JPH0420282A - アルギナーゼ遺伝子欠損株選択培地とそれを利用した尿素非生産性酵母の育種及びそれを用いる酒類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、実際の飲食品の醸造に用いられている酵母の
アルギナーゼ遺伝子（ＣＡＲｌ、）の突然変異処理によ
る欠損、あるいは、異種遺伝子を含まないＤＮＡを用い
た形質転換による破壊、のいずれかによる尿素非生産性
酵母、その選択用培地、それを用いるＹｆ種法及び当該
酵母の利用に関するものである。

本発明による変異処理あるいは形質転換法により育種さ
れる尿素非生産性実用醸造酵母は、アルギニンをオルニ
チンと尿素に分解する酵素であるアルギナーゼ（ＥＣ３
，５，３，１）を欠失しているため尿素を生成しない。

従って、尿素から誘導される発癌物質カルバミン酸エチ
ルの生成を抑えることが可能である。

つまり、本発明の突然変異株あるいは遺伝子破壊株を用
いることによって、アルコール発酵速度及び品質は親株
と変らず、しかも、カルバミン酸エチルを全く含まない
安全な酒類等を製造することかできる。従って、本発明
は酒類、アルコール、その他の醸造食品の製造に大きく
貢献するものである。

（発明の背景及び従来技術とその問題点）一般に、各種
醸造飲食品（清酒、焼酎、果実酒、ヒール、ウィスキー
、ブランデー、醤油、味噌、老酒等）の製造醪中には、
含量にはかなり差があるが、尿素が存在し、それがエタ
ノールと反応して発癌性物質であるカルバミン酸エチル
（ウレタン）を生成させるため世界中で問題になってい
る。

従来、尿素を減少させる方法としては、アルギニンの酵
母菌体への取り込みに関与するアルギニン透過酵素の欠
失した変異株を用いる方法、または、尿素をアンモニア
と炭酸ガスに分解するウレアアミドリアーゼ作用の脱抑
制変異株を用いる方法がとられてきたが、これらの菌株
を用いても従来の約半量までしか尿素量を減らすことは
できない。しかも、これらの変異株は親株に比べ一般に
発酵が鈍いため、他の酵母に汚染され易く確実な効果が
得られにくいという問題があった。

本発明者らは、特願平１−２０７８７４で、アルギナゼ
遺伝子破壊により尿素非生産性実用醸造酵母を育種した
が、酒類についての組換え体制用ガイドラインが未制定
のため当該遺伝子破壊株は現在のところ酒造場で使用で
きない状況にある。また、当該遺伝子破壊株は酵母以外
の異種遺伝子、つまり、大腸菌のＤＮＡ配列を有してお
り、飲食品の実際の製造における面からはそのような異
種生物のＤＮＡを全く含まないことが望ましい。

（問題点を解決するための手段） 以上の観点から、現時点において酒造場で実用可能な尿
素非生産性醸造酵母である人工突然変異によるアルギナ
ーゼ遺伝子欠損変異株の開発を目的として研究を行った
。また、酒類についての組換え体制用ガイドライン制定
次第、即時、酒造場での実用化が可能と思わ九る、酵母
以外の異種遺伝子を含まないアルギナーゼ遺伝子破壊株
の開発をＩ」的として鋭意研究を行った。

そこで目的とする変異株を検索するために、常法にした
がってスクリーニングを鋭意実行した。

すなわち、アルギナーゼ遺伝子欠損株はアルギナーゼを
持たないため窒素源としてアルギニンのみを含む培地で
は生育できないので、このような欠損株を選択するとき
の常法であるレプリカ法と呼ばれる方法を用いた。しか
し、このレプリカ法では１枚のプレートで約１００株し
か調べることができない。すなわち１０９に１株の割合
で起こる変異株の取得頻度では１００万枚ものプレート
を使用しなければならす、現実には不可能であった。

このように、目的とする変異株を選択するのに偶然性に
期待しなければならない点に鑑み、目的とする変異株を
取得するためには従来の発想を転換する必要があり、む
しろスクリーニングの手法を変えて新しい手法を開発す
ることの方が重要であるとの着想を得た。そして、目的
とする変異株を選択するのに好適な培地を作製すること
とした。

そこで、本発明者が特願平］−２０７８７４により育種
したアルギナーゼ遺伝子破壊株ＦＥＲＮ　Ｐ−１，０９
０３及び親株である清酒酵母協会９号（サツカロマイセ
ス・セレビシアエ）を用いて、遺伝子破壊株のみ生育可
能で、親株は生育できない培地を種々検討した。

その結果、このアルギナーゼ遺伝子破壊株のみをポジテ
ィブに選択するのに特に適した培地、アルギナーゼ遺伝
子欠損株のみが選択的に生育可能な培地（以下、ＣＡＯ
培地ともいう）を作成するのにはじめて成功し、しかも
この培地を使用すれば１−枚のプレー１−で５００万株
もの調査が可能である点をも確認した。

次に、当該培地を使用することにより、実用醸造酵母に
人工突然変異処理を施したアルギナーゼ遺伝子欠損変異
株が得られることを見いだした。

また、サツカロマイセス・セレビシアエのアルギナーゼ
遺伝子をコートするＤＮＡ断片をクローン化し、コーデ
ィングリージョンの一部を欠失させたプラスミドＡある
いはプラスミドＢを構築した。

これらのブラスミ１〜のいずれかを用い、さらに、ＣＡ
Ｏ培地を使用すれば酵母以外の異種遺伝子を含まないア
ルギナーゼ遺伝子欠損形質転換株が得られることも見い
だした。

そして、得られた突然変異株及び形質転換株を用いて酒
類の製造を行ったところ、尿素の生成は全く認めず、従
って、有害なカルバミン酸エチルの生成がなく、かつ、
アルコール発酵速度及び酒質も親株と変らないことを認
め、本発明を完成するに至った。

（詳細な説明） 本発明者らは、先に特願平１−２０７８７４でアルギナ
ーゼ遺伝子破壊により尿素非生産性醸造酵母ＡＬ−１株
（ＦＥＲＭ　１１−１．０９０３）を育種しているが、
当該酵母を用いて種々の条件検討を行った結果、アルキ
ナゼ遺伝子欠損株のみが選択的に生育可能な培地の作製
に成功した。

本発明に係る変異株選択用培地は、少なくとも力ナハニ
ン、アルギニン、オルニチンを含有するものであり、好
適な例としては、これらの成分に更にイース１〜ナイ１
−ロシエンベース（アミノ酸フリー）及び糖類（グルコ
ース、フラクトース、マルｈ−ス、ラク１〜−ス、オリ
ゴ糖、澱粉、チキス１−リン等）等を配合すればよい。

また更に必要あれば、常用される選択培地用成分を配合
してもよい。

これらの配合量としては、カナバニン０．１〜２０ＰＰ
ｍ、アルギニン０．０５−５０ｍＭ、オルニチン０．２
５−２５０ｍＭであり、イース１〜ナイトロジェンベー
ス及び糖としてグルコースを使用する場合には、前者を
０．０５〜０．７％、後者を０．５〜１０％の範囲内で
培地中に含有させればよい。

このようにして調製した選択培地（ＣＡＯ培地）は、１
枚のプレー１〜で約５００万株もの調査が可能であるの
で、きわめて低頻度で出現する目的変異株を見逃すこと
なく正確に且つ短時間で検出することができる。したが
って、本ＣＡＯ培地を使用することによって、アルギナ
ーゼ遺伝子欠損変異株及び形質転換による酵母以外の異
種遺伝子を含まないアルギナーゼ遺伝子破壊株を効率よ
く得ることができる。

突然変異株については、例えば小１’ＪＪら（日本醸造
協会誌８３．６１４（１９８８））に準した方法で行わ
れる。

すなわち、実用醸造酵母にエチルメタンスルフォネイ１
−を用いて変異処理を施し、当該ＣＡＯ培地」二に塗布
する。生育した変異株のうち、アルギニン１ｉｔ−窒素
源培地では生育てきす、オルニチン単一窒素源培地で生
育可能な株を目的とするアルギナーゼ欠損変異株として
得る。

形質転換による酵母以外の異種遺伝子を含まない遺伝子
破壊株については、用いたゲノムＤＮＡ供与体は、サツ
カロマイセス・セレビシアエであり、具体的には協会酵
母７号（市販品）である。

本菌体からの染色体ＤＮＡの抽出法及び染色体シーンラ
イフラリ−の作製法は、例えばＡｇｒｊｃ。

旧ｏ１．．．　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、、５３．４３１
．−４３６（１９８９）に記載された方法に７＜６シて
行われる。

１−記で得られた染色体シーンライブラリーからの当該
遺伝子の単離にあたってはサツカロマイセス・セレビシ
アエのアルギナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列（Ｊ、　１３ａ
ｃｔｅｒｊ、ｏｌ、、　Ｖｏｌ−，１６０，１０７８−
１０８７（１９８４））にノ□（づいて合成したＤＮＡ
オリコマ−を作製し、それをプローンに用いてプラーク
ハイブリタイゼイン３ンを行い、サツカロマイセス・セ
レビシアエのアルギナーゼ遺伝子の１）ＮＡをクローニ
ングする。

遺伝子破壊のためのプラスミ１〜Ａあるいはプラスミ１
−１３の作製は次のようにして行う。

ブラスミ１〜Ａの作製は、アルギナーゼ遺伝子由来の０
．８７Ｋｂｐのｔｌｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｐｓｉ　　Ｉフラ
グメン１〜をＰＵＣ１１９に組み込んだプラスミドｐｌ
ＩＰ−］をＳａＱ　Ｉで切断し、クレナウンラグメンｌ
−処理しセルフライケーションしたプラスミＦ　ｐＨＰ
−Ｌ、Ｓから門口ｃ　ＩＩ−旧ｎｃＩ！　（０，］５Ｋ
ｂｐ）断片を除いたプラスミＦ　Ａ　（ｐＨ１）−１８
Ｉ＋）を作製する（第１−図）。

また、ブラスミｌ’　Ｂの作製は、アルギナーゼ遺伝子
を含む約５．５　Ｋｂｐのｒｌａｍｌｌ　　Ｉ　−Ｂａ
ｍＨＴフラグメン［へをｐＬＩＣ１１９に組め込んだプ
ラスミドｐｃＡＲ１１，２からＲｇＱ　ＩＴ　−ＢｇＱ
　ＩＩ　（０，７４Ｋｐｂ）断片を除いたプラスミＦ　
１３（ｐｃＡＲ］］２−ＧＧ）を作製する（第２図）。

形質転換においては、実用醸造酵母は２倍体（もしくは
高次倍数体）であるが、アルギナーゼ遺伝子欠損株選択
培地（ＣＡＯ培地）を使用するので、２本の染色体」二
の２つの当該遺伝子を同時に破壊した株が本ＣＡＯ培地
により選択することができる。

また、染色体上の当該遺伝子のうち１つだけが破壊され
、破壊されたアルギナーゼ遺伝子が残りの健全なアルギ
ナーゼ遺伝子とシーンコンバージョンを起こすことによ
って生ずる２つのアルギナーゼ遺伝子がともに破壊され
たアルギナーゼ遺伝子欠損株も取得することができる。

従って、これまでの実用醸造酵母における遺伝子破壊で
は遺伝子破壊用プラスミドは少なくとも２種類必要であ
ったのに対し、本ＣＡＯ培地を使用すれば遺伝子破壊用
プラスミドは１種類で良いことになる。すなわち、上記
により作製したプラスミドＡあるいはＢのいずれか１つ
を使用して遺伝子破壊を行うことにより効率良く１］的
とする遺伝子破壊株を取得することができる。

つまり、１ｌｉｎｄ　■ｆ及びＰｓｔ　　Ｉサイトで切
断したプラスミドＡもしくはｎａｍＨＩサイ１〜で切断
したプラスミドＢを用いて形質転換し、ＣＡＯ培地−１
−に塗布し目的とする形質転換体を得る。なお、親株の
アルギナーゼ遺伝子とリアレンジメントするプラスミド
Ａの旧ｎｄ　Ｉｎ−Ｐｓｔ　Ｔフラグメンｌ−（０，７
２Ｋｂｐ）あるいはプラスミドＢのＢａｍＨＴ　−Ｂａ
ｍｔｌ　　Ｉフラグメンｔ−（４，８Ｋｂｐ）は、大腸
菌等の異種遺伝子の配列は含まず、酵母由来の配列のみ
からなる。

なお、アルギナーゼ遺伝子が突然変異処理により欠損を
受けたかどうか、もしくは、形質転換により破壊された
かどうかの判定は次の方法でアルギナーゼ活性を測定し
、活性の有無を調べるとともに、形質転換体については
サザンブロツテイングにより遺伝子の破壊を確認する。

なお、アルギナーゼ遺伝子欠損のキイとなるアルギナー
ゼ活性の測定は次のようにして行う。

すなわち、変異株、形質転換株及び親株をアルギナーゼ
誘導培地（イーストナイトロジェンベース（窒素源フリ
ー）　０．１７％、アルギニン塩酸塩１０ｍＭ、グルコ
ース２％、硫酸アンモニウム５　ｍＭ）に４Ｘ］Ｏ’セ
ル／ｍＱとなるように植菌し、３０℃、１晩振どう培養
後集菌洗浄する。この菌体を１．０ｍＭトリス・塩酸バ
ッファー（ｐ＋　７．０）にけん濁しガラスビズで破壊
する。このホモジネートの１５．ＯＯＯｒｐｍ、１０分
間の遠心」二清を酵素液とし、アルギニンを基質として
反応させ生成する尿素を東洋醸造（株）製尿索キッ１−
で定量し、アルギナーゼ活性とする。

次に、この変異株及び形質転換株を用いて常法どおり、
清酒や果実酒、ビール、焼酎、ライスキ、ブランデー、
老酒等の酒類を製造することにより、尿素を全く含まな
い酒類の製造ができ、ひいてはカルバミン酸エチルの生
成しない発ガン性の心配のない安全な酒類、しかも風味
は全〈従来法によるものと変らない美味な酒類の製造が
はじめて可能となるのである。

次に、本発明の実施例を示す。

実施例１ アルギナーゼ遺伝子欠損株選択培地の検索；アルギナー
ゼ遺伝子欠損株はアルギナーゼを持たないため窒素源と
してアルギニンのみを含む培地では生育できない。この
ような欠損株を選択するときには、通常レプリカ法と呼
ばれる方法が用いられる。しかし、このレプリカ法では
１枚のプレートで約１．００株しか調べることができな
い。すなわち１０′１に１株の割合で起こる変異株の取
得頻度では１００万枚ものプレー１〜を使用しなければ
ならず、現実には不可能である。

そこで、本発明者が特願平１−２０７８７４により育種
したアルギナーゼ遺伝子破壊株ＦＥＲＭ　Ｐ−１，０９
０３及び親株である清酒酵母協会９号（サツカロマイセ
ス・セレビシアエ）を用いて、遺伝子破壊株のみ生育可
能で、親株は生育できない培地を種々検討した。

その結果、このアルギナーゼ遺伝子破壊株のみをポジテ
ィブに選択するためにはイーストティ１〜ロジエンベー
ス（アミノ酸フリー）Ｏ，］、７７％カナバニラ］　Ｏ
ｐｐｍ、アルギニン１鱈、オルニチン５ｍＭ。

クルコース２％の培地が最適であることを発見し、この
組成を含む選択用培地をＣＡＯ培地と命名した。

ＣＡＯ培地の配合例は、第１表に示される。

カナバニラ オルニチン アルギニン クルコース 寒天 水 ｍｇ ０．４２ｇ ０．１０５ｇ ］Ｏｇ ０ｇ ００ｕＱ 本ｃＡｏｉＢ地を使用することにより、１枚のプレー１
−で約５００万株を調べることが可能であり、低頻度に
含まれる目的とする株を効率よく選択することが可能で
ある。

実施例２ 突然変異によるアルギナーゼを生産しないサラ力ロマイ
セス・セレヒシアエの育種； 清酒酵母（協会９号・１０号）、ワイン酵母（カイセン
ハイム７４・エバーネイ）をＹＩＥＰＤ培地（イース１
〜エクストラクｌ−１％、ポリペグ１−ン２％、クルコ
ース２％）　＋ＯｍＱに４Ｘ］Ｏ’セル／ｍＱとなるよ
う植菌し、３０℃で１晩振どう培養後集菌洗浄した。こ
の菌体をＯ，１，ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，０）
］Ｏｍ（ｌにけんン蜀、エチルメタンスルフォネイ１〜
０．３ｍΩを活力１１し、３０°Ｃ１４５分間ゆるやか
に振とうして変異処理を施した。遠心により集菌した菌
体を５％チオ硫酸す１−リウム溶液１０ｍＱで１回、殺
菌水１．０ｍ１ｌｌで２回洗浄後、殺菌水１０ｍＱにけ
ん濁し、その４００μＱをＣＡＯ培地上に塗布した。

３０’Ｃて１週間培養後、出現したコロニーをＣＡＯ培
地」二でシングルコロニーとして単離し、アルギニン１
ｌｉ−窒素源培地では生育できず、オルニチン単一窒素
源培地で生育可能な株を目的とするアルギナーゼ遺伝子
欠損変異株として取得した（第２表）。このようにして
協会９号から得たＡＬＭ−９はＦＩＥＲＭ　１１−１１
１６９として微工研に寄託されている。

第２表 アルギナーゼ欠損株の単離 （清酒酵母） 協会９号 協会１０号 （ワイン酵母） ガイゼンハイム７４ エパーネイ １００％（７／７） ６０　　（９／１．５） ６４　　（９／１４） ＊　Ａｒｇ培地 イース１−ナイトロジェンベース （す１０アミノ酸、（Ｎｏ４）２ｓｏ２）アルギニン クルコース 寒天 ０．８５ｇ ０．５３ｇ ０ｇ ０ｇ オルニチン グルコース 寒天 （す１０アミノ酸、（ＮＨ４）２Ｓｏ４）０．８５ｇ ０．４２Ｆ。

０ｇ ０ｇ 実施例３ アルギナーゼ遺伝子破壊のためのプラスミ１〜の作製； ブラスミ１〜Δの作製法：第２図記載のｐｃＡ旧１２（
特願平］−２０７８７４）から制限酵素旧ｎｄｌｌｌと
Ｐｓｔ　　１て切り出されるアルギナーゼ遺伝子由来の
０．８７Ｋｂｌ）のＤＮＡ断片をｐＵｃｌＩ９にＴ／ｌ
ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＨＰ刊を
作製した。これを５ａＱ１で切断し、フレナラフラグメ
ン１〜処理した後、１’４＋）ＮＡ　リカーセを用いて
セルフライゲーションを行い、得られたプラスミドｐＨ
Ｐ−１，Ｓの１ｌｊｎｃ　ＪＩ−１１ｉｎｃ■フラクメ
ンｌ−（０，］、５Ｋｂｐ）を制限酵素で切り出した後
に７４ＤＮＡリガーゼを用いて再連結し、アルギナーゼ
遺伝子破壊用プラスミＩ〜（ｐｌＩＰ−ＩＳｌｌ）を作
製した（第１図）。

ブラスミ１＜Ｂの作製法：　ｐｃＡＲ１＋２からＢ乙ｃ
ｎＢＦ、Ｑ　Ｈフラグメンｌ−（０，７７１Ｋｂｐ）を
制限酵素で切り出した後、Ｔ４ＤＮＡ　リカーセを用い
て再連結し、アルギナーゼ遺伝子破壊用プラスミＦＢ　
　（ｐｃＡＲ］１２ＧＧ）を作製した（第２図）。

実施例４ 形質転換によるアルギナーゼを生産しないサツカロマイ
セス・セレビシアエの作製； アルギナーゼ遺伝子破壊用ブラスミ１−ＡあるいはＢを
用い、サツカロマイセス・セレビシア工清酒酵母協会９
号（２倍体、市販品）の形質転換をＴｔｏらの方法（、
■０口ａｃｔｅｒｊｏ１．．　Ｖｏｌ、］５３．１６３
（１９８３））に準じて行った。

すなわち、清酒酵母（協会９号）をＹＥＩ”Ｄ培地１０
ＩＩＩＱに４ＸＩ０４セル／ｍＱとなるように植菌し、
３０℃で１晩振どう培養後、対数増殖期の細胞を遠心に
より集菌した。ＴＥバッファーで洗浄後、ＴＥバッファ
０．５ｍＱにけん濁し、等容量の０．２Ｍ酢酸リチウム
溶液を添加し、］−時間、３０℃で振とうした。この中
から０．１ｍＱを１．５ｍＱ容のエッペンドルフチュー
ブに移し、ＤＮＡ溶液（０，５μｇ／μＱ）２０μＱを
加え、３０℃、３０分間静置した。

なお、ここで使用したＤＮＡ溶液は次のようにして調製
した。

プラスミド八を用いて形質転換を行う場合ニブ】９ ラスミドＡ、　（ｐＨＰ−１，ＳＨ）を制限酵素旧ｎｄ
ｌｒｌ及びＰｓｔＩで処理し、生した２つの断片（０，
７２Ｋｂｐ、３．２Ｋｂｐ）のうち０．７２Ｋｂｐのフ
ラグメントをシーンクリーン法により精製した後、ＴＥ
バッファーに溶解し、ＤＮＡ溶液を調製した。なお、０
．７２Ｋｂｐのｌ１ｉｎｄ　ｍＰｓｌ：　　Ｉ断片は酵
母由来の遺伝子のみからなり、大腸菌等の異種遺伝子は
含まない。

ブラスミ１〜Ｂを用いて形質転換を行う場合ニブラスミ
ドＢ　（ｐｃＡＰｌ、］２−ＧＧ）を制限酵素Ｂ　ａ　
＋ｎ　ＩＩ　　Ｔで処理し、生した２つの断片（４，８
Ｋｂｐ、３．２Ｋｂｐ）のうち４．８ＫｂＰのフラグメ
ンＩ−をシーンクリーン法により精製した後、ＴＥバッ
ファーに溶解し、　ＤＮＡ溶液を調製した。なお、４．
８ＫｂｐのＢａｍ１ｌ　　＋　−１３ａｍｔｌ　　Ｔ断
片は酵母由来の遺伝子のみからなる。

次に、殺菌した７０％ＰＥＧ−４０００１．５０μΩを
加えよく混合し、３０℃で１時間静置した後、エラペン
１−ルフチユーブを４２℃の恒温槽中に１０分間静置し
、菌体を直ちに室温まで冷却してから、殺菌水て洗浄、
ＣＡＯ培地」−に塗布した。３０℃で１週間培養し、プ
ラスミドＡ　（ｐＨＰ−ＩＳＨ）で９菌株（９個／１０
０１ｚｇＤＮＡ）、プラスミドＢ　　（ｐｃＡＲ１＋２
−ＧＧ）で１６菌株（１６個７１００μＦ、ＤＮＡ）の
目的とする酵母以外の異種遺伝子を含まない形質転換体
を得た。

プラスミドＡで作成したＡＬＫ−９株はＦＥＲＮ　ｐ−
１１１６８として微工研に寄託されている。

実施例５ アルギナーゼ遺伝子の変異による損傷、あるいは、形質
転換による破壊の確認； このようにして得られたアルギナーゼ欠損株と親株のア
ルギナーゼ活性を第３表に示したが、アルギニンによる
誘専培養においても変異株及び形り？転換株はアルギナ
ーゼ活性が認められないことから、２本の染色体上のア
ルギナーゼ遺伝子が共に欠損を起こした、あるいは、破
壊された株であることが確認された。

さらに、形質転換株についてはサザンブロッティングで
もアルギナーゼ遺伝子が破壊されていることに確認した
。

第３表 アルギナーゼ欠損株のアルギナーゼ活性突然変異株 ＬＭ−９ ＬＭ−９１ 遺伝子破壊株 Δ１−１Ｋ−９ ＡＬＫ−４］Ｊ Ｎ１つ＊＊ Ｄ Ｄ Ｄ ＊アルギナーゼ活性（７ｚｍｏ］ｅ　Ｌｌｒｅａ／ｈｒ
／ｍｇｐｒｏｔｅｊｎ）牢傘検出限界以ド（＜０．５） 実施例７ 突然変異株及び遺伝子破壊株による酒類の醸造；親株（
協会９号）、突然変異株、遺伝子破壊株を麹エキス培地
で３０℃、３日間静置培養後装菌洗浄し、第４表に示す
仕込配合及び製造条件で総米２００ｇの清酒仕込を行っ
た。

第４表　清酒の仕込配合等 初添　　仲添　　留添　　　計 総米（ハ　　　　　　　３５　　　６５　　１．００　
　　２００蒸米（ＩＸ）　　　　　　　　２５　　　５
５　　　８０　　　１．６０麹米（ｇ）　　　　　　　
　］］０　　１０　　　２０　　　　４０吸水伝）　　
　　　　　　５５　　　７５　　１３０　　　２６０乳
酸（１，０倍希釈）（ｍｎ）　　　１．２発酵温度（°
Ｃ）　　　　　　１．５　　　９　　７→１５　（１°
Ｃ／日）原料米＝７０％精白の１１本晴 酵母添加量＝５刈０７セル／初添の汲水ｍＱ−１−槽方
法：遠心分離（３５００ｒｐｍ　１５ｍ１ｎ）アルコー
ル発酵経過をＣＯ２の発生による重量の減少で測定し、
第３図に示した。また、製成酒の尿素含量及び各種成分
を第５表に示した。この結果、変異株及び形質転換株の
使用によりアルコール発酵速度、−殻成分及び官能評価
は親株とほとんど変わらず、しかも尿素及びカルバミン
酸エチルを全く含まない清酒の製造が可能であった。

第５表　成製酒の尿素含量及び各種成分項　目　　　　
　　　協会９号　ＡＬＭ−９ＡＬＫ−９尿　　素　　　
　　　　　２２．３　　　　　ＮＤ　　　　　　ＮＤ日
本酒度　　　　　　＋２．５　　　−］、、５　　　　
０．０アルコ一ル分（％）　　　　１７．６　　　１７
．６　　　　　］、７．］酸　　度　　　　　　　　２
．４　　　　２．５　　　　　２．４アミノ酸度　　　
　　　　２．４　　　　２．２　　　　　２．４官能評
価　　　　　　　１．４　　　　　］、、３　　　　１
．２カルバミン酸エチル　Ｉｌ、２．４　　　　０．０
　　　　０．０（発明の効果） 本発明によれば、アルギナーゼ遺伝子欠損株を効率よく
選択しうる選択培地が提供され、この培地を用いること
によって、アルギナーゼを産生ぜずしたがって尿素を産
生ずることのない尿素非生産性酵母を育種することがで
きる。このようにして得た酵母を利用すれば、発ガン性
を有するエチルカーバメ−１〜を含まない安全な酒類を
醸造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はアルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプラ
スミドＡの作製説明図、第２図は同様のプラスミドＢの
作製説明図、第３図は親株と変異株及び形質転換株のア
ルコール発酵の経過図である。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ 第 ０区 ■ Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ 第 図 第 図 醪日数 （日） 一〇− 一−ムーー 一一−Ｃトー− 親株協会９号 ＬＭ−９ ＬＫ−９

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくともカナバニン、アルギニン及びオルニチ
   ンを含有することを特徴とするアルギナーゼ遺伝子欠損
   株選択培地。
2. （２）カナバニン含有量が０．１〜２０ｐｐｍ、アルギ
   ニン含有量が０．０５〜５０ｍＭ、オルニチン含有量が
   ０．２５〜２５０ｍＭであることを特徴とする請求項１
   に記載の選択培地。
3. （３）請求項１又は２に記載の選択培地を用いて取得し
   たことを特徴とする突然変異処理によりアルギナーゼ遺
   伝子が欠損をおこした尿素非生産性酵母。
4. （４）請求項１又は２に記載の選択培地を用いて取得し
   たことを特徴とする遺伝子破壊によりアルギナーゼ遺伝
   子が破壊され且つ酵母以外の異種遺伝子を含まない尿素
   非生産性酵母。
5. （５）実用醸造酵母の２ないしそれ以上あるアルギナー
   ゼ遺伝子の全てについて突然変異により欠損をおこさせ
   た株、あるいは、異種遺伝子を含まないＤＮＡを用いた
   形質転換により当該遺伝子の全てを破壊した株を、請求
   項１又は２に記載の選択培地を利用して取得することを
   特徴とする尿素非生産性酵母の育種法。
6. （６）請求項３又は４に記載の尿素非生産性酵母を用い
   ることを特徴とする酒類、アルコール等の製造法。