CN101386830B

CN101386830B - 一种带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌及其应用

Info

Publication number: CN101386830B
Application number: CN2008102248171A
Authority: CN
Inventors: 吴清民; 牛建蕊; 刘文娟; 任婕; 李娜; 张兴林; 杨羽; 刘文晓; 王真; 张春燕
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2008-10-22
Filing date: 2008-10-22
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2028-10-22
Also published as: CN101386830A

Abstract

本发明公开了一种带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌。本发明提供的带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌，是将羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)中的0抗原输出系统ATP结合蛋白的编码基因灭活得到的菌株。与出发菌株相比，本发明得到的菌株的毒力更小，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物。使用本发明的菌株免疫小鼠，小鼠体内能够产生与标准菌株、现有疫苗菌株不同的免疫反应状态，通过动物血清的免疫学检测能够将患病动物从免疫动物群体中鉴别出来。本发明对布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，开发布鲁氏菌基因缺失标记疫苗和配套的鉴别诊断试剂，促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。

Description

一种带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌及其应用。

背景技术

布鲁氏菌病是一种人畜共患的传染病，也是大动物传染病中仅次于口蹄疫，具有重要的政治、经济影响力的疾病，在世界各国的流行形势十分严峻。长期以来全球防控布鲁氏菌病的策略主要是检疫-扑杀(发达国家)或免疫接种(发展中国家)，前者通过检疫扑杀患病的牛、羊、猪等动物，耗资巨大、操作困难；后者通过免疫接种并辅助扑杀措施，虽可阻止疾病在动物群中的传播，但免疫动物和临床患病动物难以鉴别，使患病动物在自然群体中长期存在，严重威胁人类和动物群的健康，阻碍动物中布鲁氏菌病的根除和净化。

发明内容

本发明的目的是提供一种羊种布鲁氏菌的重组菌。

本发明提供的羊种布鲁氏菌的重组菌，是将羊种布鲁氏菌(Brucellamelitensis)基因组中的0抗原输出系统ATP结合蛋白的编码基因灭活后得到的重组菌。

所述羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)可为现有的菌株，如野生株(包括标准株和强毒株)、疫苗株。

所述0抗原输出系统ATP结合蛋白可为任何羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)的0---抗原输出系统ATP结合蛋白，如为序列1所示的0抗原输出系统ATP结合蛋白。

所述0---抗原输出系统ATP结合蛋白的编码序列为序列表中序列2所示的核苷酸序列。

可通过任何现有灭活方法灭活所述羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)中的0抗原输出系统ATP结合蛋白，如缺失基因组中该蛋白的编码序列、插入外源或内源序列、同源重组、RNA干扰等。

所述同源重组是将DM14的DNA片段导入所述羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)中实现的；所述DM14的DNA片段，从上游至下游依次为同源臂DM14-1和同源臂DM14-2；所述同源臂DM14-1和同源臂DM14-2能与所述羊种布鲁氏菌基因组中0抗原输出系统ATP结合蛋白编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组，灭活所述0抗原输出系统ATP结合蛋白的编码基因。

所述同源臂DM14-1和同源臂DM14-2的长度均为400-600bp。

所述同源臂DM14-1具体可为以羊种布鲁氏菌16M(Brucella melitensis16M)标准株的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

pWUM393(上游引物)：5’-GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG-3’；

pWUM394(下游引物)：5’-CTGCAGTGGCTGGATCATAGGTA-3’。

所述同源臂DM14-2具体可为以羊种布鲁氏菌16M(Brucella melitensis16M)标准菌株的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

pWUM395(上游引物)：5’-AGCCACTGCAGGAGATTCAGGCGCTCCA-3’；

pWUM396(下游引物)：5’-CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC-3’。

实验证明，所述重组菌的毒力低于出发菌株，而且具有血清学诊断标记，其免疫保护效力与现有的疫苗株相当。因此，该重组菌可用于开发羊种布鲁氏菌疫苗。

该布鲁氏菌疫苗，其活性成分为上述羊种布鲁氏菌的重组菌。

本发明通过对布鲁氏菌基因组中的功能基因进行筛选，发现0抗原输出系统ATP结合蛋白编码基因的灭活可使羊种布鲁氏菌的毒力显著降低，同时可以改变菌株免疫后动物血清中的抗体组成。本发明通过将羊种布鲁氏菌的0抗原输出系统ATP结合蛋白的编码基因灭活，得到了新的菌株，与出发菌株相比，该新菌株的毒力较小，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物，而且可以使免疫接种动物和临床患病动物通过血清学技术鉴别出来。使用本发明的菌株免疫小鼠，小鼠体内能够产生与标准菌株、现有疫苗菌株不同的免疫反应状态，通过动物血清的免疫学检测能够将患病动物从免疫动物群体中鉴别出来。本发明对布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，开发布鲁氏菌基因缺失标记疫苗和配套的鉴别诊断试剂，促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为DM14-1和DM14-2的PCR扩增结果

图2为DM14片段的PCR鉴定结果

图3为重组质粒pEX18AP-DM14转化大肠杆菌后的PCR鉴定结果

图4为重组质粒pEX18AP-DM14的双酶切鉴定结果

图5为重组载体pEX18AP-DM14的构建流程图

图6为重组菌BDM14的PCR鉴定结果

图7为重组菌BDM14接种后小鼠脾脏的重量变化趋势

图8为重组菌BDM14接种后小鼠脾脏的载菌量变化趋势

图9为重组菌BDM14接种小鼠的初步免疫保护试验结果

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

以下实施例中所用的菌株和质粒如下：

羊种布鲁氏菌标准菌株16M(Brucella melitensis16M)、羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5(购自中国兽药监察所菌种室)；质粒pEX18AP(构建方法参见文献：Tung T.Hoang，Gene1998，212:77-86)。

实施例1、带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌的构建

根据布鲁氏菌基因中的0抗原输出系统ATP结合蛋白序列(GenBank AccessionNumber：BMEI1416)，设计两对引物，一对引物用于扩增同源臂DM14-1，另一对引物用于扩增DM14-2。同源臂DM14-1和同源臂DM14-2连接后形成序列DM14，将序列DM14插入pEX18AP质粒，得到重组载体pEX18AP-DM14。重组载体pEX18AP-DM14与羊种布鲁氏菌基因组发生同源重组即可得到灭活0抗原输出系统ATP结合蛋白编码基因的羊布鲁氏菌重组菌。

一、重组载体pEX18AP-DM14的构建

构建过程示意图见图5。

1、布鲁氏菌基因组的提取

取300μl灭活的羊种布鲁氏菌标准菌株16M，加入1ml TNE(每升含有1.21gTris，5.84g NaCl，0.37g EDTA)混匀，10000r/min离心，留沉淀弃上清。之后加入135μl TNE重悬洗涤后的沉淀。再向其中加入135μl含2％Triton X-100的TNE，混匀。加30μl新鲜配制的溶菌酶(5mg/ml)，轻弹试管混匀。37℃水浴孵育30min，之后加入15μl蛋白酶K(20mg/ml)，涡旋混匀。65℃水浴至少孵育2h。

加入RNAse(使RNAse浓度达到10μg/ml)，琼脂糖凝胶电泳鉴定后将提取的基因组DNA于4℃保存备用。

2、PCR扩增目的基因上游片段DM14-1(477bp)和下游片段DM14-2(574bp)

扩增上游片段DM14-1的引物如下：

pWUM393(上游引物)：5’-GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG-3’；

pWUM394(下游引物)：5’-CTGCAGTGGCTGGATCATAGGTA-3’。

上游引物中加入KpnI酶切位点，下游引物中加入PstI酶切位点。

扩增下游片段DM14-2的引物如下：

pWUM395(上游引物)：5’-AGCCACTGCAGGAGATTCAGGCGCTCCA-3’

pWUM396(下游引物)：5’-CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC-3’

上游引物中加入PstI酶切位点，下游引物中加入BamHI酶切位点。

以步骤1得到的基因组DNA为模板，使用上述两对引物对进行降落PCR。降落PCR反应的具体条件是：先94℃预变性3min；然后94℃变性45s，退火温度从65℃至50℃每降1℃运行2个循环，每个循环72℃延伸1min；最后72℃终延伸10min。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，见图1。其中，1：DM14-1的PCR扩增产物，2：DM14-2的PCR扩增产物，M：DNA分子量标准。结果表明，成功扩增出了目的片段。

3、DM14片段的获得

通过PCR扩增将目的基因上游片段DM14-1和下游片段DM14-2连接，得到片段即为DM14片段。PCR扩增所用的引物如下：

pWUM393(上游引物)：5’-GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG-3’；

pWUM396(下游引物)：5’-CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC-3’

PCR扩增体系：

DM14-1片断 1ul

DM14-2片断 1ul

dNTP(2.5mM) 1ul

Taq酶 2ul

10XTaq buffer 5ul

pWUM393(20pmol/μl) 1ul

pWUM396(20pmol/μl) 1ul

双蒸水补足至50ul 38ul

扩增产物进行电泳检测，见图2。结果表明，DM14-1和DM14-2成功连接为DM14片段。

4、pEX18AP-DM14质粒的构建

提取含有AMP抗性基因、SacB基因以及含有多克隆位点的pEX18AP质粒。将经BamHI和KpnI双酶切后的pEX18AP质粒与步骤3得到的DM14片段连接。将得到的重组质粒命名为pEX18AP-DM14。

用pEX18AP-DM14转化到DH5α大肠杆菌，然后进行蓝白斑筛选。挑取阳性菌株的单菌落进行摇菌培养，先进行PCR鉴定，鉴定引物如下：

pWUM393(上游引物)：5’-GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG-3’；

pWUM396(下游引物)：5’-CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC-3’

结果见图3。图3中，M：DNA分子量标准；1：阳性菌株的PCR产物。

然后提取质粒并进行BamHI和KpnI双酶切鉴定。酶切鉴定的结果见图4。图4中，M：DNA分子量标准；1：重组质粒pEX18AP-DM14双酶切产物的PCR结果。

将得到的含有重组质粒菌株增殖，保存在-80℃备用。

二、灭活0抗原输出系统ATP结合蛋白编码基因的布鲁氏重组菌株获得

在含有20mlTSB液体培养基的离心管中接种羊种布鲁氏菌标准菌株16M50ul，37℃培养24小时后，离心菌体并用预冷的三蒸水悬浮并转入预冷的1.5ml离心管中，继续离心洗涤3-4次。然后，加入适量的冷三蒸水悬浮菌液，取87ul菌液和3ul质粒(pEX18AP-DM14)加入1mm的电极杯，将电极杯放入BIORAD电穿孔仪中，调整仪器至Agr程序后，按Pulse钮进行电击。查询电击参数为2.22KV。电击后，向电极杯中加入1ml SOC培养液，转入1.5ml离心管，室温下静置10min，置于37℃摇床复苏12-18h。将转化复苏后的菌液涂布于TSB+Amp(100ug/ul)。5-8天后长出单个菌落。挑取单菌落至TSB液体培养基(无抗生素)37℃增殖48h，再将该菌液稀释10-100倍后，取100ul涂布于含有5％蔗糖的TSA平板培养基。经过3-5天后长出单菌落，将此菌落进行PCR鉴定，阳性菌株即为灭活0抗原输出系统ATP结合蛋白编码基因的布鲁氏菌的重组菌，将其命名为羊种布鲁氏菌重组菌BDM14。

PCR鉴定用的引物如下：

pWUM393(上游引物)：5’-GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG-3’；

pWUM396(下游引物)：5’-CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC-3’。

带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌BDM14的PCR鉴定见图6。图6中，1：DNA分子量标准；2：羊种布鲁氏菌标准菌株16M的PCR产物；3：重组菌BDM14的PCR产物。

结果表明，获得了通过双交换灭活0抗原输出系统ATP结合蛋白编码基因的布鲁氏菌。

实施例2、灭活0抗原输出系统ATP结合蛋白的布鲁氏菌重组菌的鉴定

试验动物：4-6周龄SPF级Balb/C雌鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为SCXK(京)2007-0001。

一、毒力鉴定

将小鼠随机分为三组，每组30只。具体接种方案如下：

第一组(试验组)：接种实施例1制备的羊种布鲁氏菌重组菌BDM14，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

第二组(对照组1)：接种羊种布鲁氏菌标准菌株16M，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

第三组(对照组2)：接种羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

分别于接种后第1、2、3、4、5和10周从每组小鼠中选5只，进行脾脏大小、脾脏载菌量和血清学检测评价。

脾脏重量随时间的变化见图7。其中，野生株表示接种羊种布鲁氏菌标准菌株16M的实验结果，Vac M5表示接种羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5的实验结果，BDM14表示接种实施例1制备的羊种布鲁氏菌重组菌BDM14的实验结果。结果表明，带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌BDM14接种后，小鼠的脾脏与接种羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5(对照组2)相比有轻度肿大，但接种羊种布鲁氏菌标准菌株16M(对照组1)的小鼠脾脏在接种后期有明显肿大现象。脾脏载菌量随时间的变化见图8。结果表明，带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌株BDM14接种后，小鼠的脾脏载菌量与接种羊种布鲁氏菌标准菌株16M(对照组1)相比显著降低。

血清学检测结果表明，接种羊种布鲁氏菌标准菌株16M和疫苗株M5的小鼠血清通过布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原(中国兽医药品监察所制造，批号200801)检测时，均能够在2分钟内出现明显的凝集反应，通过试管凝集试验抗原(中国兽医药品监察所制造，批号200603)检测到的抗体效价达到1：100以上，而接种带有免疫标记的羊布鲁氏菌的重组菌BDM14的小鼠血清的检测结果均为阴性。

二、疫苗效力评价

将上述健康小鼠随机分为三组，每组5只。三组小鼠分别注射带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌株BDM14、羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5和PBS，具体如下：

第一组：接种实施例1制备的带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌株BDM14，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

第二组(疫苗对照组)：接种羊种布鲁氏菌疫苗菌株M5，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

第三组(空白对照组)：接种0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml。

上述三组小鼠接种8周后，用羊种布鲁氏菌标准株16M进行攻毒保护试验，攻毒后两周剖杀小鼠并采血，取脾脏称重量并计算脾脏载菌量变化，评价免疫效力。实验设三次重复，平均脾脏载菌量变化的结果如图9所示。图中，对照组表示空白对照组的实验结果，M5表示疫苗对照组的实验结果，BDM14表示接种实施例1制备的带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌株BDM14的实验结果。小鼠体内攻毒结果表明，0抗原输出系统ATP结合蛋白编码基因缺失的带有免疫标记的羊种布鲁氏的重组菌株BDM14的免疫保护效力明显优于疫苗株M5。说明与羊种布鲁氏菌标准株16M相比，0抗原输出系统ATP结合蛋白编码基因缺失的带有免疫标记的羊种布鲁氏菌的重组菌株BDM14的毒力较小，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物，而且可以使免疫接种动物和临床患病动物通过血清学技术鉴别出来。

序列表

<160>2

<210>1

<211>252

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>759

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

Claims

1.羊种布鲁氏菌的重组菌，是将羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)中的O抗原输出系统ATP结合蛋白的编码基因灭活得到的菌株。

2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述O抗原输出系统ATP结合蛋白是由序列表中的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

3.如权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述灭活是通过同源重组实现的。

4.权利要求1至3中任一所述重组菌在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。

5.一种布鲁氏菌疫苗，其活性成分为权利要求1至3中任一所述的羊种布鲁氏菌的重组菌。