CN101942410A - 牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域hgp44基因的克隆重组菌及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域Hgp44基因的克隆重组菌，它是Hgp44-pET22b-BL21(DE3)大肠埃希氏菌，其保藏编号为CGMCC NO.3799，其拉丁学名为Escherichia coli。本发明成功克隆了牙龈卟啉单胞菌的促血凝功能结构域Hgp44基因，并构建了Hgp44原核表达系统，为继续研究Hgp44的特性及其促进血小板聚集的具体机制奠定基础。Hgp44蛋白的成功表达为取得相应抗体，制备预防性疫苗的提供了前提条件，为建立敏感、特异的牙龈素免疫检测方法奠定了基础，也为进一步阻断牙周病致病途径提供良好的分子工具，为进一步明确牙周病和冠心病之间的相互关系奠定基础。

Description

牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域HGP44基因的克隆重组菌及构建方法

技术领域

本发明涉及牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域Hgp44基因的原核表达质粒。

背景技术

牙周病是人群中发病率很高的口腔三大疾病之一，在我国人群中发病率高达75％以上。牙周病是由牙菌斑中的微生物引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，主要症状是牙周袋形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收，最终可导致牙松动和被拔除。牙周病属于慢性感染性疾病，免疫机制在疾病的发展过程中也发挥了重要的作用。

冠心病是目前主要致死性疾病之一，病因机制复杂，传统的致病因素是高血脂、高血压、糖尿病、遗传、吸烟等。近年来越来越多的学者发现动脉粥样硬化(AS)形成过程中常伴随着炎症反应，病原微生物可以侵袭入内皮细胞、平滑肌细胞，激发和促进动脉粥样硬化的炎症反应，由此推测感染可能是冠心病一个重要的致病因子。炎症反应和免疫反应关系非常密切，免疫反应是炎症反应的重要启动因素。

大量的流行病学研究揭示了牙周病和冠心病之间存在一定的相关性，进一步的实验研究提示牙周病主要致病菌牙龈卟啉单胞菌(P.g)在一定程度上促进了动脉粥样硬化形成。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.g)是革兰氏阴性、专性厌氧的产黑色素短杆菌，能产生多种与牙周组织破坏有关的侵袭性因子，主要有内毒素、菌毛、牙龈素等，是目前公认的重要的牙周炎致病菌，也是牙周炎活动性检测的指示菌。投射扫描电子显微镜发现P.g可以侵入人脐静脉内皮细胞。

牙龈素是P.g分泌的胞外蛋白酶，可破坏细胞基质，使宿主免疫调节失衡。目前发现，与牙周疾病关系密切的牙龈素主要有两种：精氨酸特异性蛋白酶(Arginine-gingipains，Rgps)和赖氨酸特异性蛋白酶(Lysine-gingipain，Kgp)，其中Rgps又称卟啉素，分为RgpA和RgpB两种。RgpA和Kgp均为非共价复合物，包一个N-末端前肽区，蛋白水解区和一个C-末端粘附素区(HGP15[HbR]，Hgp17，Hgp27和Hgp44)，具有独立的催化区域和凝集区域。然而RgpB一级结构只有催化区域，其相当于HRgpA的催化亚基。动脉粥样硬化过程伴随有炎症反应，而内皮细胞激活是炎症反应的关键步骤。P.g可以激活内皮细胞黏附分子如细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子的释放，从而有利于中性粒细胞向内皮细胞趋化，促进血管平滑肌细胞的迁移和增殖，促进血细胞的游走以及动脉粥样硬化的形成。Hgp44是牙龈素上一段粘附素区域，Hgp44能够通过粘附到HIV-1gp120蛋白上，阻断HIV-1外膜介导的膜融合，进一步阻断HIV感染。同时，P.g依赖细胞内编码Hgp44粘附素的基因诱导血小板聚集。目前关于Hgp44促进血小板聚集的研究国外报道很少，而国内没有研究报道过。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域Hgp44基因的克隆重组菌，它是Hgp44-pET22b-BL21(DE3)大肠埃希氏菌，其保藏编号为CGMCC NO.3799，其拉丁学名为Escherichia coli。

本发明另一个所要解决的技术问题是提供一种上述克隆重组菌的构建方法，为此，本发明采用以下技术方案：它包括以下步骤：

1)、通过PCR方法克隆得到Hgp44基因；所述Hgp44基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，PCR扩增的引物为：

上游5`-CCATATGAGCGGTCAGGCCGAG-3`

下游5`-GCTCGAGTGCCGTAATCGTCTCTTC-3`，

2)、通过酶切连接方法将Hgp44基因连接到表达载体pET 22b，形成质粒Hgp44-pET22b；

3)、将构建的Hgp44-pET22b载体转化到受体菌coli.BL21(DE3)中，获得克隆重组菌Hgp44-pET22b-BL21(DE3)。

牙龈卟啉单胞菌诱发机体产生一系列细胞因子引起机体自身免疫反应，并通过RgpA，Kgp和HagA的编码基因，即细胞内编码Hgp44粘附素的基因诱导血小板聚集，促进内膜胆固醇的沉积和血管壁增厚，从而对心血管系统产生严重危害。基于Hgp44在牙龈卟啉单胞菌毒性中具有的意义，本发明利用已发表的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277Hgp44序列，设计引物，采用PCR方法从P.g ATCC 33277全基因组DNA中扩增出Hgp44基因片段，克隆到pMD 18-T载体，经酶切鉴定正确后送测序，测序结果证实与Genbank中牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277Hgp44序列高度同源。

本发明选用的pMD18-T Simple Vector是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体，由pUC18载体改建而成，它消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，再在pUC18载体的多克隆酶切位点处导入了EcoR V酶切位点，使用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3′端添加“T”而成本发明进行PCR反应扩增Hgp44基因时在PCR产物的3′末端添加“A”的特性，使用该载体可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。pMD18-T载体消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，所以本发明在为Hgp44基因设计引物时便引入了Xho I和Nde I的酶切位点，在酶切反应时就不会受到T载体上其他多克隆酶切位点上的限制酶影响，如此大大提高了酶切效率，增加了亚克隆成功率。另外，该载体分子量为2692bp，和扩增的目的基因hgp44的1083bp相比，在后期酶切回收目的基因时可以很好的分辨，有利于产物的准确回收。表达载体pET 22b含有本实验所需要的内切酶位点，氨苄抗性有利于筛选转化后的阳性克隆。配合E.coli.BL21(DE3)表达宿主菌，用于高效表达外源基因的蛋白表达。本发明选用原核表达载体pET 22b在大肠杆菌中进行融合表达，通过SDS-PAGE分析显示表达蛋白的分子量约44KD左右，与预期的Hgp44蛋白大小一致。

本发明成功克隆了牙龈卟啉单胞菌的促血凝功能结构域Hgp44基因，并构建了Hgp44原核表达系统，为继续研究Hgp44的特性及其促进血小板聚集的具体机制奠定基础。Hgp44蛋白的成功表达为取得相应抗体，制备预防性疫苗的提供了前提条件，为建立敏感、特异的牙龈素免疫检测方法奠定了基础，也为进一步阻断牙周病致病途径提供良好的分子工具，为进一步明确牙周病和冠心病之间的相互关系奠定基础。

附图说明

图1为Hgp44的PCR扩增结果电泳图。

图2为pMD18T-Hgp44质粒Xho I、Nde I双酶切鉴定结果图。

图3为pET22b-Hgp44质粒PCR鉴定结果电泳图。

图4为pET22b-Hgp44质粒的构建流程图。

图5为重组菌Hgp44-pET22b-BL21(DE3)表达蛋白的SDS-PAGE鉴定图

具体实施方式

实施例1，牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277基因组DNA及其目的基因Hgp44的获得。

本实施例描述了本发明提供的牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域Hgp4基因的获得方法，克隆方法为PCR，包括以下步骤：

1、牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277的培养和收集：

将牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277菌种(上海市第九人民医院口腔实验室提供)接种于非选择性的CDC琼脂平板，37℃厌氧箱内(80％N2，10％CO2及10％H2并放置钯粒)培养，常规接种，传代，每平皿选取4-8个进行涂片及生化鉴定及检查。用PBS将平板上的P.g菌落收集入1.5ml的EP管中。

2、牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277基因组抽提：

用上海生工生物工程技术服务有限公司的柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(EZ SpinColumn Bacterial Genomic DNA Isolation Kit UNIQ-10)抽提P.g菌的全基因组。抽提的P.g基因组(标记为P.g DNA)冻存于-20℃冰箱。

3、PCR扩增目的片段P.g ATCC 33277的Hgp44基因：

根据GenBank已知的U15282Hgp44基因序列设计并合成特异引物：上游5`-CCATATGAGCGGTCAGGCCGAG-3`下游5`-GCTCGAGTGCCGTAATCGTCTCTTC-3`。

PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段约为1100bp，与预期大小相符，见图1。图中，M：DL2000DNA Marker；1：阴性对照；2、3、4：Hgp44的PCR产物

实施例2重组质粒pMD-Hgp44制备

将实施例1的扩增产物回收后克隆到pMD 18-T载体，转化感受态细胞DH5a，经氨苄及X-Gal/IPTG筛选阳性菌落，增菌后提取质粒，经Xho I、Nde I双酶切后电泳检测，在1100bp处可见酶切片段，初步成功构建pMD-Hgp44重组质粒。重组质粒的限制性酶切鉴定结果见图2。图中，M：DNAMarker；1、2：重组质粒酶切鉴定结果。

以下具体描述上述制备过程：

1、pMD 18-T连接试剂(大连盒宝生物工程有限公司)产品，按试剂盒说明与PCR回收产物Hgp44基因连接。

2、CaCl2法制备宿主菌E.coli DH5a感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司提供)，细胞悬浮液添加冷冻保护剂(15％-20％甘油)后超低温冷冻贮存备用(-86℃)；

3、重组克隆质粒pMD-Hgp44转化感受态受体菌E.coli DH5a；

取50ul感受态受体菌与5ul连接产物混匀后，冰浴30min；42℃热休克90min；立即置冰上2min，加900ul LB培养液，37℃振摇1.5小时(130转/分)；涂平皿：将培养物于室温下以4000rpm，离心1分钟，吸去大部分上清，留约100ul上清，将菌体吹打混匀，涂氨苄阳性的LB琼脂培养基平皿[含氨苄100ug/ml，40ul X-Gal(20mg/ml溶于二甲基甲酰胺)，4ulIPTG(200mg/ml)]，37℃温箱，培养过夜；

4、阳性克隆的筛选和鉴定：

蓝白斑法筛选阳性克隆，挑取白色菌落37℃培养过夜，增菌后提取质粒，进行PCR初步鉴定和Xho I、Nde I双酶切鉴定，最后经测序确认。

5、用柱式质粒小量抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)快速提取pMD-Hgp44质粒，然后0.8％Agarose电泳观察提取结果。

6、重组质粒的酶切鉴定：

采用限制性内切酶Xho I、Nde I(Fermentas(MBI))进行酶切，回收Hgp44基因片段，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定结果见图2

7、克隆后Hgp44基因的序列测定：

PCR和酶切初步鉴定后，将含阳性重组质粒的菌液送金思特生物技术公司测序。载体取名为pMD-Hgp44，内含Hgp44基因片段，长度约为1100bp，测定结果如下：

GGCCAGTGCCAAGAAGCATGACGGCAAGTGGACGATTCCATATGAGCGGTCAGGCCG

AGATTGTTCTTGAAGCTCACGATGTTTGGAATGATGGATCCGGTTATCAGATTCTTTTG

GATGCAGACCATGATCAATATGGACAGGTTATACCCAGTGATACCCATACTCTTTGGCC

GAACTGTAGTGTCCCGGCCAATCTGTTCGCTCCGTTCGAATATACGGTTCCGGAAAATG

CAGATCCTTCTTGTTCCCCTACCAATATGATAATGGATGGTACTGCATCCGTTAATATA

CCGGCCGGAACTTATGACTTTGCAATTGCTGCTCCTCAAGCAAATGCAAAGATTTGGAT

TGCCGGACAAGGACCGACGAAAGAAGATGATTATGTATTTGAAGCCGGTAAAAAATA

CCATTTCCTTATGAAGAAGATGGGTAGCGGTGATGGAACTGAATTGACTATAAGCGAA

GGTGGTGGAAGCGATTACACCTATACAGTCTATCGTGACGGCACGAAGATCCAGGAAG

GTCTGACGGCTACGACATTCGAAGAAGACGGTGTAGCTGCAGGCAATCATGAGTATTG

CGTGGAAGTTAAGTACACAGCCGGCGTATCTCCGAAGGTATGTAAAGACGTTACGGTA

GAAGGATCCAATGAATTTGCTCCTGTACAGAACCTGACCGGTAGTGCAGTCGGCCAGA

AAGTAACGCTTAAGTGGGATGCACCTAATGGTACCCCGAATCCGAATCCGAATCCGAA

TCCAAATCCAAATCCGAATCCGAATCCCGGAACAACAACACTTTCCGAATCATTCGAA

AATGGTATTCCTGCCTCATGGAAGACGATCGATGCAGACGGTGACGGGCATGGCTGGA

AGCCTGGAAATGCTCCCGGAATCGCTGGCTACAATAGCAATGGTTGTGTATATTCAGA

GTCATTCGGTCTTGGTGGTATAGGAGTTCTTACCCCTGACAACTATCTGATAACACCGG

CATTGGATTTGCCTAACGGAGGTAAGTTGACTTTCTGGGTATGCGCACAGGATGCTAAT

TATGCATCCGAGCACTATGCGGTGTATGCATCTTCGACCGGTAACGATGCATCCAACTT

CACGAATGCTTTGTTGGAAGAGACGATTACGGCACTCGAGCAATCTCCAGAGGATCGC

CGGGAACCGAGGACGAGTCGTAATCATGT

实施例3，pET22b-Hgp44质粒构建，重组菌Hgp44-pET22b-BL21(DE3)

本实施例描述了原核表达质粒pET22b-Hgp44的构建过程及在大肠杆菌中的蛋白表达，包括以下步骤：

1、pMD-Hgp44质粒、pET22b载体的酶切及回收：

pMD-Hgp44质粒、pET22b载体(pET Expression System 22b：美国Novagen公司)分别经Xho I、Nde I双酶切后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收Hgp44、pET22b片段。

2、Hgp44片段与pET22b表达载体的连接：

通过琼脂糖凝胶电泳对Hgp44片段和pET22b载体大致定量。

3、连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂板(LBamp+)，37℃过夜。

4、原核表达质粒pET22b-Hgp44筛选：

第二天确定阴性对照无菌落长出后，长出的菌落即为重组菌落。标记为Hgp44-pET22b-BL21(DE3)。

5、诱导表达：

1)、取1-2个重组菌菌落，接入1ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养液，37C培养过夜。

2)、取50μl过夜培养物接入5ml含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养液，37℃震荡培养2小时。

3)、吸出1ml未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，标记为HGP44-pET22b(0)。

4)、在剩余培养物中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续通气培养。在诱导的不同时间，(1，2，3，4小时)，取1ml样品放于微量离心管中，室温高速离心1分钟。

5)、沉淀悬于100μl 1×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热3分钟，室温高速离心1分钟，冰上放置，待全部样品处理完后上样。

6)、样品加热至室温，取20μl悬液上样于10％SDS聚丙烯酰胺凝胶。

7)、60V恒压电泳，至溴酚蓝迁移到浓缩胶底部，进入分离胶后将电压加至120V，恒压电泳直至溴酚蓝迁移到分离胶底部。

8)、考马斯亮蓝染色，观察表达产物条带。

通过Xho I、Nde I双酶切含Hgp44基因的重组质粒pMD-Hgp44和表达质粒pET22b，回收获得目的基因Hgp44和pET22b载体进行连接，转化感受态细胞BL21(DE3)，涂皿LBAmp+培养，挑取阳性菌落进行增菌，提取质粒，PCR初步鉴定，获得重组表达质粒pET22b-Hgp44。pET22b-Hgp44的PCR鉴定结果见图3。图3中，M：DL2000DNA Marker；1，2：pET22b-Hgp44PCR鉴定结果；3：Hgp44基因。

再经酶切鉴定正确后，获得重组表达质粒pET22b-Hgp44。载体构建流程见图4。其中LacZ，Lacl：β-半乳糖苷酶基因z，Amp，Ap：氨苄抗性基因，Ori，f1 origin：复制起始原点，LacZ，Lacl：β-半乳糖苷酶基因。

6.pET22b-Hgp44原核表达蛋白的SDS-PAGE分析

挑取单个阳性重组菌进行增菌，经IPTG方法诱导表达，对细菌总蛋白加热变性后进行SDS-PAGE电泳。图5示诱导后出现一条明显区别于诱导前细菌的表达蛋白条带，分子量在44KD左右，与预期蛋白分子量大小相符。图中，M：中分子量Marker；1：诱导前对照；2，3，4：诱导后表达蛋白。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>牙龈卟啉单胞菌促血凝功能结构域HGP44基因的克隆重组菌及构建方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>1195

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

ggccagtgcc aagaagcatg acggcaagtg gacgattcca tatgagcggt  caggccgaga    60

ttgttcttga agctcacgat gtttggaatg atggatccgg ttatcagatt cttttggatg    120

cagaccatga tcaatatgga caggttatac ccagtgatac ccatactctt tggccgaact    180

gtagtgtccc ggccaatctg ttcgctccgt tcgaatatac ggttccggaa aatgcagatc    240

cttcttgttc ccctaccaat atgataatgg atggtactgc atccgttaat ataccggccg    300

gaacttatga ctttgcaatt gctgctcctc aagcaaatgc aaagatttgg attgccggac    360

aaggaccgac gaaagaagat gattatgtat ttgaagccgg taaaaaatac catttcctta    420

tgaagaagat gggtagcggt gatggaactg aattgactat aagcgaaggt ggtggaagcg    480

attacaccta tacagtctat cgtgacggca cgaagatcca ggaaggtctg acggctacga    540

cattcgaaga agacggtgta gctgcaggca atcatgagta ttgcgtggaa gttaagtaca    600

cagccggcgt atctccgaag gtatgtaaag acgttacggt agaaggatcc aatgaatttg    660

ctcctgtaca gaacctgacc ggtagtgcag tcggccagaa agtaacgctt aagtgggatg    720

cacctaatgg taccccgaat ccgaatccga atccgaatcc aaatccaaat ccgaatccga    780

atcccggaac aacaacactt tccgaatcat tcgaaaatgg tattcctgcc tcatggaaga    840

cgatcgatgc agacggtgac gggcatggct ggaagcctgg aaatgctccc ggaatcgctg    900

gctacaatag caatggttgt gtatattcag agtcattcgg tcttggtggt ataggagttc    960

ttacccctga caactatctg ataacaccgg cattggattt gcctaacgga ggtaagttga   1020

ctttctgggt atgcgcacag gatgctaatt atgcatccga gcactatgcg gtgtatgcat   1080

cttcgaccgg taacgatgca tccaacttca cgaatgcttt gttggaagag acgattacgg   1140

cactcgagca atctccagag gatcgccggg aaccgaggac gagtcgtaat catgt        1195

 

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

ccatatgagc ggtcaggccg ag                                              22

 

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>3

gctcgagtgc cgtaatcgtc tcttc                                           25

Claims (2)

1.牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.g)促血凝功能结构域Hgp44基因的克隆重组菌，它是Hgp44-pET22b-BL21(DE3)大肠埃希氏菌，其保藏编号为CGMCC NO.3799，其拉丁学名为Escherichia coli。

2.权利要求1所述的克隆重组菌的构建方法，其特征在于它包括以下步骤：

1)、通过PCR方法克隆得到Hgp44基因；所述Hgp44基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，PCR扩增的引物为：

上游5`-CCATATGAGCGGTCAGGCCGAG-3`

下游5`-GCTCGAGTGCCGTAATCGTCTCTTC-3`，

2)、通过酶切连接方法将Hgp44基因连接到表达载体pET 22b，形成质粒Hgp44-pET22b；

3)、将构建的Hgp44-pET22b载体转化到受体菌coli.BL21(DE3)中，获得克隆重组菌Hgp44-pET22b-BL21(DE3)。

Images