CN101575589B

CN101575589B - 流产布鲁氏菌疫苗株s19标记重组菌及其应用

Info

Publication number: CN101575589B
Application number: CN2009100858581A
Authority: CN
Inventors: 吴清民; 牛建蕊; 王真; 任婕; 杨羽; 刘文晓; 刘文娟; 张春燕
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2029-06-03
Also published as: CN101575589A

Abstract

本发明公开了一种流产布鲁氏菌疫苗株S19标记重组菌及其应用。本发明提供的流产布鲁氏菌重组菌株，是将流产布鲁氏菌菌株S19中的葡萄糖基转移酶编码基因灭活得到的菌株。本发明得到的重组菌株毒力较小，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物。使用本发明的菌株免疫小鼠，接种动物不产生脂多糖抗体，通过血清学反应能够区别强毒菌株感染动物和新型疫苗菌株免疫动物。本发明有助于布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，有利于开发布鲁氏菌疫苗和配套的鉴别诊断试剂，对促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。

Description

流产布鲁氏菌疫苗株S19标记重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种流产布鲁氏菌疫苗株S19标记重组菌及其应用。

背景技术

布鲁氏菌病是一种人畜共患的传染病，也是大动物传染病中仅次于口蹄疫，具有重要的政治、经济影响力的疾病，在世界各国的流行形势十分严峻。长期以来全球防控布鲁氏菌病的策略主要是检疫-扑杀(发达国家)或免疫接种(发展中国家)，前者通过检疫扑杀患病牛、羊、猪等动物为措施，耗资巨大、操作困难；后者通过免疫接种并辅助扑杀措施，虽可阻止疾病在动物群中的传播，但免疫动物和临床患病动物难以鉴别，使患病动物在自然群体中长期存在，严重威胁人类和动物群的健康，阻碍动物布鲁氏菌病的根除和净化。

根据现在国际上及我国的使用来看，粗糙型疫苗株RB51和疫苗株S19都是弱毒活疫苗，但S19的毒力强，接种母畜易引起流产，利用血清学方法不能与野生菌株感染区分；而RB51的毒力相对较弱，虽然能够进行血清学的鉴别诊断，但RB51的免疫效力备受争议，在我国也没有使用。所以安全标记疫苗菌株是现在世界各国对于布鲁氏菌病防控的技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种流产布鲁氏菌疫苗株S19标记重组菌及其应用。

本发明提供的重组菌株，是将流产布鲁氏菌疫苗菌株S19(Brucella abortus)S19中的葡萄糖基转移酶基因灭活得到的菌株。

所述流产布鲁氏菌菌株S19为现有流产布鲁氏菌疫苗株。

所述葡萄糖基转移酶可为任何来源于流产布鲁氏菌菌株(Brucella abortus)的葡萄糖基转移酶，具体可如序列表的序列1所示。

所述葡萄糖基转移酶的编码序列具体可如序列表的序列2所示。

可通过任何现有方法灭活所述葡萄糖基转移酶基因，如基因组中该序列缺失、外源或内源序列插入、同源重组、RNA干扰等。

所述同源重组可通过将DNA片段DA6导入所述流产布鲁氏菌菌株S19实现；所述DNA片段DA6自上游至下游依次为同源臂DA6-1和同源臂DA6-2；所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2能与所述菌株基因组中的葡萄糖基转移酶编码序列的上游和下游相同序列发生同源重组，灭活所述葡萄糖基转移酶。

所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2的长度均为400-600bp。

所述同源臂DA6-1具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

pWUO359(上游引物)：5’-GGAATTCATCGACGGCGGAACTGG-3’(序列表的序列3)；

pWUO360(下游引物)：5’-AAGCTTCGCCTCGGTACTTAACTGG-3’(序列表的序列4)。

所述同源臂DA6-2具体可为以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段：

pWUO361(上游引物)：5’-AGGCGAAGCTTGGGCAGGGGCATGAATA-3’(序列表的序列5)；

pWUO362(下游引物)：5’-CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3’(序列表的序列6)。

实验证明，该重组菌的毒力低于出发的母本菌株，免疫保护效力与现有疫苗株相当，并且具有临床检疫、诊断用免疫标记。因此，该重组菌可用于制备布鲁氏菌疫苗。

所述重组菌株可应用于制备流产布鲁氏菌病疫苗。

本发明还保护一种流产布鲁氏菌病疫苗，它的活性成为所述的重组菌株。

本发明通过对流产布鲁氏菌疫苗菌株S19基因组中的功能基因进行筛选，发现葡萄糖基转移酶编码基因的灭活可以改变菌株免疫动物血清中的抗体组成，接种动物不产生脂多糖抗体。本发明通过将流产布鲁氏菌疫苗菌株S19的葡萄糖基转移酶基因灭活，得到了新的重组菌株，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物，与出发菌株相比，该重组菌株的毒力较小，而且可使免疫接种动物和临床患病动物通过血清学技术进行鉴别。使用本发明的菌株免疫小鼠，小鼠体内能够产生与标准菌株、现有疫苗菌株不同的免疫反应状态，通过动物血清的免疫学检测能够将患病动物从免疫动物群体中鉴别出来。本发明可应用于布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，应用于开发布鲁氏菌病疫苗和配套的鉴别诊断试剂，对促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。

附图说明

图1为DA6-1和DA6-2的PCR扩增电泳图。

图2为DA6的PCR扩增电泳图。

图3为pEX18AP-DA6转化大肠杆菌DH5α后经PCR扩增的鉴定图。

图4为pEX18AP-DA6的BamHI和EcoRI双酶切鉴定图。

图5为重组载体pEX18AP-DA6的构建流程图。

图6为重组菌RB6的PCR鉴定图。

图7为重组菌RB6接种后小鼠脾脏载菌量随时间变化曲线。

图8为重组菌RB6接种小鼠的初步免疫保护试验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中所用的菌株和质粒如下：

流产布鲁氏菌菌株2308(Brucella abortus)2308(标准菌株)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)菌株S19(疫苗菌株)均购自中国兽药监察所菌种室；流产布鲁氏菌(Brucella abortus)菌株RB51(粗糙型疫苗菌株)来自美国产商业牛布鲁氏菌粗糙型疫苗的分离菌株；pEX18AP质粒(构建方法参见文献：Tung T.Hoang，Gene 1998，212：77-86)。

实施例1、灭活葡萄糖基转移酶基因的重组菌株的构建

根据流产布鲁氏菌基因组中的葡萄糖基转移酶基因(GenBank AccessionNumber：BAbS19_I09300)，设计两对引物，一对引物用于扩增同源臂DA6-1，另一对引物用于扩增DA6-2。同源臂DA6-1和同源臂DA6-2连接后形成序列DA6，将序列DA6插入pEX18AP质粒，得到重组载体pEX18AP-DA6。重组载体pEX18AP-DA6与流产布鲁氏菌菌株S19发生同源重组即可得到灭活葡萄糖基转移酶基因的重组菌株。

一、重组载体pEX18AP-DA6的构建

构建过程示意图见图5。

1、布鲁氏菌基因组的提取

取15μl灭活的流产布鲁氏菌菌株S19，加入1ml TNE(每升含有1.21g Tris，5.84gNaCl，0.37g EDTA)混匀，10000r/min离心，留沉淀弃上清。之后加入135μl TNE重悬洗涤后的沉淀。再向其中加入135μl含2％Triton X-100的TNE，混匀。加30μl新鲜配制的溶菌酶(5mg/ml)，轻弹试管混匀。37℃水浴孵育30min，之后加入15μl蛋白酶K(20mg/ml)，涡旋混匀。65℃水浴至少孵育2h。

加入RNAse(使RNAse浓度达到10μg/ml)，琼脂糖凝胶电泳鉴定后将提取的基因组DNA于4℃保存备用。

2、PCR扩增葡萄糖基转移酶基因的上游片段DA6-1(554bp)和下游片段DA6-2(477bp)

扩增上游片段的引物如下：

pWUO359(上游引物)：5’-GGAATTCATCGACGGCGGAACTGG-3’；

pWUO360(下游引物)：5’-AAGCTTCGCCTCGGTACTTAACTGG-3’。

上游引物中加入EcoRI酶切位点，下游引物中加入HindIII酶切位点。

扩增下游片段的引物如下：

pWUO361(上游引物)：5’-AGGCGAAGCTTGGGCAGGGGCATGAATA-3’；

pWUO362(下游引物)：5’-CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3’。

上游引物中加入HindIII酶切位点，下游引物中加入BamHI酶切位点。

以步骤1得到的基因组DNA为模板，使用上述两个引物对进行降落PCR，参数是：94℃预变性3min；94℃变性45s，退火温度从65℃至50℃每降1℃运行2个循环，每个循环72℃延伸1min；最后72℃终延伸10min。

扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，见图1。图1中，1：DA6-1的PCR扩增产物；2：DA6-2的PCR扩增产物；3：DNA分子量标准。结果表明，成功扩增出了目的片段。

3、DA6片段的获得

通过PCR扩增将上游片段DA6-1和下游片段DA6-2连接，得到片段即为DA6片段。PCR扩增所用的引物如下：

pWUO359(上游引物)：5’-GGAATTCATCGACGGCGGAACTGG-3’；

pWUO362(下游引物)：5’-CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3’。

PCR扩增体系：

DA6-1片段 1ul

DA6-2片段 1ul

dNTP(2.5mM) 1ul

Taq酶 2ul

10XTaq buffer 5ul

pWUO359(20pmol/μl) 1ul

pWUO362(20pmol /μl) 1ul

双蒸水补足至50ul 38ul

扩增产物进行电泳检测，见图2。图2中，1：PCR产物；2：DNA分子量标准。结果表明，成功获得了将DA6-1和DA6-2连接的DA6片段。

4、pEX18AP-DA6质粒的构建

提取含有AMP抗性、SacB基因和lac-Z基因以及含有多克隆位点的pEX18AP质粒。将经BamHI和EcoRI双酶切后的pEX18AP质粒与相同双酶切的步骤3的DA6片段进行连接。将得到的重组质粒命名为pEX18AP-DA6。

用pEX18AP-DA6转化大肠杆菌DH5α，然后进行蓝白斑筛选。挑取阳性菌株的单菌落进行摇菌培养，先进行PCR鉴定，鉴定引物如下：

pWUO359(上游引物)：5’-GGAATTCATCGACGGCGGAACTGG-3’；

pWUO362(下游引物)：5’-CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3’。

结果见图3。图3中，1：pEX18AP-DA6转化阳性菌株的PCR产物；2：DNA分子量标准。

然后提取质粒并进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定。酶切鉴定的结果见图4。图4中，1：DNA分子量标准；2：阳性菌株中重组质粒的双酶切产物。

将得到的含有重组质粒的菌株增殖，保存在-80℃备用。

二、重组菌株的获得

在含有20ml TSB培养基的离心管中接种50ul流产布鲁氏菌菌株S19，37℃培养24小时后，离心菌体并用预冷的三蒸水悬浮并转入预冷的1.5ml离心管中，继续离心洗涤3-4次。然后，加入适量的冷三蒸水悬浮菌液，取87ul菌液和3ul质粒(pEX18AP-DA6)加入1mm的电极杯，将电极杯放入BIORAD电穿孔仪中，调整仪器至Agr程序后，按Pulse钮进行电击。查询电击参数为2.22KV。电击后，向电极杯中加入1ml SOC培养液，转入1.5ml离心管，室温下静置10min，置于37℃摇床复苏12-18h。将转化复苏后的菌液涂布于TSB(含100ug/ul的氨苄青霉素)。5-8天后长出单个菌落。挑取单菌落至TSB液体培养基(无抗生素)37℃增殖48h，再将该菌液稀释10-100倍后，取100ul涂布于含有5％蔗糖的TSA平板培养基。经过3-5天后长出单菌落，将阳性菌落进行PCR鉴定。

PCR鉴定用的引物如下：

pWUO359(上游引物)：5’-GGAATTCATCGACGGCGGAACTGG-3’；

pWUO362(下游引物)：5’-CGGGATCCAGCCGACGAGCAAATAGAA-3’。

重组菌株RB6的PCR鉴定结果见图6。图6中，1：电转化得到的重组菌株RB6；2：流产布鲁氏菌菌株S19；3：DNA分子量标准。

结果表明，通过双交换获得了灭活葡萄糖基转移酶的流产布鲁氏菌菌株，将其命名为重组菌株RB6。

实施例2、重组菌株RB6的应用

试验动物：4-6周龄SPF级Balb/C雌鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为SCXK(京)2007-0001。

一、毒力鉴定

将小鼠随机分为四组，每组30只。具体接种方案如下：

第一组(试验组)：接种实施例1制备的重组菌株RB6，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

第二组(对照组1)：接种流产布鲁氏菌菌株2308，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

第三组(对照组2)：接种流产布鲁氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

第四组(对照组3)：接种流产布鲁氏菌粗糙型疫苗菌株RB51，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

分别于接种后第1、3、4、6和10周从每组小鼠中选5只，进行脾脏载菌量和血清学检测评价。

脾脏载菌量随时间的变化见图7。图7中，WT表示接种菌株2308的实验结果，S19表示接种菌株S19的实验结果，RB6表示接种重组菌株RB6的实验结果，RB51表示接种菌株RB51的实验结果。结果表明：重组菌株RB6接种后，小鼠的脾脏载菌量随时间延长逐渐降低，在体内的清除速度与RB51相似。同时显示该菌株在小鼠体内的持续时间可能较疫苗菌株S19还要短，相对毒力较小。

血清学检测结果表明：接种流产布鲁氏菌标准菌株2308和流产布鲁氏菌疫苗菌株S19的小鼠血清通过布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原(中国兽医药品监察所制造，批号200801)检测时，均能够在2分钟内出现明显的凝集反应，通过试管凝集试验抗原(中国兽医药品监察所制造，批号200603)检测到的抗体效价达到1∶100以上，而接种重组菌株RB6和RB51小鼠血清的检测结果为阴性。

二、疫苗效力评价

将上述健康小鼠随机分为四组，每组15只。四组小鼠分别注射重组菌株RB6、流产布鲁氏菌菌株S19、流产布鲁氏菌菌株RB51和PBS，具体如下：

第二组(疫苗对照组)：接种流产布鲁氏菌菌株S19，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

第三组(粗糙型菌株对照组)：接种流产布鲁氏菌菌株RB51，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml，内含10⁷细菌。

第四组(空白对照组)：接种0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，每只小鼠腹腔接种剂量0.1ml。

上述菌株接种后，将每组小鼠再分成三个小组(每个小组5只)，分别于接种后第12周、16周和20周用流产布鲁氏菌菌株2308(Brucella abortus)攻毒，剂量为10⁶CFU/ml。两周后采血并剖杀各组小鼠，取脾脏称重量并计算脾脏载菌量变化，评价免疫效力。试验设置三次重复，结果取平均值。

脾脏的平均载菌量变化结果如图8所示。图8中，PBS表示空白对照组的实验结果，S19表示疫苗对照组的实验结果，RB6表示试验组的实验结果，RB51表示粗糙型菌株对照组的实验结果。小鼠体内攻毒结果表明，该重组菌株RB6的免疫保护效力优于菌株RB51，但比母本菌株S19稍差，但是该重组菌株RB6具有免疫诊断标记，接种动物与临床感染动物能够通过血清学反应进行鉴别。

序列表

<110>中国农业大学

<120>流产布鲁氏菌疫苗株S19标记重组菌及其应用

<130>CGGNARY92322

<160>6

<210>1

<211>410

<212>PRT

<213>流产布鲁氏菌(Brucella abortus)

<400>1

Met Ala Pro Arg His Ile Thr Val Ile Leu Pro Val Lys Tyr Arg Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Val Thr Lys Asn Ile Val Arg Met Leu Leu Lys Gly

20 25 30

Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Gln Cys Gln Val Arg Leu Ala Val Arg Ala

35 40 45

Asp Thr Tyr Asp Ile Gly Glu Glu Phe Arg Asp Leu Ile Asp Asn Gly

50 55 60

Val Glu Val Arg Glu Ile Ser Phe Lys Glu Val Pro Pro Glu Asp Val

65 70 75 80

Asn Asn Ala Asn Tyr Phe Gln Gly Arg Asn Ile Asp Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Thr Tyr Trp Leu Met Glu Asp Gly Gln Asn Asn Cys Ala Asp Ser Asp

100 105 110

Leu Trp Leu Val Val Ser Tyr Ser Val Glu Tyr Pro Ile Ala Pro Ile

115 120 125

Arg Pro Thr Leu Ile Phe Ala Thr Asp Phe Ile Gln Arg Tyr Val Pro

130 135 140

Asp Ile Ile Trp Pro Pro Arg Pro Gly Glu Gly Asp Ala Glu Ala Leu

145 150 155 160

Ala Phe Leu Arg Gln Ser Asp Gly Val Leu Ala Thr Thr Pro His Thr

165 170 175

Arg Leu Asp Ala Ile Ser Tyr Ala Gly Leu Pro Ala Ser Lys Val Tyr

180 185 190

Leu Ala Pro Met Glu Phe Asp Pro Thr Phe Leu Asp Arg Tyr Arg Ser

195 200 205

Val Ser Lys Val Lys Glu Pro Tyr Phe Leu Trp Pro Thr Asn Pro Asn

210 215 220

Ala His Lys Asn His Ala Lys Ala Phe Gln Ala Leu Asp Leu Tyr Tyr

225 230 235 240

Gly Lys Leu Lys Gly Lys Ile Lys Thr Lys Ile Val Gly Val Ser Ser

245 250 255

Val Arg Met Asp Pro Ser His Arg Trp Gln Ala Lys Tyr Glu Asn Lys

260 265 270

Ala Tyr Val Lys Ser Val Arg Glu Ile Val Ala Gly Leu Asp Asn Leu

275 280 285

Lys Ser Asn Val Glu Phe Ala Gly Glu Val Ala Asp Lys Glu Tyr Ala

290 295 300

Glu Leu Leu Ala Ser Ala Cys Phe Leu Trp His Pro Thr Leu Ala Asp

305 310 315 320

Asn Gly Thr Phe Ala Ala Val Glu Ala Ala Tyr Met Gly Cys Pro Thr

325 330 335

Leu Ser Asn Asp Tyr Pro Gln Met Arg Tyr Ile Ser Asn Arg Phe Glu

340 345 350

Ile Pro Met Gln Tyr Phe Asn Ala Arg Ser Val Lys Glu Met Ala Ser

355 360 365

Ala Leu Lys Gln Met Glu Glu Thr Pro Ile Asp Val Gly Leu Leu Pro

370 375 380

Ser Arg Glu Thr Leu Ser Leu His Ser Trp Glu Ala His Ala Ser Glu

385 390 395 400

Tyr Trp Asp Val Ile Val Arg Ala Ala Ala

405 410

<210>2

<211>1233

<212>DNA

<213>流产布鲁氏菌(Brucella abortus)

<400>2

atggctccga gacatattac agttatccta ccagttaagt accgaggcgg aagtcttcga 60

gttacgaaga atatcgttcg aatgcttttg aagggaagtc agaattatgg tgaacagtgt 120

caagttagat tggcagtacg tgccgatacc tacgatattg gggaggagtt tcgtgatctt 180

atcgataatg gtgtagaggt tcgggaaata tcattcaaag aagttcctcc agaagatgtt 240

aacaatgcta actatttcca aggtagaaat atcgacctac agtcgagaac ctattggcta 300

atggaggatg gccaaaacaa ctgtgccgat agtgaccttt ggctagttgt atcctactct 360

gtagagtatc ctattgcccc gataaggccg acactgatat ttgccaccga tttcattcaa 420

aggtacgtac ctgatattat ttggccacca cggcccggtg agggggatgc tgaggctctt 480

gcgttcttac gacaatcaga cggcgtacta gctacaacac cacacacgcg gctggatgcg 540

atttcatacg ctggcttacc tgcgtccaaa gtttatcttg ctccgatgga gtttgacccg 600

acgtttttgg atcgttaccg gtcagtgtct aaggttaagg aaccctattt cctttggcca 660

accaacccaa atgctcacaa aaaccatgca aaagcgtttc aagcgctaga cctatattac 720

ggcaaactaa agggtaagat aaagacaaag atagtcggtg tgagtagtgt gcggatggac 780

ccatcccatc gatggcaggc caagtacgaa aataaggctt atgtgaaatc tgtacgggaa 840

attgttgcgg gtctcgacaa cctgaaaagc aatgttgagt tcgctggtga ggttgcggac 900

aaggagtatg cggagcttct tgcttcagct tgtttccttt ggcatccaac tttggcagac 960

aacggaactt ttgctgcggt cgaagcagca tatatgggat gtccaacgct ttcaaacgac 1020

tacccgcaga tgcggtatat ttctaaccgt ttcgaaattc ccatgcagta ttttaacgca 1080

aggtctgtga aggaaatggc atcagcgctt aagcaaatgg aggagacgcc aatagatgta 1140

ggtttattgc caagtcgaga aaccctatct ctgcattcgt gggaagctca cgcttccgaa 1200

tactgggatg tgatcgtgag ggcagcggca tga 1233

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ggaattcatc gacggcggaa ctgg 24

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

aagcttcgcc tcggtactta actgg 25

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

aggcgaagct tgggcagggg catgaata 28

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

cgggatccag ccgacgagca aatagaa 27

Claims

1.流产布鲁氏菌重组菌株，是将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)菌株S19中的葡萄糖基转移酶基因灭活得到的菌株；

所述葡萄糖基转移酶如序列表的序列1所示；所述葡萄糖基转移酶的编码序列如序列表的序列2所示；

所述灭活是通过同源重组实现的；所述同源重组是将DNA片段DA6导入所述流产布鲁氏菌菌株S19实现的；所述DNA片段DA6自上游至下游依次包括同源臂DA6-1和同源臂DA6-2；所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2能与所述葡萄糖基转移酶编码序列的上游和下游序列发生同源重组，灭活所述葡萄糖基转移酶基因；

所述同源臂DA6-1和同源臂DA6-2的长度均为400-600bp；

所述同源臂DA6-1是以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用序列3和序列4组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段；所述同源臂DA6-2是以流产布鲁氏菌菌株S19的基因组DNA为模板，用序列5和序列6组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。

2.权利要求1所述重组菌株在制备流产布鲁氏菌病疫苗中的应用。

3.一种流产布鲁氏菌病疫苗，其活性成分为权利要求1所述的流产布鲁氏菌重组菌株。