得的趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株。
本发明相对于现有技术的优势在于：
构建大肠杆菌趋氧受体基因aer功能丧失模型，用于研究细菌的侵染过程，治理病害；为治理环境污染，净化污水提供理论依据。
附图说明
图1PCR产物切胶回收电泳检测；
M：DL2000DNA标样；1：四环素抗性基因胶回收产物。
图2菌落PCR鉴定图；
M：DL2000DNA标样；1-4：实验组；5对照。
图3A为MG1655菌株在泳动培养基上培养结果；
图3B为aer基因缺失突变株在泳动培养基上培养结果；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】利用λ-Red重组酶方法对编码大肠杆菌趋氧受体基因aer进行敲除(1)设计引物：
用于同源重组的引物为Aer-tet-R和Aer-tet-F，设计原则是5'端为aer基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列(加下划线)，重组体的检测所用引物为JC-Aer-R及JC-Aer-F。这些引物的序列如表1所示，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1本发明所用的引物
(2)含tetRA基因的DNA片段的扩增：
以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac的DNA为模板，Aer-tet-R和Aer-tet-F为引物进行PCR扩增，获得两端分别与aer基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetRA的DNA片段。将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化，如图1所示。
(3)感受态细胞的制备：
将含有pKD46质粒的MG1655菌株在含有20μg/mL Amp的LB培养基中30℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20μg/mL Amp的LB中30℃下震荡培养，当OD600达到0.6时加入0.2％的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用。
(4)电转及目的菌株的筛选与鉴定
将胶回收的DNA片段(100ng)与80μL感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10min后，用2200V电击，电击后迅速加入1000μL LB培养液，30℃下震荡培养30min后在20μg/mL的四环素平板上涂板，37℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用JC-Aer-R及JC-Aer-F引物对这些菌落进行菌落PCR鉴定，有四环素抗性基因tetRA的DNA片段的菌落即为大肠杆菌基因aer敲除的基因增变菌株，如图2所示。
【实施例2】大肠杆菌MG1655aer基因缺失突变株泳动检测
配制泳动培养基：称取NaCl 5g，胰蛋白胨5g，琼脂粉2g，加蒸馏水1L，121℃灭菌20min，倒平板，待琼脂完全凝固后使用。
分别挑取野生型MG1655和【实施例1】经过JC-Aer-R及JC-Aer-F引物PCR鉴定的aer基因敲除菌株在LB培养基平板上划线于37℃过夜培养，用灭菌的牙签挑去单菌落用穿刺方法接种在泳动培养基中，然后在30℃培养16h后，观察菌落的生长状况，如图3所示，图3A为野生型大肠杆菌MG1655在泳动培养基上生长的结果，菌落从接种点向四周生长，同时在培养基表面有菌落生长，这是由于培养基表面氧气含量高，趋氧受体基因作用的结果；图3B为敲除趋氧性受体基因aer的菌种在泳动培养基上生长菌落形态，可以看出细菌可以向四周扩散生长，但没有向培养基表面生长的趋势，菌落主要分布在培养基内部，而且生长扩散的速度比野生型菌株有所减缓。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 武汉生物工程学院
<120> 一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株及制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcaggcatt gtgctccaac cgcccggatc cggcataccg actaagcact tgtctcctg 59
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caagaagtta acaaccatat aacctgcaca ggacgcgaac ttaagaccca ctttcaca 58
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagatgcgcc agcatcgc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggccgacata aactctga 18
Claims (2)
1.一种趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）设计引物：
用于同源重组的引物为Aer-tet-R和Aer-tet-F; 设计原则是5'端为aer基因的同源区(未加下划线)，3'端为四环素抗性基因tetRA的同源序列（加下划线），重组体的检测所用引物为JC-Aer-R及JC-Aer-F，这些引物的序列如下所示：
Aer-tet-R:ATCAGGCATTGTGCTCCAACCGCCCGGATCCGGCATACCGACTAAGCACTTGTCTCCTG；
Aer-tet-F:CAAGAAGTTAACAACCATATAACCTGCACAGGACGCGAACTTAAGACCCACTTTCACA；
JC-Aer-R:AAGATGCGCCAGCATCGC；
JC-Aer-F:GGCCGACATAAACTCTGA；
（2）含tetRA基因的DNA片段的扩增：
以含有四环素抗性基因的大肠杆菌DH10Bac（Tet+，Kan+，购自武汉淼灵生物科技有限公司）的DNA为模板，Aer-tet-R和Aer-tet-F为引物进行PCR扩增，获得两端分别与aer基因上、下游同源，中间为四环素抗性基因tetRA的DNA片段，将该片段进行琼脂糖凝胶回收，以用于下一步电转化；
（3）感受态细胞的制备：
将含有pKD46质粒的MG1655菌株在含有20 µg/mL Amp的LB培养基中30 ℃下过夜培养，之后以1:100的比例接种到含20 µg/mL Amp的LB中30 ℃下震荡培养，当OD600 达到0.6时加入0.2%的阿拉伯糖进行诱导，4小时后4 ℃下收集细胞，用1/2体积预冷的无菌去离子水洗2次，并浓缩为原体积的1/40，作为感受态细胞备用；
（4）电转及目的菌株的筛选与鉴定
将胶回收的DNA片段（100 ng）与80 µL感受态细胞在电转杯中混合，冰浴5-10 min后，用2200V 电击，电击后迅速加入1000 µL LB培养液，30 ℃下震荡培养30 min后在 20 µg/mL的四环素平板上涂板，37 ℃下过夜培养，平板上长出的菌落为抗四环素的菌落，对其进一步在四环素平板上划线纯化，并用 JC-Aer-R及JC-Aer-F引物对这些菌落进行菌落PCR鉴定，有四环素抗性基因tetRA的DNA片段的菌落即为大肠杆菌基因aer敲除的菌株。
2.一种权利要求1所述的制备方法获得的趋氧受体基因aer功能丧失的大肠杆菌菌株。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107858317A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-03-30 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种防控水产养殖动物气单胞菌出血病的减毒活疫苗 |
| CN109554323A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-04-02 | 武汉生物工程学院 | 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用 |
-
2019
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107858317A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-03-30 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种防控水产养殖动物气单胞菌出血病的减毒活疫苗 |
| CN109554323A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-04-02 | 武汉生物工程学院 | 一种大肠杆菌dnaQ基因校正功能丧失的基因增变菌株及制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SERGEI I. BIBIKOV: "A Signal Transducer for Aerotaxis in Escherichia coli", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 * |
| SHELLEY M. HORNE等: "An Escherichia coli aer mutant exhibits a reduced ability to colonize the streptomycin-treated mouse large intestine", 《ANTONIE VAN LEEUWENHOEK INTERNATIONAL JOURNAL OF GENERAL AND MOLECULAR MICROBIOLOGY》 * |
| 燕红等: "《微生物资源及利用》", 31 May 2012, 哈尔滨工程大学出版社 * |
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