JP6189566B1 - 有機酸生成酒酵母株の製造方法、清酒の製造方法、および変異pex22遺伝子 - Google Patents
有機酸生成酒酵母株の製造方法、清酒の製造方法、および変異pex22遺伝子 Download PDFInfo
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Abstract
Description
前記変異工程において、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させることを特徴とする。
前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、
前記作製工程は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする。
本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法(以下、「酵母株の製造方法」ともいう)は、前述のように、酒酵母株について、そのPEX22遺伝子を変異PEX22遺伝子に変異させる変異工程を含み、前記変異工程において、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させることを特徴とする。本発明の酵母株の製造方法は、前記変異工程において、前記酒酵母株のPEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
5’-GATGGATTANNNTCATGT-3’
5’-ATGCCACCACCATCAAGAAGTAGAATAAACAAAACAAGAACATTAGGAATAATGGGTACAGCTATAGCAGTGTTGGTCACGTCCTACTATATATATCAAAAGGTGACAAGTGCAAAGGAAGATAATGGGGCACGACCTCCAGAGGGTGATTCAGTAAAAGAGAACAAAAAGGCAAGGAAGAGCAAATGTATTATAATGAGCAAGTCGATACAAGGACTGCCCATAAAGTGGGAGGAGTACGCCGCTGATGAAGTGGTTTTGCTGGTACCTACGAGCCACACTGATGGATCAATGAAACAAGCCATTGGGGATGCCTTTCGCAAGACGAAAAACGAACACAAAATCATATATTGCGATAGCATGGATGGATTANNNTCATGTGTAAGACGGCTAGGTAAATTTCAGTGCATATTGAACTCCAGGGACTTCACAAGTAGTGGTGGTAGCGATGCAGCAGTTGTTCCTGAAGATATAGGCAGGTTTGTCAAATTTGTTGTTGATAGCGATGTAGAGGATGTGCTGATTGACACTTTATGCAATTAA-3’
本発明の第1の清酒の製造方法(以下、「第1の製造方法」ともいう)は、前述のように、酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する作製工程、および前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、前記作製工程は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする。本発明の第1の製造方法は、前記作製工程が、前記本発明の酒酵母株の製造方法により実施されることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の第1の製造方法は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法の説明を援用できる。本発明の第1の製造方法によれば、例えば、前記変異工程で得られた有機酸生成酒酵母株を使用することによって、親株で清酒を製造した場合と比較して、清酒の有機酸の含有量を増大できる。
本発明の有機酸生成酒酵母株は、そのPEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNがストップコドンである変異PEX22遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の有機酸生成酒酵母株は、そのPEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNがストップコドンである変異PEX22遺伝子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の有機酸生成酒酵母株は、例えば、PEX22遺伝子以外が同一である酵母と比較した場合、発酵力を維持し且つより優れた有機酸生成能を示す。本発明の有機酸生成酒酵母株は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法または後述の本発明のスクリーニング方法により製造できる。本発明の有機酸生成酒酵母株は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法、第1の製造方法およびスクリーニング方法の説明を援用できる。
MPPPSRSRINKTRTLGIMGTAIAVLVTSYYIYQKVTSAKEDNGARPPEGDSVKENKKARKSKCIIMSKSIQGLPIKWEEYAADEVVLLVPTSHTDGSMKQAIGDAFRKTKNEHKIIYCDSMDGL
本発明の第2の清酒の製造方法(以下、「第2の製造方法」ともいう)は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含むことを特徴とする。本発明の第2の清酒の製造方法は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株を用いることが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の第2の製造方法は、前記本発明の有機酸生成酒酵母株を使用することによって、親株で清酒を製造した場合と比較して、清酒の有機酸の含有量を増大できる。本発明の第2の製造方法は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法、第1の製造方法および有機酸生成酒酵母株の説明を援用できる。
本発明の有機酸生成酒酵母株のスクリーニング方法は、酒酵母株を、生存率0.01〜90%となるように変異原を用いて処理する変異工程と、
前記変異処理後の酒酵母株から、下記条件(1)および(2)を満たす酒酵母株を、有機酸生成酒酵母株として選択する選択工程とを含むことを特徴とする。
(1)変異原を用いて処理する前と比較して、アルコール生成量が0.9〜1.2倍である。
(2)変異原を用いて処理する前と比較して、リンゴ酸生成量が1.5〜10倍である。
培地:YPD寒天培地、YPD培地に相当する栄養源豊富な培地、YM寒天培地(独立行政法人製品評価技術基盤機構推奨培地、http://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/cultures/cultures.html:平成27年7月14日付)
培養温度:30℃前後(例えば、25℃±7℃)
培養時間:数日間(例えば、1〜10日間)
培養方法:静置培養
生存率の調整方法:EMS処理中に、前記混合液から数分ごとにサンプリングし、前記条件で培養を行い、目的となる生存率のものを選択する。
(3)変異原を用いて処理する前と比較して、コハク酸生成量が0.9〜2倍である。
本発明の変異PEX22遺伝子は、前述のように、PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域において、塩基NNNが、ストップコドンであることを特徴とする。本発明の変異PEX22遺伝子は、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域において、塩基NNNが、ストップコドンであることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の変異PEX22遺伝子は、例えば、前記本発明の酒酵母株の製造方法、第1の製造方法、有機酸生成酒酵母株、第2の製造方法、およびスクリーニング方法の説明を援用できる。
本発明の変異PEX22タンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする。本発明の変異PEX22タンパク質は、前記配列番号3のアミノ酸配列からなるペプチドであることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の変異PEX22タンパク質は、本発明の有機酸生成酒酵母株の説明を援用できる。
本発明の有機酸生成酒酵母株が、親株と比較して、優れた有機酸生成能を有することを確認した。
清酒醸造用酵母K−701を親株として使用した。変異型酵母株は、下記参考文献を参照し、取得した。具体的には、5重量% EMS含有カリウムリン酸緩衝液にK−701を懸濁し、撹拌しながら30℃で60分間インキュベートして変異処理を実施した。前記変異処理後の親株(以下、「第1変異処理株」という)を、1mmol/L 5’,5’,5’-トリフルオロロイシン存在下、YNB寒天培地(0.67%Difco yeast nitrogen base、2%グルコース、2%寒天)で生育および選抜することにより、5’,5’,5’-トリフルオロロイシン耐性が付与され、K−701と同等以上のエタノール産生能を示し、K−701と比較して、酢酸イソアミルの生成量が増大した酒酵母株(以下、「F−19株」ともいう)が得られた。
参考文献:Shinzo ASHIDA et.al., “Isolation and Application of Mutant Producing Sufficient Isoamyl Acetate, a Sake Flaovr Component”, Argic. Biol. Chem, 1987, vol.51, No.8, pages 2061-2065
F−19Hは、F−19と異なり優れた有機酸生成能を有することから、F−19Hについて、この特性に対応する遺伝子変異の解析を行った。その結果、F−19Hは、K−701と比較して、複数の変異を有していた。そのうちの1つは、K−701が、配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、TGGであるPEX22遺伝子をホモ接合で有するのに対し、F−19Hが、配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、TAG(ストップコドン)である変異PEX22遺伝子をホモ接合で有しているという変異であった。すなわち、F−19Hでは、2つのPEX22遺伝子について、その374番目の塩基がGからAに変異する点変異が生じていた。なお、F−19についても、PEX22遺伝子の塩基配列を調べたところ、F−19は、配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、TGGであるPEX22遺伝子と、配列番号2の塩基配列における塩基NNNが、TAG(ストップコドン)である変異PEX22遺伝子とをヘテロ接合で有していた。
前記実施例1において得られた点変異の前記変異PEX22遺伝子を、親株S. cerevisiae 4011(水津、醸協、91、87、1992年)に、遺伝子工学的に導入した。そして、得られた点変異導入株について、発酵試験を行い、エタノール発酵性を損じることなく、有機酸を前記親株よりも向上させることを確認した。
前記親株S. cerevisiae 4011から、一倍体4011a(MATa)を分離し、これにウラシル要求性を付与し、これを宿主GX−11として使用した。前記宿主は、URA3遺伝子について、46番目のアミノ酸残基が終止コドン(アンバーコドン)となっていることを確認済みである。
フォワードプライマー1(PEX22(1)InFusion-F、配列番号4)
5’-CTATAGGGCGAATTGATGCCACCACCATCAAGAAGTAGAATAAACAAAACAAGAACATTAGGAATAG-3’
リバースプライマー1(PEX22(743)InFusion-R、配列番号5)
5’-AGGGAACAAAAGCTGGGCATTGTTAGACATCTAATTGATTCGGTCAAGTTGTAATGATGATTTC-3’
フォワードプライマー2(pRS406InFusion-F、配列番号6)
5’- CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG-3’
リバースプライマー2(pRS406InFusion-R、配列番号7)
5’- CAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3’
前記宿主および前記GX−PEX22について、総米100gの小仕込み試験とした以外は、前記実施例1と同様にして、エタノール生成量および有機酸生成量を測定した。下記表2に、前記仕込み試験の結果、すなわち、前記仕込み開始から15日経過時の発酵産物における各測定項目の結果(2株の平均値)を示す。測定した項目は、エタノール、酸度、アミノ酸度、リンゴ酸、コハク酸、およびその他各種有機酸(αケトグルタル酸、クエン酸、ピルビン酸、乳酸、ピログルタミン酸等)である。
前記変異PEX22遺伝子により付与される形質、すなわち、有機酸の生成量の増大は、劣性形質であることを確認した。
本発明の有機酸生成酒酵母株の製造方法により得られた有機酸生成酒酵母株と、他の酒酵母株とを用い、混合醸造できることを確認した。
Claims (6)
- 酒酵母株について、その全PEX22遺伝子を変異PEX22遺伝子に変異させる変異工程を含み、
前記変異工程において、前記PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域について、塩基NNNを、ストップコドンに変異させることを特徴とする、有機酸生成酒酵母株の製造方法。 - 前記PEX22遺伝子は、配列番号2の塩基配列からなり、
前記配列番号2の塩基配列における塩基NNNを、ストップコドンに変異させる、請求項1記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法。 - 前記酒酵母株は、清酒酵母株である、請求項1または2記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法。
- 酒酵母株から有機酸生成酒酵母株を作製する作製工程、および
前記有機酸生成酒酵母株を用いて、清酒を製造する製造工程を含み、
前記作製工程は、請求項1から3のいずれか一項に記載の有機酸生成酒酵母株の製造方法により実施されることを特徴とする、清酒の製造方法。 - 前記清酒を容器に充填する充填工程を含む、請求項4記載の清酒の製造方法。
- PEX22遺伝子における配列番号1の塩基配列で示される部分領域において、塩基NNNが、ストップコドンであることを特徴とする、変異PEX22遺伝子。
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