CN115678817A - 一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用 - Google Patents

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CN115678817A CN202110860060.0A CN202110860060A CN115678817A CN 115678817 A CN115678817 A CN 115678817A CN 202110860060 A CN202110860060 A CN 202110860060A CN 115678817 A CN115678817 A CN 115678817A
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刘慧敏
尹春筱
康培
郑克义
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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用。所述重组微生物中tpx基因和/或yodD基因的表达被抑制。本发明研究发现抑制菌株中tpx基因或yodD基因可以有效提高菌株生产氨基酸等能力，同时敲除了tpx基因和yodD基因的大肠杆菌，其产苏氨酸的能力可达到27.35g/L，糖酸转化率可达到27.94％，这在苏氨酸生产领域具有重要意义。

Description

一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用。
背景技术
L-苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。
随着苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering ofEscherichia coli for L-threonine production,Mol Syst Biol.2007；3：149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用。
第一方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物中tpx基因和/或yodD基因的表达被抑制。
进一步地，所述tpx基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1具有至少60％的序列同一性；和/或，所述yodD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或与SEQID NO.3具有至少60％的序列同一性。
SEQ ID NO.1所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；SEQ ID NO.3所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示
进一步地，所述重组微生物的出发菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或沙雷氏菌中的一种或多种。
优选地，所述重组微生物的出发菌株为MHZ-0215-2或MHZ-0217-4。
其中MHZ-0215-2菌株公开于中国专利201611250306.8中，MHZ-0217-4菌株公开于中国专利202011388854.3中。
第二方面，本发明提供所述重组微生物的制备方法，包括：
通过CRISPR-Cas9技术敲除微生物中的tpx基因和/或yodD基因。
本发明进一步提供包括所述重组微生物的微生物制剂。
本发明进一步提供所述重组微生物或所述微生物制剂在生产氨基酸中的应用；优选为在生产苏氨酸中的应用。
本发明进一步提供所述重组微生物或所述微生物制剂在提高苏氨酸产量中的应用。
第三方面，本发明提供一种提高菌株氨基酸产量的方法，包括抑制所述菌株中tpx基因和/或yodD基因的表达。
进一步地，所述菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或沙雷氏菌中的一种或多种。
进一步地，所述tpx基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1具有至少60％的序列同一性；和/或，所述yodD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或与SEQID NO.3具有至少60％的序列同一性。
本发明具备如下有益效果：
本发明通过敲除微生物中的tpx基因和/或yodD基因得到一种重组微生物，该重组微生物的苏氨酸产量显著提升，在同时敲出大肠杆菌中tpx基因和yodD基因后，其产苏氨酸的能力可达到27.35g/L，糖酸转化率可达到27.94％，这在苏氨酸生产领域具有重要意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
大肠杆菌的基因组编辑，主要借鉴了Jiang Y等报道的CRISPR-Cas9基因编辑技术(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)。
以下实施例中，所述卡那霉素(Kanamycin)在培养基中的终浓度为50μg/mL，所述壮观霉素(spectinomycin)在培养基中的终浓度为50μg/ml。
以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的高转化率苏氨酸生产菌种的亲代菌株为MHZ-0215-2和MHZ-0217-4，属于W3110(埃希氏菌属(Escherichia))。
实施例中所使用引物序列见下表。
表1实施例中使用引物
Figure BDA0003185503120000031
Figure BDA0003185503120000041
实施例1：以MHZ-0215-2为底盘菌构建tpx基因缺失的菌株MHZ-0221-6
1、pTargetF-N20(tpx)质粒及Donor DNA-1构建
Step1：以pTargetF质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，选用pTF-sgRNA(tpx)-F/pTF-sgRNA(tpx)-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(tpx)，并进行PCR鉴定及测序验证；
Step2：以W3110基因组为模板，选用tpx-UF/tpx-UR引物对，扩增出上游同源臂①；
Step3：以W3110基因组为模板，选用tpx-DF/tpx-DR引物对，扩增出下游同源臂②；
Step4：以①、②为模板，选用tpx-UF/tpx-DR引物对，扩增出up-down全长片段，也称Donor DNA-1。
2、感受态细胞制备及电转化
Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；
Step2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)；
Step3：将pTargetF-N20(tpx)质粒和步骤1中构建得到的Donor DNA-1同时电转入MHZ-0215-2(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
3、重组验证
Step1：使用引物对tpx-F/tpx-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；
Step2：用引物对tpx-F/tpx-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。
4、构建相关质粒丢失
Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；
Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(tpx)质粒已丢失；
Step3：挑取pTargetF-N20(tpx)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；
Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-6(tpx缺失)菌株。
实施例2：以MHZ-0215-2为底盘菌构建yodD基因缺失的菌株MHZ-0221-7
1、pTargetF-N20(yodD)质粒及Donor DNA-2构建
Step1：以pTargetF质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，选用pTF-sgRNA(yodD)-F/pTF-sgRNA(yodD)-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(yodD)，并进行PCR鉴定及测序验证；
Step2：以W3110基因组为模板，选用yodD-UF/yodD-UR引物对，扩增出上游同源臂①；
Step3：以W3110基因组为模板，选用yodD-DF/yodD-DR引物对，扩增出下游同源臂②；
Step4：以①、②为模板，选用yodD-UF/yodD-DR引物对，扩增出up-down全长片段，也称Donor DNA-2。
2、感受态细胞制备及电转化
Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；
Step2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。
Step3：将pTargetF-N20(yodD)质粒和步骤1中构建得到的Donor DNA-2同时电转入MHZ-0215-2(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
3、重组验证
Step1：使用引物对yodD-F/yodD-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；
Step2：用引物对yodD-F/yodD-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。
4、构建相关质粒丢失
Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；
Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(yodD)质粒已丢失；
Step3：挑取pTargetF-N20(yodD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；
Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-7(yodD缺失)菌株。
实施例3：以MHZ-0215-2为底盘菌构建tpx和yodD基因同时缺失的菌株MHZ-0221-8
1、感受态细胞制备及电转化
Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入实施例1中构建得到的MHZ-0221-1感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；
Step2：挑取MHZ-0221-1(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。Step3：将实施例2中构建得到的pTargetF-N20(yodD)质粒和Donor DNA-2同时电转入MHZ-0221-1(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
2、重组验证
Step1：使用引物对yodD-F/yodD-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；
Step2：用引物对yodD-F/yodD-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。
3、构建相关质粒丢失
Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；
Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(yodD)质粒已丢失；
Step3：挑取pTargetF-N20(yodD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；
Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-8(tpx、yodD同时缺失)菌株。
实施例4：以MHZ-0217-4为底盘菌构建tpx基因缺失的菌株MHZ-0221-9
1、pTargetF-N20(tpx)质粒及Donor DNA-1构建
Step1：以pTargetF质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，选用pTF-sgRNA(tpx)-F/pTF-sgRNA(tpx)-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(tpx)，并进行PCR鉴定及测序验证；
Step2：以W3110基因组为模板，选用tpx-UF/tpx-UR引物对，扩增出上游同源臂①；
Step3：以W3110基因组为模板，选用tpx-DF/tpx-DR引物对，扩增出下游同源臂②；
Step4：以①、②为模板，选用tpx-UF/tpx-DR引物对，扩增出up-down全长片段，也称Donor DNA-1。
2、感受态细胞制备及电转化
Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0217-4感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；
Step2：挑取MHZ-0217-4(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。
Step3：将pTargetF-N20(tpx)质粒和步骤1中构建得到的Donor DNA-1同时电转入MHZ-0217-4(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
3、重组验证
Step1：使用引物对tpx-F/tpx-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；
Step2：用引物对tpx-F/tpx-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。
4、构建相关质粒丢失
Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；
Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(tpx)质粒已丢失；
Step3：挑取pTargetF-N20(tpx)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；
Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-9(tpx缺失)菌株。
实施例5：以MHZ-0217-4为底盘菌构建yodD基因缺失的菌株MHZ-0221-10
1、pTargetF-N20(yodD)质粒及Donor DNA-2构建
Step1：以pTargetF质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，选用pTF-sgRNA(yodD)-F/pTF-sgRNA(yodD)-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(yodD)，并进行PCR鉴定及测序验证；
Step2：以W3110基因组为模板，选用yodD-UF/yodD-UR引物对，扩增出上游同源臂①；
Step3：以W3110基因组为模板，选用yodD-DF/yodD-DR引物对，扩增出下游同源臂②；
Step4：以①、②为模板，选用yodD-UF/yodD-DR引物对，扩增出up-down全长片段，也称Donor DNA-2。
2、感受态细胞制备及电转化
Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0217-4感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；
Step2：挑取MHZ-0217-4(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。
Step3：将pTargetF-N20(yodD)质粒和步骤1中构建得到的Donor DNA-2同时电转入MHZ-0217-4(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
3、重组验证
Step1：使用引物对yodD-F/yodD-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；
Step2：用引物对yodD-F/yodD-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。
4、构建相关质粒丢失
Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；
Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(yodD)质粒已丢失；
Step3：挑取pTargetF-N20(yodD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；
Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-10(yodD缺失)菌株。
实施例6：以MHZ-0217-4为底盘菌构建tpx和yodD基因同时缺失的菌株MHZ-0221-11
1、感受态细胞制备及电转化
Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入实施例4中构建得到的MHZ-0222-1感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；
Step2：挑取MHZ-0222-1(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD650为0.4后制备电转感受态细胞(感受态制备方法参照《分子克隆III》)。
Step3：将实施例2中构建得到的pTargetF-N20(yodD)质粒和Donor DNA-2同时电转入MHZ-0222-1(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。
2、重组验证
Step1：使用引物对yodD-F/yodD-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；
Step2：用引物对yodD-F/yodD-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。
3、构建相关质粒丢失
Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；
Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(yodD)质粒已丢失；
Step3：挑取pTargetF-N20(yodD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-11(tpx、yodD同时缺失)菌株。
实施例1-6中所获得的产苏氨酸基因改造菌株如表2所示。
表2本发明构建的基因工程菌
Figure BDA0003185503120000131
Figure BDA0003185503120000141
实施例7：产L-苏氨酸基因工程菌摇瓶发酵验证
Step1:从冻存管中取实施例1-6涉及的MHZ-0215-2、MHZ-0221-6、MHZ-0221-7、MHZ-0221-8、MHZ-0217-4、MHZ-0221-9、MHZ-0221-10、MHZ-0221-11共8株菌，在LB平板上划线活化，37℃培养18-24h；
Step2:将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基(见表3)的500mL摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，使OD650控制在2以内；
Step3:将2mL种子液转接到含20mL发酵培养基(见表4)的500mL摇瓶中，往复摇床37℃，100rpm发酵培养直至残糖耗尽，发酵结束后测定样品OD650，并用使用HPLC测定L-苏氨酸含量，用生物传感仪方法测定残糖量。为了确保实验的可靠性，对摇瓶进行3次重复实验，其产酸及转化率结果的平均值见表5。
表3种子培养基(g/L)
Figure BDA0003185503120000142
Figure BDA0003185503120000151
表4发酵培养基(g/L)
成分 浓度
葡萄糖 85
玉米浆 6
豆粕水解液 7.7
七水硫酸镁 0.5
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 1.0
天冬氨酸 10
FeSO<sub>4</sub>、MnSO<sub>4</sub> 30mg/L
生物素 50μg
硫胺素 500μg
pH 7.2
表5产苏氨酸基因工程菌生产力比较
Figure BDA0003185503120000152
注：*表示P值<0.01，说明其与对照相比有明显差异
由表5可知，本发明所述新型大肠杆菌L-苏氨酸产量均高于对照菌株。
其中以MHZ-0215-2为底盘菌构建得到的tpx基因缺失的改造菌株MHZ-0221-6苏氨酸产量为16.32g/L，摇瓶转化率为19.20％，产量较出发菌提高18.26％，转化率提高18.30％。
yodD基因缺失的改造菌株MHZ-0221-7苏氨酸产量为16.64g/L，摇瓶转化率为19.58％，产量较出发菌提高20.58％，转化率提高20.64％。
tpx和yodD基因同时缺失的改造菌株MHZ-0221-8苏氨酸产量为17.83g/L，摇瓶转化率为20.97％，产量较出发菌提高29.20％，转化率提高29.21％。
以MHZ-0217-4为底盘菌构建得到的tpx基因缺失的改造菌株MHZ-0221-9苏氨酸产量为22.38g/L，摇瓶转化率为26.33％，产量较出发菌提高10.63％，转化率提高10.63％。
yodD基因缺失的改造菌株MHZ-0221-10苏氨酸产量为22.36g/L，摇瓶转化率为26.31％，产量较出发菌提高10.53％，转化率提高10.55％。
tpx和yodD基因同时缺失的改造菌株MHZ-0221-11苏氨酸产量为23.30g/L，摇瓶转化率为27.41％，产量较出发菌提高15.18％，转化率提高15.17％。
由摇瓶结果可以得出，tpx基因和yodD基因缺失可以明显提高重组大肠杆菌苏氨酸的生产能力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 梅花（上海）生物科技有限公司
<120> 一种重组微生物及其制备方法和在苏氨酸生产中的应用
<130> KHP211117785.3
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 507
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgtcacaaa ccgttcattt ccagggcaac ccggttacag tcgccaattc catcccgcag 60
gcgggtagca aagcgcagac ttttactctc gtggcaaaag atctgtctga cgtcaccctc 120
ggtcagtttg cgggtaaacg caaagtgctg aacattttcc cgagtattga taccggtgtt 180
tgcgccgcat cagtacgtaa gtttaaccaa ctggcaactg agatcgacaa caccgttgtg 240
ctgtgtatct ctgccgatct gccgttcgcc cagtctcgtt tctgcggcgc agaaggtctg 300
aacaacgtta tcaccctctc cactttccgt aacgctgaat ttctgcaagc ttacggtgtg 360
gcaattgctg atggcccact gaaaggtctg gcagcgcgtg ccgttgtggt tattgacgaa 420
aatgacaatg tgattttcag ccagctggtg gatgaaatca ccaccgagcc ggattacgaa 480
gcagctctgg ctgtactgaa agcataa 507
<210> 2
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Gln Thr Val His Phe Gln Gly Asn Pro Val Thr Val Ala Asn
1 5 10 15
Ser Ile Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ala Gln Thr Phe Thr Leu Val Ala
20 25 30
Lys Asp Leu Ser Asp Val Thr Leu Gly Gln Phe Ala Gly Lys Arg Lys
35 40 45
Val Leu Asn Ile Phe Pro Ser Ile Asp Thr Gly Val Cys Ala Ala Ser
50 55 60
Val Arg Lys Phe Asn Gln Leu Ala Thr Glu Ile Asp Asn Thr Val Val
65 70 75 80
Leu Cys Ile Ser Ala Asp Leu Pro Phe Ala Gln Ser Arg Phe Cys Gly
85 90 95
Ala Glu Gly Leu Asn Asn Val Ile Thr Leu Ser Thr Phe Arg Asn Ala
100 105 110
Glu Phe Leu Gln Ala Tyr Gly Val Ala Ile Ala Asp Gly Pro Leu Lys
115 120 125
Gly Leu Ala Ala Arg Ala Val Val Val Ile Asp Glu Asn Asp Asn Val
130 135 140
Ile Phe Ser Gln Leu Val Asp Glu Ile Thr Thr Glu Pro Asp Tyr Glu
145 150 155 160
Ala Ala Leu Ala Val Leu Lys Ala
165
<210> 3
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgaaaaccg caaaagagta cagcgatacc gcaaaacgtg aggtcagcgt cgatgtcgat 60
gccctgctgg cggcgatcaa tgaaattagc gaaagcgaag ttcatcgcag ccagaacgat 120
tctgaacacg ttagcgtcga tggacgtgaa tatcatacat ggcgtgaatt ggcggatgcc 180
ttcgaactgg atattcatga cttcagcgtc tctgaagtga atcgttga 228
<210> 4
<211> 75
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Met Lys Thr Ala Lys Glu Tyr Ser Asp Thr Ala Lys Arg Glu Val Ser
1 5 10 15
Val Asp Val Asp Ala Leu Leu Ala Ala Ile Asn Glu Ile Ser Glu Ser
20 25 30
Glu Val His Arg Ser Gln Asn Asp Ser Glu His Val Ser Val Asp Gly
35 40 45
Arg Glu Tyr His Thr Trp Arg Glu Leu Ala Asp Ala Phe Glu Leu Asp
50 55 60
Ile His Asp Phe Ser Val Ser Glu Val Asn Arg
65 70 75
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
agtcgggttg ccctggaaat gaagttttag agctagaaat agcaa 45
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttcatttcca gggcaacccg actagtatta tacctaggac tgagct 46
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cgggttgccc tggaaatgaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
accgatgaca accgtctgtg 20
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atattaaatt atgctgatta tctttcctgt ttaca 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
acaggaaaga taatcagcat aatttaatat gcctg 35
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atcgtctgaa cgtgttgacg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atccgctcac tgataagatg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gtgatttgcg ctacgcagaa 20
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
agtatggacg tgaatatcat acagttttag agctagaaat agcaa 45
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tgtatgatat tcacgtccat actagtatta tacctaggac tgagct 46
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
atggacgtga atatcataca 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
aagaccgttt catcgcataa 20
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
tcagagacgc tgaagcatct ttcctcgcaa ccgtt 35
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ttgcgaggaa agatgcttca gcgtctctga agtga 35
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
accttgtagc cccaacgttt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gaaccgaatc gagtatgttg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
atgatgcgtg gaaaaccgtc 20

Claims (10)

1.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中tpx基因和/或yodD基因的表达被抑制。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述tpx基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示或与SEQ ID NO.1具有至少60％的序列同一性；和/或，所述yodD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或与SEQ ID NO.3具有至少60％的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的出发菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或沙雷氏菌中的一种或多种。
4.权利要求1-3任一项所述重组微生物的制备方法，其特征在于，包括：
通过CRISPR-Cas9技术敲除微生物中的tpx基因和/或yodD基因。
5.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂含有权利要求1-3任一项所述重组微生物，或权利要求4所述制备方法制备得到的重组微生物。
6.权利要求1-3任一项所述的重组微生物或权利要求5所述微生物制剂在生产氨基酸中的应用；优选为在生产苏氨酸中的应用。
7.权利要求1-3任一项所述的重组微生物或权利要求5所述微生物制剂在提高苏氨酸产量中的应用。
8.一种提高菌株氨基酸产量的方法，其特征在于，包括：
抑制所述菌株中tpx基因和/或yodD基因的表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或沙雷氏菌中的一种或多种。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述tpx基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示或与SEQ ID NO.1具有至少60％的序列同一性；和/或，所述yodD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示或与SEQ ID NO.3具有至少60％的序列同一性。
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