JP5778426B2 - アミノ酸生合成のための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本発明は、一般的に、特にアミノ酸のような商業的な生物学的生成物の産生のために有用な組成物及び方法に関する。より具体的には、微生物の遺伝子工学的に改変された株、及び商業的な生成物の産生のためのその使用に関する。本発明はまた、特に新規な単離されたDNA、核酸、ベクター及び減少したゲノム細菌を提供する。
本願は、参照により本明細書に引用されている、2008年2月22日に出願された米国仮出願第61/030,835号の利益を請求する。
1つの実施態様では、本発明は、単離されたDNAであって、そのヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4又はその相補配列のいずれか1つを含む、DNAを提供する。
本発明は様々な形態で実施され得るが、いくつかの態様についての以下の記載は、本開示が本発明の例示として考慮され、示された特定の態様に本発明を限定することを意図するものではない、ことを理解されたい。見出しは、便宜のみのためであり、本発明を少しも限定するものと解釈するべきではない。いずれかの見出しに示された態様は、いずれかの他の見出しに示された態様と組合わせてよい。
本明細書で使用される「塩基対」とは、例えば、二重鎖DNA分子におけるアデニン (A) とチミジン (T)、又はシトシン (C) とグアニン (G) の水素結合ヌクレオチドを言うことがある。RNAでは、ウラシル (U) はチミンと置換される。塩基対は、DNA長の測定単位として使用されることもある。
天然環境にある細菌は、標準的な工業的又は研究室的な成長では通常経験されない多くの条件に曝露され、そのため、多数の条件依存的なストレス誘発遺伝子、又は他の生物の工業的又は研究室的な使用では必要とされないことがある本質的でない遺伝子を有する。細菌のゲノムに含まれる多数の遺伝的情報が、工業的又は研究室的な重要性のプロセスにおいて細菌培養の使用に対して有害な効果を与えることなく、削除されることが知られていた。減少したゲノムを有する細菌は、多くの工業的及び研修室的な用途において天然の株よりも有利であり得ることも理解されていた。例えば、減少したゲノムを有する細菌は、少なくともいくらか代謝要求性であり、そのため、所望の生成物をより効率的に産生することができる。加えて、減少したゲノムは、より少ない天然物及びより低レベルの特定の天然タンパク質をもたらし、残り細菌タンパク質からの所望のタンパク質の精製を容易にする。更に、細菌の遺伝子的配列の中には、標準的な工業的又は研究室的な実施を妨害する不安定物質(instabilitie)と関連し、コストがかかり厄介な制御手段を伴うかもしれないものがある。
親株は、任意の細菌株又は他の生物、及び減少したゲノム株が由来する中間株でよい。親株の代表的な例は、E.コリ、例えばK-12又はB、あるいは親株のそれと実質的に同一のゲノム配列を有する株を含むが、これらに限定されない。K-12株は、MG 1655でよい。親株のゲノムのヌクレオチド配列は、部分的に又は完全に知られていてよい。E.コリ及び他の通常使用されている研究室的な微生物の数種類の株の完全なゲノム配列は、知られている(例えば、Blattner他, Science, 277: 1453-74, 1997; GenBank受入番号U00096; Perna他, Nature, 409, 529-533, 2001; Hayashi他, DNA Res., 8, 11-22, 2001; Welch他, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 99: 17020-17024, 2002、及びGenBank受入番号AE014075参照。これらは参照として本明細書に引用されている)。
減少したゲノム株は、本明細書に参照として引用されている国際特許出願公開第WO 2007/024756号の表1に記載の核酸領域の1以上、又はそれと実質的に同一の配列を欠いてよい。WO 2007/024756の表1は、E.コリMG1655(注釈付きm56変形体)用のゲノムの以下の注釈特徴を提供する:カラム1(タイプ)は、注釈特徴のタイプを挙げている(コーディング配列(CDS)、プロファージ、rep_origin、繰返領域、rRNA、tRNA、misc_RNA、又はmisc_feature);カラム2(S)は、参照鎖(+: フォワード、-: 相補);カラム3(左)は、特徴の左端の位置を示す;カラム4(右)は、特徴の右端の位置を示す;カラム5(名前)は、特徴の名前を示す;及びカラム6(B)は、特徴のb-番号のブラットナ(Blattner)番号を示す。減少したゲノム株は、MDS41、MDS42、MDS43、MDS44、MDS45、MDS46、MDS47、MDS48、MDS49、MDS50、MDS51、MDS52、MDS53、MDS54、MDS55、MDS56、MDS57、MDS58、MDS59、MDS60、又はそれと実質的に同一のゲノムを有する株でよい。減少したゲノム株は、MDS42recA-でも、又はそれと実質的に同一のゲノムを有する株でもよい。
本株は、ゲノム核酸を削除するための当業者に公知の数種類の方法の任意を用いて、核酸配列を削除することによって作製してよい。核酸配列は、削除部位での任意の他の変異を生じることなく、そして任意の挿入された核酸を残すことなく(傷を残さない削除)、ゲノムから削除してよい。数種類の連続した削除が細菌ゲノムから作製される場合には、任意の挿入された核酸配列を残さないことが重要であろう。かかる挿入された配列は、それらが残された場合には、残りのゲノムの特徴付けられてなくかつおそらく重要な部分を細菌から削除するか、又は、厄介な効果を有する他の予測できないゲノム再配列を引き起こすことになる、望ましくない組換え事象、のための候補部位となることがある。
減少したゲノム株は、所望の産物、例えば組換えタンパク質、核酸、治療生成物、代謝中間体及び最終産物、の産生のために使用されることがある。組換えタンパク質の代表例は、インシュリン、インターロイキン、サイトカイン、成長ホルモン、成長因子、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、インターフェロン、抗体及び抗体断片を含むがこれらに限定されない。治療生成物の代表例は、ワクチン成分、診断生成物又は研究試薬を含むがこれらに限定されない。代謝中間体及び最終産物の代表例は、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン等、及び細菌中で実際に産生されていないが代謝経路工学又は他の遺伝的操作の結果として産生された化学化合物を含むが、これらに限定されない(例えば、本明細書に参照として引用されている米国特許第6,472,16号明細書及び同第6,372,476号参照)。
Claims (12)
- 単離されたDNAであって、そのヌクレオチド配列が、配列番号1もしくは配列番号2、又はその相補配列を含む、DNA。
- 配列番号1もしくは配列番号2、又はその相補配列を含む、単離された核酸。
- (i)配列番号1、
(ii)配列番号2、及び
(iii)(i)又は(ii)の縮重変異体
からなる群より選ばれる核酸配列を含む、単離された核酸。 - 発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号1又は配列番号2の核酸配列を含む発現ベクター。
- 請求項4記載のベクターを含む培養大腸菌(Escherichia coli)。
- 請求項4記載のベクターでトランスフェクトした培養大腸菌(Escherichia coli)。
- 大腸菌のアミノ酸を産生する能力を改善する変異体relA遺伝子を含むゲノムを含む組換え大腸菌(Escherichia coli)であって、該変異体relA遺伝子がrelA遺伝子のコーディング配列の547の位置に少なくとも1つの点変異を含み、前記点変異が、配列番号1で表される核酸配列の547の位置でのG→A変異、配列番号2で表される核酸配列の547の位置でのG→T変異である、大腸菌。
- 天然の親株のゲノムよりも少なくとも5%短いように遺伝子工学的に改変されているゲノムを有する、請求項7記載の大腸菌。
- アミノ酸の生合成の方法であって、以下:
(1) 請求項7記載の大腸菌を提供し;
(2) プロモーターによって作動可能に制御されたアミノ酸の1以上の生合成遺伝子を含むプラスミドを該大腸菌に挿入し;及び
(3) 該大腸菌からアミノ酸を発現すること、
を含む、方法。 - 前記アミノ酸が、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Val、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr及びTrpからなる群より選択される、請求項9記載の方法。
- アミノ酸を生合成するための方法であって、以下:
(1) 請求項8記載の大腸菌を提供し;
(2) プロモーターによって作動可能に制御されたアミノ酸の1以上の生合成遺伝子を含むプラスミドを該大腸菌に挿入し;及び
(3) 該大腸菌からアミノ酸を発現させること、
を含む、方法。 - 前記アミノ酸のための1以上の生合成遺伝子が、組換えtacプロモーターによって作動可能に制御されたthr ABCを含む、請求項11記載の方法。
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