JP2001238665A - アミノ酸高蓄積実用パン酵母 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 アルギナーゼ遺伝子（ＣＡＲ１）を破壊
した酵母を用いて、アミノ酸蓄積量の高い、冷凍生地耐
性実用パン酵母を製造する。 【効果】 凍結融解における生地発酵力の低下が少ない
冷凍生地耐性実用パン酵母を用いて効率よく美味なパン
を製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規にしてきわめ
て有用な冷凍生地耐性実用パン酵母に関するものであ
る。本発明に係る実用パン酵母は、冷凍耐性にすぐれ、
凍結融解における生地発酵力の低下が少ないという特徴
を有し、冷凍パン生地からすぐれた品質のパンを製造す
るのに有利に使用できる。

【０００２】

【従来の技術】近年、製パン業界においては、製パン工
程の合理化及び焼きたてパンの供給という生産者及び消
費者サイドからの要求から、冷凍生地によるパンの製造
が注目され、一部は既に実施されている。そして、この
場合、パン酵母としては従来のパン酵母を使用したので
は所期の目的を達成することはできず、冷凍耐性を有す
るパン酵母が使用されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来か
ら知られている冷凍耐性酵母は、未だ冷凍耐性が充分で
あるとはいえず、改良の余地が残されており、現時点に
おいて、最終的に美味なパンを作ることのできる冷凍生
地耐性実用パン酵母は未だ得られていないのが現状であ
る。本発明は、このような技術の現状に鑑み、冷凍耐性
にすぐれた新規な冷凍生地耐性実用パン酵母を創製し、
また、このパン酵母を用いて冷凍生地を創製し、更にま
たこの冷凍生地を用いて美味なパンを製造するトータル
システムを新たに構築する目的でなされたものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、すぐれた冷凍生地
耐性実用パン酵母を開発するために各方面から検討した
結果、本発明者らは、酵母の冷凍耐性に菌体内アミノ酸
蓄積量が影響する点に着目した。そして、アミノ酸の
内、アルギニンにはじめて着目し、アルギニン代謝酵素
のひとつであるアルギナーゼをコードする遺伝子（ＣＡ
Ｒ１遺伝子）を破壊した酵母を創製したところ、このア
ルギナーゼ遺伝子（ＣＡＲ１）破壊株は、グルタミン酸
やアルギニン蓄積量が野生型株に比して高く、凍結融解
における生地発酵力の低下が野生型株に比して顕著に少
いという新知見を得た。

【０００５】本発明は、この新規ＣＡＲ１遺伝子破壊株
が卓越した冷凍耐性を示すという上記した有用新知見に
基づき、更に研究の結果、遂に完成されたものである。
以下、本発明について詳述する。

【０００６】現在わが国で市販されている実用パン酵母
は２倍体がほとんどであり、しかもその大半がａ／α型
である。このような当業界の現状において本発明はなさ
れたものであって、本発明は、２倍体にしたとき実用パ
ン酵母となる１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊
操作してなるＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母に関するも
のであり、また、ＣＡＲ１遺伝子の遺伝子破壊操作方法
を新たに提供するものである。更に、本発明は、このＣ
ＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母を１もしくは２以上用いて
交雑してなる２倍体以上の倍数体冷凍生地耐性実用パン
酵母に関するものである。

【０００７】更に本発明は、上記した２倍体以上の倍数
体冷凍生地耐性実用パン酵母を用いてパン生地を作り、
これを前発酵し、次いで冷凍してなる冷凍生地耐性実用
パン酵母含有冷凍パン生地、及びこの冷凍パン生地を常
法にしたがって解凍、発酵、焼成してなる風味のすぐれ
たパンに関するものである。

【０００８】本発明を実施するには、先ず、２倍体にし
たとき実用パン酵母となる１倍体酵母を選別する必要が
あるが、これは常法にしたがって行えばよく、型のきま
った１倍体酵母との接合の有無により、ａ型かα型を確
定する。

【０００９】ＣＡＲ１遺伝子の遺伝子破壊操作は、１倍
体酵母が有するＣＡＲ１遺伝子（アルギナーゼ遺伝子）
内に、ＵＲＡ３（ウリジル酸合成酵素）（Gene 29 : 11
3-124(1984))やＡＤＥ２、ＬＹＳ２などの栄養要求性マ
ーカー遺伝子を挿入すればよい。その結果、ＣＡＲ１遺
伝子は破壊されて発現しなくなり、代りに挿入されたＵ
ＲＡ３や栄養要求性マーカー遺伝子が発現して、遺伝子
破壊を確認することができる。なお、挿入するＵＲＡ３
や他のマーカー遺伝子は、セルフクローニングを達成す
るために、サッカロミセス・セレビシエ、特にパン酵母
のものが好ましい。

【００１０】１倍体菌株からｕｒａ３（遺伝子マーカー
としてのＵＲＡ３欠損株）を選択するには、５−フルオ
ロオロチン酸含有培地で選択すればよく、この培地で生
育した菌株は、自然突然変異によってＵＲＡ３遺伝子を
欠損している。これらの菌株は、ウラシルを除く培地上
では生育しないが、ＵＲＡ３を含有するプラスミド、Ｙ
Ｃｐ５０等によって形質転換することにより、ウラシル
を除く培地上で生育出来るようになるので、ＵＲＡ３の
欠損が確認できる。

【００１１】ＣＡＲ１遺伝子の破壊は、ＣＡＲ１遺伝子
が発現してアルギナーゼを作り、これがアルギニンを分
解することを防止すれば、その結果、アミノ酸高蓄積株
になって目的を達成することができるので、ＣＡＲ１の
全部もしくは１部を削除してもよいし、本発明実施例に
詳述するようにＵＲＡ３をＣＡＲ１遺伝子全部ないし一
部領域内に挿入することによって、ＣＡＲ１遺伝子の破
壊を行ってもよい。

【００１２】ＣＡＲ１遺伝子としては、酵母から切り出
したり、化学合成法やＰＣＲ法等によって製造したＣＡ
Ｒ１遺伝子の全部領域又は一部領域を使用する。このク
ローニングした領域をプラスミドに挿入し、次いでこの
領域にＵＲＡ３遺伝子を挿入し、得られたプラスミドを
必要に応じて大腸菌等で大量にふやした後、このプラス
ミドから挿入遺伝子のＤＮＡ断片のみを切り出し、単離
したものをそのまま酢酸リチウム法によって、２倍体に
したとき実用パン酵母となる１倍体酵母（例えば、上記
によって得たｕｒａ３株（ＵＲＡ３遺伝子欠損株））に
形質転換する（図１）。

【００１３】ＣＡＲ１遺伝子は、アルギニン代謝酵素の
ひとつであるアルギナーゼをコードするアルギナーゼ遺
伝子であって、その塩基配列は、配列表の配列番号１、
図２に示される。また、それに対応する蛋白質（アルギ
ナーゼ）のアミノ酸配列は配列番号２、及び、図３、図
４に示される。またＵＲＡ３遺伝子は、ウリジル酸合成
酵素をコードする遺伝子であって、その塩基配列は、配
列番号３、及び、図５、図６（上段）に示され、それに
対応する蛋白質（ウリジル酸合成酵素）のアミノ酸配列
は、配列番号４、及び図５、図６（下段）に示される。

【００１４】１倍体酵母に入ったＣＡＲ１（前部）−Ｕ
ＲＡ３−ＣＡＲ１（後部）は、細胞分裂に際し、１倍体
酵母のＣＡＲ１（全部ないしは一部領域）にＵＲＡ３を
余すように結合・組換えをおこし、これらの結合が切断
されて分かれてしまい（つまり、ＣＡＲ１を前部と後部
に、ＵＲＡ３をはさんで完全にわけてしまい）、遺伝子
破壊は完成する。したがって、ＣＡＲ１遺伝子が発現す
ることはない。

【００１５】ここに得られるＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体
酵母は、既にａ型かα型かは定まっており、また、２倍
体にしたとき実用パン酵母になるすぐれた性質は有する
もので、遺伝子破壊操作ではＣＡＲ１遺伝子のみが破壊
され、その他のすぐれた性質を生む遺伝子はそのままで
ある。本発明では、２倍体にしたとき実用パン酵母とな
る１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してな
る酵母を１もしくは２以上用いて交雑し、２倍体以上の
倍数体冷凍生地耐性実用パン酵母を得る。

【００１６】これらの内、好ましい酵母としては、例え
ばａ型ＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母とα型ＣＡＲ１遺
伝子破壊１倍体酵母を交雑して得られた２倍体酵母が非
限定的に例示される。得られた２倍体パン酵母の内の１
株（ＣＡ１１８株）を、Saccharomyces cerevisiae CA1
18と命名し、これを工業技術院生命工学工業技術研究所
にＦＥＲＭ ＢＰ−７０４２として国際寄託した。

【００１７】このようにして造成した新規な倍数体冷凍
生地耐性実用パン酵母は、ＣＡＲ１遺伝子が破壊されて
おり、冷凍耐性、特にパン生地を前発酵したものを冷凍
した冷凍パン生地における冷凍耐性にきわめてすぐれて
いる。したがって、本発明に係る実用パン酵母は、前発
酵した生地中でも凍結状態によく耐え、解凍して発酵さ
せたとき、よくその能力を発揮し、これを焼上げたと
き、美味な各種パンを得ることができる。

【００１８】本発明に係る冷凍パン生地は、上記した倍
数体冷凍生地耐性実用パン酵母を使用するほかは常法に
したがって製造すればよいし、パンの製造も、本発明に
係る冷凍パン生地を使用するほかは冷凍生地製パンの常
法にしたがって行えばよい。以下、本発明の実施例につ
いて述べる。

【００１９】

【実施例１】（１）実用パン酵母１倍体株のｕｒａ３
（ＵＲＡ３欠損株）株の取得 交雑して二倍体株とした場合、市販のパン酵母となりう
る性能を保有する野生型の１倍体株（実用パン酵母１倍
体株）について、そのｕｒａ３株を取得した。すなわ
ち、１倍体株をＹＰＤ培地（１％イーストエキス、２％
ペプトン、２％グルコース）で培養した後、５−フルオ
ロオロチン酸を含む培地（０．７％ ＹＥＡＳＴ ＮＩ
ＴＲＯＧＥＮ ＢＡＳＥ（ＤＩＦＣＯ）、２％グルコー
ス、０．１％５−フルオロオロチン酸、０．０５％ウラ
シル、２％寒天）に塗沫した後、３０℃で３日間培養
し、生育したコロニーを選別した。

【００２０】（２）ＣＡＲ１遺伝子のクローニング ＣＡＲ１遺伝子を破壊するために、ＣＡＲ１遺伝子の一
部領域をクローニングした。クローニングはＰＣＲ法に
より行った。すなわち酵母染色体ＤＮＡを鋳型として、
下記の配列をプライマーとして用いた。９４℃で５分間
インキュベートした後に、９４℃１分、４５℃１分、７
２℃１分の条件で３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。
これらのプライマーは配列表の配列番号５、６に示し
た。

【００２１】（３）ＣＡＲ１破壊用ベクターの作成（図
７） ＰＣＲ反応で得られた約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を市販
されているプラスミドベクターｐＧＥＭ−Ｔに挿入し、
プラスミドｐＡＲＧ１を作製した。ここに、公知のプラ
スミドＹＥｐ２４を制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化して得
られるＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡ断片を挿入することによ
り、プラスミドｐＡＲＧ２を作製した。

【００２２】（４）ＣＡＲ１遺伝子破壊１倍体株の作成 プラスミドｐＡＲＧ２を制限酵素ＰｖｕIIで消化するこ
とにより得られる挿入遺伝子のＤＮＡ断片のみを切り出
し、単離したものを酢酸リチウム法により１倍体酵母
（ｕｒａ３）に導入した。ここでウラシル要求性を示さ
ない株を選抜することにより、形質転換によりＣＡＲ１
遺伝子が破壊された株を選別することができた。

【００２３】（５）交雑による２倍体株の作成 こうして得られたＣＡＲ１遺伝子破壊された１倍体株を
交雑することにより２倍体の実用パン酵母を得た。同様
に野生型株の１倍体を交雑することにより親株となる２
倍体の実用パン酵母を得た。すなわち野生型株の１倍体
同士を掛け合わせたＴ１１８株と、遺伝子組換えにより
ＣＡＲ１遺伝子が破壊された１倍体同士を掛け合わせた
ＣＡ１１８株を造成した。

【００２４】上記した菌株は、下記に示すとおりであ
る。これらの菌株は、いずれも農林水産省 食品総合研
究所 酵母研究室に保管されており、希望者は容易に入
手することができるだけでなく、ＣＡ１１８株は生命研
にＦＥＲＭ ＢＰ−７０４２として寄託されている。ま
た、親株であるＴ１１８株も、Saccharomyces cerevisi
ae T118として同じく生命研に寄託されているので（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６０９６）、本実施例その他本明細書の
記載によれば、容易に本発明を実施することができ、本
発明の効果を確認することができる。

【００２５】 （菌株） 1n T007 ａ型 wild type T007ca ａ型 ΔCAR1 T018 α型 wild type T018ca α型 ΔCAR1 2n T118 T007×T018 CA118 T007ca×T018ca

【００２６】

【実施例２】（２倍体株の培養試験）流加培養試験は、
ＹＭＰＤ培地（０．３％、イーストエキス、０．３％マ
ルトエキス、０．５％ペプトン、３％グルコース）で培
養した酵母菌体１．２ｇを種酵母として糖蜜、ウレア、
リン酸１ナトリウム２水和物を用いて、糖蜜を連続流加
した。バッチ培養試験はＹＭＰＤ培地で３０℃４８時間
培養することにより、酵母菌体を得た。

【００２７】（１）アミノ酸含量 培養した菌体を集菌した後、熱水抽出（１００℃、５
分）を行い、菌体内のアミノ酸をアミノ酸アナライザー
にて測定した。得られた結果を図８に示す。なお、図
中、各株におけるアミノ酸含量の測定結果は、それぞ
れ、左から順にＧｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏの結果を示す。

【００２８】流加培養した場合にはＴ１１８株とＣＡ１
１８株を比較すると遊離のグルタミン酸の含量が増大し
ていることがわかる。また、実験室レベルで行われるＹ
ＭＰＤ培地における培養試験を実施し、同様にアミノ酸
含量を測定した。このときは培地中の窒素源の形態が違
うため、細胞内の遊離アミノ酸のバランスが流加培養時
とまったく異なることがわかる。Ｂａｔｃｈ培養時には
ＣＡＲ１遺伝子破壊により菌体内のアルギニン含量が増
大していた。このように培養法の違いにより菌体内遊離
アミノ酸のバランスはまったく異なるため、実用化に即
した冷凍耐性を判定するためには実用レベルを模した培
養条件で試験を行う必要がある。

【００２９】（２）発酵過程 流加培養により得られた菌体を用いて、液系での発酵試
験を行った。すなわち、酵母菌体をＧ１０培地（１０％
グルコース）に接種し、３０℃で振とう培養した。ここ
で１０分おきに菌体をサンプリングして、アミノ酸含量
を測定した。

【００３０】実際冷凍生地における製パン時には、冷凍
前に一度パン生地中で発酵する過程（前発酵）が入る。
このとき当然菌体内の遊離アミノ酸含量は変化すること
が考えられ、特に凍結直前の遊離アミノ酸含量が冷凍生
地耐性を左右すると考えられる。そこで培養終了時に最
も蓄積量の差が大きいグルタミン酸について発酵過程に
おける消長を観察した。得られた結果を図９に示す。Ｔ
１１８株とＣＡ１１８株を比較すると、初発でグルタミ
ン酸の含量の差が最も大きく、発酵が進むにしたがいそ
の差は縮まっていくことが判る。

【００３１】

【実施例３】実施例１で造成したＣＡＲ１遺伝子破壊株
とその野生型株の２倍体の流加培養試験で得られた菌体
について、冷凍生地耐性について評価した。実施例１の
実験結果において、実験室レベルで行われるバッチ培養
と実際にパン酵母製造時に行われる糖蜜を用いた流加培
養とでは、酵母細胞内の遊離アミノ酸の構成比がまった
く異なるため、バッチ培養した菌体を用いた冷凍生地試
験は無意味であるため、今回流加培養した菌体を用いて
冷凍生地耐性を評価した。

【００３２】（冷凍生地試験） 凍結区：低糖生地の配合（小麦粉１００ｇ、イースト２
ｇ、砂糖６ｇ、塩２ｇ、水６５ｍｌ）で混合したパン生
地を４０ｇずつ分割し、３０℃の恒温槽で６０分または
１２０分発酵させた後、−２０℃で凍結保存した。凍結
２週間後、生地を３０℃で１時間解凍し、ファーモグラ
フ（ＡＴＴＯ社製）で炭酸ガス発生量（ｍｌ／１２０
分）を測定した。

【００３３】非凍結区：低糖生地の配合で混合したパン
生地を４０ｇずつ分割し、３０℃の恒温槽で６０分また
は１２０分発酵させた後、ファーモグラフ（ＡＴＴＯ社
製）で炭酸ガス発生量（ｍｌ／１２０分）を測定した。
冷凍生地耐性については非凍結区の２時間発酵で生成し
た炭酸ガス量に対する凍結区の２時間発酵で生成した炭
酸ガス量の百分率で表した。得られた結果を下記表１に
示す。

【００３４】 （表１） 第１表：生地試験 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 生地試験 前発酵 前発酵60 冷凍生 前発酵120 前発酵120 冷凍生 炭酸ガス発生量 60分非 分凍結区 地耐性 分非凍結区 分凍結区 地耐性 (ml/120分) 凍結区 ％ ％ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ T118 159 84 53 146 26 17 CA118 150 101 67 139 38 27 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００３５】上記結果から明らかなようにＴ１１８株と
ＣＡ１１８株を比較した場合、ＣＡＲ１遺伝子の破壊に
よりグルタミン酸の蓄積が向上したＣＡＲ１遺伝子破壊
株は、野生型株に比較して冷凍生地耐性が向上してい
た。また前発酵時間が短いときのほうがより遺伝子破壊
効果が顕著であり、これは発酵過程において、初発でグ
ルタミン酸の含量の差が最も大きく、発酵が進むにした
がいその差は縮まっていく事実と一致する。

【００３６】以上の結果より、ＣＡＲ１遺伝子を破壊す
ることにより酵母細胞中のグルタミン酸含量を増大させ
ることに成功し、結果、冷凍生地耐性を向上させること
ができた。

【００３７】

【実施例４】（冷凍生地耐性実用パン酵母含有冷凍パン
生地）本発明に係るパン酵母ＣＡ１１８（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７０４２）及びその親株であるＴ１１８を圧搾して
市販イーストと同様の形状となし、これを用いて下記の
配合及び製パン条件にて冷凍生地製パン試験をおこなっ
た。

【００３８】（配合割合） 小麦粉 １００ｇ 砂糖 ５ｇ 食塩 ２ｇ イースト ２ｇ ショートニング ５ｇ 水 ６７ｍｌ

【００３９】（製パン条件） 凍結前発酵 ６０分 冷凍期間 １週間 解凍 ３０℃、９０分 丸め、ベンチ ３０分 成型 ホイロ ５５分 焼成 ２５分

【００４０】焼成したパンを比較すると、親株であるＴ
１１８株を用いて製造したパンに比して、アルギナーゼ
遺伝子破壊株であるＣＡ１１８株を用いて製造したパン
は明らかに品質が優れており、高い冷凍生地耐性を示し
た。

【００４１】

【発明の効果】本発明に係る冷凍生地耐性実用パン酵母
は、ＣＡＲ１が破壊されているため、アミノ酸蓄積量が
高く、凍結融解における生地発酵力の低下がきわめて少
なく、すぐれた冷凍耐性を示す。

【００４２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈１１０〉 National Food Research Institute, Oriental Yeast Co., Ltd. 〈１２０〉 Baker's Yeast Containing Large Amount of Amino Acids 〈１３０〉 ６２６６ 〈１４１〉 ２０００−３−２ 〈１６０〉 ６ 〈２１０〉 １ 〈２１１〉 １００２ 〈２１２〉 ＤＮＡ 〈２１３〉 Saccharomyces cerevisiae 〈４００〉 １ atggaaacag gacctcatta caactactac aaaaatcgcg aattg 45 tccatcgttc tggctccatt cagcggcggt cagggtaagc ttggt 90 gtcgagaagg gccctaaata catgcttaag catggtctgc aaaca 135 agcatagagg atttgggctg gtctacggaa ttagagccct caatg 180 gacgaggccc aatttgtggg aaagttgaaa atggagaagg actcc 225 acaactgggg gttcctctgt tatgatagac ggtgtcaagg ctaaa 270 agagcagatt tggttggtga agccaccaag ttggtgtaca actcc 315 gtgtcgaaag tggtccaggc gaacagattc cccttgacct tgggt 360 ggtgatcatt caatagccat tggtactgta tccgcggttt tggac 405 aaataccccg atgctggtct tttatggata gacgcccacg ctgat 450 ataaacacca tagaaagcac cccctctgga aacttgcacg gctgt 495 cccgtgtcat tcctaatggg tttgaacaag gatgtcccac attgt 540 cccgagtcgc tcaaatgggt tccaggcaac ttgagcccaa aaaag 585 atcgcgtata ttgggttgag agatgttgat gccggagaaa agaaa 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100 105 Val Ser Lys Val Val Gln Ala Asn Arg Phe Pro Leu Thr Leu Gly 110 115 120 Gly Asp His Ser Ile Ala Ile Gly Thr Val Ser Ala Val Leu Asp 125 130 135 Lys Tyr Pro Asp Ala Gly Leu Leu Trp Ile Asp Ala His Ala Asp 140 145 150 Ile Asn Thr Ile Glu Ser Thr Pro Ser Gly Asn Leu His Gly Cys 155 160 165 Pro Val Ser Phe Leu Met Gly Leu Asn Lys Asp Val Pro His Cys 170 175 180 Pro Glu Ser Leu Lys Trp Val Pro Gly Asn Leu Ser Pro Lys Lys 185 190 195 Ile Ala Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Ala Gly Glu Lys Lys 200 205 210 Ile Leu Lys Asp Leu Gly Ile Ala Ala Phe Ser Met Tyr His Val 215 220 225 Asp Lys Tyr Gly Ile Asn Ala Val Ile Glu Met Ala Met Lys Ala 230 235 240 Val His Pro Glu Thr Asn Glu Glu Glu Pro Ile Met Cys Ser Tyr 245 250 255 Asp Val Asp Gly Val Asp Pro Leu Tyr Ile Pro Ala Thr Gly Thr 260 265 270 Pro Val Arg Gly Gly Leu Thr Leu Arg Glu Gly Leu Phe Leu Val 275 280 285 Glu Arg Leu Ala Glu Ser Gly Asn Leu Ile Ala Leu Asp Val Val 290 295 300 Glu Cys Asn Pro Asp Leu Ala Ile His Asp Ile His Val Ser Asn 305 310 315 Thr Ile Ser Ala Gly Cys Ala Ile Ala Arg Cys Ala Leu Gly Glu 320 325 330 Thr Leu Leu 333 〈２１０〉 ３ 〈２１１〉 ８０４ 〈２１２〉 ＤＮＡ 〈２１３〉 Saccharomyces cerevisiae 〈４００〉 ３ atgtcgaaag ctacatataa ggaacgtgct gctactcatc ctagt 45 cctgttgctg ccaagctatt taatatcatg cacgaaaagc aaaca 90 aacttgtgtg cttcattgga tgttcgtacc accaaggaat tactg 135 gagttagttg aagcattagg tcccaaaatt tgtttactaa aaaca 180 catgtggata tcttgactga tttttccatg gagggcacag ttaag 225 ccgctaaagg cattatccgc caagtacaat tttttactct tcgaa 270 gacagaaaat ttgctgacat tggtaataca gtcaaattgc agtac 315 tctgcgggtg tatacagaat agcagaatgg gcagacatta cgaat 360 gcacacggtg tggtgggccc aggtattgtt agcggtttga agcag 405 gcggcagaag aagtaacaaa ggaacctaga ggccttttga tgtta 450 gcagaattgt catgcaaggg ctccctatct actggagaat atact 495 aagggtactg ttgacattgc gaagagcgac aaagattttg ttatc 540 ggctttattg ctcaaagaga catgggtgga agagatgaag gttac 585 gattggttga ttatgacacc cggtgtgggt ttagatgaca aggga 630 gacgcattgg gtcaacagta tagaaccgtg gatgatgtgg tctct 675 acaggatctg acattattat tgttggaaga ggactatttg caaag 720 ggaagggatg ctaaggtaga gggtgaacgt tacagaaaag caggc 765 tgggaagcat atttgagaag atgcggccag caaaactaa 804 〈２１０〉 ４ 〈２１１〉 ２７６ 〈２１２〉 ＰＲＴ 〈２１３〉 Saccharomyces cerevisiae 〈４００〉 ４ Met Ser Lys Ala Thr Tyr Lys Glu Arg Ala Ala Thr His Pro Ser 5 10 15 Pro Val Ala Ala Lys Leu Phe Asn Ile Met His Glu Lys Gln Thr 20 25 30 Asn Leu Cys Ala Ser Leu Asp Val Arg Thr Thr Lys Glu Leu Leu 35 40 45 Glu Leu Val Glu Ala Leu Gly pro Lys Ile Cys Leu Leu Lys Thr 50 55 60 His Val Asp Ile Leu Thr Asp Phe Ser Met Glu Gly Thr Val Lys 65 70 75 Pro Leu Lys Ala Leu Ser Ala Lys Tyr Asn Phe Leu Leu Phe Glu 80 85 90 Asp Arg Lys Phe Ala Asp Ile Gly Asn Thr Val Lys Leu Gln Tyr 95 100 105 Ser Ala Gly Val Tyr Arg Ile Ala Glu Trp Ala Asp Ile Thr Asn 110 115 120 Ala His Gly Val Val Gly Pro Gly Ile Val Ser Gly Leu Lys Gln 125 130 135 Ala Ala Glu Glu Val Thr Lys Glu Pro Arg Gly Leu Leu Met Leu 140 145 160 Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Ser Leu Ser Thr Gly Glu Tyr Thr 165 170 175 Lys Gly Thr Val Asp Ile Ala Lys Ser Asp Lys Asp Phe Val Ile 180 185 190 Gly Phe Ile Ala Gln Arg Asp Met Gly Gly Arg Asp Glu Gly Tyr 195 200 205 Asp Trp Leu Ile Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Asp Lys Gly 210 215 220 Asp Ala Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Val Asp Asp Val Val Ser 225 230 235 Thr Gly Ser Asp Ile Ile Ile Val Gly Arg Gly Leu Phe Ala Lys 240 245 250 Gly Arg Asp Ala Lys Val Glu Gly Glu Arg Tyr Arg Lys Ala Gly 255 260 265 Trp Clu Ala Tyr Leu Arg Arg Cys Gly Gln Gln Asn 270 275 276 〈２１０〉 ５ 〈２１１〉 ２０ 〈２１２〉 ＤＮＡ 〈２１３〉 Artificial sequence 〈４００〉 １ ctttctatca agatctaaga 20 〈２１０〉 ６ 〈２１１〉 ２０ 〈２１２〉 ＤＮＡ 〈２１３〉 Artificial sequence 〈４００〉 ６ atggctattg aatgatcacc 20

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＡＲ１遺伝子破壊株の作成図である。

【図２】ＣＡＲ１遺伝子の塩基配列を示す。

【図３】ＣＡＲ１遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸
配列１を示す。

【図４】ＣＡＲ１遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸
配列２を示す。

【図５】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列及びそれぞれ対応す
るアミノ酸配列１を示す。

【図６】ＵＲＡ３遺伝子の塩基配列及びそれぞれ対応す
るアミノ酸配列２を示す。

【図７】ＣＡＲ１遺伝子破壊用ベクターの作成図であ
る。

【図８】アミノ酸蓄積量を示す。

【図９】グルタミン酸の消長を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｒ 1:865） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 高野 博幸 茨城県つくば市吾妻３丁目19−１パークヒ ル吾妻２−303 (72)発明者 渡辺 肇 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号オリエ ンタル酵母工業株式会社内 (72)発明者 中島 亮一 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号オリエ ンタル酵母工業株式会社内 (72)発明者 鈴木 康生 東京都板橋区小豆沢三丁目６番10号オリエ ンタル酵母工業株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA77 CA02 CA20 DA12 EA04 GA11 HA08 HA09 4B032 DB01 DB36 DK58 DP37 4B065 AA80X AA80Y AB01 AC03 BA02 BD09 CA42

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２倍体にしたとき実用パン酵母となる１
   倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＣ
   ＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母。
2. 【請求項２】 ２倍体にしたとき実用パン酵母となる１
   倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＣ
   ＡＲ１遺伝子破壊１倍体酵母を１もしくは２以上用いて
   交雑してなる２倍体以上の倍数体冷凍生地耐性実用パン
   酵母。
3. 【請求項３】 ａ型１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝
   子破壊操作してなるＣＡＲ１遺伝子破壊ａ型１倍体酵母
   と、α型１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作
   してなるＣＡＲ１遺伝子破壊α型１倍体酵母を交雑して
   なるａ／α型２倍体冷凍生地耐性実用パン酵母。
4. 【請求項４】 ２倍体にしたとき実用パン酵母となるａ
   型１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子を遺伝子破壊操作してな
   るＣＡＲ１遺伝子破壊ａ型１倍体酵母と、２倍体にした
   とき実用パン酵母となるα型１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝
   子を遺伝子破壊操作してなるＣＡＲ１遺伝子破壊α型１
   倍体酵母を交雑してなるａ／α型２倍体冷凍生地耐性実
   用パン酵母。
5. 【請求項５】 該１倍体酵母のＣＡＲ１遺伝子の遺伝子
   破壊操作がＣＡＲ１遺伝子内への栄養要求性マーカー遺
   伝子の挿入であることを特徴とする請求項１〜４のいず
   れか１項に記載の酵母。
6. 【請求項６】 ２倍体冷凍生地耐性実用パン酵母、Sacc
   haromyces cerevisiae CA 118(FERM BP-7042）。
7. 【請求項７】 菌体内にアミノ酸を高蓄積する請求項２
   〜６のいずれか１項に記載の冷凍生地耐性実用パン酵
   母。
8. 【請求項８】 請求項２〜７のいずれか１項に記載した
   実用パン酵母を用いてパン生地を作り、これを前発酵
   し、次いで冷凍してなる冷凍生地耐性実用パン酵母含有
   冷凍パン生地。
9. 【請求項９】 請求項８に記載した冷凍パン生地を、解
   凍し、発酵し、焼成して得られた冷凍生地からのパン。