MX2014012350A - Produccion microbiana de alcanolamidas y amidoaminas y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

La descripción se relaciona con un microorganismo recombinante modificado para expresar una enzima la cual cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa. La descripción abarca además un método para producir una amida grasa al cultivar el microorganismo recombinante en presencia de una fuente de carbono.

Description

PRODUCCION MICROBIANA DE ALCANOLAMIDAS Y AMIDOAMINAS Y USOS DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCION La descripción se relaciona con un microorganismo que ha sido modificado para que exprese una enzima con el fin de producir amidas grasas cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las amidas grasas son componentes endógenos de lípidos animales y vegetales que tienen una amplia variedad de funciones bioquímicas y fisiológicas (Bachur et al. (1965) J Biol . Chem 240:1019-1024). Las amidas grasas endógenas tales como N-palmitoiletanolamina (PEA), N-araquidonoil etanolamida (anandamida), N-oleoil etanolamida (OEA), y N-araquidonoil dopamina (NADA) funcionan como moléculas de señalización en el sistema nervioso central y periférico (véase, por ejemplo, Tan et al (2006) AAPS J 8(3): E461-E465; y Lo Verme et al . (2004) Mol . Pharmacol . 67(1):15-19). Se ha demostrado que PEA ejerce actividades antiinflamatorias y antinociceptivas y las formulaciones farmacéuticas de PEA para el tratamiento de dolor están disponibles en Europa bajo el nombre comercial NORMAST (Petrosino et al . (2010) Biochimie 92(6):724-7; y Bacci et al . (2011) ISRN Surgery, Volumen 2011, Artículo ID 917350, 6 páginas; No. de ref.: 251836 doi:10.5402/2011/917350).

Las amidas grasas tales como las alcanolamidas grasas y aminoamidas grasas, también tienen una amplia variedad de usos comerciales no farmacéuticos. Las alcanolamidas grasas y aminoamidas grasas son útiles como agentes espumantes, tensioactivos o intermediarios de los mismos en la producción de productos para el cuidado personal (por ejemplo, champús, lavados corporales y limpiadores faciales), formulaciones cosméticas (por ejemplo, rubores, mascarillas y lápices de labios) y productos de limpieza casera (por ejemplo detergentes de ropa sucia, líquidos para lavavajillas y composiciones limpiadoras de superficies). Las alcanolamidas grasas y aminoamidas grasas también son útiles como aditivos de combustible. Se calcula que 100,000 toneladas de alcanolamidas se consumen en el mercado mundial cada año (Adlercreutz et al. (2010) Industrial Biotechnology 6 (4):204-211).

Las alcanolamidas grasas para uso comercial clásicamente se han producido por medio de costosas reacciones orgánicas de síntesis entre un ácido graso o un éster metílico de ácido graso derivado de materias primas tales como aceites naturales o grasas y petróleo crudo y una alcanolamina (Adlercreutz et al . , supra, and Frost & Sullivan, "Nonionic Surfactants in the Industrial Triad" (2002)). Por ejemplo, se puede producir PEA al hacer reaccionar ácidos grasos de palmitoilo derivados de aceites de coco con monoetanolamina en una reacción de Schotten-Baumann, como sigue: ácido palmitoil grasos N-palmitoiletanolamida Las alcanolamidas grasas también se han producido de manera biosintética. Por ejemplo, se puede producir OEA a partir de fosfatidiletanolamina (PE) y precursores de sn-1-oleoil-fosfatidilcolina (PC) por medio de un proceso con dos enzimas, en donde PE y ns-l-oleoil-PC se hacen reaccionar con N-aciltransferasa para formar N-acilfosfatidiletanolamina (NAPE) la cual después se combina con liso-PC y se hace reaccionar con fosfolipasa D específica para NAPE para formar OEA y ácido fosfatídico (véase Astarita et al (2006) Am. J Physiol . Regul , Integr . Comp. Physiol 290:R1407-R1412).

Estos métodos así como otros métodos conocidos en el ámbito para sintetizar amidas grasas con frecuencia involucran etapas de reacción que no son eficientes y por lo tanto son costosas, desde la perspectiva tanto económica como ambiental. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos y reactivos mejorados para la producción de amidas grasas, en donde la longitud y saturación de la cadena grasa así como el tipo de grupo de cabeza de amida se puedan controlar eficientemente.

SUMARIO DE LA INVENCION Un aspecto de la presente descripción proporciona un microorganismo recombinante que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa, en donde el microorganismo se cultiva en presencia de una fuente de carbono. En la presente, el microorganismo se modifica para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa cuando el microorganismo se cultiva en presencia de una fuente de carbono. En una modalidad, la fuente de carbono es un carbohidrato. En otra modalidad, el polipéptido es un polipéptido palmitoilputrescina sintasa (PPS). En otra modalidad adicional el polipéptido es un polipéptido de N- (4-amino-2-hidroxilbutil)tetradecanamida sintasa (AhtS).

Otro aspecto de la descripción proporciona un polipéptido de palmitoilputrescina sintasa (PPS) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1. En una modalidad, el polipéptido de PPS incluye una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1. En otra modalidad, el polipéptido de PPS es codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 2.

Otro aspecto de la descripción proporciona un polipéptido de N- (4-amino-2-hidroxilbutil) tetradecanamida sintasa (AhtS) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3. En una modalidad, el polipéptido de AhtS incluye una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3. En otra modalidad, el polipéptido de AhtS es codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 22.

Además, otro aspecto de la descripción proporciona un microorganismo recombinante en donde la amina primaria incluye, pero no se limita a 3-dimetilamino-1-propilamina, (+)-1-amino-2-propanol, 2-metoxietilamina, 3-amino-l-propanol, 2-amino-1,3-propanodiol, 3-metoxipropilamina, N-(2-hidroxietil)etilendiamina y butilamina, 1,4-diaminobutano o una combinación de los mismos.

Además, otro aspecto de la descripción proporciona un microorganismo recombinante en donde el tioéster de acilo es un acil graso-ACP o un acil graso-CoA. El acil graso-ACP o el acil graso-CoA son producidos por el microorganismo.

La descripción abarca además un microorganismo recombinante que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para uno o más de un polipéptido biosintético de ácido graso, un polipéptido de tioesterasa (EC 3.1.2.14 o EC 3.1.1.5) y un polipéptido de acil-CoA sintasa (EC 2.3.1.86). En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido tioesterasa es tesA. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido acil-CoA sintasa es fadD. En otra modalidad adicional, el microorganismo incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de ácido graso que incluye, pero que no se limita a accABCD, FabD, FabH, FabG, FabB, FabA, FabZ, FabF, FabI, y/o FadR.

La descripción además contempla un microorganismo que incluye, pero que no se limita a bacterias, cianobacterias, algas y hongos. En una modalidad, la bacteria es E. coli . En otra modalidad, el hongo es levadura, un hongo filamentoso. En otra modalidad adicional el microorganismo incluye, pero no se limita a Saccharomyces cerevisiae , Candida lipolytica, Escherichia coli, Arthrobacter, Rhodotorula glutinins , Acinetobacter , Candida lipolytica, Botryococcus braunii, Vibrio furnissii , Micrococcus leuteus, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus subtilis , Bacillus lichenoformis , Psuedomonus putida, Psuedomonas florescens , Streptomyces coelicolor, Synechococcus sp . PCC7002 , Thermosynechococcus elongatus BP-1, Prototheca moriformis, Prototheca krugani , Prototheca stagnora, Prototheca zopfii o una célula de Chorella protothecoide . En otra modalidad adicional el microorganismo incluye, pero no se limita a Arthrobacter AK 19, Acinetobacter sp. cepa M-l, E coli B, E. coli C, E coli K, o una célula de E. coli W.

Otro aspecto de la descripción proporciona un microorganismo recombinante que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa, en donde el polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa es endógeno al microorganismo.

Otro aspecto de la descripción proporciona un microorganismo recombinante que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa, en donde el polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa es exógeno al microorganismo.

Además, otro aspecto de la descripción proporciona un microorganismo recombinante que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para una enzima que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa. En una modalidad, la amida grasa es una alcanolamida grasa y/o una amidoamina grasa. En otra modalidad, la amida grasa es una alcanolamida grasa de 14, 16 y/o 18 carbonos y/o una amidoamina grasa de 14, 16 ó 18 carbonos. En otra modalidad adicional, la amida grasa es una alcanolamida grasa de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 19 o 20 carbonos y/o una amidoamina grasa de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 196 20 carbonos.

En otro aspecto adicional de la descripción se proporciona un microorganismo recombinante que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa, en donde el microorganismo expresa un polipéptido de serina descarboxilasa.

La descripción abarca además un método para producir una amida grasa que incluye: (a) proporcionar un microorganismo recombinante que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa; y (b) cultivar el microorganismo recombinante en un medio de cultivo bajo condiciones adecuadas para la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa en presencia de por lo menos un sustrato para el polipéptido. Este método puede incluir además aislar la amida grasa del medio de cultivo. El método se puede utilizar para producir amidas grasas. En una modalidad, la amida grasa es una alcanolamida grasa y/o una amidoamina grasa. En otra modalidad, la amida grasa es una alcanolamida grasa de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 carbonos y/o una amidoamina grasa de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 carbonos.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La presente descripción se entiende menor cuando se lee junto con las figuras anexas, las cuales sirven para ilustrar las modalidades preferidas. No obstante, se entiende que la descripción no se limita a las modalidades específicas descritas en las figuras.

La figura 1 es un cromatograma representativo de cromatografía de gas-espectroscopia de masas (GC-MS) de las especies grasas producidas por E. coli MG1655 cepa DG5 transformada con un vector de expresión que codifica para una palmitoilputrescina sintasa (PPS) cultivada en presencia de etanolamina. El panel superior muestra un pico que tiene un tiempo de retención CG de 13.1 min el cual se identificó como N-palmitoiletanolamida por análisis de EM mostrado en el panel inferior.

La figura 2A a la figura 2D son cromatogramas GC-MS del producto N-palmitoiletanolamida seguido de derivatización con N, 0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA).

La figura 2A muestra un pico que tiene un tiempo de retención de CG de 13.3 min el cual se identificó como N-palmitoiletanolamida protegida con trimetilsililo (TMS) por análisis de EM mostrado en la figura 2E. La figura 2B a la figura 2D son cromatogramas de control de BSTFA solo, N-palmitoiletanolamida sin derivatización de BSTFA y reacción en blanco, respectivamente.

La figura 3 es un cromatograma de GC-MS de las amidas N-(3-dimetilamino-1-propilamina) grasas producidas por E. coli , MG1655 cepa DG5 transformadas con un vector de expresión que codifica para una PPS cultivada en presencia de 3-dimetilamino-l-propilamina.

La figura 4 muestra los productos de amida grasa obtenidos de células E. coli MG1655 transformadas con un vector de expresión que codifica para una PPS y cultivados en la presencia de alimentaciones de amina primaria indicados.

La figura 5 es un cromatograma GC-MS representativo de las especies grasas producidas por una cepa de E. coli MG1655 transformada con un vector de expresión que codifica para la enzima N- (4-amino-2-hidroxilbutil)tetradecanamida sintasa (AhtS) cultivada en presencia de 3-dimetilamino-l-propilamina. El panel superior muestra un pico que tiene un tiempo de retención CG de 11.4 min el cual se identificó como N-(3-di etilamino-1-propilamida) grasa C14:0 por análisis EM, mostrado en el panel inferior.

La figura 6 es un diagrama esquemático de las vías metabólicas las cuales pueden ser modificadas genéticamente de acuerdo con los métodos de la descripción.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El antibiótico natural palmitoilputrescina se puede producir por bacterias las cuales expresan palmitoilputrescina sintasa (PPS) (GenBank Acceso No. AAV33349.1 (a continuación "AAV33349")) (SEC ID NO: 1) codificado por la secuencia de ácido nucleico de GenBank Acceso No. AY632377.1 (a continuación "AY632377") (SEC ID NO: 2) (Brady et al . (2004) J Nat. Prod, 67:1283-1286). Cuando se sobreepresa en E. coli, la PPS codificada por AY632377 ha demostrado que produce únicamente un derivado de N-acilo mayor de putrescina (1,4-diaminobutano), específicamente palmitoilputrescina (Brady et al, supra) . Un homólogo que codifica para la enzima N- (4-amino-2-hidroxilbutil) tetradecanamida sintasa (AhtS) (GeneBank Acceso No. ACX33975.1) (SEC ID NO: 3), tiene una secuencia de aminoácidos que es 38% idéntica a la secuencia de aminoácidos de PPS. El gen para N- (4-amino-2-hidroxibutil) tetradecanamida sintasa (AhtS) a partir de bacteria no cultivada RM44 (GenBank GQ869386) se muestra en la (SEC ID NO: 22).

La descripción se basa, por lo menos parte, en el descubrimiento de que un microorganismo (por ejemplo, una bacteria) que expresa una PPS o AhtS puede producir amidas grasas a partir de precursores de tioéster de acilo cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono. Sin desear unirse a teoría alguna, se considera que PPS cataliza directamente la amidación entre un tioéster de acilo y una amina primaria. Esta es la primera vez que un microorganismo ha sido modificado específicamente para expresar una enzima tal como PPS o AhtS con el fin de producir amidas grasas. Esto es útil debido a que el microorganismo de esta manera sirve como una fabrica biológica conveniente que genera amidas grasas de longitud de cadena deseada, incluidas en forma ramificada o no ramificada. Además, diversas materias primas diferentes (por ejemplo maíz, caña de azúcar, glicerol, pasto varilla) se pueden utilizar de modo intercambiable para suministrar la fuente de carbono necesaria para el microorganismo, permitiendo flexibilidad. De esta manera, el microorganismo se puede utilizar para producir amidas grasas según se requiera que pueden ser recolectadas por medio de fermentación, para de esta manera evitar los problemáticos y costosos sistemas de la téenica anterior que aún se basan en aceites naturales costosos y química de síntesis complicada. Las amidas grasas son necesarias para la producción de numerosos productos que incluyen, pero que no se limitan a agentes espumantes, tensioactivos catiónicos, intermediarios para uso como champús y productos para el baño, agentes emulsificantes y cosméticos y sustancias farmacéuticas, aditivos de combustible y similares.

La descripción proporciona un microorganismo recombinante modificado para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa, en donde el microorganismo se cultiva en presencia de una fuente de carbono. En una modalidad, la fuente de carbono es un carbohidrato. De manera más específica, el microorganismo se modifica de manera que una enzima como PPS o AhtS se expresa con el fin de catalizar la amidación entre cualquier amina primaria (por ejemplo, etanolamina, amina 3-dimetilamino-1-propilamina) con un tioéster de acilo (por ejemplo, acil-CoA o acil-ACP) con el fin de producir amidas grasas tales como alcanolamidas y amidoaminas. Este es un proceso novedoso debido a que las alcanolamidas grasas (por ejemplo, los intermediarios utilizados en la síntesis de cocamidopropilbetaína) y las amidoaminas han sido producidas hasta ahora de manera sintética a partir de materias primas tales como aceites naturales (o grasas) y petróleo crudo, lo cual es un proceso ineficiente debido a que se basa en el refinamiento de materias crudas hasta que se obtienen los materiales deseados. En comparación, la presente descripción proporciona un método de producción en donde un microorganismo es modificado para expresar enzimas tales como, por ejemplo, alcanolamidas y N-(3-dimetilamino-1-propilamina)amidas grasas son sintetizadas bioquímicamente, lo cual es un proceso mucho más efectivo para producir amidas grasas. Se pueden agregar aminoácidos o carbohidratos al medio de fermentación del microorganismo para suministrar la fuente de carbono necesaria (véanse los ejemplos 3 a 7). De manera alternativa, el microorganismo se puede modificar para generar su propia amina primaria in vivo. Por ejemplo, la biosíntesis de etanolamina se puede llevar a cabo al incrementar genéticamente la biosíntesis de serina y las vías de descarboxilación de serina (véase el ejemplo 8).

Enzimáticamente, AhtS produce los mismos compuestos amida que PPS pero con preferencia por sustratos de tioéster grasos C14:0. Ambas enzimas pertenecen a la familia EC 2.3.1.X.X.

La descripción proporciona además un método para producir una amida grasa en un microorganismo recombinante. Las amidas grasas producidas por este método incluyen, pero no se limitan a alcanolamidas grasas y amidoaminas grasas. En una modalidad, la amida grasa es una alcanolamida grasa de 14, 16 y/o 18 carbonos. En otra modalidad, la amida grasa es una amidoamina grasa de 14, 16 y/o 18 carbonos. El método involucra las etapas de: (a) proporcionar un microorganismo recombinante modificado para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido tal como PPS o AhtS, el cual catalizar la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa, y (b) cultivar el microorganismo recombinante bajo condiciones adecuadas para expresión del polipéptido en presencia de por lo menos un sustrato para el polipéptido para de esta manera producir la amida grasa. El microorganismo se cultiva en presencia de una fuente de carbono. La fuente de carbono se puede seleccionar de una amplia variedad de fuentes diferentes que incluyen pero que no se limitan a aminoácidos, carbohidratos y lípidos. En una modalidad, la fuente de carbono es un carbohidrato. La amida grasa que se produce por el microorganismo se puede aislar del caldo de cultivo (por ejemplo, caldo de fermentación). En una modalidad, la amida grasa se aísla del ambiente extracelular del microorganismo. En otra modalidad, la amida grasa es secretada de manera espontánea, parcial o completamente, del microorganismo. En otra modalidad, la amida grasa es transportada al ambiente extracelular, opcionalmente con la ayuda de una o más proteínas de transporte adecuadas. En otra modalidad adicional, la amida grasa es transportada de manera pasiva al ambiente extracelular.

Los términos "amida grasa" y "alquilamida se refiere a un compuesto que tiene la fórmula R^-CONHR2, en donde R1 representa un grupo alifático derivado de un ácido graso, y R2 representa un alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido o un grupo heteroalquenilo sustituido o no sustituido, derivado de una amina primaria.

Un "tioéster de acilo" se refiere a un ácido graso el cual ha sido "activado" por una vía biosintética de ácido graso del microorganismo hospedador de producción. El tioéster de acilo se puede generar a partir de un ácido graso endógeno al microorganismo, o el tioéster de acilo se puede generar a partir de un ácido graso proporcionado al microorganismo de manera exógena. Los ejemplos no limitantes de tioésteres de acilo son acil-coenzima A (CoA) y la proteína portadora de acil-acilo (ACP).

El término "acil-CoA" se refiere a un tioéster de acilo formado entre el carbono carbonilo de una cadena alquilo y el grupo sulfhidrilo de la porción 4 1-fosfopanteteina de CoA, la cual tiene la fórmula R1-C(O)S-CoA, en donde R1 es un grupo alifático. El término "acil-ACP" se refiere a un tioéster de acilo formado entre el carbono de carbonilo y una cadena alquilo y el grupo sulfhidrilo de una porción 41-fosfopanteteina unida a ACP, la cual tiene la fórmula R!C(O)S-ACP, en donde R1 es un grupo alifático.

El término "ácido graso" significa un ácido carboxílico que tiene la fórmula I^COOH. R1 representa un grupo alifático, preferiblemente un grupo alquilo. R1 puede comprender entre 4 y 26 átomos de carbono. En ciertas modalidades, R1 es por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18. por lo menos 19, por lo menos 20 o por lo menos 21 carbonos de longitud. De manera alternativa o adicional, el grupo R1 es de una longitud de carbonos de 22 o menos, 21 o menos, 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos o 6 o menos. De este modo, el grupo R1 puede tener un grupo R1 limitado por cualesquiera dos de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, el grupo R1 puede tener una longitud de 6 a 16 carbonos, una longitud de 10 a 14 carbonos o una longitud de 12 a 18 carbonos. En algunas modalidades, el ácido graso es un ácido graso de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 carbonos. En ciertas modalidades, el ácido graso es un ácido graso de 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 carbonos. En una modalidad preferida, la amida grasa es una alcanolamida grasa de 14, 16 o 18 carbonos. En otra modalidad preferida, la amida grasa es una amidoamina grasa de 14, 16 ó 18 carbonos.

En otra modalidad preferida adicional, la amida grasa es una alcanolamída de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 carbonos. En una modalidad preferida adicional, la amida grasa es una amidoamina de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 carbonos.

El grupo R1 de un ácido graso puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener más de un punto de ramificación y pueden incluir ramas cíclicas. En algunas modalidades, el ácido graso ramificado es un ácido graso ramificado de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 carbonos. En modalidades particulares, el ácido graso ramificado es un ácido graso ramificado con 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 carbonos. En ciertas modalidades, el grupo hidroxilo del ácido graso ramificado está en una posición primaria (Ci).

En ciertas modalidades, el ácido graso ramificado es un ácido iso-graso o un ácido anteiso-graso. En modalidades ejemplares, el ácido graso ramificado se selecciona de un ácido graso ramificado iso-C7:o, iso-Cs:o, ÍSO-Cg:o, ÍSO-Cl0:0, ÍSO-Cll:0, ÍSO Cl2:0, lSO-Cl3:0, ÍSO-Cl4:0, ÍSO-Cl5:0, ÍSO-Cl6:0, ÍSO-Cl7:0, ÍSO-Cl8:0, ÍSO-Cl9:0, antq?SO-C7:0, anteiso-C8:0 anteiso-C9:o, anteiso-Cio:o, anteiso-Cn:o, anteiso Ci2:0 anteiso-Ci3:o, anteiso-Ci4:o, anteiso-Cis:o, anteiso-Ci6:o, anteiso-Ci7;c, anteiso-Cis;o y anteiso-Ci9:o- El grupo R1 de un ácido graso ramificado o no ramificado puede estar saturado o insaturado. Si está insaturado, el grupo R1 puede tener uno o más de un punto de insaturación. En algunas modalidades, el ácido graso insaturado es un ácido graso monoinsaturado. En ciertas modalidades, el ácido graso insaturado es un ácido graso insaturado C6:l, C7:l, C8:l, C9:l, C10:l, Cll:l, C12:l, C13 :1, C14:1, C15:l, C16:l, C17:l, C18:l, C19:l, C20:l, C21:1, C22:1, C23:l, C24:l, C25:l, C26:1. En otras modalidades, el ácido graso insaturado es un ácido graso insaturado C10:l, C12:l, C14:l, C15:l, C16:l, o C18:l. En otras modalidades adicionales, el ácido graso insaturado está insaturado en la posición omega-7. En ciertas modalidades, el ácido graso insaturado comprende un enlace doble cis.

La amina primaria puede ser cualquier amina primaria capaz de servir como un sustrato para PPS que tiene la fórmula R2NH2, en donde R2 representa un alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido o una cadena heteroalquenilo sustituida o no sustituida. En ciertas modalidades, R2 esta sustituido con un grupo hidroxilo, y la amida grasa se le puede denominar como una "alcanolamida" o una "alcanolamida grasa". En otras modalidades, R2 contiene un grupo amino y la amida grasa se le puede denominar como una "amidoamina" o una "amidoamina grasa".

R2 puede comprender entre 1 y 12 átomos de carbono. En ciertas modalidades, R2 comprende por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6 o por lo menos 7 carbonos. De manera alternativa o adicional, R2 comprende 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos o 4 o menos carbonos. De esta manera, el grupo R2 puede comprender carbonos limitados por cualesquiera dos de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, el grupo R2 puede comprender 2-8 carbonos, 4-10 carbonos o 3-6 carbonos. En algunas modalidades, el grupo R2 contiene 3, 4, 5 ó 6 átomos de carbono.

El grupo R2 de una amina primaria puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada. Las cadenas ramificadas pueden tener más de un punto de ramificación y pueden incluir ramas cíclicas.

El término "alquilo" por si mismo o como parte de otro sustituyente significa, a menos que se indique en otro sentido, una cadena lineal o cadena ramificada o un radical de hidrocarburo cíclico o una combinación de los mismos. Esta definición también se aplica si "alquilo" se presenta como parte de un grupo tal como, por ejemplo, hidroxialquilo, haloalquilo, aminoalquilo, alquilamino, dialquilamino, etc.

El término "alquenilo" por si mismo o como parte de otro sustituyente significa, a menos que se indique en otro sentido, una cadena lineal o una cadena ramificada o un radical de hidrocarburo cíclico o una combinación de los mismos que contiene, por ejemplo, aproximadamente 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono y que contiene por lo menos un enlace doble carbono-carbono.

Los términos "heteroalquilo" y "heteroalquenilo" a menos que se indique en otro sentido, se refieren a un radical de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada o cíclico, o combinaciones de los mismos, que consiste del número indicado de átomos de carbono y por lo menos un heteroátomo que se selecciona del grupo que consiste de O, N, Si y S y en donde los átomos de nitrógeno y azufre opcionalmente pueden estar oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno opcionalmente puede estar cuaternizado. Uno o varios de los heteroátomos de 0, N, Si y S puede estar colocado en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o heteroalquenilo. Los grupos heteroalquilo ejemplares para el grupo R2 incluyen pero no se limitan a -CH2-CH2-OH, CH2-CH2-O-CH3, CH2-CHOH-CH3, CH2-CH2-O-CH3, CH2-CH2-CH2-N (CH3)2, CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH3, CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-OH, -CH-(CH2-OH)2 y -Si(CH3)3. Hasta dos heteroátomos pueden estar consecutivos, tal como, por ejemplo, -CH2-CH2-O-Si(CH3)3.

Los términos alquilo, heteroalquilo, alquenilo y heteroalquenilo significa incluir ambas formas, sustituida y no sustituida del radical indicado. Los sustituyentes ejemplares para los radicales alquilo, heteroalquilo, alquenilo y heteroalquenilo del grupo R2 pueden ser uno o más de una diversidad de grupos que se seleccionan de, pero que no se limitan a -0R', =0, =NR1, =N-OR', -NR1R11, -SR', -halógeno, -SiR'R''R''', -0C(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CN y -NO2 en un número que varía de 0 a (2m'+l), en donde m' es el número total de átomos de carbono en ese radical. Cada uno de R', R'1 y R1'’, independientemente, se refiere a hidrógeno, alquilo no sustituido o sustituido, heteroalquilo no sustituido o sustituido, alquenilo no sustituido o sustituido, heteroalquenilo no sustituido o sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi o grupos arilalquilo.

En algunas modalidades, el sustituyente para el grupo R2 es -OH. El ciertas modalidades, el grupo R2 es una porción polihidroxialquilo o una porción polihidroxiheteroalquilo que contiene 2, 3 ó 4 grupos hidroxilo.

La cadena alquilo, heteroalquilo, alquenilo o heteroalquenilo del grupo R2 también puede estar interrumpida con una porción de óxido de polietileno. En ciertas modalidades, el grupo R2 contiene una porción de óxido de polietileno que comprende 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más o 6 o más o 7 o más porciones de óxido de etileno. En otras modalidades, el grupo R2 contiene una porción de óxido de polietileno que comprende 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos o 5 o menos porciones de óxido de etileno. De esta manera, el grupo R2 puede contener una porción de óxido de polietileno que tiene un número de porciones de óxido de etileno limitadas por cualesquiera dos de los puntos de extremo anteriores. Por ejemplo, el grupo R2 puede contener una porción de óxido de polietileno que tenga 2 a 10, 4 a 8 o 3 a 5 porciones de óxido de etileno.

La amina primaria se puede producir en el microorganismo a partir de una fuente de carbono fermentable. Por ejemplo, se puede generar monoetanolamina in vivo a partir de serina mediante la acción de serina descarboxilasa (SDC) (Rontein et al . , (2001) J. Biol . Chem. 276(38):35523-35529). En algunas modalidades, el microorganismo expresa un polipéptido SDC endógeno. En otras modalidades, el microorganismo es modificado para sobreexpresar un polipéptido de SDC.

Se puede generar putrescina (1,4-diaminobutano) in vivo a partir de arginina mediante las acciones de arginina descarboxilasa (ADC) y agmatina ureohidrolasa (AUH), lo cual convierte arginina a agmatina y agmatina a putrescina, respectivamente (Moore et al. (1990) J. Bacteriol 172(8):4631-4640). En algunas modalidades, el microorganismo expresa polipéptidos de ADC y AUH endógenos. En otras modalidades, el microorganismo es modificado para sobreexpresar un polipéptido de ADC, un polipéptido de AUH o polipéptidos de ADC y AUH. En ciertas modalidades, el ADC es codificado por el gen speA de E. coli MG1655 (GenBank, acceso número NC_000913).

La amina primaria también se puede proporcionar al microorganismo de manera exógena.

Las aminas primarias ejemplares adecuadas para uso en la descripción incluyen, pero no se limitan a etanolamina (monoetanolamina), 3-dimetilamino-1-propilamina, (+)-1-amino-2-propanol, 2-metoxietilamina, 3-amino-1-propanol, 2-amino-1,3-propanodiol, 3-metoxipropilamina, N- (2-hidroxietil)etilendiamina, butilamina, 1,4-diaminobutano y combinaciones de los mismos. En ciertas modalidades, la amina primaria es 3-dimetilamino-l-propilamina.

El ácido nucleico adecuado para uso en los microorganismos recombinantes y métodos de la descripción puede ser cualquier ácido nucleico que tenga una secuencia la cual codifique para un polipéptido capaz de convertir una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa cuando el ácido nucleico se expresa y el microorganismo se cultiva en presencia de una fuente de carbono.

En una modalidad, el polipéptido es un polipéptido de PPS. En ciertas modalidades, el polipéptido de PPS comprende, consiste esencialmente o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1, es decir, la secuencia de aminoácidos de AAV33349. En algunas modalidades, el polipéptido de PPS es codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 2. En otras modalidades, el polipéptido de PPS es un homólogo del polipéptido de PPS que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1. El polipéptido de PPS preferiblemente comprende, consiste esencialmente de o consiste de una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1.

En otras modalidades, el polipéptido es un polipéptido N-(4-amino-2-hidroxibutil)tetradecanamida sintasa (AhtS). En ciertas modalidades, el polipéptido AhtS comprenden consiste esencialmente o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3, es decir, la secuencia de aminoácidos de GenBank, acceso número ACX33975. En algunas modalidades, el polipéptido de AhtS es codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 22. En otras modalidades, el polipéptido de AhtS es un homólogo del polipéptido de AhtS que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3. El polipéptido de AhtS preferiblemente comprende, consiste esencialmente o consiste de una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3.

En ciertas modalidades, el polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa es endógeno al microorganismo. En estas modalidades, el microorganismo recombinante es modificado para sobreexpresar el polipéptido endógeno que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa.

En otras modalidades, el polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa es exógeno al microorganismo. En estas modalidades, el microorganismo recombinante es modificado para expresar el polipéptido exógeno de manera que catalice la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa. Por ejemplo, el ácido nucleico exógeno que codifica para el polipéptido exógeno se puede integrar en el microorganismo a través de procedimientos de biología molecular estándar. Proporcionar el microorganismo con una fuente de carbono permitirá que el microorganismo incremente la producción de amida grasa.

Los términos "homólogos", "homologa" y "homólogos", como se utilizan en la presente, se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que comprende una secuencia que es por lo menos aproximadamente 70% homologa a la secuencia correspondiente polinucleotídica o polipeptídica. Una persona habitualmente experta en el ámbito conocerá bien los métodos para determinar homología entre dos o más secuencias. Por ejemplo, la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático tal como Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al . (1990) J. Mol . Biol .215(3):403-410).

El término "polinucleótido" se refiere a un polímero de ADN o ARN el cual puede ser de cadena sencilla o de cadena doble y el cual puede contener nucleótidos no naturales o alterados. Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico", se utilizan en la presente de modo intercambiable para ser referencia a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN).

Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos aminoácidos. El término "polipéptido recombinante" se refiere a un polipéptido que es producido por téenicas de ADN recombinantes en donde de manera general el ADN que codifica para la proteína expresada o el ARN se insertan dentro del vector de expresión adecuado que a su vez se utiliza para transformar una célula hospedadora para producir el polipéptido o ARN.

En las composiciones y métodos de la descripción, la producción de un ácido graso o un derivado de tioéster de acilo del mismo, deseados se puede incrementar al alterar la expresión de uno o más genes involucrados en la regulación de producción, degradación y/o secreción de ácido graso en el microorganismo recombinante.

En algunas modalidades, el microorganismo recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de ácido graso. Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido biosintético de ácido graso" se refiere a cualquier polipéptido involucrado en la biosíntesis de ácido graso. La vía biosintética de ácido graso en las células hospedadoras utiliza los precursores acetil-CoA y malonil-CoA. Las etapas en esta vía son catalizadas por enzimas de la biosíntesis de ácido graso ( fab , por sus siglas en inglés), y las familias de genes de acetil-CoA carboxilasa (acc, por sus siglas en inglés) (véanse, por ejemplo, Heath et al . (2001) Prog. Lipid Res, 40(6):467-497). El acetil-CoA es carboxilado por acetil-CoA carboxilasa (EC 6.4.1.2) para formar malonil-CoA. La acetil-CoA carboxilasa (EC 6.4.1.2) es una enzima de subunidades múltiples codificada por cuatro genes separados (accA, accB, accC, y accD) , en la mayor parte de los procariotes, En algunas bacterias, tales como Corynebacterium glutamicus, la acetil-CoA carboxilasa incluye dos subunidades, AccDA [YP_225123.1] y AccBC [YP_224991], codificadas por accDA y accBC, respectivamente. Dependiendo del ácido graso deseado o el producto derivado de ácido graso, los genes específicos fab y/o acc (o combinaciones de los mismos) se pueden sobreexpresar, modificar, atenuar o suprimir en una célula hospedadora modificada.

En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de ácido graso codifica para accABCD. En otras modalidades, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido biosintético de ácido graso codifica para FabD, FabH, FabG, FabB, FabA, FabZ, FabF, Fabl o a un homólogo funcional de Fab de otro organismo, tal como FabV. Los números de acceso de GenBank ejemplares para los polipéptidos biosintéticos de ácido graso adecuados para uso en las composiciones y métodos de la descripción incluyen FabD (AAC74176), FabH (A-AC74175), FabG (AAC74177), FabB (P0A953), FabA (ACY27485.1), FabZ (ACY27493.1), FabF (AAC74179) y Fabl (NP_415804).

En algunas modalidades, el microorganismo recombinante comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para dos o más (por ejemplo, 3 o más, 4 o más) polipéptidos biosintéticos (por ejemplo, accABCD y FabD; FabD, FabH, y FabG; o Fabl, FabG,H,D, FabA,B, y FabZ).

FadR es un factor de transcripción involucrado en degradación de ácido graso y vías de biosíntesis de ácido graso (Cronan et al (1998) Mol . Microbiol 29(4):937-943). Se sabe que FadR modula la expresión y/o actividad de numerosos genes, que incluyen fabA, fabB, iclR, fadA, fadB, fadD, fadE, fadl, fadJ, fadL, fadM, uspA, aceA, aceB y aceK. Los números de acceso de GenBank ejemplares para polipéptidos codificados por los genes objetivo FadR incluyen fabA (NP_415474), fabB (BAA16180), (NP_418442), fadA (YP_026272.1), fadB (NP_418288.1), fadD (AP-002424), fadE (NP_414756.2), fadl (NP_416844.1), fadJ (NP_416843.1), fadL (AAC75404), fadM (NP_414977.1), uspA (AAC76520), aceA (AAC76985.1), aceB (AAC76984.1) y aceK (AAC76986.1).

En algunas modalidades, el microorganismo recombinante incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de ácido graso y la secuencia de ácido nucleico que codifica para FadR. En ciertas modalidades, la secuencia de ácido nucleico codifica para FadR a partir E. coli MG1655 (NP_415705).

Las tioesterasas (EC 3.1. 2.14 o EC 3.1.1.5) hidrolizan ácidos grasos a partir de tioésteres de acil-ACP. La longitud de cadena de un sustrato de tioéster de acilo se puede seleccionar al modificar la expresión de las tioesterasas seleccionadas. En ciertas modalidades, una célula hospedadora es modificada para expresar, sobreexpresar, tener expresión atenuada o no expresar una o más tioesterasas seleccionadas para incrementar la producción de un sustrato derivado de ácido graso preferido. Por ejemplo, se pueden producir ácidos grasos de 10 carbonos al expresar una tioesterasa que tenga una preferencia por producir ácidos grasos de 10 carbonos y atenuar tioesterasas que tengan una preferencia por producir ácidos grasos diferentes de ácidos grasos de 10 carbonos (por ejemplo, una tioesterasa la cual prefiere producir ácidos grasos de 14 carbonos). Esto podría resultar en una población relativamente homogénea de ácidos grasos que comprenden 10 carbonos. En otras instancias, se pueden producir ácidos grasos de 14 carbonos al atenuar tioesterasas endógenas que producen ácidos grasos diferentes de 14 carbonos y expresar las tioesterasas que tengan una preferencia por ACP de 14 carbonos. En algunas situaciones, se pueden producir ácidos grasos de 12 carbonos al expresar tioesterasas que tengan una preferencia por ACP de 12 carbonos y atenuar tioesterasas que producen de manera preferencial ácidos grasos diferentes de 12 carbonos. Se puede verificar la sobreproducción de acetil-CoA, malonil-CoA y ácido graso utilizando métodos conocidos en el ámbito, por ejemplo, mediante la utilización de precursores radioactivos, HPLC o GC-MS.

Los ejemplos no limitantes de genes para tioesterasa (y uno o varios de los números de acceso de GenBank correspondientes) cuya expresión se pueda alterar en las composiciones y métodos de la descripción incluyen tesA sin la secuencia líder (tesA) a partir de E. coli (AAC73596), tesB de E. coli (AAC73555), fatB de Umbellularia california (Q41635, AAA34215), fatB2 de Cuphea hookeriana (AAC49269), fatB3 de Cuphea hookeriana (Q39513; AAC72881), fatB de Cinnamonum camphorum (Q39473, AAC49151), fatB [M141T] de Arabidopsis thaliana (CAA85388) (Mayer et al, (2007) BMC Plant Biology 7:1-11), fatA de Arabidopsis thaliana (NP 189147; NP 193041), fatA de Bradyrhiizobium japonicum (CAC39106), fatA de Cuphea hookeriana (AAC72883), y fatAl de Helianthus annus (AAL79361).

En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica para una tioesterasa y la secuencia de ácido nucleico es tesA DE E coli MG1655 (AAC73596).

Las acil-CoA sintasas (EC 2.3.1.86) activan ácidos grasos al catalizar la formación de tioésteres de acil-CoA. Los ejemplos no limitantes de genes para acil-CoA sintasa cuya expresión se puede alterar en las composiciones y métodos de la descripción incluyen fadD, fadK, BH3103, yhfL, Pf 1 -4354, EAV15023 , fadDl, fadD2, RPC-4074 , fadDD35, fadDD22, faa3p o el gen que codifica para la proteína ZP_01644857. Los ejemplos específicos de genes para acil-CoA sintasa incluyen fadDD35 de M. tuberculosis H37Rv [NP_217021] , fadDD22 de M. tuberculosis H37Rv [NP_217464], fadD de E. coli [NP-416319] fadK de E. coli [YP_416216], fadD de Acinetobacter sp. ADP1 [NP_045024], fadD de Haemophillus influenzae RdkW20 [NP_438551], fadD de Rhodopseudomonas palustris Bis B18 [YP_533919], BH3101 de Bacillus halodurans C-125 [NP_243969], Pfl -4354 de Pseudomonas fluorescens Pfo-1 [YP_350082], EAV15023 de Comamonas testosterone KF-1 [ZP:01520072], yhfL de B. subtilis [NP_388908], faddl de P. aeruginosa PA01 [NP_251989], fadDl de Ralstonia solanacearum GM1 1000 [NP_520978], fadD2 de P. aeruginosa PA01 [NP_251990], el gen que codifica para la proteína ZP_01644857 de Stenotrophomonas maltophilia R551-3, faa3p de Saccharomyces cerevisiae [NP_012257], faalp de Saccharomyces cerevisiae [NP_014962], IcfA de Bacillus subtilis [CAA99571] y aquellos descritos en Shockey et al (2002) Plant . Physiol . 129:1710-1722); Caviglia et al . (2004) J Biol Chem. 279:1163-1169); Knoll el al . (1994) J Biol . Chem. 269(23):16348-56); Johnson et al . (1994) J Biol . Chem. 269:18037-18046); y Black et al (1992) J Biol, Chem. 267:25513-25520).

En algunas modalidades, el microorganismo recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de acil-CoA sintasa y el polipéptido de acil-CoA sintasa es FadD de E. coli MG1655 [NP_416319].

El microorganismo recombinante puede comprender ácidos nucleicos que codifican para cualquier combinación de polipéptidos biosintéticos de ácido graso, polipéptidos de tioesterasa y polipéptidos de acil-CoA sintasa. En ciertas modalidades, el microorganismo comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de tioesterasa y una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de acil-CoA sintasa.

Una persona habitualmente experta en el ámbito entenderá que, dependiendo del propósito (por ejemplo, ácido graso deseado o derivado de tioéster de acilo del mismo), los genes específicos (o combinaciones de genes) involucrados en el metabolismo de ácido graso pueden ser sobreexpresados, modificados, atenuados o suprimidos en un microorganismo recombinante modificado para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido capaz de catalizar la conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa. Los ejemplos adicionales de genes involucrados en metabolismo de ácido graso adecuados para uso en la descripción se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente U.S. 2011/0162259, la cual se incorpora en su totalidad como referencia en la presente.

En algunas modalidades, el polipéptido es un fragmento de cualquiera de los polipéptidos que aquí se describen. El término "fragmento" se refiere a una porción más corta de un polipéptido de longitud completa o proteína que varía en tamaño desde cuatro residuos aminoácidos hasta la secuencia completa de aminoácidos menos un residuo aminoácido. En ciertas modalidades de la invención, un fragmento se refiere a la totalidad de la secuencia de aminoácidos de un dominio de un polipéptido o proteína (por ejemplo, un dominio de unión a sustrato o un dominio catalítico).

En algunas modalidades el polipéptido es un mutante o una variante de cualquiera de los polipéptidos que aquí se describen. Los términos "mutante" y "variante", como se utilizan en la presente se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de un polipéptido natural eenn por lo menos un aminoácido. Por ejemplo, el mutante puede comprender una o más de las siguientes sustituciones conservadoras de aminoácidos: sustitución de un aminoácido alifático tal como alanina, valina, leucina e isoleucina con otro aminoácido alifático; sustitución de una serina con una treonina; sustitución de una treonina con una serina; sustitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico con otro residuo ácido; sustitución de un residuo que presenta un grupo amida tal como asparagina y glutamina, con otro residuo que presenta un grupo amida; intercambio de un residuo básico, tal como lisina y arginina con otro residuo básico; y sustitución de un residuo aromático tal como fenilalanina y tirosina con otro residuo aromático. En algunas modalidades, el polipéptido mutante tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más sustituciones, adiciones, inserciones o supresiones de aminoácidos.

Los fragmentos preferidos o mutantes de un polipéptido retienen parte o la totalidad de la función biológica (por ejemplo, actividad enzimática) del polipéptido natural correspondiente. En algunas modalidades, el fragmento o mutante requiere por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95% o por lo menos aproximadamente 98% o más de la función biológica del polipéptido natural correspondiente. En otras modalidades, el fragmento o mutante retiene aproximadamente 100% de la función biológica del polipéptido natural correspondiente. La guía para determinar cuáles residuos aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados o suprimidos sin alterar la actividad biológica se pueden encontrar utilizando programas de computadora bien conocidos en el ámbito, por ejemplo, el programa LASERGENEMR (DNASTAR, Inc., Madison, WI).

En otras modalidades, un fragmento o mutante tiene un "nivel aumentado de actividad". Mediante el término "nivel aumentado de actividad" se quiere indicar que un polipéptido tiene un nivel mayor de función bioquímica o biológica (por ejemplo, unión a ADN o actividad enzimática) en una célula modificada en comparación con su nivel de función bioquímica y/o biológica en una célula hospedadora natural correspondiente bajo las mismas condiciones. El grado de actividad mejorada puede ser de aproximadamente 10% o mayor, aproximadamente 20% o mayor, aproximadamente 50% o mayor, aproximadamente 75% o mayor, aproximadamente 100% o mayor, aproximadamente 200% o mayor, aproximadamente 500% o mayor, aproximadamente 1000% o mayor, o cualquier intervalo en los mismos.

En algunas modalidades, un polipéptido o polinucleótido que tiene un nivel de expresión alterado o modificado se "sobreexpresa" o tiene un "nivel aumentado de expresión". Como se utiliza en la presente, "sobreexpresión" e "incremento en el nivel de expresión" significa expresar o provocar que se exprese un polinucleótido o polipéptido en una célula modificada en una concentración mayor que la normalmente expresada en una célula natural correspondiente bajo las mismas condiciones. Por ejemplo, un polipéptido puede ser "sobreexpresado " en una célula modificada cuando el polipéptido está presente en una concentración mayor en una célula modificada en comparación con su concentración en una célula hospedadora no modificada de la misma especie bajo las mismas condiciones.

En otras modalidades, un polipéptido o polinucleótido que tiene un nivel de expresión alterado está "atenuado" o tiene un "nivel disminuido de expresión". Como se utiliza en la presente, "atenuado" y "disminución en el nivel de expresión" significa expresar o provocar que se exprese un polinucleótido o polipéptido en una célula modificada en una concentración menor que la que normalmente se expresa en una célula natural correspondiente bajo las mismas condiciones.

El grado de sobreexpresión o atenuación puede ser de 1.5 veces o mayor, por ejemplo 2 veces o mayor, 3 veces o mayor, 5 veces o mayor, 10 veces o mayor, 15 veces o mayor. De manera alternativa o adicional, el grado de sobreexpresión o atenuación puede ser de 500 veces o menor, por ejemplo 100 veces o menor, 50 veces o menor, 25 veces o menor, o 20 veces o menor. De esta manera, el grado de sobreexpresión o atenuación se puede unir por cualquiera de los dos puntos finales anteriores. Por ejemplo, el grado de sobreexpresión o atenuación puede ser de 1.5-500 veces, 2-50 veces, 10-25 veces ó 15-20 veces.

Un polinucleótido o polipéptido puede ser atenuado utilizando métodos conocidos en el ámbito. En algunas modalidades, la expresión de un gen o polipéptido codificado por el gen es atenuado por mutación de las secuencias polinucleotídicas reguladoras las cuales controlan la expresión del gen. En otras modalidades, la expresión de un gen o polipéptido codificado por el gen es atenuado por sobreexpresión de una proteína receptora o al proporcionar un elemento regulador exógeno que activa una proteína represora. En otras modalidades adicionales, se utilizan métodos de silenciado (bloqueo de expresión) de genes basados en ADN o ARN para atenuar la expresión de un gen o polinucleótido. En algunas modalidades, la expresión de un gen o polipéptido es atenuada por completo, por ejemplo, al suprimir la totalidad o una porción de la secuencia polinucleotídica de un gen.

Un polinucleótido o polipéptido puede ser sobreexpresado utilizando métodos conocidos en el ámbito.

En algunas modalidades, la sobreexpresión de un polipéptido se obtiene mediante el uso de un elemento regulador exógeno. El término "elemento regulador exógeno" generalmente se refiere a un elemento regulador que se origina fuera de la célula hospedadora. No obstante, en ciertas modalidades, el término "elemento regulador exógeno" puede referirse a un elemento regulador derivado de la célula hospedadora cuya función es replicada o usurpada para el propósito de controlar la expresión de un polipéptido endógeno. Por ejemplo, si el microorganismo recombinante es una célula de E. coli , la cual comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido biosintético de ácido graso y el polipéptido biosintético de ácido graso es FadR codificado por un gen fadR endógeno, entonces la expresión de fadR endógeno se puede controlar por un promotor derivado de otro gen de E . coli .

En algunas modalidades, el elemento regulador exógeno es un compuesto químico tal como una molécula pequeña. Como se utiliza en la presente, el término "molécula pequeña" se refiere a una sustancia o compuesto que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 1,000 g/mol.

En algunas modalidades, el elemento regulador exógeno el cual controla la expresión de una secuencia de ácido nucleico es una secuencia de control de expresión la cual está unida operablemente a la secuencia de ácido nucleico. Las secuencias de control de expresión se conocen en el ámbito e incluyen, por ejemplo, promotores, mejoradores, señales de poliadenilación, terminadores de transcripción, sitios de entrada de ribosoma internos (IRES), sitios de unión de ribosoma (RBS) y similares, que se proporcionan para la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una célula hospedadora. Las secuencias de control de expresión interactúan específicamente con proteínas celulares e involucradas en la transcripción (Maniatis et al . (1987) Science 236:1237-1245). Las secuencias de control de expresión ejemplares se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology. Vol.185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

Mediante el término "unido operablemente" se quiere indicar que una secuencia de ácido nucleico y una o varias secuencias de control de expresión están conectadas de manera tal que permiten la expresión de un gen cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras transcripcionales) se unen a una o varias de las secuencias de control de expresión. Los promotores unidos operablemente se localizan hacia el extremo 51 de la secuencia de ácido nucleico seleccionada en términos de la dirección de transcripción y traducción. Los mejoradores unidos operablemente pueden localizarse hacia el extremo 51, dentro o hacia el extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico seleccionada.

En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico se proporciona a la célula hospedadora por medio de un vector recombinante el cual comprende un promotor unido operablemente a la secuencia polinucleotídica. En algunas modalidades, el promotor es un promotor inducible, uno constitutivo o específico de organelo. En ciertas modalidades, la secuencia de control de expresión está unida operablemente a una secuencia endógena de ácido nucleico por integración de la secuencia de control de expresión en el genoma de una célula hospedadora por recombinación homologa utilizando métodos conocidos en el ámbito (por ejemplo Datsenko et al . (2000) Proc. Nati . Acad. Sci . U. S.A. 97(12): 6640-6645).

Como se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra secuencia de ácido nucleico a la cual se ha unido. Un tipo de vector útil es un episoma (es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica). Los vectores útiles son aquellos capaces de replicación y/o expresión autónoma de ácidos nucleicos a los cuales están unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están unidos operativamente se denominan en la presente como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en téenicas de ADN recombinante con frecuencia están en forma de "plásmidos" los cuales se refieren generalmente a bucles de ADN de cadena doble circulares que, en su forma de vector, no se unen al cromosoma. No obstante, también se incluyen otras formas de vectores de expresión que proporcionan funciones equivalentes y que se conocen en el ámbito subsecuentemente a la presente.

En algunas modalidades, el vector recombinante comprende por lo menos una secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia de control de expresión acoplada operativamente a la secuencia de ácido nucleico; (b) un marcador de selección acoplado operativamente a la secuencia de ácido nucleico; y (c) una secuencia dirigida acoplada operativamente a la secuencia de ácido nucleico.

Se apreciará por aquellos expertos en el ámbito que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión que aquí se describen se pueden introducir en células hospedadoras para producir polipéptidos, que incluyen polipéptidos de fusión, codificados por las secuencias polinucleotídicas como se describen en la presente.

Los sistemas de expresión adecuados para células procarióticas y eucarióticas son bien conocidos en el ámbito; véase, por ejemplo, Sambrook et al . , "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, Coid Spring Harbor Laboratory (1989). Los ejemplos de vectores de expresión para E. coli sin fusión inducibles incluyen pTrc (A ann et al. (1988) Gene 69:301-315) y PET lid (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, pp. 60-89 (1990)). En ciertas modalidades, una secuencia polinucleotídica de la descripción está unida operablemente a un promotor derivado de bacteriófago T5. Los ejemplos de vectores para expresión en levadura incluyen pYepSecl (Baldari et al . (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan et al. (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA), y picZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA).

Los vectores pueden ser introducidos en células procarióticas o eucarióticas por medio de téenicas de transformación o transfección convencionales. Como se utiliza en la presente, los términos "transformación" y "transfección" se refieren a una variedad de técnicas reconocidas en el ámbito para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora que incluye co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras así como métodos para seleccionar células las cuales han captado el vector se pueden encontrar, por ejemplo en Sambrook et al . (supra) .

Un "microorganismo recombinante" es una célula hospedadora utilizada para generar un producto descrito en la presente (por ejemplo, una amida grasa). Un microorganismo recombinante, también denominado en la presente como una "célula hospedadora recombinante", un "microorganismo modificado" o una "célula hospedadora modificada" es una célula hospedadora en donde la expresión de uno o más ácidos nucleicos o polipéptidos ha sido alterada o modificada en comparación con su expresión en una célula hospedadora natural correspondiente bajo las mismas condiciones. En cualquiera de los aspectos de la descripción que aquí se describen, la célula hospedadora puede incluir, pero no se limita a una célula de bacteria, una célula de cianobacteria, una célula de alga y una célula de hongo (por ejemplo, células de hongos filamentosos o una célula de levadura).

En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula bacteriana grampositiva. En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula bacteriana gramnegativ .

En algunas modalidades, la célula hospedadora se selecciona del género Escherichia, Bacillus, Lactobacillus , Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus , Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces , Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochae te, Pleurotus , Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces , Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces , Synechococcus , Yarrowia o Streptomyces .

En ciertas modalidades, la célula hospedadora es una célula de Saccharomyces cerevisiae , Candida lipolytica, Escherichia coli , Arthrobacter, Rhodotorula glutinins , Acinetobacter , Candida lipolytica, Botrycoccus braunii , Vibrio furnissii , Micrococcus leuteus, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus subtilis , Bacillus lichenoformis , Psuedomonus putida, Psuedomonas florescens, Streptomyces coelicolor , Prototheca moriformis , Prototheca kurgani , Prototheca stagnora, Prototheca zopfii o Chorella protothecoide .

En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula de Arthrobacter AK 19, Acinetobacter sp. cepa M-l, E- coli B, E- coli C, E- coli K o E- coli W.

En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de Bacillus lentus, una célula de Bacillus brevis, una célula de Bacillus stearothermophilus , una célula de Bacillus lichenformis, una célula de Bacillus alkalophilus , una célula de Bacillus coagulans , una célula de Bacillus circulans , una célula de Bacillus pumilis, una célula de Bacillus thuringi ensis, una célula de Bacillus clausii , una célula de Bacillus megaterium o una célula de Bacillus amyloliquefaciens.

En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de Trichoderma koningii, una célula de Trichoderma viride, una célula de Trichoderma reesei, una célula de Trichoderma longibrachiatum, una célula de Aspergillus awamori , una célula de Aspergillus fumigates , una célula de Aspergillus foetidus , una célula de Aspergillus nidulans, una célula de Aspergillus niger, una célula de Aspergillus oryzae, una célula de Humicola insolens, una célula de Humicola lanuginose , una célula de Rhodococcus opacus, una célula de Rhizomucor miehei , una célula de Mucor michei .

En otras modalidades adicionales, la célula hospedadora es una célula de Streptomyces lividans o una célula de Streptomyces murinus .

En otras modalidades adicionales, la célula hospedadora es una célula de Actinomycetes .

En otras modalidades, la célula hospedadora es una célula de una planta eucariótica, alga, cianobacteria, bacteria de azufre verde, bacteria no de azufre verde, bacteria de azufre púrpura, bacteria no de azufre púrpura, extremófilo, levadura, hongo, un organismo modificado del mismo o un organismo sintético. En algunas modalidades, la célula hospedadora es dependiente de la luz o fija carbono. En algunas modalidades, la célula hospedadora depende de la luz o fija carbono. En algunas modalidades, la célula hospedadora tiene actividad autotrófica. En algunas modalidades, la célula hospedadora tiene actividad fotoautotrófica tal como en la presencia de luz. En algunas modalidades, la célula hospedadora es heterotrófica o mixotrófica en ausencia de luz. En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula de Avabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Chlamydomonas reinhardtii , Dunaliela salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp . PCC 7942, Synechocystis Sp . PCC 6803, Thermosynechococcus elongates BP-1, Chlorobium tepidum, Chlorojlexus auranticus , Chromatiumm vinosum, Rhodospirllum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris , Clostridium ljungdahlii, Clostridiuthermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris , Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonasj luorescens o Zymomonas mobilis .

Como se utiliza en la presente, el término "condición permisiva para la producción" significa cualquier condición que permita que una célula hospedadora genere un producto deseado tal como una amida grasa. De manera similar, el término "condiciones adecuadas para expresión" significa cualquier condición que permita que una célula hospedadora sintetiza un polipéptido. Las condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentación. Las condiciones de fermentación pueden comprender muchos parámetros tales como intervalos de temperatura, niveles de aireación y composición del medio. Cada una de estas condiciones, individualmente o en combinación permite que la célula hospedadora crezca. Los medios de cultivo ejemplares incluyen cambios o geles. Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono que puede ser metabolizada por la célula hospedadora directamente. Además, se pueden utilizar enzimas en el medio para facilitar la movilización (por ejemplo, la despolimerización de almidón o celulosa a azúcares fermentables) y metabolismo subsecuente de la fuente de carbono.

Como se utiliza en la presente, la frase "fuente de carbono" se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para ser utilizado como una fuente de carbono para crecimiento de células procarióticas o eucarióticas simples. Las fuentes de carbono pueden estar en diversas formas que incluyen, pero que no se limitan a polímeros, carbohidratos, ácidos, alcoholes, aldehidos, cetonas, aminoácidos, péptidos y grasas (por ejemplo, CO y CO2). Las fuentes de carbono ejemplares incluyen, pero no se limitan a monosacáridos tales como glucosa, fructosa, mañosa, xilosa y arabinosa; oligosacáridos tales como fructo-oligosacáridos y galacto-oligosacáridos; polisacáridos tales como almidón, celulosa, pectina y xilano; disacáridos tales como sacarosa, maltosa y turanosa; material celulósico y variantes tales como meti'lcel^u^losa y carboximetilcelulosa de sodio; ésteres de ácido graso saturados o insaturados, succinato, lactato y acetato; alcoholes tales como etanol, metanol y glicerol o mezclas de los mismos. La fuente de carbono también puede ser un producto de fotosíntesis tal como glucosa. En algunas modalidades preferidas, la fuente de carbono es biomasa. En otras modalidades preferidas la fuente de carbono es glucosa.

El término "biomasa" se refiere a cualquier material biológico a partir del cual se deriva una fuente de carbono. En algunas modalidades, una biomasa es procesada en una fuente de carbono, la cual es adecuada para bioconversión. En otras modalidades, la biomasa no requiere procesamiento adicional en una fuente de carbono. La fuente de carbono se puede convertir en un biocombustible. Una fuente ejemplar de biomasa es un material vegetal o vegetación tal como maíz, caña de azúcar o pasto varilla. Otra fuente ejemplar de biomasa son productos de desperdicios metabólicos tales como materia animal (por ejemplo, estiércol de vaca). Las fuentes ejemplares adicionales de biomasa incluyen algas y otras plantas marinas. La biomasa también incluye productos de desperdicio de la industria, agricultura, silvicultura y doméstico, que incluye, pero que no se limita a desperdicios de fermentación, ensilaje, paja, troncos, aguas cloacales, desperdicios, desechos urbanos celulósicos, restos de alimentos y glicerol. El término biomasa" también se refiere a fuentes de carbono tales como carbohidratos (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos o polisacáridos).

Para determinar si las condiciones son suficientes para permitir la producción de un producto o la expresión de un polipéptido, una célula hospedadora se puede cultivar, por ejemplo, durante aproximadamente 4, 8, 12, 24, 36, 48, 72 o más horas. Durante y/o después del cultivo, las muestras se pueden obtener y analizar para determinar si las condiciones permiten la producción o expresión. Por ejemplo, las células hospedadoras en la muestra o el medio en el cual las células hospedadoras se hacen crecer se puede probar para determinar la presencia de un producto deseado. Cuando se prueba para determinar la presencia de una amida grasa, los análisis tales como, pero sin limitarse a EM, cromatografía en capa delgada (TLC, por sus siglas en inglés), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC ), cromatografía líquida (CL), CG acoplada con detector de ionización de flama (FID, por sus siglas en inglés), GC-MS y CL-EM se pueden utilizar. Cuando se realiza la prueba para la expresión de un polipéptido las téenicas tales como, pero sin limitarse a transferencia Western y transferencia de manchas (dot blotting) se pueden utilizar.

En los métodos de la invención, la producción y aislamiento de amidas grasas se puede mejorar al optimizar las condiciones de fermentación. En algunas modalidades, las condiciones de fermentación se optimizan para incrementar el porcentaje de la fuente de carbono que se convierte a productos de hidrocarburo. Durante los ciclos de vida celulares normales, el carbono se utiliza en las funciones celulares, por ejemplo, en la producción de lípidos, sacáridos, proteínas, ácidos orgánicos y ácidos nucleicos. La reducción de la cantidad de carbono necesario para las actividades relacionadas con el crecimiento puede aumentar la eficiencia de la conversión de fuente de carbono a producto. Esto se puede obtener, por ejemplo, mediante primero hacer crecer las células hospedadoras a una densidad deseada (por ejemplo, una densidad que se obtiene en el pico de la fase logarítmica del crecimiento). En este punto, los genes de punto de verificación de replicación pueden ser controlados para detener el crecimiento de las células. Específicamente, mecanismos de detección de quorum (revisados en Camilli et al . (2006) Science 311:1113; Venturi (2006) FEMS Microbiol . Rev. 30:274-291; y Reading et al., (2006) FEMS Microbiol . Lett . 254:1-11) se pueden utilizar para activar los genes de punto de verificación tales como p53 , p21, u otros genes de punto de verificación.

Los genes que pueden ser activados para detener la replicación y el crecimiento celulares en E. coli incluyen los genes umuDC. La sobreexpresión de los genes umuDC detiene el progreso desde la fase estacionaria a la fase exponencial (Muri et al . (2000) J. Bacteriol . 182:1127-1135). UmuC es una ADN polimerasa que puede llevar a cabo la síntesis translesión sobre lesiones no codificantes las cuales resultan comúnmente de mutagénesis ultravioleta (UV) y química. Los productos del gen umuDC están involucrados en el proceso de síntesis de translesión y también sirven como un punto de verificación de daño de secuencia de ADN. Los productos del gen umuDC incluyen UmuC, UmuD, umuD1, UmuD^C, UmuD'2 y UmuD'2. Simultáneamente, los genes que producen producto se pueden activar por lo que se minimiza la necesidad para replicación en vías de mantenimiento que van a ser utilizadas mientras la amida grasa o el intermediario de la misma se elabora. Las células hospedadoras también se pueden modificar para expresar umuC y umuD a partir de E. coli en pBAD24 bajo el sistema promotor prpBCDE a través de síntesis de novo de este gen con los genes de producción de producto final apropiados.

La célula hospedadora adicionalmente se puede modificar para expresar un celulosoma recombinante el cual puede permitir que la célula hospedadora utilice material celulósico como una fuente de carbono. Las celulosomas ejemplares adecuadas para uso en los métodos de la descripción incluyen, por ejemplo, las celulosomas descritas en la publicación de solicitud de patente internacional WO 2008/100251. La célula hospedadora también se puede modificar para asimilar el carbono eficientemente y utilizar materiales celulósicos como fuentes de carbono de acuerdo con los métodos descritos en las patentes U.S. Nos.5,000,000; 5,028,539; 5,424,202; 5,482,846; y 5,602,030. Además, la célula hospedadora puede ser modificada para expresar una invertasa de manera que se pueda utilizar sacarosa como una fuente.de carbono.

En algunas modalidades de los métodos de fabricación de la descripción, la cámara de fermentación encierra una fermentación que está experimentando una reducción continua para de esta manera crear un ambiente reductor estable. El equilibrio de electrones se puede mantener por liberación de dióxido de carbono (en forma gaseosa). Los esfuerzos por aumentar el equilibrio NAD/H y NADP/H también pueden facilitar la estabilización del equilibrio de electrones. La disponibilidad de NADPH intracelular también se puede mejorar mediante modificación de la célula hospedadora para que exprese una NADH:NADPH transhidrogenasa. La expresión de una o más de NADH:NADPH transhidrogenasas convierte el NADH producido en glucólisis a NADPH, lo cual puede incrementar la producción de amidas grasas e intermediarios de las mismas.

Para producción a pequeña escala, las células hospedadoras modificadas se pueden hacer crecer en lotes, por ejemplo, de aproximadamente 100 mi, 500 mi, 11, 2 1, 51 ó 10 1; fermentarse e introducirse para que expresen una secuencia deseada de ácido nucleico, tal como una secuencia de ácido nucleico que codifica para una PPS. Para producción a gran escala, las células hospedadoras modificadas se pueden hacer crecer en lotes de aproximadamente 101, 1001, 10001, 10,000 1, 100,000 1 o 1,000,000 1 o más grandes; se pueden fermentar; y se pueden inducir para expresar una secuencia deseada de ácido nucleico.

Las amidas grasas producidas por los métodos de la descripción generalmente se aíslan de la célula hospedadora. El término "aislado" como se utiliza en la presente con respecto a los productos, tales como amidas grasas se refiere a productos que están separados de los componentes celulares, del medio de cultivo celular o de los precursores químicos o sintéticos. Las amidas grasas producidas por los métodos que aquí se describen, pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentación así como en el citoplasma. Por lo tanto, las amidas grasas y derivados de las mismas pueden recolectarse en una fase orgánica ya sea por vía intracelular o extracelular. La recolección de los productos en la fase orgánica puede disminuir el impacto de la amida grasa sobre la función celular y puede permitir que la célula hospedadora elabore más producto.

En algunas modalidades, las amidas grasas producidas por los métodos de la descripción se purifican. Como se utiliza en la presente, el término "purificar", "purificado" o "purificación" significa la separación o aislamiento de una molécula de su ambiente, por ejemplo, por aislamiento o separación. Las moléculas "sustancialmente purificadas" están por lo menos aproximadamente 60% libres (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 70% libres, por lo menos aproximadamente 75% libres, por lo menos aproximadamente 85% libres, por lo menos aproximadamente 90% libres, por lo menos aproximadamente 95% libres, por lo menos aproximadamente 97% libres, por lo menos aproximadamente 99% libres) de otros componentes con los cuales están asociadas. Como se utiliza en la presente, estos términos también se refieren a la remoción de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la remoción de contaminantes puede resultar en un incremento en el porcentaje de una amida grasa en una muestra. Por ejemplo, cuando se produce una amida grasa en una célula hospedadora, la amida grasa se puede purificar por la remoción de proteínas de la célula hospedadora. Después de la purificación, el porcentaje de la amida grasa en la muestra se incrementa.

Como se utiliza en la presente, los términos "purificar", "purificado" y "purificación" son términos relativos los cuales no requieren pureza absoluta. Así, por ejemplo, cuando se produce una amida grasa en células hospedadoras, una amida grasa purificada es una amida grasa que ha sido separada sustancialmente de otros componentes celulares (por ejemplo, ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos, carbohidratos u otros hidrocarburos).

Adicionalmente, una preparación de amida grasa purificada es una preparación de amida grasa en la cual la amida grasa está sustancialmente libre de contaminantes tales como aquellos que pueden estar presentes después de la fermentación. En algunas modalidades, una amida grasa se purifica cuando por lo menos aproximadamente 50% en peso de una muestra está compuesta de la amida grasa. En otras modalidades, una amida grasa se purifica cuando por lo menos aproximadamente 60%, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 92% en peso de una muestra está constituido de la amida grasa. De manera alternativa o adicional, una amida grasa está purificada cuando menos de aproximadamente 100%, por ejemplo, menos de aproximadamente 99%, menos de aproximadamente 98%, menos de aproximadamente 95%, menos de aproximadamente 90% o menos de aproximadamente 80% en peso de una muestra está constituido de la amida grasa. Así, una amida grasa purificada puede tener un nivel de pureza limitado por cualesquiera dos de los puntos de extremo anteriores. Por ejemplo, una amida grasa puede estar purificada cuando por lo menos 80%-95%, por lo menos aproximadamente 85%-99% o por lo menos aproximadamente 90%-98% de una muestra está constituido de la amida grasa.

La amida grasa puede estar presente en el ambiente extracelular, o puede estar aislada del ambiente extracelular de la célula hospedadora. En algunas modalidades, la amida grasa se selecciona de la célula hospedadora. En otras modalidades, una amida grasa es transportada en el ambiente extracelular. En otras modalidades adicionales, la amida grasa es transportada de manera pasiva al ambiente extracelular. Una amida grasa se puede aislar de una célula hospedadora utilizando métodos conocidos en el ámbito tales como aquellos descritos en las publicaciones de solicitud de patente internacional WO 2010/042664 y WO 2010/062480.

Los métodos descritos en la presente pueden resultar en la producción de compuestos homogéneos en donde por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90% o por lo menos aproximadamente 95% de las amidas grasas producidas tendrán cadenas grasas que varían en menos de 6 carbonos, menos de 5 carbonos, menos de 4 carbonos, menos de 3 carbonos o menos de aproximadamente 2 carbonos. De manera alternativa o adicional, los métodos que aquí se describen pueden resultar en la producción de compuestos homogéneos en donde menos de aproximadamente 98%, menos de aproximadamente 95%, menos de aproximadamente 90%, menos de aproximadamente 80% o menos de aproximadamente 70% de las amidas grasas producidas tendrán cadenas grasas que varían en menos de 6 carbonos, menos de 5 carbonos, menos de 4 carbonos, menos de 3 carbonos o menos de aproximadamente 2 carbonos. De esta manera, las amidas grasas pueden tener un grado de homogeneidad limitado por cualquiera dos de los puntos de extremo anteriores. Por ejemplo, la amida grasa puede tener un grado de homogeneidad en donde aproximadamente 70%-95%, aproximadamente 80%-98% o aproximadamente 90%-95% de las amidas grasas producidas tendrán cadenas grasas que varían en menos de 6 carbonos, menos de 5 carbonos, menos de 4 carbonos, menos de 3 carbonos o menos de aproximadamente 2 carbonos. Estos compuestos también se pueden producir con un grado relativamente uniforme de saturación.

Como un resultado de los métodos de la invención, uno o más del título, el rendimiento o la productividad de la amida grasa producida por microorganismos recombinantes modificados para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que cataliza la conversión de una amina primaria en un tioéster de acilo a una amida grasa se incrementa en relación a la del microorganismo natural correspondiente.

El término "título" se refiere a la cantidad de amida grasa producida por unidad de volumen de cultivo de célula hospedadora. En cualquier aspecto de las composiciones y métodos que aquí se describen, una amida grasa es producida con un título de 25 mg/1 o mayor, 50 mg/1 o mayor, 75 mg/1 o mayor, 100 mg/1 o mayor, 125 mg/1 o mayor, 150 mg/1 o mayor, 175 mg/1 o mayor, 200 mg/1 o mayor, 250 mg/1 o mayor, 300 mg/1 o mayor, 350 mg/1 o mayor, 400 mg/1 o mayor, 450 mg/1 o mayor, 500 mg/1 o mayor, 600 mg/1 o mayor, 700 mg/1 o mayor, 800 mg/1 o mayor, 900 mg/1 o mayor o 1000 mg/1 o mayor. De manera alternativa o adicional, la amida grasa se produce en un título de 2000 mg/1 o menos 1900 mg/1 o menos, 1800 mg/1 o menos, 1700 mg/1 o menos, 1600 mg/1 o menos, 1500 mg/1 o menos, 1400 mg/1 o menos, 1300 mg/1 o menos, 1200 mg/1 o menos, 1100 mg/1 o menos, 1000 mg/1 o menos. 900 mg/1 o menos, 800 mg/1 o menos, 700 mg/1 o menos, 600 mg/1 o menos, 500 mg/1 o menos, 400 mg/1 o menos, 300 mg/1 o menos, 200 mg/1 o menos. De esta manera, la amida grasa se produce en un título limitado por cualquiera dos de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, la amida grasa se puede producir en un título de 150-1000 mg/1, 200-500 mg/ml, 500-1500 mg/ml, o 300-1300 mg/ml. En otras modalidades, la amida grasa se produce con un título de más de 2000 mg/ml, más de 5000 mg/ml, más de 10,000 mg/ml o mayor tal como 50 g/1, 70 g/1, 100 g/1, 120 g/1, 150 g/1 ó 200 g/1.

El término "rendimiento" se refiere a la eficiencia con la cual una fuente de carbono introducida se convierte a producto (es decir, a amida grasa) en una célula hospedadora. Para fuentes de carbono que contienen oxígeno (por ejemplo, glucosa y otras fuentes basadas en carbohidratos), el oxígeno debe ser liberado en forma de dióxido de carbono. Así, por cada dos átomos de oxígeno liberados, un átomo de carbono también es liberado lo que genera una eficiencia metabólica teórica máxima de aproximadamente 34% (p/p) (para productos derivados de ácido graso). Esta cantidad, no obstante, cambia para otros compuestos orgánicos y fuentes de carbono. El rendimiento típico reportado en la literatura es aproximadamente menor de 5%. Las células hospedadoras modificadas para producir amidas grasas de acuerdo con los métodos de la descripción pueden tener un rendimiento de aproximadamente 3% o mayor, aproximadamente 5% o mayor, aproximadamente 10% o mayor, aproximadamente 15% o mayor, aproximadamente 18% o mayor, o aproximadamente 20% o mayor. De manera alternativa o adicional, el rendimiento es de aproximadamente 30% o menos, aproximadamente 27% o menos, aproximadamente 25% o menos, aproximadamente 22% o menos, aproximadamente 20% o menos, aproximadamente 17% o menos, aproximadamente 13% o menos o aproximadamente 10% o menos. De esta manera, el rendimiento se puede limitar por cualesquiera de dos puntos finales anteriores. Por ejemplo, el rendimiento de la vida grasa producida por el microorganismo recombinante de la descripción puede ser aproximadamente 5% a aproximadamente 25%, aproximadamente 10% a aproximadamente 25%, aproximadamente 10% a aproximadamente 22%, aproximadamente 15% a aproximadamente 27% o aproximadamente 18% a aproximadamente 22%. En otras modalidades, el rendimiento es mayor de 30%.

El término "productividad" se refiere a la cantidad de amida grasa producida por unidad de volumen de cultivo de célula hospedadora por unidad de densidad de cultivo de célula hospedadora. En cualquier aspecto de las composiciones y métodos que aquí se describen, la productividad de una amida grasa producida por un microorganismo recombinante es aproximadamente 3 mg/l/D06oo o mayor, aproximadamente 6 mg/l/DC>6oo o mayor, aproximadamente 9 mg/l/DC>6oo o mayor, aproximadamente 12 mg/l/DC>6oo o mayor, aproximadamente 15 mg/l/DO6oo o mayor, aproximadamente 18 mg/l/D06oo o mayor, o aproximadamente 20 mg/l/DC>6oo o mayor. De manera alternativa o adicional, la productividad es de aproximadamente 50 mg/l/DC>6oo o menor, aproximadamente 40 mg/l/DC>6oo o menor, aproximadamente 30 mg/l/DC>6oo o menor, aproximadamente 25 mg/l/D06oo o menor, aproximadamente 20 mg/l/D06oo o menor, aproximadamente 17 mg/l/D06oo o menor o aproximadamente 10 mg/l/DC>6oo o menor. Así, la productividad se puede limitar por cualesquiera dos de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, la productividad puede ser de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/l/D06oo, aproximadamente 6 a aproximadamente 20 mg/l/D06oo o aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/l/DC>6oo. La descripción también proporciona una amida grasa producida por los microorganismos recombinantes y métodos descritos en la presente. Un bioproducto (por ejemplo, una amida grasa) producida por los microorganismos recombinantes y métodos de la descripción se pueden distinguir de compuestos orgánicos derivados de carbono petroquímico en base en la huella dactilar isotópica de carbono doble o la determinación de fechas por 14C adicionalmente, se puede determinar la fuente específica de carbono b100riginado (por ejemplo, glucosa versus glicerol) mediante la huella dactilar isotópica de carbono doble (véase, por ejemplo, U.S. patente 7,169,588).

La capacidad de distinguir bioproductos a partir de compuestos orgánicos basados en petróleo es benéfico para realizar un seguimiento de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, los compuestos orgánicos o las sustancias químicas que comprenden perfiles de isótopos de carbono tanto basados biológicamente como basados en petróleo se pueden diferenciar de compuestos orgánicos y sustancias químicas elaboradas únicamente de materiales basados en petróleo. De este modo, las amidas grasas preparadas de acuerdo con los métodos de la invención pueden ser seguidas en el comercio en base en su perfil único de isótopo de carbono.

Los bioproductos pueden ser diferenciados de compuestos orgánicos basados en petróleo al comparar la relación de isótopo de carbono estable (13C/12C) en cada combustible. La relación 13C/12C en un bioproducto dado es una consecuencia de la relación 13C/12C en el dióxido de carbono atmosférico en el momento en que se fija el dióxido de carbono. También refleja la vía metabólica precisa. También pueden producirse variaciones regionales. El petróleo, las plantas con C3 (de hoja amplia), las plantas de C4 (los pastos) y los carbonatos marinos todos muestran diferencias significativas en 13C/12C y los valores 513C correspondientes. Además, el material lipídico de plantas C3 y C4 se analizan de modo diferente que los materiales derivados de los componentes de carbohidrato de las mismas plantas como una consecuencia de la vía metabólica.

La escala de medición de 13C originalmente se define por un ajuste a cero por piedra caliza Pee Dee Belemnita (PDB), en donde los valores se proporcionan en partes por mil desviaciones de este material. Los valores "513C" se expresan en partes por mil (por mil) abreviado 0/00 y se calculan como sigue: 513C (0/00) = [(13C/12C)muestra-(13C/12C)estándar]/(13C/12C)estándar X 1000 En algunas modalidades, una amida grasa producida de acuerdo con los métodos de la descripción presenta una 513C de aproximadamente -30 o mayor, aproximadamente -28 o mayor, aproximadamente -27 o mayor, aproximadamente -20 o mayor, aproximadamente -18 o mayor, aproximadamente -15 o mayor, aproximadamente -13 o mayor o aproximadamente -10 o mayor. De manera alternativa o adicional, una amida grasa tiene una 513C de aproximadamente -4 o menos, aproximadamente -5 o menos, aproximadamente -8 o menos, aproximadamente -10 o menos, aproximadamente -13 o menos, aproximadamente -15 o menos, aproximadamente -18 o menos, o aproximadamente -20 o menos. Así, la amida grasa puede tener una 513C limitada por cualesquiera dos de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, la amida grasa puede tener una 513C de aproximadamente -30 a aproximadamente -15, de aproximadamente -27 a aproximadamente -19, de aproximadamente -25 a aproximadamente -21, de aproximadamente -15 a aproximadamente -5, de aproximadamente -13 a aproximadamente -7, o aproximadamente -13 a aproximadamente -10. En algunas modalidades, la amida grasa puede tener una 513C de aproximadamente -10, -11, -12 o -12.3. En otras modalidades, la amida grasa tiene una 513C de aproximadamente -15.4 o mayor. En otras modalidades adicionales, la amida grasa tiene una 613C de aproximadamente -15.4 a aproximadamente -10.9 o una ó13C de aproximadamente -13.92 a aproximadamente -13.84.

Los bioproductos también se pueden distinguir de compuestos orgánicos basados en petróleo al comparar la cantidad de 14C en cada compuesto. Debido a que 14C tiene una vida media nuclear de 5730 años, los combustibles basados en petróleo que contienen carbono "más antiguo" se pueden distinguir de los bioproductos los cuales contienen carbono "más nuevos" (véase, por ejemplo, Currie, "Source Apportionment of Atmospheric Particles", Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series, Lewis Publishers, Inc., pp.3-74 (1992)).

Se puede medir 14C por espectrometría de masas de acelerador (AMS, por sus siglas en inglés) con resultados proporcionados en unidades de "fracción de carbono moderno" (ÍM). El término ÍM se define por National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B y 4990C. Como se utiliza en la presente, la "fracción de carbono moderno" o ÍM tiene el mismo significado al definido por el National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B y 4990C, conocidos como estándares de ácido oxálico Hoxl y HOxII, respectivamente. La definición fundamental se relaciona con 0.95 veces la relación del isótopo 14C/12C Hoxl (como referencia para AD 1950). Este es un equivalente aproximado a la extensión corregida de madera antes de la revolución industrial. Para la biosfera viva actual (material vegetal), ÍM es de aproximadamente 1:1.

En algunas modalidades, una amida grasa producida de acuerdo con los métodos de la descripción tiene una fM14C de por lo menos aproximadamente 1, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 1.003, por lo menos aproximadamente 1.01, por lo menos aproximadamente 1.04, por lo menos aproximadamente 1.111, por lo menos 1.18 o por lo menos aproximadamente 1.124. De manera alternativa o adicional, la amida grasa tiene una fM14C de aproximadamente 1.130 o menos, por ejemplo, desde aproximadamente 1.124 o menos, aproximadamente 1.18 o menos, aproximadamente 1.111 o menos o aproximadamente 1.04 o menos. De esta manera, la vida grasa puede tener una fM14C limitada por cualesquiera dos de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, la amida grasa puede tener una fM14C de aproximadamente 1.003 a aproximadamente 1.124, una ÍM14C de aproximadamente 1.04 a aproximadamente 1.18 o una fM14C de aproximadamente 1.111 a aproximadamente 1.124.

Otra medición de 14C se conoce como el por ciento de carbono modem, es decir, Pmc. Para un arqueólogo o geólogo utilizando fechas 14C, AD 1950 es igual a "cero años de edad". Esto también representa 100 pMC. El "carbono de bomba" en la atmósfera alcanzó casi dos veces el nivel normal de 1963 en el pico de pruebas de armas termonucleares. Su distribución dentro de la atmósfera ha sido aproximada desde su aparición, mostrando valores que son mayores de 100 pMC para plantas y animales que viven desde AD 1950. Ha disminuido gradualmente con el tiempo hasta el valor actual que es cercano a 107.5 pMC. Esto significa que un material de biomasa fresco, tal como maíz, puede tener una firma 14C cercana a 107.5 pMC. Los compuestos basados en petróleo tendrán un valor pMC de cero. Combinar carbón fósil con carbón actual resultará en una dilución de contenido pMC del día actual. Suponiendo que 107.5 pMC representa el contenido de 14C de los materiales de biomasa del día actual y 0 pMC representa el contenido de 14C de productos basados en petróleo, el valor pMC medido para ése material reflejará las proporciones de los dos tipos de componentes. Por ejemplo, un material derivado 100% de frijoles de soya del día actual tendrá una firma de radiocarbono cercana a 107.5 pMC. Si ése material se diluye a 50% con productos basados en petróleo, la mezcla resultante tendrá una firma de radiocarbono de aproximadamente 54 pMC.

Un contenido de carbono basado biológicamente se deriva al asignar "100%" igual a 107.5 pMC y "0%" igual a 0 pMC. Por ejemplo, una muestra que mide 99 pMC proporcionará un contenido de carbono basado biológicamente equivalente de 93%. Este valor se denomina como el resultado de la media de carbono basado biológicamente y supone que la totalidad de los componentes dentro del material analizado se originaron ya sea de material biológico del día actual o material basado en petróleo.

En algunas modalidades, una amida grasa producida de acuerdo con los métodos de la descripción presenta un pMC de por lo menos aproximadamente 50, por lo menos aproximadamente 60, por lo menos aproximadamente 70, por lo menos aproximadamente 75, por lo menos aproximadamente 80, por lo menos aproximadamente 85, por lo menos aproximadamente 90, por lo menos aproximadamente 95, por lo menos aproximadamente 96, por lo menos aproximadamente 97 o por lo menos aproximadamente 98. De manera alternativa adicional, la amida grasa tiene un pMC de aproximadamente 108 o menos, aproximadamente 105 o menos, aproximadamente 102 o menos, aproximadamente 99 o menos, aproximadamente 96 o menos, aproximadamente 93 o menos, aproximadamente 90 o menos, aproximadamente 85 o menos o aproximadamente 80 o menos. De esta manera, la amida grasa puede tener un pMC limitado por cualquiera de los dos puntos finales anteriores. Por ejemplo, una amida grasa puede tener un pMC de aproximadamente 50 a aproximadamente 100; de aproximadamente 60 a aproximadamente 105; de aproximadamente 70 a aproximadamente 100; de aproximadamente 80 a aproximadamente 105; de aproximadamente 85 a aproximadamente 100; de aproximadamente 87 a aproximadamente 98; o de aproximadamente 90 a aproximadamente 95. En otras modalidades, una amida grasa descrita en la presente tiene un pMC de aproximadamente 90, aproximadamente 91, aproximadamente 92, aproximadamente 93, aproximadamente 94 o aproximadamente 94.2.

Una amida grasa producida por cualquiera de los microorganismos recombinantes y métodos que aquí se describen puede ser utilizada directamente como un tensioactivo o detergente por sí misma o la amida grasa se puede formular en una composición personal, para mascotas o para limpieza doméstica. El tensioactivo, detergente y las composiciones limpiadoras y métodos para la producción de la misma son bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito y se describen con mayor detalle, por ejemplo, en la publicación y solicitud de patente U.S. 2011/0206630, la cual se incorpora en su totalidad como referencia a la presente.

Así, la descripción proporciona tensioactivos, detergentes y composiciones limpiadoras que comprenden una amida grasa producida por cualquiera de los métodos que aquí se describen. Una persona habitualmente experta en el ámbito apreciará que, dependiendo del propósito destinado del tensioactivo, detergente o composición limpiadora, se pueden producir y utilizar diferentes amidas grasas. Por ejemplo, cuando las amidas grasas descritas en la presente se utilizan como materia prima para la producción de tensioactivos o detergentes, una persona habitualmente experta en el ámbito apreciará que las características de la materia prima de amida grasa alterarán las características de la composición de tensioactivo o de detergente que se produzca. De lo anterior, las características de la composición de tensioactivo o de detergente se pueden seleccionar al producir amidas grasas particulares para uso como una materia prima.

Un tensioactivo o detergente basado en amida grasa de la descripción se puede mezclar con otros tensioactivos y/o detergentes bien conocidos en el ámbito. La amida grasa puede estar presente en la mezcla de una cantidad de 10% en peso (% en peso) o mayor, 15% en peso o mayor, 20% en peso o mayor, 30% en peso o mayor, 40% en peso o mayor, 50% en peso o mayor, 60% o mayor o 70% o mayor, en base en el peso total de la mezcla. De manera alternativa o adicional, la amida grasa puede estar presente en la mezcla en una cantidad de 95% o menos, 90% en peso o menos, 80% en peso o menos, 70% en peso o menos, 60% o menos, 50% en peso o menos o 40% en peso o menos en base en el peso total de la mezcla. De esta manera, la amida grasa puede estar presente en la mezcla en una cantidad limitada por cualesquiera dos de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, la amida grasa puede estar presente en la mezcla en una cantidad de 15-40%, 30-90%, 50-95% ó 40-50%.

Un tensioactivo basado en amida grasa se puede formular en una composición limpiadora para impartir detergencia y poder limpiador a la composición limpiadora. La amida grasa puede estar presente en la composición limpiadora en una cantidad de 0.001% en peso o mayor, 0.1% en peso o mayor, 1% en peso o mayor, 10% en peso o mayor, 20% en peso o mayor o 40% en peso o mayor, en base en el peso total de la composición limpiadora. De manera alternativa o adicional, la amida grasa puede estar presente en la composición limpiadora en una cantidad de 60% en peso o menos, 50% en peso o menos, 40% en peso o menos, 30% en peso o menos, 15% en peso o menos, o 5% en peso o menos, en base en el peso total de la composición limpiadora. De esta manera, la amida grasa puede estar presente en la composición limpiadora en una cantidad limitada por cualquiera dos de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, la amida grasa se puede formular en una composición limpiadora en una cantidad de 0.1-10% en peso, 10-15% en peso, 20-40% en peso o 0.001-5% en peso.

Una composición limpiadora de la descripción puede estar en forma sólida, tal como una tableta, gránulo, polvo o material compacto. La composición limpiadora también puede estar en forma líquida, tal como un fluido, gel, pasta, emulsión o concentrado.

En ciertas modalidades, la composición limpiadora de la descripción es una composición de detergente para lavandería líquido o sólido. En algunas modalidades, la composición limpiadora es una composición limpiadora de superficies duras, en donde la composición limpiadora de superficies duras preferiblemente impregna un sustrato no tejido. Como se utiliza en la presente, el término "impregna" significa que la composición limpiadora de superficie dura se coloca en contacto con un sustrato no tejido de manera tal que por lo menos una porción del sustrato no tejido es penetrado por la composición limpiadora de superficie dura. Por ejemplo, la composición limpiadora de superficie dura preferiblemente satura el sustrato no tejido. En otras modalidades, la composición limpiadora de la descripción es una composición para el cuidado de vehículos, la cual es útil para la limpieza de diversas superficies tales como madera dura, azulejo, cerámica, plástico, cuero, metal y/o vidrio. En algunas modalidades, la composición limpiadora es una composición para lavavajillas tal como, por ejemplo, una composición para lavado de vajillas a mano líquida, una composición para lavado de vajillas automática o sólida, una composición para lavado de vajillas automático líquido y una barra/forma de dosificación unitaria de una composición de lavavajillas automática.

En otras modalidades, la composición limpiadora se puede utilizar en ambientes industriales para la limpieza de diversos equipos y maquinaria y para uso en operaciones de perforación de petróleo. Por ejemplo, la composición limpiadora de la descripción puede ser particularmente adecuada en ambientes en donde se pone en contacto con dureza libre y en composiciones que requieren sistemas tensioactivos tolerantes a dureza por ejemplo cuando se utilizan como auxiliar en la perforación para petróleo.

En algunas modalidades, una amida grasa producida por cualquiera de los microorganismos recombinantes y métodos de la descripción se formula en composiciones para el cuidado personal o de mascotas tal como un champú, lavado corporal, lavado facial o jabón liquido o sólido.

Una composición limpiadora que contiene una amida grasa producida por cualquiera de los microorganismos recombinantes y métodos de la descripción puede comprender otros adyuvantes limpiadores los cuales son bien conocidos por aquellos expertos en el ámbito. Los adyuvantes limpiadores comunes aplicables a la mayor parte de las composiciones limpiadoras, incluyendo composiciones limpiadoras domésticas, composiciones para el cuidado personal y similares, incluyen disolventes, agentes solubilizantes, portadores, diluyentes, enzimas, polímeros, refuerzos de espumas, supresores de espuma (antiespumantes), colorantes, materiales de relleno, herbicidas, hidrotropos, antioxidantes, perfumes, pro-perfumes, agentes estabilizantes de enzimas, pigmentos y similares. En algunas modalidades, la composición limpiadora es una composición limpiadora líquida, en donde la composición comprende uno o más que se seleccionan de disolventes, agentes quelantes, dispersantes y agua. En otras modalidades, la composición limpiadora es un sólido, en donde la composición comprende además, por ejemplo, una sal de material de relleno inorgánico. Las sales de material de relleno inorgánicas son ingredientes convencionales de composiciones limpiadoras sólidas, presentes en cantidades sustanciales que varían, por ejemplo, desde aproximadamente 10% en peso a aproximadamente 35% en peso. Las sales del material de relleno adecuadas incluyen, por ejemplo, sales de metal alcalino o alcalinotérreo de sulfatos y cloruros. Una sal de material de relleno ejemplar es sulfato de sodio.

Las composiciones limpiadoras domésticas (por ejemplo, detergentes de lavandería y limpiadores de superficies domésticas) pueden comprender uno o más ingredientes adicionales que se seleccionan de blanqueadores, activadores de blanqueador, materiales catalíticos, polímeros dispersantes, cuidado de plata y contra el empañamiento y/o agentes contra la corrosión, fuentes de alcalinidad, auxiliares de procesamiento, agentes inhibidores de transferencia de colorante, abrillantadores, agentes elastificantes de estructura, suavizantes de telas, agentes contra la abrasión y otros agentes para el cuidado de telas. Los adyuvantes limpiadores particularmente útiles para composiciones limpiadoras domésticas y las concentraciones de uso se han descrito, por ejemplo, en las patentes U.S. 5,576,282, 6,306,812 y 6,326,348. Una lista de adyuvantes limpiadores de ropa de lavandería adecuados u otros adyuvantes limpiadores domésticos se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente internacional WO 99/05245.

Las composiciones para el cuidado personal, el cuidado de mascotas o composiciones cosméticas (por ejemplo, champús, limpiadores faciales, sanitizantes de las manos, rubores, bronceadores y similares) pueden comprender uno o más ingredientes adicionales que se seleccionan de agentes acondicionadores (por ejemplo, vitaminas, silicona, componentes estabilizantes de emulsión de silicona), celulosa catiónica o polímeros (polímeros de guar), agentes contra la caspa, agentes antibacterianos, agentes formadores de gel, agentes de suspensión, modificadores de viscosidad, colorantes, disolventes o diluyentes no volátiles (solubles o insolubles en agua), refuerzos de espuma, pediculicidas, agentes para ajustar el pH, perfumes, conservadores, quelantes, proteínas, agentes activos cutáneos, filtros solares, sustancias absorbentes de radiación UV, minerales, extractos herbales/de frutos/alimentos, derivados de esfingolípidos y arcilla.

La descripción también proporciona un aditivo de combustible que comprende una amida grasa producida por cualquiera de los microorganismos recombinantes y métodos que aquí se describen. En ciertas modalidades, el aditivo de combustible se selecciona de un aditivo de desempeño de motor, detergente, dispersante, un agente contra el desgaste, un modificador de índice de viscosidad, modificador de fricción, antioxidante, inhibidor de herrumbre, agente antiespumante, fijador de sello, aditivo lubricante, depresor del punto de vertido, reductor del punto de turbidez, supresor de humo, aditivo reductor de arrastre, desactivador de metal, biocida y desmulsificante. Los aditivos de combustible se describen con mayor detalle en la publicación de solicitud de patente U.S. 2010/0257777, la cual se incorpora en la presente como referencia.

En ciertas modalidades, el aditivo de combustible que comprende una amida grasa producida por cualquiera de los microorganismos recombinantes y métodos se combina en un empaque que comprende la amida grasa y uno o más aceites de base utilizados como un disolvente para la amida grasa. En base en el grado y/o tipo, el aceite de base puede proporcionar un grado variable de beneficio de desempeño a un empaque aditivo que incluye, por ejemplo, beneficios de temperatura extrema, beneficios antioxidantes o un punto de vertido adecuado.

La descripción también proporciona una composición farmacéutica que comprende una amida grasa producida por cualquiera de los microorganismos recombinantes y métodos descritos en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede contener componentes adicionales tales como, por ejemplo, diluyentes, adyuvantes, excipientes, conservadores, agentes para ajustar el pH y similares así como agentes terapéuticos adicionales tales como, por ejemplo, agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de una indicación particular (por ejemplo dolor o inflamación).

La composición farmacéutica puede ser una composición sólida (por ejemplo, tableta, cápsula, tableta sublingual, polvo, saquito). La composición farmacéutica también puede ser una composición líquida (por ejemplo, un líquido acuoso, gel, loción, crema). La composición farmacéutica se puede formular para administración por cualquier vía adecuada tal como, por ejemplo, una vía de administración que se selecciona del grupo que consiste de oral, tópica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, epidural, percutánea, subcutánea, transmucosal y vía intranasal.

La descripción también proporciona un método para evitar o tratar una enfermedad o condición en un sujeto en necesidad del mismo que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una amida grasa producida por cualquiera de los microorganismos recombinantes y métodos que aquí se describen, con lo que se evita o se trata la enfermedad o condición en el sujeto.

Mediante los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se quiere indicar una cantidad que alivia (en cierta medida, a juicio del médico experto practicante) uno o más síntomas de la enfermedad o condición en un sujeto humano o animal. Adicionalmente, mediante los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se quiere indicar una cantidad que regresa a la normalidad, ya sea de modo parcial o completo, los parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados con o causantes de una enfermedad o condición. Un médico experto en el ámbito puede determinar la cantidad terapéuticamente eficaz de una composición con el fin de tratar o evitar una condición de enfermedad particular, o trastorno cuando se administra. La cantidad precisa de la composición requerida para que sea terapéuticamente eficaz dependerá de numerosos factores, por ejemplo, tales como la actividad específica de la sustancia activa, el dispositivo de suministro utilizado, las características físicas de la sustancia, el propósito para la administración, además de muchas consideraciones específicas para el paciente. La determinación de cantidad de una composición que debe ser administrada para que sea una cantidad eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz es sistemático en el ámbito y está dentro de las habilidades habitualmente de un profesional de la salud experto.

En algunas modalidades, una cantidad eficaz puede ser de 1 ng o mayor, por ejemplo, 10 ng o más, 100 ng o más, 1 mg o más, 10 pg o más, 100 pg o más, 1 mg o más, 10 mg o más, 50 mg o más, o 100 mg o más, de una amida grasa de la descripción por unidad de dosificación. De manera alternativa 0 adicional, una cantidad eficaz puede ser de 5 g o menos, 1 g o menos, 500 mg o menos, 250 mg o menos, 100 mg o menos, 75 mg o menos, 25 mg o menos, 10 mg o menos, 1 mg o menos de una amida grasa de la descripción por dosificación unitaria. De esta manera, la amida grasa puede estar presente en una unidad de dosificación en una cantidad limitada por cualquiera de los puntos finales anteriores. Por ejemplo, la amida grasa puede estar presente en una unidad de dosificación, en una cantidad de 100 ng-10 mg, 50 mg-250 mg, 1 pg-1 mg ó 100 mg/500 mg. Una unidad de dosificación que comprende una cantidad eficaz de una amida grasa de la descripción se puede administrar en una dosis diaria única, o la dosificación diaria total se puede administrar en dosis divididas de dos, tres, cuatro veces o más diariamente, según se necesite.

La enfermedad o condición puede ser cualquier enfermedad o condición que tenga uno o más síntomas y/o parámetros fisiológicos o bioquímicos que responden al tratamiento con una amida ácida de la invención. En algunas modalidades, la enfermedad es una enfermedad inflamatoria y la amida grasa de la descripción se administra en una cantidad suficiente para reducir la inflamación. En ciertas modalidades, el trastorno inflamatorio es una enfermedad autoinmune, artritis reumatoide, esclerosis múltiple o enfermedad de Crohn.

En ciertas modalidades, la condición es dolor y la amida grasa de la descripción se administran en una cantidad suficiente para proporcionar analgesia.

En otras modalidades, la condición es hipertensión y la amida grasa de la descripción se administra en una cantidad suficiente para provocar la reducción de presión sanguínea.

La anandamida es un agonista endógeno del receptor de canabinoide (CB) 1 y, en menor grado, del receptor CB2 y el receptor vaniloide 1 (Tan et al., supra). La administración de anandamida a un sujeto humano y animal se ha demostrado que tiene una gran cantidad de efectos fisiológicos, que incluyen regular la ingestión de alimento y el peso corporal, disminuir la presión sanguínea, disminuir la frecuencia cardíaca, proteger contra daño por reperfusión del miocardio, reducir dolor agudo inducido por estímulos químicos, mecánicos o térmicos, reducir el dolor crónico de origen neuropático o inflamatorio, reducir la inflamación, proporcionar neuroprotección en daño neuronal agudo (por ejemplo, daño traumático al cerebro, apoplejía y epilepsia) y en trastornos neurodegenerativos crónicos (por ejemplo, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad de Alzheimer), promover la broncodilatación, reducir la presión infraocular (por ejemplo, en pacientes con glaucoma) y promover la apoptósis de células tumorales (véase, por ejemplo Pacher et al . (2006) Pharmacol . Rev. 58 (3):389-462).

En algunas modalidades, la amida grasa es una anandamida producida por los microorganismos recombinantes y métodos que aquí se describen y la enfermedad o condición es una de las enfermedades o condiciones mencionadas antes capaces de ser tratadas o evitadas por la administración de una cantidad eficaz de anandamida.

PEA y OEA son agonistas endógenos de receptor a activado por proliferador de peroxisoma (PPAR-a) (Fu et al. (2003) Nature 425 (6953): 90-93; y Lo Verme et al., supra) .

La administración de PEA u OEA a humanos y sujetos animales se ha demostrado que induce muchas de las mismas respuestas generadas por anandamida, que incluyen ingestión de alimentos y peso corporal, reduce del dolor e inflamación, proporciona neuroprotección y reducción de presión infraocular (véase, por ejemplo Fu et al., supra, Tan et al., supra, Lo Verne et al., supra y las patentes U.S. números 6,348,498 y 6,656,972).

En algunas modalidades la amida grasa es PEA producida por los microorganismos recombinantes y métodos que aquí se describen y la enfermedad o condición es una de las enfermedades o condiciones mencionadas en lo anterior capaz de ser tratada o evitada por la administración de una cantidad eficaz de PEA. En otras modalidades, la amida grasa es OEA producida por microorganismos recombinantes y métodos que aquí se describen, y la enfermedad o condición es una de las enfermedades o condiciones mencionadas en lo anterior capaz de ser tratada o evitada por la administración de una cantidad eficaz de OEA.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos específicos están destinados para ilustrar la descripción y no deben considerarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones.

EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra la construcción de un microorganismo modificado genéticamente en el cual la expresión de una acil-CoA deshidrogenasa, un receptor de proteína de membrana externa, una piruvato formiato liasa, una lactato deshidrogenasa y un represor transcripcional han sido atenuados.

E. col i MG1655 DV4 es una cepa de E. col i K modificada genéticamente que comprende las supresiones de los genes fadE (una acil-CoA deshidrogenasa), fhuA (un receptor de proteína de membrana externo), pflB (una piruvato formiato liasa) y ldhA (una lactato deshidrogenasa) (véanse las publicaciones de solicitudes de patentes U.S.2011/0072714 y 2011/0162259, las cuales se incorporan como referencia en la presente). El gen fa bR de E . coli MG1655 (GenBank, No. de acceso AAC76945), el cual codifica para un represor transcripcional se suprimió de E. coli MG1655 DV4 utilizando el sistema Lambda Red de acuerdo con Datsenko et al. (2000) Proc . natl . Acad. Sci . USA 97: 6640-6645, con las siguientes modificaciones descritas en la presente.

Los dos cebadores utilizados para crear la cepa de supresión son: EabR_del_F:5'- ATGTTTTATTGCGTTACCGTTCATTCACAATACTGGAGCAATCCAGTATGATTCCGGGGAT CCGTCGACC-3' (sec id no: 4); y fabR_del_R:5'- CGTACCTCTATCTTGATTTGCTTGTTTCATTACTCGTCCTTCACATTTCCTGTAGGCTGGA GCTGCTTCG-3' (SEC ID NO:5).

Los cebadores fabR_del_F y fabR_del_R se utilizaron para amplificar el casete de resistencia a canamicina (KmR) del plásmido pKD13 por PCR, como se describe por Datsenko et al., supra . El producto de PCR resultante después se utiliza para transformar células E. coli MG1655 DV4 electrocompetentes que contienen el plásmido pKD46, células las cuales previamente han sido inducidas con arabinosa durante 3-4 horas, como se describe por Datsenko et al . , supra . Después de un crecimiento excesivo durante 3 horas en medio SOC a 37°C, las células se siembran en placa sobre placas de agar Luria que contienen 50 m9/tt\1 de canamicina. Las colonias que son resistentes a canamicina se identificaron y aislaron después de incubación durante la noche a 37°C. La ruptura del gen fabR se confirma utilizando cebadores que flanquean al gen fabR de E. col i .

La confirmación de la supresión de fabR se realiza utilizando los siguientes cebadores: fabR_3: 5'-GCGACGCGCGCACCTTGCTTAACCAGGCCC-3' (SEC ID NO: 6) fabR_4 :5'-CGCATCTTCGCGCCAATCCAGAACACC-3' (SEC ID NO: 7).

Después de que se confirmaron las supresiones, se utiliza una sola colonia para remover el marcador KmR de acuerdo con el método descrito por Datsenko et al., supra . La cepa de E. coli MG1655 resultante que tiene las supresiones de los genes fadE, fhuA, pflB, ldhA y fabR se denomina E. coli MG1655 AfadE_AfhuA_ApflB_Aldha_AfabR o E. coli MG1655 DG5.

Este ejemplo muestra la construcción de E. coli MG1655 DG5, el cual es un microorganismo modificado genéticamente en el cual la expresión de una acil-CoA deshidrogenasa, un receptor de proteína de membrana externa, una piruvato formiato liasa, una lactato deshidrogenasa y un represor transcripcional han sido atenuados.

EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra la construcción de un microorganismo modificado genéticamente en el cual las secuencias de nucleótidos que codifican para una tioesterasa ('tesA) y una acil-CoA sintasa (fadD) se integran en el cromosoma del microorganismo bajo el control de un promotor inducible.

La secuencia ' tesA es una secuencia nucleotídica que comprende un gen para tesA de E. coli sin líder (Gen Bank, entrada AAC73596, acceso U00096.2). La secuencia ' tesA codifica para tioesterasa de E. coli (EC 3.1.1.5, 3.1.2.-) en la cual los primeros veinticinco aminoácidos se han suprimido y el aminoácido en la posición 26, alanina, ha sido sustituido con metionina. Esa metionina después se vuelve el primer aminoácido de 'tesA (Cho et al. (1995) J. Biol . Chem. 270: 4216-4219) E. coli fadD (Gen Bank entrada AAC74875; acceso U00096.2) codifica para una acil-CoA sintasa.

Construcción de un plásmido pACYC-Ptre que contiene tesA o ' tesA- fadD El gen ' tesA se obtiene del plásmido pETDuet-1- ' tesA, el cual ha sido ha sido construido por clonación del gen ' tesA en un plásmido pETDuet-1 digerido con Ndel/Avrll (Novagen, Madison, WI) como se ha descrito previamente (véase la publicación de solicitud de patente U.S.2010/0242345 y la publicación de solicitud de patente internacional WO 2007/136762, las cuales se incorporan en su totalidad como referencia en la presente). El gen fadD se obtiene del plásmido pHZ1.61 (SEC ID NO: 8), el cual se construye por clonación del gen fadD en un plásmido pCDFDuet-1 (Novagen, Madison, WI) como se ha descrito previamente (véase también la publicación de solicitud de patente U.S.2010/0257777, la cual se incorpora en su totalidad como referencia en la presente). Los genes ' tesA y fadD se amplifican a partir de pETDuet-1-' tesA y pHZ1.61, respectivamente, utilizando polimerasa de alta fidelidad PHUSIONMR (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA) y los siguientes cebadores: ’ tesAdirecta-5’ - CTCTAGAAATAATTTAACTTTAAGTAGGAGAUAGGTACCCATGGCGGACACGTTATTGAT-3' (SEC ID NO: 9) 't esAinversa-5'- CTTCGAATTCCATTTAAATTATTTCTAGAGTCATTATGAGTCATGATTTACTAAAGGC-3' (SEC ID NO: 10) fadDdirecto-5'- CTCTAGAAATAATTTTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACCATGGTGAAGAAGGTTTGGC TTAA-3' (SEC ID NO: 11) fadDinverso-5'- CTTCGAATTCCATTTAAATTATTTCTAGAGTTATCAGGCTTTATTGTCCAC-3' (SEC ID NO: 12).

Para construir el plásmido pACYC-' tesA, el producto de PCR de ' tesA y el vector pACYC-Ptrc (SEC ID NO: 13) se digieren con Ncol y EcoRI . Después de ligación durante la noche con ADN ligasa T4 (New England Biolabs, Ipswich, MA), el producto de ADN se transforma en células TOP10MR ONE SHOTMR (Invitrogen, Carlsbad, CA). La inserción de ' tesA en el vector pACYC-Ptrc se confirma por digestión de restricción. Un sitio de restricción SwaI y fragmentos de superposición para clonación IN-FUSIONMR (Clontech, Mountain View, CA) también se generaron en el extremo 3' del inserto ' tesA.

Para construir el plásmido pACYC-Ptrc-' tesA-fadD, el plásmido pACYC-Ptrc- 'tesA se somete a digestión de restricción durante la noche por SwaI. El producto de PCR fadD se amplifica a partir de pHZ1.61 y se clona hacia el extremo 3' a partir del gen ' tesA utilizando el sistema de clonación IN-FUSIONMR (Clontech, Mountain View, CA). La inserción de fadD se verifica con digestión de restricción. La inserción de fadD destruye el sitio SwaI después del gen ' tesA, pero genera un sitio SwaI nuevo en el extremo 3' de fadD.

Construcción de los plásmidos Tn7tes y Tn7tesfad Los plásmidos pACYC-Ptrc-' tesA y pACYC-Ptrc-' tesA- fadD se utilizan como plantillas para generar los casetes Ptrc-'tesA y Ptrc-' tesA-fadD, respectivamente. Se utilizaron los siguientes cebadores para obtener los casetes: IFF : 5'-GGGTCAATAGCGGCCGCCAATTCGCGCGCGAAGGCG-3' (SEC ID NO: 14) IFR : 5'-TGGCGCGCCTCCTAGGGCATTACGCTGACTTGACGGG-3' (SEC ID NO: 15).

El plásmido pGRG25 (GenBank, acceso No. DQ460223) se purifica y se somete a digestión de restricción por Nofcl y Avrll (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA). El casete Ptrc-'tesA se clona en los sitios de restricción Noti y Avrll de pGRG25 utilizando el sistema de clonación IN-FUSION1® (Clontech, Mountain View, CA) lo que genera el plásmido Tn7tes (SEC ID NO: 16), en donde los genes Iaclq y Ptrc-'tesA están flanqueados por los extremos Tn7 izquierdo y derecho. El casete Ptrc-' tesA-fadD se clona en los sitios de restricción Not 1 y Avrll de pGRG25 de manera similar, por lo que se genera el plásmido Tn7tesfad (SEC ID NO: 17) en donde los genes Iacl y Ptrc- 'tesA-fadD por los extremos Tn7 izquierdo y derecho.

Generación de E. coli MG1655 DG5 Tn7-'fcesA y E. coli MG1655 DG5 Tn7-'t es A- fadD Los plásmidos Tn7tes y Tn7tesfad se someten a electroporación, cada uno por separado en la cepa E. coli MG1655 DG5 (descrita en el ejemplo 1) utilizando un protocolo descrito por McKenzie et al., BMC Microbiology, 6: 39 (2006). Después de electroporación, las células resistentes a ampicilina se seleccionan por crecimiento en un medio LB que contiene glucosa 0.1% y 100 m9/hi1 de carbenicilina a 32°C durante la noche, seguido por selección para células que comprenden las fracciones de transposición Tn7 por crecimiento sobre placas LB que contienen arabinosa 0.1% durante la noche a 32°C. Las colonias solas se siembran en estrías sobre placas con medio LB, con o sin ampicilina y se hacen crecer durante la noche a 42°C para el curado de plásmidos Tn7tes o Tn7tesfad. De esta manera, los genes lacl y Ptrc- ' tesA o lacl y Ptrc-’ tesA-fadD se integraron el sitio attTn7 en el cromosoma de E. coli MG1655 localizado entre los genes pstS y glmS. La integración de estos genes se confirmó por PCR y determinación de secuencia utilizando los siguientes cebadores: attTn7.A: 5'-GATGCTGGTGGCGAAGCTGT-3' (SEC ID NO: 18) attTn7.C: 5'-GTTGCGACGGTGGTACGCATAAC-3' (SEC ID NO: 19)· Las cepas resultantes se les proporcionaron los nombres E. coli MG1655 DG5 Tn7-’tesA y E. col i MG1655 DG5 Tn7-’t esA-fadD, en consecuencia.

Los resultados de este ejemplo ilustran la generación de microorganismos modificados genéticamente en los cuales las secuencias nucleotídicas que codifican para una tioesterasa (es decir, E. coli MG1655 DG5 Tn7'-'tesA), o una tioesterasa y una acil-CoA sintasa (es decir, E. coli MG1655 DG5 Tn7-’ tesA-fadD) se integraron en el cromosoma de las células hospedadoras bajo el control de un promotor inducible .

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra un método para producir N-palmitoiletanolamida por expresión de un gen que codifica para una palmitoilputrescina sintasa en un microorganismo modificado genéticamente.

Un gen que codifica para una palmitoilputrescina sintasa (PPS) bacteriana, identificada como GenBank acceso No. AY632377 (Brady, S. F., et al. (2004) J. Nat . Prod. , 67: 1283-1286) (SEC ID NO; 2), se sintetiza por DNA2.0 (Menlo Park, CA). El plásmido DNA2.0, denominado pJ201:30127, se diseña para contener un sitio Ncol que flanquea el codón de inicio y un sitio Pmel que flanquea el codón de detención. El gen que codifica para PPS en pJ201:30127 no es optimizado en codones. El gen que codifica para PPS se subclona en el vector de expresión OP80, el cual ha sido descrito previamente (véase publicación de solicitud de patente U.S. No. 2010/0154293, la cual se incorpora en su totalidad como referencia en la presente). El vector OP80 se basa en pCL1920 , el cual es un plásmido de pocas copias que expresa genes unidos operablemente bajo el control del promotor t re inducible por IPTG. La construcción del vector OP80 que expresa en gen PPS, los plásmidos OP80 y pJ201:30127 se purificaron y sometieron a digestiones de restricción con Ncol/Pmel (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA). El gen que codifica para PPS se liga con ligasa de ADN T4 en el plásmido OP80 digerido con Ncol/Pmel . La reacción de ligación se transforma en células E. coli TOP10MR y las células se siembran en placas sobre agar LB que contiene espectinomicin . Se seleccionan diez colonias y se prueban para el inserto que codifica para PPS mediante el cultivo de las colonias, aislamiento del ADN plasmídico y digestión del ADN plasmídico con Ncol/Pmel . Una colonia es positiva para el plásmido que contiene el inserto que codifica para PPS por digestión de restricción. Se confirma que el plásmido contiene el gen que codifica para PPS por análisis de secuencia y se denomina "OP80-PPS". El plásmido OP80-PPS después se transforma en E. coli MG1655 cepa de DG5 (descrita en el ejemplo 1), DG5 Tn7- 'tesA (descrita en el ejemplo 2) y DG5 Tn7-'t esA-fadD (descrita en el ejemplo 2). Como un control, el vector OP80 vacío se transforma en E. coli MG1655 cepas DG5, DG5 Tn7-’tesA y DG5 Tn7-'t esA-fadD. La totalidad de las seis cepas se cultivan en caldo LB sin glucosa adicional. Cuando cada cultivo alcanza una ?qeoo de 1.2, se agrega IPTG a una concentración final de 1 mM, junto con etanolamina (0.1% (v/v)). Después de 24 h, los cultivos se cosechan y se extraen con acetato de etilo (2 volúmenes de cultivo a 1 volumen de acetato de etilo) y la fracción orgánica se recolecta y utiliza para análisis de especies grasas por GC-MS.

Todas las muestras se analizaron por GC-MS (Agilent 6850 GC con 5975B VL MSD) equipado con una película de 30 m x 0.25 mm 0.25 mm de una columna Agilent HP-5-EM para separación con detectores de masa de ionización de electrones (El, por sus siglas en inglés) en modo de exploración completa (50-500 m/z). Una cantidad de 1 ml de la extracción de acetato de etilo se inyecta en la entrada sin salpicaduras Agilent ajustada a 300°C. Se programa la temperatura de la columna como sigue: 100°C durante 5 min, incremento a 320°C a 20°C/min y retención a 320°C durante 5 min. El gas portador helio se ajusta a un caudal de 1.2 ml/min. En la figura 1 se muestra un cromatograma representativo con una interpretación de los espectros de masa de E. coli MG1655 cepa DG5, transformada con OP80-PPS. Un pico que tiene un tiempo de retención de 13.1 min se identificó en los trazos de GC-MS de todas las E. coli MG1655 cepas DG5, DG5 Tn7-'tesA y DG5 Tn7- 1 tesA-fadD transformadas con OP80-PPS. Este pico se identificó como N-palmitoiletanolamida. El pico identificado como N-palmitoiletanolamida no está presente en alguna de las cepas control transformadas con el vector vacío.

Se calcula que aproximadamente 200 mg/1 de N-palmitoiletanolamida se produce en E. coli MG1655 cepa DG5 transformada con OP80-PPS. E. coli MG1655 cepa DG5 se modifica para producir acil graso-ACP mientras que DG5 Tn7- ' tesA se modifica para producir ácido graso libre en DG5 Tn7- ’t esA-fadD es modificado para producir acil graso-CoA. Puesto que estos resultados demuestran que la totalidad de las tres cepas producen N-palmitoiletanolamida, la producción de N-palmitoiletanolamida en la cepa DG5 original sugiere que la enzima PPS codificada por el gen AY632377 utiliza acil C16:0-ACP como sustrato en presencia de la etanolamina primaria. La N-palmitoiletanolamida identificada en la figura 1 se caracteriza adicionalmente por derivatización con N,0-bis (trimetilsilil)-trifluoroacetamida (BSTFA) en la cual el grupo hidroxilo está protegido con trimetilsililo. Como se muestra en la figura 2A, un pico en el trazo de GC-MS que tiene un tiempo de retención de 13.3 min se identificó como el producto protegido con trimetilsililo (TMS).

Los resultados de este ejemplo ilustran un método para producir N-palmitoiletanolamida por expresión de una enzima PPS codificada por el gen AY632377 en una cepa bacteriana que ha sido modificada para producir acil graso-ACP. Además, estos resultados sugieren que una sola enzima (es decir, PPS) puede realizar amidación secundaria directamente a partir de acil-ACP y un grupo de cabeza amina primario in vivo.

EJEMPLO 4 Este ejemplo muestra un método para producir N-palmitoiletanolamida mediante expresión de un gen que codifica una palmitoilputrescina sintasa en un microorganismo modificado genéticamente.

El vector vacío OP80 o el plásmido OP80-PPS se transforma en E . coli MG1655 cepa DG5,-DG5 Tn7-'tesA y DG5 Tn7-'t esA-fadD, como se describe en el ejemplo 3. Cada una de las seis cepas se cultiva durante la noche en caldo LB sin glucosa adicional. Después, cada uno de los cultivos durante la noche se inocula en un medio rico en nutrientes que contiene glucosa. De manera más específica, 1 mi de cada uno de los cultivos durante la noche se inocula por triplicado en 2 N-BT rico en nutrientes (glucosa 2%, medio limitado en nitrógeno, Bis-Tris 0.2 M, pH 7.0, Tritón 0.1%): media LB (1:10) que contiene IPTG 1 mM, antibióticos y etanolamina 1% y se cultivó en un incubador con pH controlado. Después de 48 h, se registra la ?qboo de cada cultivo y las células se recolectan y extraen con acetato de etilo (2 volúmenes de cultivo respecto a 1 volumen de acetato de etilo) . Las fracciones orgánicas se recolectan y utilizan para análisis por GC-MS como se describe en el ejemplo 3. Un pico que tiene un tiempo de retención de 13.1 min se encuentra que es más abundante en el trazo GC-MS para E. coli MG1655 cepa DG5 Tn7-’t esA-fadD transformada con OP80-PPS. El pico que tiene un tiempo de retención de 13.1 es el segundo más abundante en la cepa D5 transformada con OP80-PPS y el tercero más abundante en la cepa DG5 Tn7- ' tesA transformado con OP80-PPS. El pico de 13.1 min se identificó como N-palmitoiletanolamida a partir de todas las cepas. El pico identificado como N-palmitoiletanolamida no está presente en alguna de las cepas DG5 control transformadas con vector vacío .

Como se indica en lo anterior, E. coli MG1655 cepa DG5 Tn7-’t esA-fadD se modifica para producir acil graso-CoA. Por lo tanto, la producción de N-palmitoiletanolamida en la cepa DG5 Tn7-’t esA-fadD sugiere que la enzima PPS codificada por el gen AY632377 también puede utilizar acil graso-CoA como un sustrato en presencia de etanolamina.

Los resultados de este ejemplo muestran un método para producir N-palmitoiletanolamida mediante expresión de una enzima PPS codificada por un gen AY632377 en una cepa bacteriana que es modificada para producir acil graso-CoA. Además, estos resultados sugieren que una sola enzima (es decir, PPS) puede realizar una amidación secundaria directamente a partir de un tioéster graso y un grupo de cabeza amina primario in vivo.

EJEMPLO 5 Este ejemplo muestra un método para producir amidas grasas saturadas e insaturadas por expresión de un gen que codifica una PPS en un microorganismo modificado genéticamente .

La 3-dimetilamino-1-propilamida grasa es un precursor en la síntesis del detergente anfotérico cocamidopropilbetaína (CAPB). Para determinar si las N- (3-dimetilamino-l-propilamina) amidas grasas se pueden producir en un microorganismo modificado genéticamente para expresar una PPS, células E. coli MG1655 cepa DG5 se transformaron con el vector vacío OP80 o con el plásmido OP80-PPS y se cultivaron durante la noche en caldo LB sin glucosa adicional. Después, cada uno de los cultivos durante la noche se inoculó en un medio rico en nutriente que contiene glucosa. De manera más específica, 1 mi de cada uno de los cultivos durante la noche se inoculo por triplicado en nutriente rico 2N-BT (glucosa 2%, medio limitado en nitrógeno, Bis-Tris 0.2 M, pH 7.0, Tritón 0.1%): medio LB (1:10) que contiene IPTG 1 mM, antibióticos y 1% de amina primaria 3-dimetilamino-l-propilamina, y se cultivó en un incubador con pH controlado. Después de 60 h, se registró la DC>6OO de cada cultivo y las células se recolectaron y extrajeron con acetato de etilo (2 volúmenes de cultivo respecto a 1 volumen de acetato de etilo). Las fracciones orgánicas se recolectaron y utilizaron para análisis por GC-MS como se describe en el ejemplo 3. El cromatograma se analizó por extracción de cromatograma de iones para el ión 58, el cual es un ión común para N- (3-dimetilamino-1-propilamina) amidas grasa. Las N- (3-dimetilamino-l-propilamina) amidas grasas que contienen cadenas grasas C12:0 (12.8 min), C14:0 (13.2 min), C16:l (13.5 min), C16:0 (13.6 min) y C18:l (14.3 min) se identificaron en el trazo de GC-MS (figura 3). Las amidas grasas que contienen una cadena grasa C16:0 se identificaron que son las más abundantes en el trazo de GC-MS (figura 3).

Los resultados de este ejemplo muestran un método para producción de amidas grasas con diversas longitudes de cadena grasa que tienen ya sea cero o una insaturación por cultivo en una cepa de E. coli que fue modificada para producir acil-ACP y la cual expresa adicionalmente una enzima PPS codificada por el gen AY632377 en un medio que contiene 3-dimetilamino-1-propilamina.

EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra un método para producir diversas amidas grasas mediante alimentación de una diversidad de aminas primarias a un microorganismo modificado genéticamente.

El vector vacío OP80 o el plásmido OP80-PPS se transforma en E. coli MG1655 cepas DG5, DG5 Tn7-’tesA y DG5 Tn7- ’t esA-fadD, como se describe en el ejemplo 3. Cada una de las seis cepas se cultiva durante la noche en caldo LB sin glucosa adicional. Después, cada uno de los cultivos durante la noche se inocula en un medio rico en nutriente que contiene glucosa. De manera más específica, 1 mi de cada uno de los cultivos de la noche se inocula en nutriente rico 2N-BT (glucosa 2%, medio limitado en nitrógeno, Bis-Tris 0.2 M, pH 7.0, Tritón 0.1%): medio LB (1:10) que contiene IPTG 1 mM, antibióticos y 1% de una de las siguientes aminas primarias: (+)-l-amino-2-propanol, 2 -metoxietilamina, 3-amino-1-propanol, 2 -amino-1,3-propanodiol, 3-metoxipropilamina, N- (2-hidroxietil)etilendiamina o butilamina. Los cultivos se incuban en un ambiente con pH controlado durante 60 h. Se registra la DC>6oo de cada cultivo y las células se recolectan y extraen con acetato de etilo (2 volúmenes de cultivo respecto a 1 volumen de acetato de etilo). Las fracciones orgánicas se recolectan y utilizan para análisis por GC-MS, como se describe en el ejemplo 3. Las amidas grasas se obtienen a partir de cada una de las cepas de E. coli que expresan PPS alimentadas con una amina primaria. El producto de amida grasa obtenido a partir de cada sustrato de alimentación se muestra en la figura 4. Los productos de amida grasa no se detectan en cepas de E. coli transformadas con vector vacío.

Los resultados de este ejemplo demuestran un método para producir distintas especies de amidas grasas en una cepa de E. coli que ha sido modificada genéticamente para producir tioésteres grasos y la cual expresa adicionalmente una enzima PPS codificada por el gen AY632377 al hacer variar el tipo de alimentación de amina primaria.

EJEMPLO 7 Este ejemplo muestra que la expresión de un homólogo de PPS en un microorganismo modificado genéticamente produce los mismos compuestos de amida grasa que se producen cuando se expresa PPS.

La PPS codificada por AY632377 (SEC ID NO: 2) se ha determinado previamente que no tiene una identidad de secuencia de más de 20% con cualquier otra secuencia conocida por análisis BLAST (véase Brady et al. (2004) J. Nat . Prod. , 67: 1283-1286). La secuencia de aminoácidos de la enzima PPS codifica por el gen AY632377, es decir, GenBank, acceso No. AAV33349 (SEC ID NO: 1) se somete a una búsqueda BLAST de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Un homólogo, que codifica para la enzima, N- (4-amino-2-hidroxibutil) tetradecanamida sintasa (AhtS) (GenBank, acceso No. ACX33975.1) (SEC ID NO: 3) se identifica que tiene una secuencia de aminoácidos que es 38% idéntica a la secuencia de aminoácidos de PPS codificada por el gen AY632377. El gen que codifica para AhtS se sintetiza por GENEARTMR (Life Technologies, Grand Island, NY) y se clona en el vector de expresión OP80, como sigue. El plás ido OP80 se purifica y se somete a digestiones de restricción con Ncol/Pmel (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA). El gen AhtS se clona en OP80 utilizando el sistema de clonación IN-FUSI0NMR PCR (Clontech, Mountain View, CA) con los siguientes cebadores: 3.10.10-2_InfusF: 5'-GAGGAATAAACCATGCCCATTCTTGAAAGCGTGGG-3' (SEC ID NO: 20) y 3.10.10-2_InfusR: 5'-AGCTGGAGACCGTTTAAACTTATAAACCGCTGTTTGTCGCAACCG-3' (SEC ID NO: 21).

Dos colonias fueron positivas para el péptido que contiene el inserto que codifica para AhtS por digestión por restricción. Se confirma que el plásmido contiene la secuencia que codifica para AhtS por análisis de secuencia y se denomina "OP80-AhtS". El plásmido OP80-AhtS se transforma en E. coli MG1655 cepas DG5, DG5 Tn7-’tesA y DG5 Tn7-’tesA-fadD. Se cultivan tres cepas y se inducen como se describe en el ejemplo 4 y cada cultivo se alimenta ya sea con 3-dimetilamino-1-propilamina, (±)-1-amino-2-propanol o etanolamina a una concentración final de 1%. Después de 60 h de cultivo en un incubador con pH controlado, los cultivos se recolectan y se extraen con acetato de etilo (2 volúmenes de cultivo respecto a 1 volumen de acetato de etilo). Las fracciones orgánicas se recolectan y utilizan para análisis de GC-MS como se describe en el ejemplo 3.

Las amidas grasas se obtienen a partir de cada una de las cepas de E. coli que expresan AhtS alimentadas con cada una de las aminas primarias. El trazo de GC-MS representativo de los productos elaborados por E. coli MG1655 DG5 Tn7 tesA-fadD transformada con OP80-AhtS alimentada con dimetilamino-1-propilamina se proporcionada como figura 5. El pico que tiene un tiempo de retención CG de 11.4 min se confirmó como N-(3-dimetilamino-1-propilamida) grasa C14:0 por análisis de EM (figura 5). Los productos de amida grasa no se detectaron en cepas de E. coli transformadas con vector vacío. La cantidad más grande de amidas se produjeron en E. coli MG1655 cepa DG5 Tn7- ' tesA-fadD mientras que la cantidad más baja de amidas se produjeron en E. coli MG1655 cepa DG5 Tn7- 'tesA. La producción aumento en amidas en la cepa DG5 Tn7-' tesA-fadD sugiere que la enzima AhtS tiene una preferencia por sustratos de tioéster grasos de C14:0. Estos datos también sugieren que ambas, AhtS y PPS pueden utilizar cada uno de los dos sustratos de tioéster grasos (es decir, ACP grasos y CoA grasos) en E. coli para producir amidas grasas.

Los resultados de este ejemplo demuestran que la enzima AhtS puede catalizar el mismo tipo de reacción entre aminas primarias y sustratos de tioéster grasos que la enzima PPS. Además, los datos mostrados en este ejemplo indican que la enzima AhtS tiene una preferencia por sustratos de tioéster graso C14:0.

EJEMPLO 8 Este ejemplo proporciona un método in vivo para generar una amina primaria útil como un material de inicio en la generación de una amida grasa de acuerdo con la presente descripción.

La producción in vivo de etanolamina se puede obtener al incrementar genéticamente las vías de biosíntesis de serina y descarboxilación de serina. Para hacerlo de esta manera, el intermediario glucolítico 3-fosfoglicerato se incrementa por modificación de E. coli cepa MG1655 para sobreexpresar fosfoglicerato mutasas ( gpm AB). La vía de producción de serina es modificada por sobreexpresión de fosfoglicerato deshidrogenase (se rA) , 3-fosfoserina aminotransferasa (serC) y fosfato de 3-fosfoserina (serB) . Una serina descarboxilasa heteróloga (SDC) la cual descarboxila serina a etanolamina se expresa en el hospedador. Con el fin de evitar que la cepa etabolice etanolamina y serina, se suprimen los genes que codifican para las enzimas de degradación de etanolamina amoniaco-liasa (eutABC) y serina desaminasas ( sdaAB ) (figura 6). Las amidas grasas después se pueden producir en el microorganismo recombinante el cual produce etanolamina por sobreexpresión de un polipéptido tal como PPS o AhtS, el cual cataliza la conversión de etanolamina a un tioéster de acilo de una amida grasa .

Diversas modificaciones y variaciones de la presente descripción serán evidentes para aquellos expertos en el ámbito sin por esto apartarse del alcance y espíritu de la descripción. Aunque la descripción se ha descrito en relación con modalidades preferidas específicas, debe entenderse que las reivindicaciones no deben considerarse limitadas indebidamente a estas modalidades específicas. En realidad, las diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la descripción, los cuales son entendidos por los expertos en el ámbito se pretende que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un microorganismo recombinante caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que cataliza una conversión de una amina primaria y un tioéster de acilo a una amida grasa, en donde el microorganismo se cultiva en presencia de una fuente de carbono.

2. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido de palmitoilputrescina sintasa (PPS).

3. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido de PPS comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 1.

4. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido de PPS tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID NO: 1.

5. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido de PPS es codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 2.

6. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido de N- ( -amino-2-hidroxilbutil) tetradecanamida sintasa (AhtS).

7. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido de AhtS comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 91%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 3.

8. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido de AhtS tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID NO: 3.

9. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido de AhtS es codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 22.

10. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la fuente de carbono es un carbohidrato.

11. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la amina primaria se selecciona del grupo que consiste de 3-dimetilamino-1-propilamina, (±)-l-amino-2-propanol, 2-metoxietilamina, 3-amino-1-propanol, 2-amino-1,3-propanodiol, 3-metoxipropilamina, N- (2-hidroxietil)etilendiamina, butilamina y 1,4-diaminobutano o una combinación de los mismos.

12. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el tioéster de acilo es un acilo graso-ACP o un acilo graso-CoA.

El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el acil graso-ACP o el acil graso-CoA son producidos por el microorganismo.

14. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el microorganismo recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para uno o más de un polipéptido biosintético de ácido graso, un polipéptido de tioesterasa (EC 3.1.2.14 o EC 3.1.1.5) y un polipéptido de acil-CoA sintasa (EC 2.3.1.86).

15. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el microorganismo comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de tioesterasa y un polipéptido de acil-CoA sintasa.

16. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido tioesterasa comprende una secuencia de ácido nucleico de 1tesA.

17. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de acil-CoA sintasa es fadD.

18. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque el polipéptido biosintético de ácido graso se selecciona de una secuencia de ácido nucleico que codifica para accABCD, FabD, FabH, FabG, FabB, FabA, FabZ, FabF, FabI, o FadR.

19. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el microorganismo es una bacteria, una cianobacteria, una alga o un hongo.

20. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el microorganismo es un hongo.

21. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el hongo es una levadura o un hongo filamentoso.

22. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el microorganismo es una célula de Saccharomyces cerevisiae , Candida lipolytica , Escherichia coli, Arthrobacter , Rhodotorula glutinins , Acinetobacter, Candida lipolytica, Botryococcus braunii , Vibrio furnissii, Micrococcus leuteus, Stenotrophomonas maltophilia , Bacillus subtilis, Bacillus lichenoformis , Pseudomonus putida, Psuedomonas florescens , Streptomyces coelicolor , Synechococcus sp. PCC7002, Thermosynechococcus elongatus BP-1 , Prototheca moriformis , Prototheca krugani , Prototheca stagnora, Prototheca zopfii o una célula de Chorella protothecoide .

23. El microorganismo recombinante de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el microorganismo es una célula de Arthrobacter AK 19, Acinetobacter sp. cepa M-l, E coli B, E. coli C, E coli K o una célula de E . coli W.

24. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque el polipéptido que cataliza la conversión de la amina primaria y el tioéster de acilo a la amida grasa es endógeno al microorganismo.

25. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque el polipéptido que cataliza la conversión de la amina primaria y el tioéster de acilo a una amida grasa es exógeno al microorganismo.

26. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque la amida grasa es una alcanolamida grasa o una amidoamina grasa.

27. El microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque el microorganismo expresa un polipéptido de serina descarboxilasa.

28. Un método para producir una amida grasa, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un microorganismo recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27; y (b) cultivar el microorganismo recombinante en un medio de cultivo bajo condiciones adecuadas para la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido que cataliza la conversión de la amina primaria y el tioéster de acilo a la amida grasa en presencia de por lo menos un sustrato para el polipéptido.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende además aislar la amida grasa del medio de cultivo.

30. El método de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizado porque la amida grasa es una alcanolamida grasa 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 carbonos.

31. El método de conformidad con la reivindicación 28 ó 29, caracterizado porque la amida grasa es una amidoamina grasa de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 carbonos.