CN104962575B - 牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，本发明涉及口腔医学领域。所述方法包括如下步骤：扩增牙龈卟啉单胞菌RgpA基因的上、下游同源臂；扩增红霉素抗性基因片段；构建两端为所述RgpA基因的上、下游同源臂，中间为红霉素抗性基因片段的同源重组片段；将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，进行同源重组，采用红霉素抗性平板筛选，获得牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株。本发明牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，操作简便灵活，无需繁琐的酶切连接和筛选，对突变位点的选择无特异性要求，重组效率高。

Description

牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法

技术领域

本发明涉及口腔医学领域，具体涉及牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法。

背景技术

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，缩写为P.g)是一种非酵解糖的革兰氏阴性厌氧球杆菌，是研究广泛且证据充足的重要牙周致病菌之一。国外有学者研究发现37％的0～18岁个体中均可检测到P.g。牙龈素(Gingipains)是P.g在细胞内合成并分泌到细胞外的一种胰蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶,在其致病性中起着重要作用。它包括具有与赖氨酸残基特异结合活性的牙龈素蛋白酶K(gingipainK,Kgp)和与精氨酸残基特异结合活性的牙龈素蛋白酶R(gingipainR,Rgp)。其中,Rgp包括RgpA和RgpB两种存在形式。为了研究牙龈卟啉单胞菌的致病机制、寻找治疗方法，需要研究上述蛋白酶的相关功能。通常采用敲除目的基因的方法，来研究牙龈蛋白酶的功能。但是，采用常规方法敲除牙龈蛋白酶，需要进行大量的筛选工作，工作效率较低。

发明内容

本发明的目的是提供牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，该方法简单高效。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，包括如下步骤：

(1)扩增牙龈卟啉单胞菌RgpA基因的上、下游同源臂；

(2)扩增红霉素抗性基因片段；

(3)构建两端为所述RgpA基因的上、下游同源臂，中间为红霉素抗性基因片段的同源重组片段；

(4)将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，进行同源重组，采用红霉素抗性平板筛选，获得牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株。

在本发明中，所述上游同源臂的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游同源臂的序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明中，步骤(4)中采用电转化方法将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，电击条件为：电压为2.5kV、电击时间为5ms。

在本发明中，以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以upF和upR为引物，扩增RgpA基因的上游同源臂；以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以downF和downR为引物，扩增RgpA基因的下游同源臂；所述upF的序列为：ccgaattcGGATACGGGTTCGTCTATGTAGCGGCGGAAAAATGC：所述upR的序列为：CGGAAGCTATCGGGGGTACCGTTTTTCATTTTGATG所述downF的序列为：CTAGAGTCGACCTGCAGTTCTGTCTTGGACTCGGAG所述downR的序列为：aaggatccTATCTATCTCATGCCGGAGGCGGAAGGTGGTAACTC。

有益效果：本发明牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，操作简便灵活，无需繁琐的酶切连接和筛选，对突变位点的选择无特异性要求，重组效率高。

附图说明

图1.制备牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株，原理图,WT：野生型P.g。RgpA-：RgpA基因突变型P.g。PGN_1969和PGN_19671分别为RgpA基因的上、下游基因。

图2.牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株构建过程中的电泳图。(A)P.g基因组和抗性基因的扩增电泳图，其中泳道1,2：上游同源臂(1kb)；3,4：抗性基因erm(2.2kb)；5,6：下游同源臂(1kb)。(B)重组片段up_erm_down的构建电泳图，1,2：overlap PCR的产物up_erm_down(4.3kb)。(C)质粒pPHU281_up_erm_down的酶切验证电泳图。1：质粒的EcoRⅠ酶切产物(6.9kb，4.3kb)；2：质粒的SacⅠ酶切产物(11.2kb)。(D)RgpA基因敲除突变株的正向验证电泳图，其中1-4:突变株；5:野生株；6：质粒pPHU281_up_erm_down(阳性对照)。(E)RgpA基因敲除突变株的反向验证电泳图，1-4:突变株；5:野生株；6.质粒pPHU281_up_erm_down(阳性对照)。

图3.含有红霉素的哥伦比亚血琼脂平板培养照片。

具体实施方式

采用下面的方法制备牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株，原理如图1所示。

1.质粒pPHU281_up_erm_down的制备

(1)RgpA基因上、下游同源臂的扩增和纯化

选择RgpA基因编码区起始密码子开始向上游818bp的序列作为上游同源臂(序列如SEQ ID NO:1所示)，RgpA编码区终止密码子开始向下游686bp的序列作为下游同源臂(序列如SEQ ID NO:2所示)。

根据P.gATCC33277株(野生株)的RgpA基因序列(GenBank:6330747)，使用Oligo6软件设计扩增RgpA基因上、下游同源臂的引物，使用BLAST对引物进行同源性分析后，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

其中，扩增上游同源臂的引物包括upF和upR，具体序列如下：

upF(SEQ ID NO:3)：ccgaattcGGATACGGGTTCGTCTATGTAGCGGCGGAAAAATGC，

upR(SEQ ID NO:4)：CGGAAGCTATCGGGGGTACCGTTTTTCATTTTGATG。

以P.gATCC33277株基因组DNA为模板，以upF、upR为引物扩增，扩增RgpA基因上游同源臂。PCR体系(相关试剂购自thermo，USA)如下：

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，35cylce；72℃10min。

产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并回收上游同源臂片段up，大小约为1.1kb。

下游同源臂的扩增引物为downF和downR。仅改变引物，采用上述相同反应体系和反应条件扩增下游同源臂。扩增引物的具体序列如下：

downF(SEQ ID NO:7)：CTAGAGTCGACCTGCAGTTCTGTCTTGGACTCGGAG，

downR(SEQ ID NO:8)：aaggatccTATCTATCTCATGCCGGAGGCGGAAGGTGGTAACTC。产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并回收上游同源臂片段down，大小约为1kb。RgpA基因上、下游同源臂PCR扩增产物电泳图如图2(A)所示。

(2)ermF-ermAM抗性基因的扩增和纯化

根据质粒pVA2198(Hansel M.fletcher,Harveya.Schenkein,RoderickM.Morgan,et al.Virulence of a Porphyromonas gingivalis W83mutant defective inthe prtH gene.Infection and immunity.1995,63:1521-1528.)上ermF-ermAM基因(红霉素抗性基因，GenBank:AF219231.1)序列，使用Oligo6软件设计引物ermF和ermR，以质粒pVA2198为模板，扩增ermF-ermAM抗性基因。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

其中，ermF和ermR的序列如下：

ermF序列(SEQ ID NO:5)：CATCAAAATGAAAAACGGTACCCCCGATAGCTTCCG，

ermR序列(SEQ ID NO:6)：CTCCGAGTCCAAGACAGAACTGCAGGTCGACTCTAG。

PCR反应体系参照标题(1)中,不同之处在于模板为质粒pVA2198，引物为ermF和ermR。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃4min30s，35cylce；72℃10min。产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2(A)所示，回收目的条带中的产物，获得ermF-ermAM抗性基因片段(记为erm，2.2kb)

(3)overlap PCR扩增同源重组片段

①重叠延伸反应

该反应中片段up、erm、down的摩尔数比为1:1:1，三条片段互为模板和引物，延伸获得长度为4.3kb的同源重组片段。

反应体系如下：

反应程序：94℃5min预变性；94℃30s，60℃30s，72℃4min，8个循环；72℃延伸10min。

②扩增反应

在重叠延伸反应产物(25μl)中加入外侧引物upF(10μM，带有EcoR I位点)和downR(10μM，带有BamH I位点)各1.5ul，立即开始扩增反应，除循环数设置为30个循环，余PCR反应程序同重叠延伸反应。最终获得同源重组片段A(SEQ ID NO:9)，记为up_erm_down。同源重组片段A自5’至3’端依次为上游同源臂up、ermF-ermAM抗性基因片段erm和下游同源臂down。PCR产物采用2％凝胶电泳检测，结果如图2(B)。所示。回收目的条带。

(4)质粒pGT_up_erm_dowm的构建及鉴定

对上述获得的长片段up_erm_down两端进行加A反应，反应产物与pGEM-T-EasyVector(购自Promega)以摩尔数3:1的比例加入到反应缓冲液中，充分混匀，4℃过夜连接。将连接产物转化于大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆，阳性质粒送至南京金斯瑞南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果与GenBank序列进行同源性比对分析，与参考序列一致，质粒命名为pGT_up_erm_dowm。

(1)质粒pPHU281_up_erm_down的构建及鉴定

质粒pGT_up_erm_dowm和pPHU281(Hübner,P.,B.Masepohl,W.Klipp,et al..nifgene expression studies in Rhodobacter capsulatus:ntrC-independent repressionby high ammonium concentrations.Mol.Microbiol.1993,10:123–132)同时用限制性内切酶EcoRⅠ酶切，将获得的目的片段up_erm_down连接到线性化的pPHU281载体上，转化连接产物于大肠杆菌DH-5α，用红霉素抗性LB平板培养基(含有300μg/ml红霉素)筛选阳性克隆，阳性质粒经EcoRⅠ和SacⅠ酶切后电泳鉴定，结果如图2(C)所示。经测序，与GeneBank中序列进行同源性分析，与参考序列一致。该阳性质粒命名为pPHU281_up_erm_down。

2.P.gRgpA基因敲除突变菌的构建

(1)供体DNA片段的大量制备和纯化

兼顾Pfu酶的扩增效率和细菌同源重组对同源臂长度的要求，我们以upF’(SEQ IDNO:10)和downR’(SEQ ID NO:11)为引物，以质粒pPHU281_up_erm_down为模板，采用ThermoScientific Pfu DNApolymerase(高保真酶，USA)，PCR扩增获得同源重组片段A第316位至3996位的核苷酸，得到3.7kb的同源重组片段B。酚-氯仿抽提法纯化同源重组片段B。真空干燥，溶于适量的ddH₂O，作为电转化的供体片段。

其中，upF’序列(SEQ ID NO:10)：GTGTGGCGCATCAGATATATTTTCATC，downR’序列(SEQ ID NO:11)GGACAAGCCTATGGGTCGAGGACATAAG。

(2)供体DNA片段的电转化：将平板上P.g接种于10ml TSB液体培养基(购自Oxoid，UK)中，厌氧环境下37℃过夜培养。取过夜培养的菌液加入到新鲜配制的100ml TSB液体培养基中，调整OD₅₅₀至0.1，继续培养至OD₅₅₀达0.55-0.65。将菌体培养液在4℃、3000g条件下离心10min，弃上清，在菌沉淀中加入100ml电穿孔缓冲液EP buffer(含有质量百分浓度为10％的甘油和1mM MgCl₂的水溶液，过滤除菌，4℃预冷)，洗涤，离心后，50ml EP buffer重复洗涤，采用常规方法制备感受态细胞，最后采用1ml的EP buffer重悬感受态细胞沉淀。将100ul感受态细胞悬液和2μg供体DNA片段共同加入到一个无菌电击杯中，电击参数为：电压2.5kV、电击时间5ms(ms为毫秒)，电击后立即将电击杯中悬液加入到1.0ml预保温的TSB液体培养基中，厌氧环境下37℃培养16h，取300ul菌液接种于添加有红霉素(10μg/ml)的哥伦比亚血琼脂平板。哥伦比亚血琼脂平板的配制方法如下：取哥伦比亚血琼脂(OXOID，UK)38g，氯化血红素(阿拉丁，上海)5mg，脱纤维羊血50mL，维生素K 0.5mg，加入1000mL水，灭菌后得到。

(3)突变株的筛选和鉴定

转化菌在厌氧环境下培养7d后，添加有红霉素的哥伦比亚血琼脂平板上可见黑色、半球形菌落生长(如图3)，选取单菌落划板增菌，提取细菌基因组DNA。以引物upF’(序列同上)和ermR(序列同上)扩增含有erm基因的部分重组片段进行正向验证；以RgpAF(SEQ IDNO:12)和RgpAR(SEQ ID NO:13)为引物特异性扩增RgpA基因编码区长度为1.6kb的一段序列，进行反向验证。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测目标片段。

其中，正向验证的反应体系(试剂购自takara)如下：

正向验证的反应条件如下：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃3min，30cylce；72℃10min。PCR扩增结果如图2(D)，产物片段长度约3kb，以质粒pPHU281_up_erm_down为模板作为阳性对照组，同样获得长度约3kb的产物；以P.gATCC33277的基因组DNA为模板作为阴性对照组，未见特异性扩增条带。

反向验证：RgpAF序列(SEQ ID NO:12)：TCCACTCAGCAATCGGTGAC，RgpA R序列(SEQID NO:13)：CGAGCATCTTCTCACCATCC。

反向验证PCR体系如下：

反向验证PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，30cylce；72℃10min。

以RgpAF和RgpAR对突变株和野生株基因组DNA进行反向验证，如图2(E)阴性对照野生菌扩增出目的产物，而以突变株和质粒pPHU281_up_erm_down为模板，未见特异性扩增条带，表明在抗性培养基上长出的菌落为RgpA基因敲除突变株。

采用相同方法将pPHU281_up_erm_down转化入P.g，筛选过程中出现较多假阳性，即在含有红霉素的哥伦比亚血琼脂平板上生长的菌落有一部分是未发生基因重组的，从而降低了突变菌的筛选效率。与转化质粒pPHU281_up_erm_down相比，转化片段up_erm_down的优势在于(1)片段的分子质量小，电击过程更易透过细菌感受态细胞的细胞膜进入胞质，转化效率高；(2)在含有红霉素的哥伦比亚血琼脂平板上生长的菌落几乎均为突变菌，筛选效率高；(3)不存在回复突变株，稳定性好。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京大学

<120> 牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法

<130> 20150624

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 816

<212> DNA

<213> P.g

<400> 1

gtgtggcgca tcagatatat tttcatcagt ggattattag ggtatcggtc agaaaaagcc 60

ttccgaatcc gacaaagata gtagaaagag agtgcatctg aaaacagatc attcgaggat 120

tatcgatcaa ctgaaaaggc aggagttgtt ttgcgttttg gttcggaaaa ttacctgatc 180

agcattcgta aaaacgtggc gcgagaattt tttcgttttg gcgcgagaat taaaaatttt 240

tggaaccaca gcgaaaaaaa tctcgcgccg ttttctcagg atttacagac cacaatccga 300

gcattttcgg ttcgtaattc atcgaagaga caggttttac cgcattgaaa tcagagagag 360

aatatccgta gtccaacggt tcatccttat atcagaggtt aaaagatatg gtacgctcat 420

cgaggagctg attggcttag taggtgagac tttcttaaga gacctatcgg cacctacagg 480

aagttcatgg cacacaaggc aaaggaggca atcttcgcag accggactca tatcaaaagg 540

atgaaacgac ttttccatac gacaaccaaa tagccgtcta cggtagacga atgcaaaccc 600

aatatgaggc catcaatcaa tccgaatgac agcttttggg caatatatta tgcatatttt 660

gattcgcgtt taaaggaaaa gtgcatatat ttgcgattgt ggtatttctt tcggtttcta 720

tgtgaatttt gtctcccaag aagactttat aatgcataaa tacagaaggg gtactacaca 780

gtaaaatcat attctaattt catcaaaatg aaaaac 816

<210> 2

<211> 686

<212> DNA

<213> P.g

<400> 2

ttctgtcttg gactcggaga ctttgtgcag acacttttaa tataggtctg taattgtctc 60

agagtatgaa tcgatcgccc gacctccttt taaggaagtc gggcgacttc gtttttatgc 120

ctattattct aatatacttc tgaaacaatt tgttccaaaa agttgcatga aaagattatc 180

ttactatctt tgcactgcaa aaggggagtt tcctaaggtt ttccccggag tagtacggta 240

ataacggtgt ggtagttcag ctggttagaa tacctgcctg tcacgcaggg ggtcgcgggt 300

tcgagtcccg tccataccgc taaaataagg agttgtgttg aaatagtttt tcggcacagc 360

tccatttttg tatgttatcg cagcaccgga aagtataatt gccggatgag attattcaat 420

atgctcggaa gattttctta gaacgaagca gaagtgtttg tctttattac gatctgcttg 480

ggacataggg attaaattag tattattgca ggagggacgg tacatggagt cgcccggcca 540

atcagatgaa gaaagaagaa ctacgattga tttttatggg aacggccgat tttgctgttc 600

cggcactccg agctttggtc gaaaacggat accaagtaaa agctgtggtc actatgccgg 660

acaagcctat gggtcgagga cataag 686

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> upF

<400> 3

ccgaattcgg atacgggttc gtctatgtag cggcggaaaa atgc 44

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> upR

<400> 4

cggaagctat cgggggtacc gtttttcatt ttgatg 36

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> ermF

<400> 5

catcaaaatg aaaaacggta cccccgatag cttccg 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> ermR

<400> 6

ctccgagtcc aagacagaac tgcaggtcga ctctag 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> downF

<400> 7

ctagagtcga cctgcagttc tgtcttggac tcggag 36

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> down R

<400> 8

aaggatccta tctatctcat gccggaggcg gaaggtggta actc 44

<210> 9

<211> 4305

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> 重组片段A

<400> 9

ccgaattcgg atacgggttc gtctatgtag cggcggaaaa atgcttctat gtctgtcgtg 60

tccagaattt cttcccaggg tttgccttcc cagtcgccga agttcatctc cttcagccgg 120

tcgtctcgga tggcatcggg atagccgcaa aaggccgcca acttggccgc acgctgcaga 180

gggctggtaa agaccgcctc gggatcgagg cctttgagac gggcacaagc cgccgcagcc 240

tcctcttcga aggtgtctcg aacgtccaca tcggtgaatc cgtagcagtg ctcattgcca 300

ttgagcagca ccgaggtgtg gcgcatcaga tatattttca tcagtggatt attagggtat 360

cggtcagaaa aagccttccg aatccgacaa agatagtaga aagagagtgc atctgaaaac 420

agatcattcg aggattatcg atcaactgaa aaggcaggag ttgttttgcg ttttggttcg 480

gaaaattacc tgatcagcat tcgtaaaaac gtggcgcgag aattttttcg ttttggcgcg 540

agaattaaaa atttttggaa ccacagcgaa aaaaatctcg cgccgttttc tcaggattta 600

cagaccacaa tccgagcatt ttcggttcgt aattcatcga agagacaggt tttaccgcat 660

tgaaatcaga gagagaatat ccgtagtcca acggttcatc cttatatcag aggttaaaag 720

atatggtacg ctcatcgagg agctgattgg cttagtaggt gagactttct taagagacct 780

atcggcacct acaggaagtt catggcacac aaggcaaagg aggcaatctt cgcagaccgg 840

actcatatca aaaggatgaa acgacttttc catacgacaa ccaaatagcc gtctacggta 900

gacgaatgca aacccaatat gaggccatca atcaatccga atgacagctt ttgggcaata 960

tattatgcat attttgattc gcgtttaaag gaaaagtgca tatatttgcg attgtggtat 1020

ttctttcggt ttctatgtga attttgtctc ccaagaagac tttataatgc ataaatacag 1080

aaggggtact acacagtaaa atcatattct aatttcatca aaatgaaaaa cggtaccccc 1140

gatagcttcc gctattgctt ttttgctcat cggtatttgc aacatcatag aaattgcata 1200

cctttgttcc tcggttatat gtttgctcat ctgcaacttt tttttctttg gacggacaat 1260

taaagcaaag atagcaaact ttatccattc agagtgagag aaagggggac attgtctctc 1320

tttcctctct gaaaaataaa tgtttttatt gcttattatc cgcacccaaa aagttgcatt 1380

tataagttga actcaagaag tattcacctg taagaagtta ctaatgacaa aaaagaaatt 1440

gcccgttcgt tttacgggtc agcactttac tattgataaa gtgctaataa aagatgcaat 1500

aagacaagca aatataagta atcaggatac ggttttagat attggggcag gcaaggggtt 1560

tcttactgtt catttattaa aaatcgccaa caatgttgtt gctattgaaa acgacacagc 1620

tttggttgaa catttacgaa aattattttc tgatgcccga aatgttcaag ttgtcggttg 1680

tgattttagg aattttgcag ttccgaaatt tcctttcaaa gtggtgtcaa atattcctta 1740

tggcattact tccgatattt tcaaaatcct gatgtttgag agtcttggaa attttctggg 1800

aggttccatt gtccttcaat tagaacctac acaaaagtta ttttcgagga agctttacaa 1860

tccatatacc gttttctatc atactttttt tgatttgaaa cttgtctatg aggtaggtcc 1920

tgaaagtttc ttgccaccgc caactgtcaa atcagccctg ttaaacatta aaagaaaaca 1980

cttatttttt gattttaagt ttaaagccaa atacttagca tttatttcct gtctgttaga 2040

gaaacctgat ttatctgtaa aaacagcttt aaagtcgatt ttcaggaaaa gtcaggtcag 2100

gtcaatttcg gaaaaattcg gtttaaacct taatgctcaa attgtttgtt tgtctccaag 2160

tcaatggtta aactgttttt tggaaatgct ggaagttgtc cctgaaaaat ttcatccttc 2220

gtagttcaaa gtcgggtggt tgtcaagatg atttttttgg tttggtgtcg tcttttttta 2280

agctgccgca taacggctgg caaattggcg atggagcgga aacgtaaaag aagttatgga 2340

aataagactt agaagcaaac ttaagagtgt gttgatagtg cagtatctta aaattttgta 2400

taataggaat tgaagttaaa ttagatgcta aaaatttgta attaagaagg agtgattaca 2460

tgaacaaaaa tataaaatat tctcaaaact ttttaacgag tgaaaaagta ctcaaccaaa 2520

taataaaaca attgaattta aaagaaaccg ataccgttta cgaaattgga acaggtaaag 2580

ggcatttaac gacgaaactg gctaaaataa gtaaacaggt aacgtctatt gaattagaca 2640

gtcatctatt caacttatcg tcagaaaaat taaaactgaa tactcgtgtc actttaattc 2700

accaagatat tctacagttt caattcccta acaaacagag gtataaaatt gttgggagta 2760

ttccttacca tttaagcaca caaattatta aaaaagtggt ttttgaaagc catgcgtctg 2820

acatctatct gattgttgaa gaaggattct acaagcgtac cttggatatt caccgaacac 2880

tagggttgct cttgcacact caagtctcga ttcagcaatt gcttaagctg ccagcggaat 2940

gctttcatcc taaaccaaaa gtaaacagtg tcttaataaa acttacccgc cataccacag 3000

atgttccaga taaatattgg aagctatata cgtactttgt ttcaaaatgg gtcaatcgag 3060

aatatcgtca actgtttact aaaaatcagt ttcatcaagc aatgaaacac gccaaagtaa 3120

acaatttaag taccgttact tatgagcaag tattgtctat ttttaatagt tatctattat 3180

ttaacgggag gaaataattc tatgagtcgc ttttgtaaat ttggaaagtt acacgttact 3240

aaagggaatg tagataaatt attaggtata ctactgacag cttcggggat cctctagagt 3300

cgacctgcag ttctgtcttg gactcggaga ctttgtgcag acacttttaa tataggtctg 3360

taattgtctc agagtatgaa tcgatcgccc gacctccttt taaggaagtc gggcgacttc 3420

gtttttatgc ctattattct aatatacttc tgaaacaatt tgttccaaaa agttgcatga 3480

aaagattatc ttactatctt tgcactgcaa aaggggagtt tcctaaggtt ttccccggag 3540

tagtacggta ataacggtgt ggtagttcag ctggttagaa tacctgcctg tcacgcaggg 3600

ggtcgcgggt tcgagtcccg tccataccgc taaaataagg agttgtgttg aaatagtttt 3660

tcggcacagc tccatttttg tatgttatcg cagcaccgga aagtataatt gccggatgag 3720

attattcaat atgctcggaa gattttctta gaacgaagca gaagtgtttg tctttattac 3780

gatctgcttg ggacataggg attaaattag tattattgca ggagggacgg tacatggagt 3840

cgcccggcca atcagatgaa gaaagaagaa ctacgattga tttttatggg aacggccgat 3900

tttgctgttc cggcactccg agctttggtc gaaaacggat accaagtaaa agctgtggtc 3960

actatgccgg acaagcctat gggtcgagga cataaggtaa gtcccagtat ggtcaaacta 4020

tacgcacagg aattgggtct gcctattctc cagccggaca atctgaacga ggaatctttt 4080

ctcgatgaac tacggactta tcagccgcac ttgcaaatcg tagtggcttt ccgtatgctt 4140

cctcgctccg tatggcaaat gccccccatg ggaacaatca atctgcatgg ctctctgctg 4200

cccatgtatc gaggagcagc ccctatcaac cacgcgatac gccatggcga tacggaaacg 4260

ggagttacca ccttccgcct ccggcatgag atagatagga tccaa 4305

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> upF’

<400> 10

gtgtggcgca tcagatatat tttcatc 27

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> downR’

<400> 11

ggacaagcct atgggtcgag gacataag 28

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> RgpA F

<400> 12

tccactcagc aatcggtgac 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> RgpA R

<400> 13

cgagcatctt ctcaccatcc 20

Claims (3)

1.牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）扩增牙龈卟啉单胞菌RgpA基因的上、下游同源臂；

（2）扩增红霉素抗性基因片段；

（3）构建两端为所述RgpA基因的上、下游同源臂，中间为红霉素抗性基因片段的同源重组片段；

（4）将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，进行同源重组，采用红霉素抗性平板筛选，获得牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株；

所述上游同源臂的序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游同源臂的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，其特征在于步骤（4）中采用电转化方法将同源重组片段转化入牙龈卟啉单胞菌内，电击条件为：电压为2.5kV、电击时间为5ms。

3.根据权利要求2所述牙龈卟啉单胞菌RgpA基因敲除突变株的制备方法，其特征在于以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以upF和upR为引物，扩增RgpA基因的上游同源臂；以牙龈卟啉单胞菌的基因组DNA为模板，以downF和downR为引物，扩增RgpA基因的下游同源臂；所述upF的序列如SEQ ID NO:3所示，所述upR的序列如SEQ ID NO:4所示；所述downF的序列如SEQ ID NO:7所示，所述downR的序列如SEQ ID NO:8所示。