ES2693753T3

ES2693753T3 - Producción de ácidos grasos de cadena ramificada y derivados de los mismos en células microbianas recombinantes

Info

Publication number: ES2693753T3
Application number: ES11722657.1T
Authority: ES
Inventors: Zhihao Hu; Grace J. Lee; Andreas Schirmer; Kseniya Zakharyevich; Derek L. GREENFIELD; Tarah S. BARON; Kevin Holden
Original assignee: REG Life Sciences LLC
Current assignee: REG Life Sciences LLC
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2011-05-10
Publication date: 2018-12-13
Anticipated expiration: 2031-05-10
Also published as: EP2663636A1; CA2823928C; EP4282972A2; CA3087554A1; EP3456814A2; WO2012096686A1; EP3456814A3; CA2823928A1; EP2663636B1; EP4282972A3

Abstract

Una célula microbiana recombinante que comprende: (a) polinucleótidos que codifican un complejo deshidrogenasa de alfa-cetoácidos de cadena ramificada (BKD) que comprende polipéptidos que tienen actividad deshidrogenasa de alfa-cetoácidos de cadena ramificada, actividad lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa, (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que utiliza una molécula de acil-CoA ramificada como sustrato, (c) uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad enzimática de derivación de ácidos grasos seleccionado entre el grupo que consiste en: (i) un polipéptido que tiene actividad tioesterasa; (ii) un polipéptido que tiene actividad descarboxilasa; (iii) un polipéptido que tiene actividad de ácido carboxílico reductasa; (iv) un polipéptido que tiene actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1); (v) un polipéptido que tiene actividad aldehído descarbonilasa (EC 4.1.99.5); (vi) un polipéptido que tiene actividad acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50); (vii) un polipéptido que tiene actividad acil-ACP reductasa; (viii) un polipéptido que tiene actividad éster sintasa (EC 3.1.1.67); (ix) un polipéptido que tiene actividad OleA; y (x) un polipéptido que tiene actividad OleCD u OleBCD, y (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad aspartocinasa, en el que al menos un polinucleótido de acuerdo con (a), (b) o (d) codifica un polipéptido que es heterólogo para la célula microbiana recombinante y en el que la célula microbiana recombinante produce un derivado de ácidos grasos anteiso-ramificados cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleótidos.

Description

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DESCRIPCION

Produccion de acidos grasos de cadena ramificada y derivados de los mismos en celulas microbianas recombinantes

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a nuevas celulas microbianas recombinantes que producen derivados de acidos grasos de cadena ramificada y a procedimientos de fabricacion de derivados de acidos grasos de cadena ramificada usando las celulas microbianas recombinantes.

Antecedentes

El petroleo crudo es una mezcla muy compleja que contiene una gran variedad de hidrocarburos. Se convierte en diversos combustibles y productos qufmicos mediante una serie de procedimientos qufmicos en refinerfas. El petroleo crudo es una fuente de combustibles para transporte, asf como una fuente de materias primas para producir compuestos petroqufmicos. Los compuestos petroqufmicos se usan para fabricar productos qufmicos especiales, tales como plasticos, resinas, fibras, elastomeros, productos farmaceuticos, lubricantes y geles.

Se sabe que los hidrocarburos ramificados, los acidos grasos ramificados y otros derivados de acidos grasos de cadena ramificada (incluyendo los esteres grasos ramificados, aldehfdos grasos ramificados y alcoholes grasos ramificados) tienen propiedades preferidas adicionales cuando se comparan con las moleculas de cadena lineal del mismo peso molecular (es decir, isomeros), tales como puntos de fusion considerablemente mas bajos que a su vez, pueden conferir puntos de vertido mas bajos cuando se convierten en productos qufmicos industriales. Estos beneficios adicionales permiten que los hidrocarburos ramificados, los acidos grasos ramificados y otros derivados de acidos grasos ramificados confieran una volatilidad y presion de vapor sustancialmente menores y una estabilidad mejorada frente a la oxidacion y la rancidez, haciendo que de este modo, sean particularmente adecuados como componentes o materias primas para aplicaciones cosmeticas y farmaceuticas o como componentes de plastificantes para resinas sinteticas, disolventes para soluciones para tinta de imprenta y tintas especiales y lubricantes industriales.

Dichas propiedades preferidas adicionales tambien pueden obtenerse en derivados de acidos grasos insaturados (incluyendo hidrocarburos insaturados, acidos grasos insaturados y otros derivados de acidos grasos insaturados), normalmente con altos grados de insaturacion, pero la insaturacion promueve la oxidacion y pueden dar lugar a una vida util mas corta y a problemas de corrosion. Por lo tanto, se obtienen mas facilmente menores puntos de fusion, puntos de vertido, volatilidad y presion de vapor, asf como una estabilidad oxidativa mejorada, mediante ramificacion.

La obtencion de productos qufmicos de especialidad ramificados a partir de petroleo requiere una inversion financiera significativa, asf como una gran cantidad de energfa termica. Asimismo, es un procedimiento ineficaz, ya que con frecuencia, los hidrocarburos de cadena larga en el petroleo crudo se craquean para producir monomeros mas pequenos. Despues, estos monomeros se usan como material en bruto para fabricar los productos qufmicos especiales mas complejos. Ademas, en la industria petroqufmica, es frecuente obtener productos qufmicos ramificados, tales como, por ejemplo, alcanos ramificados, alquenos ramificados, acidos grasos ramificados, esteres grasos ramificados, alcoholes grasos ramificados y aldehfdos grasos ramificados mediante la isomerizacion de hidrocarburos de cadena larga, usando diversos procedimientos catalfticos. En estos procedimientos normalmente se emplean costosos catalizadores, aumentando por tanto los costes de fabricacion. Los catalizadores que normalmente se usan se convierten en contaminantes no deseados que han de retirarse de los productos terminados, anadiendo por tanto costes adicionales a los procedimientos.

Los combustibles para transporte mas importantes (gasolina, diesel y combustible de aviacion) contienen mezclas distintivas diferentes de hidrocarburos que se disenan a medida a fin de obtener un rendimiento optimo de los motores. Por ejemplo, la gasolina comprende predominantemente hidrocarburos de cadena lineal, de cadena ramificada y aromaticos que varfan de aproximadamente 4 a 12 atomos de carbono, mientras que el diesel comprende predominantemente hidrocarburos de cadena lineal que varfan de aproximadamente 9 a 23 atomos de carbono. La calidad del combustible diesel se evalua mediante parametros tales como numero de cetano, viscosidad cinematica, estabilidad oxidativa y punto de turbidez (Knothe G., Fuel Process Technol. 86:1059-1070 (2005)). Estos parametros, entre otros, se ven afectados por la longitud de la cadena de hidrocarburo, asf como por el grado de ramificacion o saturacion del hidrocarburo.

Los acidos grasos producidos por microbios y otros derivados de acidos grasos (tales como esteres grasos, alcoholes grasos e hidrocarburos) pueden producirse a medida mediante manipulacion genetica. La ingenierfa metabolica permite a las cepas microbianas producir diferentes mezclas de acidos grasos y otros derivados de acidos grasos, que pueden optimizare para satisfacer o superar los estandares para combustibles y pueden disenarse a medida para producir otros productos qufmicos o moleculas precursoras que normalmente son derivados del petroleo.

Existe la necesidad de alternativas economicas para los productos del petroleo que no requieran de la exploracion,

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extraccion, transporte a lo largo de grandes distancias, refinado sustancial y que eviten los tipos de dano ambiental asociado con el procesamiento del petroleo. Por motivos similares, existe la necesidad de fuentes alternativas de qufmicos que normalmente son derivados del petroleo. Tambien existe la necesidad de procedimientos eficientes y economicos para producir biocombustibles de alta calidad, alternativas a los combustibles y productos qufmicos industriales a partir de fuentes de energfa renovables.

Las celulas microbianas recombinantes disenadas para producir acidos grasos de cadena ramificada y otros derivados de acidos grasos de cadena ramificada, los procedimientos que usan estas celulas microbianas recombinantes para producir derivados de acidos grasos de cadena ramificada y las composiciones producidas mediante estos procedimientos abordan estas necesidades.

El documento US 2010/0154293 A1 se refiere a enzimas tioesterasa mutantes y describe la expresion de genes que codifican enzimas biosinteticas de derivados de acidos grasos. El documento US 2010/0242345 A1 se refiere a microorganismos modificados por ingenierfa genetica que producen productos a partir de la ruta biosintetica de derivados de acidos grasos. Kikuchi y col. 1999 (FEMS Microbiology Letters 173: 211-215) describen el analisis mutacional de los sitios de retroalimentacion de la aspartocinasa sensible a lisina de Escherichia coli. El documento WO 2011/087787 A1 se refiere a acidos grasos de cadena ramificada y a la produccion biologica de los mismos y describe un procedimiento para producir acidos grasos anteiso.

Sumario

La presente invencion proporciona nuevas celulas microbianas recombinantes que producen derivados de acidos grasos de cadena ramificada. La invencion tambien se refiere a procedimientos para fabricar derivados de acidos grasos de cadena ramificada que comprenden cultivar celulas microbianas recombinantes de la divulgacion y otras caracterfsticas evidentes tras una revision posterior.

La invencion se define por las reivindicaciones. En particular, la presente invencion proporciona:

[1.] Una celula microbiana recombinante que comprende:

(a) polinucleotidos que codifican un complejo deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD) que comprende polipeptidos que tienen actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, actividad lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa,

(b) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que utiliza como sustrato una molecula de acil-CoA ramificada,

(c) uno o mas polinucleotidos que codifican un polipeptido que tiene actividad enzimatica de derivacion de acidos grasos seleccionado entre el grupo que consiste en: (i) un polipeptido que tiene actividad tioesterasa; (ii) un polipeptido que tiene actividad descarboxilasa; (iii) un polipeptido que tiene actividad de acido carboxflico reductasa; (iv) un polipeptido que tiene actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1); (v) un polipeptido que tiene actividad aldehfdo descarbonilasa (EC 4.1.99.5); (vi) un polipeptido que tiene actividad acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50); (vii) un polipeptido que tiene actividad acil-ACP reductasa; (viii) un polipeptido que tiene actividad ester sintasa (EC 3.1.1.67); (ix) un polipeptido que tiene actividad OleA; y (x) un polipeptido que tiene actividad OleCD u OleBCD, y

(d) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad aspartocinasa,

en el que al menos un polinucleotido de acuerdo con (a), (b) o (d) codifica un polipeptido que es heterologo respecto de la celula microbiana recombinante y en el que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acido graso anteiso-ramificado cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

[2.] La celula microbiana recombinante de [1], que ademas comprende (e) uno o mas polinucleotidos que codifican un polipeptido que tiene actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa o actividad beta- isopropilmalato deshidrogenasa.

[3.] La celula microbiana recombinante de [1], que produce una composicion de derivado de acidos grasos que comprende derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos ramificados, en la que al menos un 5% de los derivados de acidos grasos en la composicion son derivados de acidos grasos ramificados, cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

[4.] La celula microbiana recombinante de [1], que produce al menos 25 mg/l de derivados de acidos grasos ramificados cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

[5.] La celula microbiana recombinante de [1], que comprende una secuencia de polinucleotidos endogena que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que no utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato, en la que la expresion de la secuencia de polinucleotidos endogena que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa en la celula microbiana recombinante esta atenuada.

[6.] La celula microbiana recombinante de [1], en la que la celula microbiana recombinante es un miembro del genero Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pantoea, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, 5 Yarrowia, Streptomyces, Synechococcus, Chlorella o Prototheca.

[7.] Un cultivo celular que comprende la celula microbiana recombinante de [1].

[8.] La celula microbiana recombinante de [1], que produce al menos 10 mg/l de un derivado de acido graso anteiso- ramificado.

[9.] Un procedimiento de fabricacion de una composicion que comprende un derivado de acido graso anteiso- 10 ramificado, comprendiendo el procedimiento: obtener la celula microbiana recombinante de [1], cultivar la celula microbiana recombinante en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos y producir una composicion de derivados de acidos grasos que comprende derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos ramificados, en la que al menos un 10 % de los derivados de acidos grasos ramificados en la composicion son derivados de acidos grasos anteiso-ramificados y 15 opcionalmente, recuperar la composicion del medio de cultivo.

[10.] El procedimiento de [9], en el que la composicion de derivado de acidos grasos ramificados producida en el medio de cultivo comprende al menos 10 mg/l de derivados de acidos grasos anteiso-ramificados.

[11.] El procedimiento de [9], en el que la celula microbiana recombinante expresa uno o mas peptidos que tienen una actividad enzimatica derivada de acidos grasos seleccionada entre el grupo que consiste en: (i) un polipeptido 20 que tiene actividad tioesterasa; (ii) un polipeptido que tiene actividad descarboxilasa; (iii) un polipeptido que tiene actividad de acido carboxflico reductasa; (iv) un polipeptido que tiene actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1); (v) un polipeptido que tiene actividad aldehfdo descarbonilasa (EC 4.1.99.5); (vi) un polipeptido que tiene actividad acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50); (vii) un polipeptido que tiene actividad acil-ACP reductasa; (viii) un polipeptido que tiene actividad ester sintasa (EC 3.1.1.67); (ix) un polipeptido que tiene actividad OleA; y (x) un polipeptido que tiene 25 actividad OleCD u OleBCD;

en el que la celula microbiana recombinante produce una composicion que comprende uno o mas acidos grasos anteiso-ramificados, esteres grasos anteiso-ramificados, esteres de cera anteiso-ramificados, aldehfdos grasos anteiso-ramificados, alcoholes grasos anteiso-ramificados, alcanos anteiso-ramificados, alquenos anteiso- ramificados, olefinas internas anteiso-ramificadas, olefinas terminales anteiso-ramificadas y cetonas anteiso- 30 ramificadas.

[12.] La celula recombinante de [1], en la que el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa tiene ademas actividad homoserina deshidrogenasa.

[13.] La celula recombinante de [1], en la que el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa es ThrA.

En un primer aspecto, en el presente documento se describe una celula microbiana recombinante que comprende: 35 (a) polinucleotidos que codifican un complejo deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD), que

comprende polipeptidos que tienen actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, actividad lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa y (b) polinucleotidos que codifican un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que utiliza como sustrato una molecula de acil-CoA ramificada, en la que al menos un polinucleotido de acuerdo con (a) o (b) codifica un polipeptido que es exogeno 40 para la celula microbiana recombinante o se modula la expresion de dicho polinucleotido en la celula microbiana recombinante; y que comprende uno o mas polinucleotidos, codificando cada uno de ellos un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos grasos ramificados cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. En algunos aspectos, la expresion del al menos un polinucleotido de acuerdo con (a) o 45 (b) se modula mediante la sobreexpresion del polinucleotido, tal como uniendo operativamente el polinucleotido a un

promotor exogeno.

En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante de acuerdo con el primer aspecto produce una composicion de derivado de acidos grasos cuando la celula se cultiva en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos, comprendiendo la composicion de derivados de acidos 50 grasos derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos de cadena ramificada y comprendiendo los derivados de acidos grasos de cadena ramificada derivados de acidos grasos anteiso- ramificados y derivados de acidos grasos iso-ramificados.

En algunos aspectos, al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los derivados de 55 acidos grasos en la composicion producida por la celula microbiana del primer aspecto son derivados de acidos grasos de cadena ramificada. En algunos aspectos, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los derivados de acidos grasos de cadena ramificada en la composicion producida por la celula microbiana del primer

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aspecto son derivados de acidos grasos iso-ramificados. En algunos aspectos, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los derivados de acidos grasos ramificados en la composicion producida por la celula microbiana del primer aspecto son derivados de acidos grasos anteiso-ramificados. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante del primer aspecto produce al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l de derivados de acidos grasos de cadena ramificada cuando se cultiva en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

En un segundo aspecto, en el presente documento se describe una celula microbiana recombinante que comprende:

(a) polinucleotidos que codifican un complejo deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD), que comprende polipeptidos que tienen actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, actividad lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa y (b) polinucleotidos que codifican un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que utiliza como sustrato una molecula de acil-CoA ramificada y que ademas comprende: (c) polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa, actividad treonina sintasa y actividad treonina desaminasa o (d) polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa y actividad beta-isopropil malato deshidrogenasa o (c) y (d); y (e) polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen actividad acetohidroxiacido sintasa, actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa y actividad dihidroxiacido deshidratasa; en el que al menos un polinucleotido de acuerdo con (a),

(b) , (c), (d) o (e) codifica un polipeptido que es exogeno para la celula microbiana recombinante o se modula la expresion de dicho polinucleotido en la celula microbiana recombinante; y que comprende uno o mas polinucleotidos, codificando cada uno de ellos un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos grasos anteiso-ramificados cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. En algunos aspectos, la expresion del al menos un polinucleotido de acuerdo con (a), (b), (c), (d) o (e) se modula mediante la sobreexpresion del polinucleotido, tal como uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno.

En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante de acuerdo con el segundo aspecto produce una composicion de derivado de acidos grasos cuando la celula se cultiva en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos, comprendiendo la composicion de derivados de acidos grasos derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos de cadena ramificada, comprendiendo lo derivados de acidos grasos de cadena ramificada derivados de acidos grasos anteiso- ramificados y derivados de acidos grasos iso-ramificados.

En algunos aspectos, al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los derivados de acidos grasos en la composicion producidos por la celula microbiana recombinante de acuerdo con el segundo aspecto son derivados de acidos grasos de cadena ramificada. En algunos aspectos, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los derivados de acidos grasos de cadena ramificada en la composicion producida por la celula microbiana del segundo aspecto son derivados de acidos grasos anteiso-ramificados. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante del segundo aspecto produce al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l de derivados de acidos grasos de cadena ramificada cuando se cultiva en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

En algunos casos del primer aspecto o del segundo aspecto, la enzima derivada de acidos grasos comprende actividad tioesterasa y el derivado de acidos grasos de cadena ramificada producido por la celula recombinante es un acido graso de cadena ramificada. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce una composicion de acido graso que comprende acidos grasos de cadena lineal y acidos grasos de cadena ramificada, comprendiendo los acidos grasos ramificados acidos grasos anteiso-ramificados y acidos grasos iso-ramificados. En algunos casos, al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los acidos grasos en la composicion son acidos grasos ramificados. En algunos casos, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los acidos grasos de cadena ramificada en la composicion producida por la celula microbiana son acidos grasos anteiso-ramificados. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce al menos 10 mg/L, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l de acidos grasos de cadena ramificada o acidos grasos de cadena anteiso-ramificada cuando se cultiva en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

En algunos casos del primer aspecto o del segundo aspecto, la enzima derivada de acidos grasos comprende actividad ester sintasa y el derivado de acidos grasos de cadena ramificada producido por la celula recombinante es un ester graso ramificado. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce una composicion de ester graso que comprende esteres grasos de cadena lineal y esteres grasos de cadena ramificada, comprendiendo los

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esteres de cadena ramificada esteres grasos de cadena anteiso-ramificado y esteres grasos de cadena iso- ramificada. En algunos casos, al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los esteres grasos en la composicion son esteres grasos ramificados. En algunos casos, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los esteres grasos ramificados en la composicion producida por la celula microbiana son esteres grasos anteiso-ramificados o esteres grasos iso-ramificados. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l de esteres grasos de cadena ramificada o esteres grasos anteiso-ramificados o esteres grasos iso-ramificados cuando se cultivan en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

En algunos casos del primer aspecto o del segundo aspecto, la enzima derivada de acidos grasos comprende actividad biosintetica de aldehfdos grasos y el derivado de acidos grasos de cadena ramificada producido por la celula microbiana recombinante es un aldehfdo graso ramificado. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce una composicion de aldehfdo graso que comprende aldehfdos grasos de cadena lineal y aldehfdos grasos de cadena ramificada, comprendiendo los aldehfdos grasos ramificados aldehfdos grasos anteiso- ramificados y aldehfdos grasos iso-ramificados. En algunos casos, al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los aldehfdos grasos en la composicion son aldehfdos grasos ramificados. En algunos casos, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los aldehfdos grasos de cadena ramificada en la composicion producida por la celula microbiana son aldehfdos grasos anteiso-ramificados o aldehfdos grasos iso- ramificados. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l de aldehfdos grasos de cadena ramificada o aldehfdos grasos anteiso-ramificados o aldehfdos grasos iso-ramificados cuando se cultivan en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

En algunos casos del primer aspecto o del segundo aspecto, la enzima derivada de acidos grasos comprende actividad biosintetica de alcoholes grasos y el derivado de acidos grasos de cadena ramificada producido por la celula microbiana recombinante es un alcohol graso ramificado. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce una composicion de alcohol graso que comprende alcoholes grasos de cadena lineal y alcoholes grasos de cadena ramificada, comprendiendo los alcoholes grasos ramificados alcoholes grasos anteiso- ramificados y alcoholes grasos iso-ramificados.

En algunos casos, al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los alcoholes grasos en la composicion son alcoholes grasos ramificados. En algunos casos, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los alcoholes grasos de cadena ramificada en la composicion producida por la celula microbiana son alcoholes grasos anteiso-ramificados o alcoholes grasos iso-ramificados. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l de alcoholes grasos de cadena ramificada o alcoholes grasos anteiso-ramificados o alcoholes grasos iso-ramificados cuando se cultivan en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

En algunos casos del primer aspecto o del segundo aspecto, la enzima derivada de acidos grasos comprende actividad biosintetica de hidrocarburos y el derivado de acidos grasos de cadena ramificada producido por la celula microbiana recombinante es un hidrocarburo ramificado, tal como un alcano ramificado, una olefina terminal ramificada o una olefina interna ramificada. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce una composicion de hidrocarburos que comprende hidrocarburos de cadena lineal e hidrocarburos de cadena ramificada, comprendiendo los hidrocarburos ramificados hidrocarburos anteiso-ramificados e hidrocarburos iso-ramificados. En algunos casos, al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los hidrocarburos en la composicion son hidrocarburos ramificados. En algunos casos, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los hidrocarburos de cadena ramificada en la composicion producida por la celula microbiana son hidrocarburos anteiso-ramificados o hidrocarburos iso-ramificados. En algunos casos, la celula microbiana recombinante produce al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l de hidrocarburos de cadena ramificada o hidrocarburos anteiso- ramificados o hidrocarburos iso-ramificados cuando se cultivan en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

En diversas realizaciones de la invencion, la fuente de carbono comprende un monosacarido, un disacarido o un oligosacarido. En realizaciones mas preferidas, la fuente de carbono comprende un monosacarido, preferentemente, una hexosa o una pentosa, preferentemente, una hexosa, tal como glucosa. En algunas realizaciones, la fuente de carbono se obtiene de biomasa, tal como un hidrolizado celulosico. En otras realizaciones, la fuente de carbono

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comprende un acido carboxflico de cadena corta ramificada, tal como isobutirato, isovalerato o 2-metil-butirato.

En diversas realizaciones de la invencion, la celula hospedadora (por ejemplo, parental) es un hongo filamentoso, un alga, una levadura o un procariota, tal como una bacteria. En realizaciones mas preferidas, la celula hospedadora es una celula bacteriana. En realizaciones particulares, la celula hospedadora es una celula de E. coli o una celula de Bacillus, preferentemente, una celula de E. coli.

En una realizacion de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, que se categoriza como EC 1.2.4.4. En algunas realizaciones, el polipeptido que tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada tiene una subunidad alfa y una subunidad beta, codificado por un gen bkdA y bkdB, un gen bkdAA y bkdAB o un gen Pput_1453 y Pput_1452. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada comprende una subunidad alfa y una subunidad beta. En algunas realizaciones, la subunidad alfa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9,11 y 13 o un fragmento o una variante de las mismas o comprende uno o mas motivos seleccionados entre las SEQ ID NO: 15-21, en la que la subunidad alfa combinada con una subunidad beta tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada y que, cuando se combina con un polipeptido que tiene actividad lipoamida aciltransferasa y un polipeptido que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa, cataliza la conversion de un alfa-cetoacido ramificado en una acil-CoA ramificada in vitro o in vivo, preferentemente in vivo. En algunas realizaciones, la subunidad beta comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28, 30, 32 y 34 o un fragmento o una variante de las mismas o comprende uno o mas motivos seleccionados entre las SEQ ID NO: 36-42, en la que la subunidad beta combinada con una subunidad alfa tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada y que, cuando se combina con un polipeptido que tiene actividad lipoamida aciltransferasa y un polipeptido que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa, cataliza la conversion de un alfa-cetoacido ramificado en una acil-CoA ramificada in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En una realizacion de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad lipoamida aciltransferasa, que se categoriza como EC 2.3.1.168. En algunas realizaciones, el polipeptido que tiene actividad lipoamida aciltransferasa esta codificado por un gen bkdB, bkdC o Pput_1451. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad lipoamida aciltransferasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad lipoamida aciltransferasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otras realizaciones, el polipeptido que tiene actividad lipoamida aciltransferasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO:43, 45,47, 49, 51, 53 y 55 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad lipoamida aciltransferasa o comprende uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre las SEQ ID NO:57-62 y que, cuando se combina con un polipeptido que tiene actividad dihidrolipoamina deshidrogenasa y un polipeptido que tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, cataliza la conversion de un alfa-cetoacido ramificado en una acil-CoA ramificada in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En una realizacion de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad lipoamida deshidrogenasa, que se categoriza como EC 1.81.4. En algunas realizaciones, el polipeptido que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa esta codificado por un gen IpdV, un gen Pput_1450 o un gen IpdA. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa comprende una secuencia seleccionada entre las sEq ID NO:63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 y 77 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa o comprende uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre las SEQ ID NO:79-83 y que, cuando se combina con un polipeptido que tiene actividad lipoamida aciltransferasa y un polipeptido que tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, cataliza la conversion de un alfa-cetoacido ramificado en una acil-CoA ramificada in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

La celula microbiana recombinante de la invencion comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa y utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato, preferentemente, una actividad beta-cetoacil-ACP sintasa III categorizada como EC 2.3.1.180. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa esta codificado por un gen fabH. En una realizacion, el

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polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor fuerte, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98,100,102,104,106 y 108 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa o comprende uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre las SEQ ID NO: 110-115 y que cataliza la condensacion de una acil-CoA ramificada con malonil-ACP para formar una acil-ACP ramificada in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En una realizacion de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende una secuencia de polinucleotidos endogena (tal como un gen fabH endogeno) que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que no utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato y se atenua la expresion de la secuencia de polinucleotidos endogena en la celula microbiana recombinante. En algunas realizaciones, la expresion del polinucleotido endogeno se atenua mediante la eliminacion de la totalidad o parte del polinucleotido endogeno en la celula microbiana recombinante.

En otra realizacion de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende una secuencia de polinucleotidos endogena (tal como un gen fadE endogeno) que codifica un polipeptido que tiene actividad acil-CoA deshidrogenasa y se atenua la expresion del polinucleotido endogeno en la celula microbiana recombinante. En algunas realizaciones, la expresion del polinucleotido endogeno se atenua mediante la eliminacion de la totalidad o parte del polinucleotido endogeno en la celula microbiana recombinante.

En una realizacion, la celula microbiana recombinante de acuerdo con el segundo aspecto comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad aspartocinasa, que se categoriza como EC 2.7.2.4. En algunas realizaciones, el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa esta codificado por un gen thrA, dapG o hom3. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO:116,118,120,122,124 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad aspartocinasa y que cataliza la conversion de aspartato a fosfato de aspartilo in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En una realizacion de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad homoserina deshidrogenasa, que se categoriza como EC 1.11.3. En algunas realizaciones, el polipeptido que tiene actividad homoserina deshidrogenasa esta codificado por un gen thrA, hom o hom6. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad homoserina deshidrogenasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad homoserina deshidrogenasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad homoserina deshidrogenasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID nO:1 16,118,126,128 y 130 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad homoserina deshidrogenasa y que cataliza la conversion de aspartato semialdehfdo a homoserina in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En una realizacion particular de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad aspartocinasa y homoserina deshidrogenasa. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa y homoserina deshidrogenasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa y homoserina deshidrogenasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa y homoserina deshidrogenasa comprende la secuencia de SEQ ID NO: 116 o una variante o fragmento de la misma, tal como la SEQ ID NO: 118, que cataliza la conversion de aspartato a fosfato de aspartilo y la conversion de aspartato semialdehfdo a homoserina in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

Ademas, en el presente documento se describe una celula microbiana recombinante de acuerdo con el segundo aspecto que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad homoserina cinasa, que se categoriza como EC 2.7.1.39. En algunos aspectos, el polipeptido que tiene actividad homoserina cinasa esta codificado por un gen thrB o un gen thrl. En un aspecto, el polipeptido que tiene actividad homoserina cinasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otro aspecto, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad homoserina cinasa se modula en la celula

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microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otro aspecto, el polipeptido que tiene actividad homoserina cinasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO:132,l34,136,138 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad homoserina cinasa y que cataliza la conversion de homoserina a O-fosfo-L-homoserina in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

Ademas, en el presente documento se describe una celula microbiana recombinante de acuerdo con el segundo aspecto que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad treonina sintasa, que se categoriza como Ec 4.2.3.1. En un aspecto, el polipeptido que tiene actividad treonina sintasa esta codificado por un gen thrC. En un aspecto, el polipeptido que tiene actividad treonina sintasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otro aspecto, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad treonina sintasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otro aspecto, el polipeptido que tiene actividad treonina sintasa comprende una secuencia seleccionada entre las sEq ID NO:140,143,144 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad treonina sintasa y que cataliza la conversion de O-fosfo-L-homoserina a treonina in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

Ademas, en el presente documento se describe una celula microbiana recombinante de acuerdo con el segundo aspecto que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad treonina desaminasa, que se categoriza como EC 4.3.1.19. En algunos aspectos, el polipeptido que tiene actividad treonina desaminasa esta codificado por un gen tdcB o un gen ilvA. En un aspecto, el polipeptido que tiene actividad treonina desaminasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otro aspecto, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad treonina desaminasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otro aspecto, el polipeptido que tiene actividad treonina desaminasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ Id NO:146, 148, 150, 152 y 154 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad treonina desaminasa y que cataliza la conversion de treonina a 2-cetobutirato in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En una realizacion de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad (R)-citramalato sintasa, que se categoriza como EC 2.3.1.182. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad (R)-citramalato sintasa esta codificado por un gen cimA. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad (R)-citramalato sintasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad (R)-citramalato sintasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad (R)-citramalato sintasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO:156,158,160 y 162 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad (R)-citramalato sintasa y que cataliza la reaccion de acetil-CoA y piruvato a (R)-citramalato in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En una realizacion de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad isopropilmalato isomerasa, que se categoriza como EC 4.2.1.33. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad isopropilmalato isomerasa comprende una subunidad mayor y una subunidad menor codificadas por genes leuCD. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad isopropilmalato isomerasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad isopropilmalato isomerasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad isopropilmalato isomerasa comprende una subunidad mayor y una subunidad menor. En otras realizaciones, el polipeptido que tiene actividad isopropilmalato isomerasa comprende una secuencia de subunidad mayor seleccionada entre las SEQ ID NO:164 y 168 y una secuencia de subunidad menor seleccionada entre las SEQ ID NO:166 y 170 o variantes o fragmentos del mismo que tienen actividad isopropilmalato isomerasa y que cataliza la conversion de (R)-citramalato a citraconato y de citraconato a beta-metil-D-malato in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En una realizacion de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa, que se categoriza como EC 1.1.1.85. En algunas realizaciones, el polipeptido que tiene actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa esta codificado por un gen leuB o un gen leu2. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se

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sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad beta- isopropilmalato deshidrogenasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO:172,174,176 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa y que cataliza la conversion de beta-metil-D-malato a 2-cetobutirato in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En un aspecto, la celula microbiana recombinante de acuerdo con el segundo aspecto comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido sintasa, que se categoriza como EC 2.2.1.6. En algunos aspectos, el polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido sintasa comprende una subunidad mayor y una subunidad menor codificadas por genes ilvBN, genes ilvGM o genes ilvIH. En un aspecto, el polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido sintasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otro aspecto, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido sintasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otro aspecto, el polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido sintasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID

NO:178,180,182,184,186,188,190 y 192 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad acetohidroxiacido sintasa y que cataliza la conversion de 2-cetobutirato a 2-ceto-3-metilvalerato in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En un aspecto, la celula microbiana recombinante de acuerdo con el segundo aspecto comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa, que se categoriza como EC 1.1.1.86. En algunos aspectos, el polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa esta codificado por un gen ilvC o un gen ilv5. En un aspecto, el polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otro aspecto, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otro aspecto, el polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO:194 y 196 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa y que cataliza la conversion de 2-aceto-2-hidroxibutirato a 2,3-dihidroxi-3-metilvalerato in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En un aspecto, la celula microbiana recombinante de acuerdo con el segundo aspecto comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad dihidroxiacido deshidratasa, que se categoriza como EC 4.2.1.9. En algunos aspectos, el polipeptido que tiene actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa esta codificado por un gen ilvD o un gen ilv3. En un aspecto, el polipeptido que tiene actividad dihidroxiacido deshidratasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad dihidroxiacido deshidratasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otro aspecto, el polipeptido que tiene actividad dihidroxiacido deshidratasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO:198 y 200 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad dihidroxiacido deshidratasa y que cataliza la conversion de 2,3-dihidroxi-3-metilvalerato a 2-ceto-3-metilvalerato in vitro o in vivo, preferentemente in vivo.

En otros aspectos, una celula microbiana recombinante de acuerdo con el primer aspecto o el segundo aspecto comprende ademas uno o mas polinucleotidos que codifican uno o mas polipeptidos que tienen cada uno actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos grasos de cadena ramificada cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono.

Como se describe en el presente documento, la actividad de enzima derivada de acidos grasos puede comprender una actividad tioesterasa, una actividad ester sintasa, una actividad biosintetica de aldehfdos grasos, una actividad biosintetica de alcoholes grasos, una actividad biosintetica de cetonas y/o una actividad biosintetica de hidrocarburos. En algunas realizaciones de la invencion, la celula microbiana recombinante comprende polinucleotidos que codifican dos o mas polipeptidos, teniendo cada polipeptido actividad de enzima derivada de acidos grasos. En realizaciones particulares, la celula microbiana recombinante expresa o sobreexpresa uno o mas peptidos que tienen una actividad enzimatica derivada de acidos grasos seleccionada entre: (1) un polipeptido que tiene actividad tioesterasa; (2) un polipeptido que tiene actividad descarboxilasa; (3) un polipeptido que tiene actividad de acido carboxflico reductasa; (4) un polipeptido que tiene actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1); (5) un polipeptido que tiene actividad aldehfdo descarbonilasa (EC 4.1.99.5); (6) un polipeptido que tiene actividad acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50); (7) un polipeptido que tiene actividad acil-ACP reductasa; (8) un polipeptido que tiene actividad ester sintasa (EC 3.1.1.67); (9) un polipeptido que tiene actividad OleA; o (10) un polipeptido que tiene actividad OleCD u OleBCD; en el que la celula microbiana recombinante produce una composicion que comprende acidos grasos anteiso-ramificados, esteres grasos anteiso-ramificados, esteres de cera anteiso- ramificados, aldehfdos grasos anteiso-ramificados, alcoholes grasos anteiso-ramificados, alcanos anteiso- ramificados, alquenos anteiso-ramificados, olefinas internas anteiso-ramificadas, olefinas terminales anteiso- ramificadas o cetonas anteiso-ramificadas.

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En una realizacion de la invencion, la actividad de la enzima derivada de acidos grasos es una actividad tioesterasa y el derivado de acido graso de cadena anteiso-ramificada es un acido graso de cadena anteiso-ramificada, en el que un cultivo que comprende la celula microbiana recombinante produce una composicion de acido graso de cadena anteiso-ramificada cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono. En algunas realizaciones, el polipeptido tiene una actividad tioesterasa, que se categoriza como EC 3.1.1.5, EC 3.1.2.- o EC 3.1.2.14. En algunas realizaciones, el polipeptido que tiene una actividad tioesterasa esta codificado por un gen tesA, tesB, fatA, o fatB. En una realizacion, el polipeptido que tiene actividad tioesterasa es endogeno para la celula microbiana parental o es exogeno para la celula microbiana parental. En otra realizacion, la expresion del polinucleotido que codifica el polipeptido que tiene actividad tioesterasa se modula en la celula microbiana recombinante. En algunos casos, la expresion del polinucleotido se modula uniendo operativamente el polinucleotido a un promotor exogeno, de tal forma que el polinucleotido se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante. En otra realizacion, el polipeptido que tiene actividad tioesterasa comprende una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222 y 224 o una variante o un fragmento del mismo que tiene actividad tioesterasa y que cataliza la hidrolisis de una acil-ACP ramificada en un acido graso ramificado o cataliza la alcoholisis de una acil- ACP ramificada en un ester de acido graso, in vitro o in vivo, preferentemente in vivo. En algunas realizaciones, la celula microbiana recombinante, que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad tioesterasa, cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono, produce al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l de acidos grasos de cadena anteiso-ramificada cuando se cultiva en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. Como adicionalmente se describe en el presente documento, la celula microbiana recombinante de acuerdo con el primer aspecto o el segundo aspecto, que ademas comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad tioesterasa, produce una composicion de acido graso que comprende acidos grasos de cadena lineal y acidos grasos de cadena ramificada, comprendiendo los acidos grasos ramificados acidos grasos anteiso-ramificados y acidos grasos iso-ramificados. En algunos aspectos, al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los acidos grasos en la composicion son acidos grasos ramificados. En algunos aspectos, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% de los acidos grasos de cadena ramificada en la composicion producida por la celula microbiana son acidos grasos anteiso-ramificados.

En un tercer aspecto, en el presente documento se describe un procedimiento para producir una composicion que comprende un derivado de acido graso ramificado, comprendiendo el procedimiento: obtener una celula microbiana recombinante que comprende: (a) polinucleotidos que codifican un complejo deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD), que comprende polipeptidos que tienen actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, actividad lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa y (b) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato, en la que al menos un polinucleotido de acuerdo con (a) o (b) codifica un polipeptido que es exogeno para la celula microbiana parental o se modula la expresion de dicho polinucleotido en la celula microbiana recombinante; comprendiendo ademas la celula microbiana recombinante uno o mas polinucleotidos que codifican cada uno un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos grasos de cadena ramificada cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos; cultivar la celula microbiana recombinante en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos y producir una composicion de derivados de acidos grasos que comprende derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos ramificados y opcionalmente, recuperar la composicion del medio de cultivo.

En algunos aspectos, la composicion de derivado de acidos grasos producida por la celula recombinante comprende derivados de acidos grasos ramificados, en la que al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% en peso de los derivados de acidos grasos en la composicion son derivados de acidos grasos ramificados. En algunos aspectos, la composicion de derivados de acidos grasos comprende derivados de acidos grasos ramificados en una cantidad (por ejemplo, un tftulo) de al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l.

En diversos aspectos, la actividad de enzima derivada de acidos grasos comprende una actividad tioesterasa, una actividad ester sintasa, una actividad biosintetica de aldehfdos grasos, una actividad biosintetica de alcoholes grasos, una actividad biosintetica de cetonas y/o una actividad biosintetica de hidrocarburos. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende polinucleotidos que codifican dos o mas polipeptidos, teniendo cada polipeptido actividad de enzima derivada de acidos grasos. En aspectos mas particulares, la celula microbiana recombinante expresa o sobreexpresa uno o mas peptidos que tienen una actividad enzimatica derivada de acidos grasos seleccionada entre: (1) un polipeptido que tiene actividad tioesterasa; (2) un polipeptido que tiene actividad descarboxilasa; (3) un polipeptido que tiene actividad de acido carboxflico reductasa; (4) un polipeptido que tiene actividad alcohol deshidrogenasa (Ec 1.1.1.1); (5) un polipeptido que tiene actividad aldehfdo descarbonilasa (EC 4.1.99.5); (6) un polipeptido que tiene actividad acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50); (7) un polipeptido que tiene

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actividad acil-ACP reductasa; (8) un polipeptido que tiene actividad ester sintasa (EC 3.1.1.67); (9) un polipeptido que tiene actividad OleA; o (10) un polipeptido que tiene actividad OleCD u OleBCD; en la que la celula microbiana recombinante produce una composicion que comprende acidos grasos ramificados, esteres grasos ramificados, esteres de cera ramificados, aldehfdos grasos ramificados, alcoholes grasos ramificados, alcanos ramificados, alquenos ramificados, olefinas internas ramificadas, olefinas terminales ramificadas o cetonas ramificadas.

En algunos aspectos, la composicion de derivado de acidos grasos producida por la celula recombinante comprende derivados de acidos grasos ramificados, en la que al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% en peso de los derivados de acidos grasos en la composicion son derivados de acidos grasos ramificados. En algunos aspectos, la composicion de derivados de acidos grasos comprende derivados de acidos grasos ramificados en una cantidad (por ejemplo, un tftulo) de al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l. En algunos aspectos, la composicion de derivado de acidos grasos producida por el cultivo de celulas microbianas recombinantes comprende derivados de acidos grasos iso- ramificados, en la que al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% o al menos un 80% en peso de los derivados de acidos grasos ramificados en la composicion son derivados de acidos grasos iso-ramificados.

En un cuarto aspecto, en el presente documento se describe un procedimiento para producir una composicion que comprende un derivado de acido graso anteiso-ramificado, comprendiendo el procedimiento: obtener una celula microbiana recombinante (tal como un cultivo que comprende una celula microbiana recombinante) que comprende: (a) polinucleotidos que codifican un complejo deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD), que comprende polipeptidos que tienen actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, actividad lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa y (b) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato y que comprende (c) polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa, actividad treonina sintasa y actividad treonina desaminasa, o (d) polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa y actividad beta-isopropil malato deshidrogenasa o (c) y (d); y (e) polipeptidos que tienen actividad acetohidroxiacido sintasa, actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa y actividad dihidroxiacido deshidratasa; en el que al menos un polinucleotido de acuerdo con (a), (b), (c), (d) o (e) codifica un polipeptido que es exogeno para la celula microbiana recombinante o se modula la expresion de dicho polinucleotido en la celula microbiana recombinante; comprendiendo ademas la celula microbiana recombinante uno o mas polinucleotidos que codifican cada uno un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos grasos de cadena anteiso-ramificada cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos; cultivar la celula microbiana recombinante en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos y producir una composicion de derivados de acidos grasos que comprende derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos ramificados, comprendiendo lo derivados de acidos grasos ramificados derivados de acidos grasos anteiso-ramificados y derivados de acidos grasos iso-ramificados; y opcionalmente, recuperar la composicion del medio de cultivo.

En diversos aspectos, la actividad de enzima derivada de acidos grasos comprende una actividad tioesterasa, una actividad ester sintasa, una actividad biosintetica de aldehfdos grasos, una actividad biosintetica de alcoholes grasos, una actividad biosintetica de cetonas y/o una actividad biosintetica de hidrocarburos, como se ha descrito anteriormente en el presente documento; en el que la celula microbiana recombinante produce una composicion que comprende acidos grasos anteiso-ramificados, esteres grasos anteiso-ramificados, esteres de cera anteiso- ramificados, aldehfdos grasos anteiso-ramificados, alcoholes grasos anteiso-ramificados, alcanos anteiso- ramificados, alquenos anteiso-ramificados, olefinas terminales anteiso-ramificadas o cetonas anteiso-ramificadas.

En algunos aspectos, la composicion de derivado de acidos grasos producida por la celula recombinante comprende derivados de acidos grasos ramificados, en la que al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% en peso de los derivados de acidos grasos en la composicion son derivados de acidos grasos ramificados. En algunas realizaciones, la composicion de derivados de acidos grasos comprende derivados de acidos grasos ramificados en una cantidad (por ejemplo, un tftulo) de al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l. En algunos aspectos, la composicion de derivado de acidos grasos producida por el cultivo de celulas microbianas recombinantes comprende derivados de acidos grasos anteiso-ramificados, en la que al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% o al menos un 80% en peso de los derivados de acidos grasos ramificados en la composicion son derivados de acidos grasos anteiso-ramificados. En algunos aspectos, la composicion de derivados de acidos grasos comprende derivados de acidos grasos anteiso-ramificados en una cantidad (por ejemplo, un tftulo) de al menos 10 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1000 mg/l o al menos 2000 mg/l.

Estos y otros objetos y caracterfsticas de la divulgacion seran mas facilmente evidentes cuando la siguiente descripcion detallada se lea junto con las figuras adjuntas.

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Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 representa una via biosintetica de acidos grasos de cadena ramificada (AGCR) como se describe en el presente documento.

Las figuras 2A y 2B representan intermedios y productos ilustrativos de la via biosintetica de AGCR cuando se suministra con las moleculas de acil-CoA ramificadas (A) 2-metil-butiril-CoA, que genera el intermedio de p-cetoacil- ACP anteiso-ramificado, 4-metil-3-oxo-hexanoil-ACP, que da lugar a la produccion de derivados de acidos grasos anteiso-ramificados y (B) isobutiril-CoA, que genera el intermedio de p-cetoacil-ACP iso-ramificado, 4-metil-3-oxo- pentanoil-ACP, que da lugar a la produccion de derivados de acidos grasos iso-ramificados. Asimismo, la molecula de acil-CoA ramificada, isovaleril-CoA puede producir derivados de acidos grasos iso-ramificados por medio del intermedio de p-cetoacil-ACP iso-ramificado, 5-metil-3-oxo-hexanoil-ACP.

Las figuras 3A y 3B representan una via biosintetica de anteiso-AGCR como se describe en el presente documento.

La figura 4 muestra trazados representativos de CG-EM de (a) acidos grasos producidos por una cepa de E. coli que expresa un polipeptido TesA sin lfder y protefna FabHI de B. subtilis, en comparacion con (b) acidos grasos producidos por la misma cepa de E. coli que no expresa la protefna FabHI de B. subtilis. Los picos correspondientes a acidos grasos C14 de cadena iso-ramificada, acidos grasos C14 monoinsaturados de cadena lineal y acidos grasos C14 saturados de cadena lineal producidos por estas cepas se marcan como "iso-C1C14:0", "C1C14:1" y "C1C14:1", respectivamente, debido al procedimiento de derivatizacion de TMAH empleado, que convirtio los acidos grasos en metil esteres de acidos grasos antes del analisis por CG/EM.

La figura 5 muestra un trazado de CG/EM representativo de acidos grasos producidos por una cepa de E. coli que expresa un polipeptido TesA sin lfder, complejo BKD de B. subtilis y FabH1 de B. subtilis. Los picos correspondientes a acidos grasos iso-ramificados ("i-"), anteiso-ramificados ("a-"), monoinsaturados (Cn:1) y saturados (Cn:0) con una longitud de cadena (Cn) de C13 a C17 se marcan de manera correspondiente.

La figura 6 muestra un trazado de CG/EM representativo de acidos grasos producidos por una cepa de E. coli que expresa un polipeptido TesA sin lfder, complejo BKD de P. putida y FabH1 de B. subtilis. Los picos correspondientes a acidos grasos iso-ramificados ("i-"), anteiso-ramificados ("a-"), monoinsaturados (Cn:1) y saturados (Cn:0) con una longitud de cadena (Cn) de C13 a C17 se marcan de manera correspondiente.

La figura 7 muestra trazados de CG/EM representativos de alcoholes grasos producidos por cepas de E. coli que expresan (A) AAR de S. elongatus, mas plasmidos que expresan el complejo BKD de P. putida y FabH1 de B. subtilis y (B) la misma cepa de E. coli que expresa Aar de S. elongatus pero que carece de los plasmidos que expresan BKD y FabH1. Los picos que representan alcoholes grasos ramificados se encuentran recuadrados.

Descripcion detallada

Ha de entenderse que la terminologfa usada en el presente documento tiene el fin unico de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el ambito de la presente invencion.

Numeros de acceso: Los numeros de acceso de secuencia a lo largo de la presente descripcion se obtuvieron de bases de datos proporcionadas por el NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantenida por el National Institute of Health, EE. UU. (que se identifican en el presente documento como "numeros de acceso del NCBI" o como alternativa, como "numeros de acceso de GenBank") y de las bases de datos UniProt Knoledgebase (UniProtKB) y Swiss-Prot proporcionadas por el Swiss Institute of Bioinformatics (que se identifican en el presente documento como "numeros de acceso de UniProtKB"). A menos que se indique expresamente lo contrario, la secuencia identificada por un numero de acceso de NCBI/GenBank es la version numero 1 (es decir, el numero de version de la secuencia es el "numero de acceso 1"). Los numeros de acceso de NCBI y UniProtKB proporcionados en el presente documento fueron los vigentes a 31 de marzo de 2011.

Numeros de clasificacion de enzimas (EC): Los numeros de EC vienen determinados por el Comite de Nomenclatura de la Union Internacional de Bioqufmica y Biologfa Molecular (IUBMB), cuya descripcion se encuentra disponible en el sitio web de nomenclatura de enzimas de la IUBMB disponible en Internet. Los numeros EC clasifican enzimas segun la reaccion catalizada. Los numeros EC citados en el presente documento proceden de la base de datos KEGG Ligand, mantenida por la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics, patrocinada en parte por la Universidad de Tokio. A menos que se indique otra cosa, los numeros EC son como se proporcionaban en la base de datos KEGG a 31 de marzo de 2011.

A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado entendido por una persona normalmente versada en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque pueden usarse cualesquiera materiales y procedimientos similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o prueba de la invencion, a continuacion se describen composiciones y procedimientos preferidos.

Definiciones

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Tal como se usa en el presente documento, la expresion "acido graso" significa un acido carboxflico que tiene la formula R(C=O)OH. R representa un grupo alifatico, preferentemente un grupo alquilo, que puede comprender entre aproximadamente 4 y aproximadamente 22 atomos de carbono. Los acidos grasos pueden estar saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. En caso de estar insaturados, R puede tener uno o mas puntos de insaturacion. R puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada. La cadena ramificada puede tener uno o mas puntos de ramificacion. La cadena ramificada puede tener una conformacion iso o anteiso.

La expresion "acido graso ramificado" es sinonima de "acido graso de cadena ramificada" y se abrevia en el presente documento como "AGCR". Asimismo, la expresion "derivado de acido graso ramificado" es sinonima de "derivado acido graso de cadena ramificada" y se abrevia en el presente documento como "derivado de AGCR". Tal como se usa en el presente documento, la expresion "aldehfdo de cadena ramificada" es sinonima de "aldehfdo de acido graso ramificado", "aldehfdo graso de cadena ramificada" y "aldehfdo de acido graso de cadena ramificada"; la expresion "alcohol graso ramificado" es sinonima de "alcohol de acido graso ramificado", "alcohol graso de cadena ramificada" y "alcohol de acido graso de cadena ramificada"; la expresion "ester graso ramificado" es sinonima de "ester de acido graso ramificado", "ester graso de cadena ramificada" y "ester de acido graso de cadena ramificada"; y asf sucesivamente. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "hidrocarburo ramificado" es sinonima de "hidrocarburo de cadena ramificada", "alcano ramificado" es sinonima de "alcano de cadena ramificada" y asf sucesivamente.

Tal como se usa en el presente documento, una cadena "iso-" ramificada se refiere a una estructura de hidrocarburo ramificada que tiene un metilo en el penultimo atomo de carbono, mientras que una cadena "anteiso-" ramificada se refiere a una estructura de hidrocarburo ramificada que tiene un metilo en el tercer atomo de carbono desde el extremo.

La expresion "p-cetoacil-ACP ramificada", tal como se usa en el presente documento, se refiere al producto de condensacion de una molecula "cebadora" de una acil-CoA ramificada con malonil-ACP catalizada por una enzima beta-cetoacil-ACP sintasa III (es decir, FabH) representada por la parte (D) de la via de AGCR en las figuras 1,2 y 3. Esta molecula inicial de p-cetoacil-ACP ramificada entra en el ciclo de la sintasa de acidos grasos (FAS), representada en la parte (E) de la figura 1, en el que se somete a una ronda de ceto reduccion, deshidratacion y reduccion de enoflo, formando una molecula de acil-ACP ramificada que despues se condensa con otra molecula de malonil-ACP, seguido de otro ciclo de ceto reduccion, deshidratacion y reduccion de enoflo, elongando la cadena de acilo de la acil-ACP ramificada en dos unidades de carbono por ciclo. El producto de elongacion de "acil-ACP ramificada" es un tioester de acilo formado entre el carbono de carbonilo de una cadena de alquilo ramificada y el grupo sulfhidrilo del resto de 4'-fosfopantetionilo de una protefna transportadora de acilo (ACP) y, tal como se usa en el presente documento, normalmente tiene la formula R-C(O)S-ACP, en la que R es un grupo alquilo ramificado que puede encontrarse en la configuracion "iso-" o "anteiso-". La acil-ACP ramificada es un intermedio en la produccion de acidos grasos de cadena ramificada y derivados de acidos grasos de cadena ramificada por las vfas de AGCR descritas en el presente documento.

A menos que se especifique otra cosa, se pretende que un "derivado de acido graso" incluya cualquier producto formado, al menos en parte, por la via biosintetica del acido graso de la celula microbiana recombinante. Un derivado de acido graso tambien incluye cualquier producto formado, al menos en parte, por un intermedio de la via del acido graso, tal como un intermedio de acil-ACP. Las vfas biosinteticas de acidos grasos descritas en el presente documento pueden incluir enzimas de vfas de acidos grasos que pueden modificarse por ingenierfa genetica para producir derivados de acidos grasos y en algunos casos, pueden expresarse enzimas adicionales para producir derivados de acidos grasos que tienen caracterfsticas de la cadena de carbono deseadas, tales como, por ejemplo, acidos grasos de cadena ramificada y derivados de acidos grasos ramificados (incluyendo, por ejemplo, acidos grasos anteiso-ramificados y derivados de los mismos) producidos por las enzimas de las vfas biosinteticas de acidos grasos de cadena ramificada descritas en el presente documento. Los derivados de acidos grasos incluyen, pero sin limitacion, acidos grasos, aldehfdos grasos, alcoholes grasos, esteres grasos (tales como ceras), hidrocarburos (tales como alcanos y alquenos (por ejemplo, olefinas terminales y olefinas internas)) y cetonas.

Asimismo, a menos que se especifique otra cosa, se pretende que un "derivado de acido graso ramificado" incluya cualquier producto formado, al menos en parte, por una via biosintetica de acidos grasos ramificados (es decir, via de AGCR) de una celula microbiana recombinante descrita en el presente documento. Un derivado de acido graso ramificado tambien incluye cualquier producto formado, al menos en parte, a partir de un intermedio de la via del AGCR, tal como un intermedio de acil-ACP ramificado. Los derivados de acidos grasos ramificados incluyen, pero sin limitacion, acidos grasos ramificados, aldehfdos grasos ramificados, alcoholes grasos ramificados, esteres grasos ramificados (tales como ceras), hidrocarburos ramificados (tales como alcanos ramificados y alquenos ramificados (por ejemplo, olefinas terminales ramificadas y olefinas internas ramificadas)) y cetonas ramificadas.

Un polipeptido "endogeno" (por ejemplo, un polipeptido "endogeno" para una celula microbiana recombinante), se refiere a un polipeptido codificado por el genoma de la celula progenitora (es decir, hospedadora) a partir de la cual se modifica por ingenierfa genetica la celula.

Un polipeptido "exogeno" se refiere a un polipeptido que no esta codificado por el genoma de la celula microbiana progenitora. Un polipeptido variante (es decir, mutante) es un ejemplo de un polipeptido endogeno.

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En las realizaciones de la invencion en las que la secuencia de polinucleotidos recombinante codifica un polipeptido endogeno, en algunos casos, el polipeptido endogeno esta sobreexpresado. La sobreexpresion puede lograrse por cualquier medio adecuado. Tal como se usa en el presente documento, "sobreexpresar" significa expresar o provocar la expresion de un polinucleotido o un polipeptido en una celula a una concentracion mayor a la que normalmente se expresa en una celula hospedadora correspondiente (por ejemplo, de tipo silvestre) en las mismas condiciones. Por ejemplo, un polinucleotido puede "sobreexpresarse" en una celula microbiana recombinante cuando el polinucleotido esta presente en una concentracion mayor en la celula microbiana recombinante en comparacion con su concentracion en una celula microbiana no recombinante de la misma especie en las mismas condiciones.

La expresion "aumentar el nivel de expresion de un polipeptido endogeno" significa provocar la sobreexpresion de una secuencia de polinucleotido que codifica el polipeptido endogeno o provocar la sobreexpresion de una secuencia de polipeptido endogena. El grado de sobreexpresion puede ser de aproximadamente 1,5 veces o mas, aproximadamente 2 veces o mas, aproximadamente 3 veces o mas, aproximadamente 5 veces o mas, aproximadamente 10 veces o mas, aproximadamente 20 veces o mas, aproximadamente 50 veces o mas, aproximadamente 100 veces o mas o cualquier intervalo intermedio.

La expresion "aumentar el nivel de actividad de un polipeptido endogeno" significa potenciar la funcion bioqufmica o biologica (por ejemplo, actividad enzimatica) de un polipeptido endogeno. El grado de actividad potenciada puede ser de aproximadamente un 10% o mas, aproximadamente un 20% o mas, aproximadamente un 50% o mas, aproximadamente un 75% o mas, aproximadamente un 100% o mas, aproximadamente un 200% o mas, aproximadamente un 500% o mas, aproximadamente un 1000% o mas o cualquier intervalo intermedio.

En algunas realizaciones, la sobreexpresion del polipeptido endogeno en la celula microbiana recombinante se logra mediante el uso de un elemento regulador exogeno. La expresion "elemento regulador exogeno" se refiere generalmente a un elemento regulador (tal como una secuencia de control de la expresion o un compuesto qufmico) que se origina fuera de la celula hospedadora. Sin embargo, en determinadas realizaciones, la expresion "elemento regulador exogeno" (por ejemplo, "promotor exogeno") puede referirse a un elemento regulador procedente de la celula hospedadora cuya funcion se replique o usurpe con el fin de controlar la expresion del polipeptido endogeno en la celula recombinante. Por ejemplo, en caso de que la celula sea una celula de E. coli y el polipeptido sea un polipeptido endogeno, puede controlarse la expresion del polipeptido endogeno en la celula recombinante mediante un promotor procedente de otro gen de E. coli. En algunas realizaciones, el elemento regulador exogeno que provoca un aumento en el nivel de expresion y/o actividad de un polipeptido endogeno es un compuesto qufmico, tal como una molecula pequena.

En algunas realizaciones, el elemento regulador exogeno que controla la expresion de un polinucleotido (por ejemplo, un polinucleotido exogeno) que codifica un polipeptido endogeno es una secuencia de control de la expresion que esta unida operativamente al polinucleotido endogeno mediante la integracion recombinante en el genoma de la celula hospedadora. En determinadas realizaciones, la secuencia de control de la expresion se encuentra integrada en un cromosoma de la celula hospedadora mediante recombinacion de homologos usando procedimientos conocidos en la tecnica (por ejemplo, Datsenko y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97(12): 66406645 (2000)).

Se conocen en la tecnica secuencias de control de la expresion e incluyen, por ejemplo, promotores, potenciadores, senales de poliadenilacion, terminadores de la transcripcion, sitios de entrada a ribosomas internos (IRES) y similares, que posibilitan la expresion de la secuencia de polinucleotidos en la celula hospedadora. Las secuencias de control de la expresion interaction especfficamente con las protefnas celulares implicadas en la transcripcion (Maniatis y col., Science, 236:1237-1245 (1987)). Se describen secuencias de control de la expresion ilustrativas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

En los procedimientos de la invencion, se une operativamente una secuencia de control de la expresion a una secuencia de polinucleotidos. Por "unido operativamente" se entiende que se conectan una secuencia de polinucleotidos y una secuencia de control de la expresion de tal forma que se permite la expresion genica cuando se unen las moleculas adecuadas (por ejemplo, protefnas activadoras de la transcripcion) a las secuencias de control de la expresion. Los promotores unidos operativamente se ubican cadena arriba de la secuencia de polinucleotidos seleccionada en terminos de la direccion de la transcripcion y la traduccion. Los potenciadores unidos operativamente pueden ubicarse cadena arriba, dentro o cadena abajo del polinucleotido seleccionado. Las secuencias de acido nucleico adicionales, tales como secuencias de acido nucleico que codifican marcadores de seleccion, restos de purificacion, protefnas de direccionamiento y similares, pueden unirse operativamente a la secuencia de polinucleotidos, de tal forma que las secuencias de acido nucleico adicionales se expresan junto con la secuencia de polipeptido.

En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleotidos se proporciona a la celula recombinante mediante un vector recombinante, que comprende un promotor unido operativamente a la secuencia de polinucleotidos. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor regulado por el desarrollo, uno especffico de organulo, uno especffico de tejido, uno inducible, uno constitutivo o uno especffico de celula.

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Tal como se usa en el presente documento, el termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico, es decir, una secuencia de polinucleotidos, a la que se ha unido. Un tipo de vector util es un episoma (es decir, un acido nucleico capaz de replicarse de manera extracromosomica). Los vectores utiles son aquellos capaces de replicarse de manera autonoma y/o de expresar los acidos nucleicos a los que estan unidos. Los vectores capaces de dirigir la expresion de los genes a los que estan unidos operativamente se citan en el presente documento como "vectores de expresion". En general, los vectores de expresion utiles en las tecnicas de ADN recombinante normalmente se encuentran en forma de "plasmidos", que se refieren en general a bucles de ADN bicatenarios circulares que, en su forma de vector, no estan unidos al cromosoma. Los terminos "plasmido" y "vector" se usan de manera indistinta en el presente documento, en tanto que un plasmido es la forma mas comunmente usada de vector. Sin embargo, tambien se incluyen otras formas similares de vectores de expresion que cumplen funciones equivalentes y que se han vuelto conocidos en la tecnica subsiguientemente a la presente.

En algunas realizaciones, el vector recombinante comprende al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en (a) una secuencia de control de la expresion unida operativamente a la secuencia de polinucleotidos; (b) un marcador de seleccion unido operativamente a la secuencia de polinucleotidos; (c) una secuencia marcadora unida operativamente a la secuencia de polinucleotidos; (d) un resto de purificacion unido operativamente a la secuencia de polinucleotidos; (e) una secuencia de secrecion unida operativamente a la secuencia de polinucleotidos; y (f) una secuencia de direccionamiento unida operativamente a la secuencia de polinucleotidos.

Los vectores de expresion descritos en el presente documento incluyen una secuencia de polinucleotidos descrita en el presente documento en una forma adecuada para la expresion de la secuencia de polinucleotidos en una celula hospedadora. Los expertos en la materia apreciaran que el diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula hospedadora que se vaya a transformar, el nivel de expresion de polipeptido deseado, etc. Los vectores de expresion descritos en el presente documento pueden introducirse en celulas de expresion para producir polipeptidos, incluyendo polipeptidos de fusion, codificados por las secuencias de polinucleotidos descritas en el presente documento.

La expresion de genes que codifican polipeptidos en procariotas, por ejemplo, E. coli, se lleva a cabo normalmente con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresion de polipeptidos de fusion o no de fusion. Los vectores de fusion anaden una serie de aminoacidos a un polipeptido codificado en los mismos, normalmente al extremo amino o carboxilo del polipeptido recombinante. Dichos vectores de fusion cumplen uno o mas de los tres fines siguientes: (1) aumentar la expresion del polipeptido recombinante; (2) aumentar la solubilidad del polipeptido recombinante; y (3) ayudar en la purificacion del polipeptido recombinante actuando como ligando en la purificacion por afinidad. A menudo, en los vectores de expresion de fusion, se introduce un sitio de escision proteolftica en la union del resto de fusion y el polipeptido recombinante. Esto permite la separacion del polipeptido recombinante a partir del resto de fusion tras la purificacion del polipeptido de fusion. Algunos ejemplos de dichas enzimas y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Algunos vectores de expresion de fusion ejemplares incluyen pGEX (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith y col., Gene, 67: 31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRITS (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N.J.), que fusionan glutation S-transferasa (GST), protefna E de union a maltosa o protefna A, respectivamente, al polipeptido recombinante diana.

Los vectores pueden introducirse en celulas procariotas o eucariotas mediante transformacion convencional o tecnicas de transfeccion. Tal como se usa en el presente documento, los terminos "transformacion" y "transfeccion" se refieren a una variedad de tecnicas reconocidas en la tecnica para introducir acido nucleico exogeno (por ejemplo, ADN) en una celula hospedadora, incluyendo coprecipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfeccion mediada por DEAE-dextrano, lipofeccion o electroporacion. Los procedimientos adecuados para transformar o transfectar celulas hospedadoras pueden encontrarse en, por ejemplo, Sambrook y col. (anteriormente citado).

Para la transformacion estable de celulas bacterianas, se sabe que, dependiendo del vector de expresion y la tecnica de transformacion empleada, solo una pequena parte de las celulas captara y replicara el vector de expresion. Para identificar y seleccionar estos transformantes, puede introducirse un gen que codifica un marcador de seleccion (por ejemplo, resistencia a un antibiotico) en las celulas hospedadoras junto con el gen de interes. Los marcadores de seleccion incluyen aquellos que confieren resistencia a farmacos, tales como, pero sin limitacion, ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los acidos nucleicos que codifican un marcador de seleccion pueden introducirse en una celula hospedadora en el mismo vector que el que codifica un polipeptido descrito en el presente documento o puede introducirse en un vector separado. Las celulas hospedadoras se transforman de manera estable con el acido nucleico introducido, dando como resultado celulas recombinantes, que pueden identificarse cultivandolas en presencia de un farmaco de seleccion adecuado.

De forma similar, para la transformacion estable de celulas de mamffero, se sabe que, dependiendo del vector de expresion y la tecnica de transfeccion empleada, solo una pequena parte de las celulas puede integrar el ADN exogeno en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, puede introducirse un gen que codifica un marcador de seleccion (por ejemplo, resistencia a un antibiotico) en las celulas hospedadoras junto con el gen de interes. Los marcadores de seleccion preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a farmacos, tales como

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G418, higromicina y metotrexato. Los acidos nucleicos que codifican un marcador de seleccion pueden introducirse en una celula hospedadora en el mismo vector que el que codifica un polipeptido descrito en el presente documento o puede introducirse en un vector separado. Las celulas hospedadoras transfectadas de manera estable con el acido nucleico introducido, dando como resultado celulas recombinantes, que pueden identificarse cultivandolas en presencia de un farmaco de seleccion adecuado.

"Supresion genica", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento mediante el cual se modifica o inactiva un gen que codifica una protefna diana a fin de reducir o eliminar la funcion de la protefna intacta. La inactivacion del gen puede llevarse a cabo mediante procedimientos generales, tales como mutagenesis por irradiacion UV o tratamiento con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, mutagenesis de sitio dirigido, recombinacion de homologos, mutagenesis por insercion-eliminacion o "integracion dirigida por Red" (Datsenko y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-45, 2000). Por ejemplo, en una realizacion, se introduce una construccion en una celula progenitora, de tal forma que es posible seleccionar los eventos de recombinacion de homologos en la celula recombinante resultante. Un experto en la materia puede disenar facilmente una construccion de supresion genica que incluye genes de seleccion tanto positiva como negativa para seleccionar de manera eficaz celulas transfectadas (es decir, recombinantes) que han sufrido un evento de recombinacion de homologos con la construccion. Puede obtenerse la alteracion en la celula progenitora, por ejemplo, reemplazando mediante una recombinacion de sobrecruzamiento sencillo o doble una secuencia de ADN de tipo silvestre (es decir, endogena) por una secuencia de ADN que contiene la alteracion. Para una seleccion conveniente de los transformantes (es decir, celulas recombinantes), la alteracion puede ser, por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica un marcador de resistencia a antibioticos o un gen que codifica una posible auxotrofia de la celula hospedadora. Las mutaciones incluyen, pero sin limitacion, mutaciones de eliminacion-insercion. Un ejemplo de dicha alteracion en una celula recombinante incluye una alteracion genica, es decir, una perturbacion de un gen, de tal forma que el producto que se produce normalmente a partir de este gen no se produce de una manera funcional. Esto puede deberse a una eliminacion completa, una eliminacion e insercion de un marcador de seleccion, una insercion de un marcador de seleccion, una mutacion de desplazamiento de fase, una eliminacion en fase o una mutacion puntual que da lugar a una terminacion prematura. En algunos casos, el ARNm completo esta ausente. En otras situaciones, varfa la cantidad de ARNm producida.

La frase "la expresion de dicha secuencia de polinucleotidos se modifica en relacion con la secuencia de polinucleotidos de tipo silvestre", tal como se usa en el presente documento, significa un aumento o una reduccion en el nivel de expresion y/o actividad de una secuencia de polinucleotidos endogena. En algunos aspectos, el elemento regulador exogeno que controla la expresion de un polinucleotido exogeno es una secuencia de control de la expresion que esta unida operativamente al polinucleotido endogeno mediante la integracion recombinante en el genoma de la celula hospedadora. En algunos aspectos, la secuencia de control de la expresion se encuentra integrada en un cromosoma de la celula hospedadora mediante recombinacion de homologos usando procedimientos conocidos en la tecnica.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "en condiciones eficaces para expresar dichas secuencias de polinucleotido" significa cualesquiera condiciones que permitan que una celula recombinante produzca un derivado de acido graso deseado. Las condiciones incluyen, por ejemplo, condiciones de fermentacion. Las condiciones de fermentacion pueden comprender muchos parametros, tales como intervalos de temperatura, niveles de aireacion y composicion del medio. cada una de estas condiciones, de manera individual y en combinacion, permite el crecimiento de la celula hospedadora. Los medios de cultivo ejemplares incluyen caldos o geles. Generalmente, el medio incluye una fuente de carbono que puede metabolizarse directamente por una celula recombinante. La fermentacion indica el uso de una fuente de carbono por un hospedador de produccion, tal como una celula microbiana recombinante de la invencion. La fermentacion puede ser aerobia, anaerobia o variaciones de las mismas (tales como micro-aerobicas). Tal como sera evidente por los expertos en la materia, las condiciones en las que una celula microbiana recombinante puede procesar una fuente de carbono en una acil-ACP ramificada o un derivado de acido graso ramificado deseado (por ejemplo, un acido graso ramificado, ester graso ramificado, aldehfdo graso ramificado, alcohol graso ramificado, alcano ramificado u olefina ramificada) variaran, en parte, basandose en el microorganismo especffico. En algunas realizaciones, el proceso se produce en un ambiente aerobio. En algunas realizaciones, el proceso se produce en un ambiente anaerobio. En algunas realizaciones, el proceso se produce en un ambiente micro-aerobio.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "fuente de carbono" se refiere a un sustrato o compuesto adecuado para su uso como fuente de carbono para el crecimiento de celulas procariotas o eucariotas simples. Las fuentes de carbono pueden variar de diversos modos, incluyendo, pero sin limitacion, polfmeros, carbohidratos, acidos, alcoholes, aldehfdos, cetonas, aminoacidos, peptidos y gases (por ejemplo,CO y CO2). Las fuentes de carbono ejemplares incluyen, pero sin limitacion, monosacaridos, tales como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, xilosa y arabinosa; oligosacaridos, tales como fructooligosacaridos y galacto-oligosacaridos; polisacaridos, tales como almidon, celulosa, pectina y xilano; disacaridos, tales como sacarosa, maltosa, celobiosa y turanosa; material celulosico y variantes, tales como hemicelulosas, metilcelulosa y carboximetilcelulosa de sodio; acidos grasos saturados o insaturados, succinato, lactato y acetato; alcoholes, tales como etanol, metanol y glicerol o mezclas de los mismos. La fuente de carbono puede ser un acido carboxflico de cadena corta ramificada, tal como isobutirato, isovalerato o 2-metil-butirato. La fuente de carbono puede ser un producto de la fotosfntesis, tal como glucosa. En determinadas realizaciones preferidas, la fuente de carbono es biomasa. En otra realizacion preferida, la fuente de

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carbono comprende sacarosa. En otra realizacion preferida, la fuente de carbono comprende glucosa.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "biomasa" se refiere a cualquier material biologico del que procede una fuente de carbono. En algunos aspectos, la biomasa se procesa en una fuente de carbono, que es adecuada para la bioconversion. En otros aspectos, la biomasa no requiere un procesado adicional en una fuente de carbono. La fuente de carbono puede convertirse en un biocombustible. Una fuente de biomasa ejemplar es material vegetal o vegetacion, tal como mafz, cana de azucar o pasto varilla. Otra fuente de biomasa ejemplar es productos de desecho metabolicos, tales como materia animal (por ejemplo, estiercol de vaca). Las fuentes ejemplares de biomasa adicionales incluyen algas y otras plantas marinas. La biomasa tambien incluye productos de desecho de origen industrial, agrfcola, silvfcola o domestico, incluyendo, pero sin limitacion, desechos de fermentacion, ensilado, paja, maderas, aguas residuales, basura, desechos celulosicos urbanos y desechos de comida. El termino "biomasa" tambien puede referirse a fuentes de carbono, tales como carbohidratos (por ejemplo, monosacaridos, disacaridos o polisacaridos).

Para determinar si las condiciones son suficientes para permitir la produccion de un producto o la expresion de un polipeptido, puede cultivarse una celula microbiana recombinante, por ejemplo, durante aproximadamente 4, 8,12, 24, 36, 48, 72 o mas horas. Durante y/o despues del cultivo, pueden obtenerse y analizarse muestras para determinar si las condiciones permiten la produccion o la expresion. Por ejemplo, puede evaluarse la presencia de un producto deseado en las celulas microbianas recombinantes en la muestra o el medio en el que se cultivaron las celulas microbianas recombinantes. Cuando se evalua la presencia de un acido graso ramificado, un ester graso ramificado, un aldehfdo graso ramificado, un alcohol graso ramificado, un hidrocarburo ramificado u otro derivado de acido graso ramificado, pueden usarse ensayos, tales como, pero sin limitacion, cromatograffa de gases (CG), espectrometrfa de masas (EM), cromatograffa en capa fina (TLC), cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC), cromatograffa lfquida (CL), CG acoplada a un detector de ionizacion de llama (FlD), CG-EM y CL-EM. Cuando se evalua la expresion de un polipeptido, pueden usarse tecnicas, tales como, pero sin limitacion, transferencia de Western y transferencia por puntos.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "microorganismo" significa especies procariotas y eucariotas de los dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, incluyendo este ultimo levaduras y hongos filamentosos, protozoos, algas y protistas superiores. Los terminos "microbios" y "celulas microbianas" (es decir, celulas de microbios) se usan de manera indistinta con "microorganismos" y se refieren a celulas u organismos pequenos que solo pueden verse con la ayuda de un microscopio.

En algunas realizaciones, la celula hospedadora es una celula microbiana. En algunas realizaciones, la celula hospedadora se selecciona entre el genero Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pantoea, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces, Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Streptomyces, Synechococcus, Chlorella o Prototheca.

En otras realizaciones, la celula hospedadora es una celula de Bacillus lentus, una celula de Bacillus brevis, una celula de Bacillus stearothermophilus, una celula de Bacillus lichenoformis, una celula de Bacillus alkalophilus, una celula de Bacillus coagulans, una celula de Bacillus circulans, una celula de Bacillus pumilis, una celula de Bacillus thuringiensis, una celula de Bacillus clausii, una celula de Bacillus megaterium, una celula de Bacillus subtilis o una celula de Bacillus amyloliquefaciens.

En otras realizaciones, la celula hospedadora es una celula de Trichoderma koningii, una celula de Trichoderma viride, una celula de Trichoderma reesei, una celula de Trichoderma longibrachiatum, una celula de Aspergillus awamori, una celula de Aspergillus fumigates, una celula de Aspergillus foetidus, una celula de Aspergillus nidulans, una celula de Aspergillus niger, una celula de Aspergillus oryzae, una celula de Humicola insolens, una celula de Humicola lanuginose, una celula de Rhodococcus opacus, una celula de Rhizomucor miehei o una celula de Mucor michei.

En otras realizaciones mas, la celula hospedadora es una celula de Streptomyces lividans o una celula de Streptomyces murinus.

En otras realizaciones mas, la celula hospedadora es una celula de Actinomycetes.

En algunas realizaciones, la celula hospedadora es una celula de Saccharomyces cerevisiae.

En algunas realizaciones, la celula hospedadora es una celula de una planta eucariota, algas, cianobacterias, bacterias verdes del azufre, bacterias verdes no del azufre, bacterias purpuras del azufre, bacterias purpuras no del azufre, extremofilos, levaduras, hongos, un organismo disenado por ingenierfa genetica del mismo o un organismo sintetico. En algunas realizaciones, la celula hospedadora es dependiente de la luz o fija el carbono. En algunas realizaciones, la celula hospedadora tiene actividad auxotrofa. En algunas realizaciones, la celula hospedadora tiene actividad fotoautotrofa, tal como en presencia de luz. En algunas realizaciones, la celula hospedadora es heterotrofa o mixotrofa en ausencia de luz.

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En determinadas realizaciones, la celula hospedadora es una celula de Arabidopsis thaliana, Panicum virgatum, Miscanthus giganteus, Zea mays, Botryococcuse braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliela salina, Synechococcus Sp. PCC 7002, Synechococcus Sp. PCC 7942, Synechocystis Sp. PCC 6803, Thermosynechococcus elongates BP-1, Chlorobium tepidum, Chlorojlexus auranticus, Chromatiumm vinosum, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palusris, Clostridium ljungdahlii,

Clostridiuthermocellum, Penicillium chrysogenum, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pseudomonas jluorescens, Pantoea citrea o Zymomonas mobilis. En determinadas realizaciones, la celula hospedadora es una celula de Chlorella fusca, Chlorella protothecoides, Chlorella pyrenoidosa, Chlorella kessleri, Chlorella vulgaris, Chlorella saccharophila, Chlorella sorokiniana, Chlorella ellipsoidea, Prototheca stagnora, Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis, Prototheca wickerhamii o Prototheca zopfii.

En algunas realizaciones, la celula hospedadora es una celula bacteriana grampositiva. En otras realizaciones, la celula hospedadora es una celula bacteriana gramnegativa.

En determinadas realizaciones preferidas, la celula hospedadora es una celula de E. coli. En algunas realizaciones, la celula de E. coli es una cepa B, una cepa C, una cepa K o una cepa W de celulas de E. coli.

En determinadas realizaciones de la invencion, la celula hospedadora se modifica por ingenierfa genetica para expresar (o sobreexpresar) una protefna de transporte. Las protefnas de transporte pueden exportar polipeptidos y compuestos organicos (por ejemplo, acidos grasos o derivados de los mismos) de una celula hospedadora.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "modificada metabolicamente" o "ingenierfa metabolica" implica el diseno racional de la via y el ensamblaje de polinucleotidos correspondientes a los genes biosinteticos, genes asociados con operones y elementos de control de dichos polinucleotidos, para la produccion de un metabolito deseado, tales como, por ejemplo, un a-cetoacido ramificado, un p-cetoacil-ACP ramificado, un acil-ACP ramificado o un derivado de acido graso ramificado, en una celula recombinante, tal como, una celula microbiana recombinante. "Modificada metabolicamente" puede incluir, ademas, la optimizacion del flujo metabolico mediante la regulacion y optimizacion de la transcripcion, traduccion, estabilidad de protefnas y funcionalidad de protefnas usando ingenierfa genetica y condiciones de cultivo adecuadas, incluyendo la reduccion, disrupcion o supresion genica, de una via metabolica competidora que compite con un intermedio que da lugar a una via deseada. Un "gen biosintetico" puede ser nativo para la celula hospedadora (es decir, un gen que no se modifica a partir de la celula hospedadora) o, puede ser exogeno (heterologo) para la celula hospedadora ya sea por virtud de ser exogeno para la celula hospedadora o modificandose por mutagenesis, recombinacion y/o asociacion en la celula recombinante con una secuencia de control de la expresion exogena (heterologa). Un gen biosintetico codifica un "polipeptido biosintetico" o una "enzima biosintetica".

La expresion "via biosintetica", tambien denominada "via metabolica", se refiere a una serie de reacciones bioqufmicas, catalizadas por enzimas biosinteticas, que convierten una especie qufmica en otra. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "via biosintetica de acidos grasos" (o dicho de un modo mas simple, "via de acidos grasos") se refiere a un conjunto de reacciones bioqufmicas que produce derivados de acidos grasos (por ejemplo, acidos grasos, esteres grasos, aldehfdos grasos, alcoholes grasos, alcanos, alquenos, cetonas y similares). La via de acidos grasos incluye enzimas biosinteticas de vfas de acidos grasos (es decir, "enzimas de via de acidos grasos") que pueden modificarse, como se describe en el presente documento, para producir derivados de acidos grasos y en algunas realizaciones, puede expresarse con enzimas adicionales para producir derivados de acidos grasos que tienen caracterfsticas deseadas en la cadena de carbono. Por ejemplo, una "via biosintetica de acidos grasos de cadena ramificada" (es decir, una "via de AGCR") como se describe en el presente documento, incluye enzimas que son suficientes para producir derivados de acidos grasos ramificados.

La expresion "celula microbiana recombinante" se refiere a una celula microbiana (es decir, un microorganismo) que se ha modificado geneticamente (es decir, "disenado por ingenierfa genetica") mediante la introduccion de material genetico en una "celula microbiana progenitora" (es decir, una celula hospedadora) seleccionada, modificando o alterando de este modo la fisiologfa celular y la bioqufmica de la celula progenitora. Mediante la introduccion de material genetico, la celula microbiana recombinante adquiere una propiedad nueva o mejorada en comparacion con la de la celula microbiana progenitora, tal como, por ejemplo, la cantidad para producir un nuevo metabolito intracelular o mayores cantidades de este. Las celulas microbianas recombinantes proporcionadas en el presente documento pueden expresar una serie de enzimas biosinteticas (por ejemplo, enzimas de vfas de acidos grasos, tales como enzimas de la via de AGCR) implicadas en vfas para la produccion de, por ejemplo, una acil-CoA ramificada, una acil-ACP ramificada o un derivado de acido graso ramificado (tal como un acido graso ramificado, ester graso ramificado, ester de cera ramificado, aldehfdo graso ramificado, alcohol graso ramificado, alcano ramificado, alqueno ramificado, olefina terminal ramificada, olefina interna ramificada o cetona ramificada), a partir de una fuente de carbono adecuada. El material genetico introducido en la celula microbiana progenitora contiene genes o partes de genes, que codifican una o mas de las enzimas implicadas en una via biosintetica (es decir, enzimas biosinteticas) para la produccion de un derivado de acido graso ramificado y tambien puede incluir elementos adicionales para la expresion y/o regulacion de estos genes, tales como secuencias promotoras. Por consiguiente, las celulas microbianas recombinantes descritas en el presente documento se han modificado por ingenierfa genetica para expresar o sobreexpresar enzimas biosinteticas implicadas en vfas biosinteticas de acidos grasos de cadena ramificada (AGCR) como se describen en el presente documento.

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Se entiende que las expresiones "celula microbiana recombinante" y "microorganismo recombinante" se refieren no solo a la celula/microorganismo microbiano recombinante particular, sino a la descendencia o a la potencial descendencia de dicha celula microbiana.

Una celula microbiana recombinante puede, como alternativa o ademas de comprender material genetico introducido en la celula microbiana progenitora, incluir una reduccion, alteracion, eliminacion o una "supresion genica" de un gen o polinucleotido para alterar la fisiologfa celular y la bioqufmica de la celula microbiana progenitora. Mediante la reduccion, alteracion, eliminacion o supresion genica de un gen o polinucleotido (tambien conocido como "atenuacion" del gen o el polinucleotido), la celula microbiana recombinante adquiere una propiedad nueva o mejorada (tal como, por ejemplo, la cantidad para producir un nuevo metabolito intracelular o mayores cantidades de este, la capacidad para mejorar el flujo de un metabolito a traves de una via deseada y/o la capacidad para reducir la produccion de un subproducto no deseado) en comparacion con la de la celula microbiana progenitora.

Modificacion por inqenieria genetica de celulas microbianas recombinantes para producir derivados de acidos grasos ramificados

Los acidos grasos de cadena ramificada normalmente se producen en bacterias, tales como Bacillus, Stenotrophomonas, Streptomyces, Listeria, Staphylococcus y Streptococcus (Kaneda, Microbiol. Rev. 55: 288-302 (1991). Las moleculas de acil-CoA ramificadas se sintetizan en dichos microorganismos mediante la accion de un complejo de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos ramificados (BKD) (Cropp y col., Can J Microbiol 46: 506-14 (2000)). Los complejos BKD tambien se producen en microorganismos, tales como Pseudomonas, que son capaces de metabolizar aminoacidos de cadena ramificada (leucina, isoleucina o valina) o a-cetoacidos de cadena ramificada como fuentes de carbono (Sokatch y col., J. Bacteriol. 148: 647-652 (1981)). Las enzimas con actividad beta-cetoacil ACP sintasa III (tambien denominadas "FabH") que utilizan sustratos de CoA ramificada catalizan posteriormente la condensacion inicial de la acil-CoA ramificada con malonil-ACP para formar un intermedio de p-cetoacil-ACP ramificado, que despues entra en el ciclo de sintasa de acidos grasos (FAS) para alargar las cadenas de acilo ramificadas.

En la naturaleza, algunas bacterias no producen acidos grasos de cadena ramificada; por ejemplo, la E. coli nativa carece de los componentes de un complejo BKD y la enzima beta-cetoacil ACP sintasa (FabH) de E. coli nativa acepta unicamente moleculas de acil-CoA de cadena lineal en la condensacion con malonil-ACP, produciendo intermedios de p-cetoacil-ACP de cadena lineal y generando acidos grasos de cadena lineal.

La invencion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que mediante la modificacion por ingenierfa genetica de microorganismos para introducir o para mejorar vfas biosinteticas que implican la generacion de alfa- cetoacidos de cadena ramificada e intermedios de acil-CoA de cadena ramificada a partir de azucares sencillos, se crea o potencia un flujo metabolico a traves de los intermedios de la via de cadena ramificada y se optimizan las composiciones de productos de acidos grasos ramificados, dando como resultado una produccion microbiana eficaz de acidos grasos de cadena ramificada y de derivados de acidos grasos de cadena ramificada a partir de azucares sencillos o biomasa.

Dado que el fin ultimo es proporcionar procedimientos responsables desde el punto de vista medioambiental y economicos para la produccion de derivados de acidos grasos de cadena ramificada a escala industrial partiendo de azucares (tales como monosacaridos o disacaridos) o de biomasa, es deseable mejorar el rendimiento de las moleculas de cadena ramificada producidas por microbios y la optimizacion de las composiciones de moleculas de cadena ramificada producidas por microbios, tal como aumentando la cantidad de productos de cadena anteiso- ramificada en relacion con los productos de cadena iso-ramificada. Por consiguiente, se han examinado estrategias para la sobreproduccion de diversos intermedios de la via para aumentar el flujo de metabolitos a traves de vfas biosinteticas de acidos grasos de cadena ramificada. Las vfas que dirigen el flujo metabolico desde un material de partida, tal como un azucar, hasta un intermedio de acil-CoA ramificada, hasta un intermedio de acil-ACP ramificada y a un producto de acido graso ramificado o un producto derivado de acido graso ramificado, pueden modificarse en un microorganismo util desde el punto de vista industrial.

En un aspecto, la divulgacion incluye una celula microbiana recombinante que comprende polinucleotidos que codifican una o mas enzimas que participan en la biosfntesis de un intermedio de acil-ACP ramificada cuando el microorganismo se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. En algunas realizaciones, la celula microbiana recombinante comprende ademas uno o mas polinucleotidos que codifican cada uno un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos grasos ramificados cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones suficientes para expresar los polinucleotidos. La divulgacion tambien incluye procedimientos para producir derivados de acidos grasos ramificados que comprenden cultivar una celula microbiana recombinante de la invencion.

La celula microbiana recombinante puede ser un hongo filamentoso, un alga, una levadura o un procariota, tal como una bacteria (por ejemplo, una E. coli o una Bacillus sp).

En general, los derivados de acidos grasos ramificados (tales como, acidos grasos ramificados, esteres grasos

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ramificados (incluyendo metil esteres de acidos grasos ramificados (FAME ramificados), etil esteres de acido graso ramificados (FAEE ramificados) y esteres de cera ramificados), aldehfdos grasos ramificados, alcoholes grasos ramificados, cetonas ramificadas e hidrocarburos ramificados (incluyendo alcanos ramificados, alquenos ramificados, olefinas terminales ramificadas, olefinas internas ramificadas)) pueden producirse en una celula microbiana recombinante de la invencion por la via biosintetica de acidos grasos ramificados ("via de AGCR") representada en la figura 1.

Para producir un derivado de acido graso ramificado, la celula microbiana recombinante utiliza una molecula de acil- CoA ramificada como "cebador" para iniciar el proceso de elongacion de la cadena de acilo graso ramificada. El proceso de elongacion del acilo graso ramificado implica inicialmente la condensacion del cebador de acil-CoA ramificado con una molecula de malonil-ACP, catalizada por una enzima p-cetoacil-ACP sintasa III, para formar un intermedio de p-cetoacil-ACP ramificado (como se representa en la etapa (D) de la figura 1). El intermedio de p- cetoacil-ACP ramificado se somete a ceto-reduccion, deshidratacion y reduccion de enoflo en el carbono p para formar un intermedio de acil-ACP ramificado inicial, que se somete a ciclos adicionales de condensacion con malonil- ACP, ceto-reduccion, deshidratacion y reduccion de enoflo para formar intermedios de acil-ACP ramificados de longitud creciente. Despues, el intermedio de acil-ACP ramificado elongado se convierte en un derivado de acido graso ramificado (tal como un acido graso ramificado, un ester graso ramificado, un aldehfdo graso ramificado, un alcohol graso ramificado, un hidrocarburo ramificado o una cetona ramificada). Esto contrasta con el proceso en, por ejemplo, E. coli de tipo silvestre, que produce acidos grasos de cadena lineal pero no acidos grasos de cadena ramificada. En E. coli de tipo silvestre, la molecula de cebador de cadena lineal de acetil-CoA se condensa inicialmente con una molecula de malonil-ACP para formar un intermedio de p-cetoacil-ACP de cadena lineal, que de manera similar se somete a ciclos de ceto-reduccion, deshidratacion, reduccion de enoflo y condensacion con moleculas adicionales de malonil-ACP, para producir, en ultima instancia, por ejemplo, un acido graso de cadena lineal.

La molecula "cebadora" de acil-CoA ramificada anteriormente indicada puede suministrarse a la via biosintetica de AGCR de la celula microbiana recombinante de la invencion mediante diversos procedimientos, como se indica a continuacion.

En un aspecto, se genera una molecula de acil-CoA ramificada por la maquinaria biosintetica nativa de la celula microbiana (por ejemplo, es endogena para la celula microbiana progenitora). En algunos casos similares, para aumentar la cantidad de la molecula de acil-CoA ramificada producida en la celula microbiana recombinante, pueden sobreexpresarse una o mas enzimas endogenas para la celula microbiana progenitora que contribuyen a la produccion de acil-CoA ramificada (tales como, por ejemplo, uno o mas componentes de un complejo BKD nativo, correspondientes a la etapa marcada como (C) de la via en la figura 1) en la celula microbiana recombinante.

En otro aspecto, se produce una molecula de acil-CoA ramificada en la celula microbiana recombinante modificando por ingeniena genetica la celula para que exprese enzimas exogenas, tal como uno o mas componentes de un complejo BKD exogeno, que deriva el flujo metabolico hacia intermedios de a-cetoacidos ramificados para producir moleculas de acil-CoA ramificadas, como se representa por la etapa (C) de la figura 1. Esta estrategia es particularmente util para modificar por ingeniena genetica celulas microbianas, tales como E. coli, que normalmente no producen acidos grasos ramificados. Los polinucleotidos que codifican componentes del complejo BKD pueden obtenerse de microorganismos que normalmente producen acidos grasos ramificados o pueden metabolizar aminoacidos ramificados o a-cetoacidos ramificados, incluyendo, pero sin limitacion, cepas de Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Listeria, Staphylococcus y Streptococcus.

Un complejo BKD comprende tres componentes: un componente E1 que tiene actividad deshidrogenasa de a- cetoacidos (por ejemplo, EC 1.2.4.4), que, dependiendo de la fuente, puede ser un solo polipeptido (es decir, un monomero) o, dos polipeptidos diferentes (es decir, un heterodfmero) denominados E1alfa y E1beta; un componente E2 que tiene actividad lipoamida aciltransferasa (por ejemplo, EC 2.3.1.168) y un tercer componente, denominado E3, que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa (por ejemplo, EC 1.8.1.4). Los componentes tanto E1 (o E1alfa/E1beta) como E2 del complejo BKD utilizan sustratos ramificados. En algunos casos, puede usarse una enzima que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa (por ejemplo, EC 1.8.1.4) que es endogena para una celula microbiana que normalmente no produce acidos grasos ramificados (tal como E. coli) pero que, sin embargo, utiliza sustratos de cadena ramificada, en lugar de un componente E3 de BKD procedente de una cepa que normalmente produce acidos grasos de cadena ramificada o metaboliza aminoacidos de cadena ramificada o a- cetoacidos ramificados.

En un aspecto, una o mas secuencias de polinucleotidos, codificando cada una un polipeptido que tiene una actividad BKD (actividad deshidrogenasa de a-cetoacidos, actividad lipoamida aciltransferasa o actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa) que es endogena para la celula microbiana progenitora, se sobreexpresan en la celula microbiana recombinante. En otro aspecto, una o mas secuencias de polinucleotidos, codificando cada una un polipeptido que tiene una actividad bKd (actividad deshidrogenasa de a-cetoacidos, actividad lipoamida aciltransferasa o actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa) que es exogena para la celula microbiana progenitora, se expresan o sobreexpresan en la celula microbiana recombinante. Las secuencias de polinucleotido que codifican polipeptidos que tienen actividades BKD (actividad deshidrogenasa de a-cetoacidos, actividad lipoamida aciltransferasa, actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa) pueden obtenerse de un microorganismo que normalmente produce acidos grasos de cadena ramificada o pueden metabolizar aminoacidos de cadena ramificada o a-cetoacidos ramificados (incluyendo, pero sin limitacion, cepas de Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Listeria,

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Staphylococcus y Streptococcus). En algunos aspectos, se modifica la secuencia de polinucleotidos para generar un polipeptido variante que tiene una actividad BDK y una propiedad mejorada, en comparacion con la del polipeptido parental, que es mas adecuada para la celula microbiana y/o para la via que se este modificando por ingenierfa genetica; tales como, por ejemplo, mayor actividad catalftica o estabilidad mejorada en condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante; inhibicion reducida (por ejemplo, inhibicion por retroalimentacion reducida) por un metabolito celular o por un componente del medio de cultivo y similares. Los ejemplos no limitantes de polipeptidos componentes de BKD y de los acidos nucleicos que codifican dichos polipeptidos para su uso en la modificacion por ingenierfa genetica de la parte (C) de la via biosintetica de AGCR se proporcionan en la tabla 4, a continuacion.

En otro aspecto, se produce una molecula de acil-CoA ramificada en la celula microbiana recombinante modificando por ingenierfa genetica la celula para que exprese o sobreexprese ciertas enzimas de transporte/activacion que participan en la conversion de un sustrato de acido carboxflico de cadena corta ramificada en una molecula de acil- CoA ramificada. Las enzimas de transporte/activacion pueden incluir, sin limitacion, una fosfotransbutirilasa (ligasa) (por ejemplo, EC 2.3.1.19) y/o una butirato cinasa (por ejemplo, EC 2.7.2.7). En un aspecto, la celula microbiana recombinante expresa una fosfotransbutirilasa (ligasa) y una butirato cinasa de Clostridium acetobutylicum.

El sustrato de acido carboxflico de cadena corta ramificada (tal como isobutirato, isovalerato o 2-metil-butirato) se convierte en la molecula de acil-CoA ramificada (tal como isobutiril-CoA, isovaleril-CoA o 2-metil-butiril-CoA). En algunos casos, dicha celula microbiana recombinante se cultiva (es decir, se "alimenta") en presencia del sustrato de acido carboxflico de cadena corta ramificada, por ejemplo, isobutirato, isovalerato o 2-metil-butirato, dando como resultado la produccion de isobutiril-CoA, isovaleril-CoA o 2-metil-butiril-CoA, respectivamente.

En otro aspecto, la molecula de acil-CoA ramificada, isobutiril-CoA, se produce en la celula microbiana recombinante modificando por ingenierfa genetica la celula para expresar una crotonil-CoA reductasa (Ccr, EC 1.6.5.5,1.1.11) y una isobutiril-CoA mutasa (subunidad mayor, IcmA, EC 5.4.99.2; subunidad menor, IcmB, EC 5.4.99.2) (Han y Reynolds, J. Bacteriol. 179:5157,1997). Algunos ejemplos no limitantes de genes ccr e icm incluyen los genes ccr, icmA e icmB de Streptomyces coelicolor (por ejemplo, los numeros de acceso del NCBI NP_630556, NP_629554 y NP_630904, respectivamente) y los genes ccr, icmA e icmB de Streptomyces cinnamonensis (por ejemplo, los numeros de acceso del NCBI AAD53915, AAC08713 y AJ246005, respectivamente).

En otro aspecto, se produce una molecula de acil-CoA ramificada en la celula microbiana recombinante modificando por ingenierfa genetica la celula para que exprese enzimas que dirigen el flujo metabolico a partir de materiales de partida sencillos (por ejemplo, azucares, tales como glucosa) para generar intermedios de a-cetoacidos ramificados, sobre los que despues actua la maquinaria biosintetica natural de la celula microbiana recombinante particular o por componentes del complejo BKD modificados por ingenierfa genetica en la celula microbiana recombinante (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente), para generar moleculas de acetil-CoA ramificadas. A continuacion se describe de manera mas detallada un ejemplo de esta estrategia y se muestra esquematicamente en la figura 3A.

Como se indico anteriormente, la molecula de acil-CoA ramificada sirve como cebador para la elongacion de la cadena de acilo ramificada. El inicio del proceso de elongacion implica la condensacion de la acil-CoA ramificada con una molecula de malonil-ACP para formar un intermedio de p-cetoacil-ACP ramificado. Esta etapa, representada por la parte (D) de la figura 1, se cataliza en la celula microbiana recombinante por una enzima que tiene actividad p- cetoacil-ACP sintasa III (por ejemplo, EC 2.3.1.180) que utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato (en otras palabras, una enzima que tiene actividad "p-cetoacil-ACP de cadena ramificada sintasa III"). La enzima puede ser endogena para la celula microbiana recombinante (por ejemplo, en caso de que la celula microbiana progenitora produzca normalmente acidos grasos de cadena ramificada) o exogena para la celula microbiana recombinante.

En un aspecto, se sobreexpresa un polinucleotido que codifica un polipeptido endogeno para la celula microbiana progenitora que tiene actividad sintasa III de p-cetoacil-ACP de cadena ramificada en la celula microbiana recombinante. En otro aspecto, se expresa o sobreexpresa un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad sintasa III de p-cetoacil-ACP de cadena ramificada que es exogeno para la celula microbiana progenitora en la celula microbiana recombinante. Puede obtenerse una secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido que tiene actividad sintasa III de p-cetoacil-ACP de cadena ramificada a partir de una celula microbiana que normalmente produce acidos grasos de cadena ramificada (incluyendo, pero sin limitacion, cepas de Bacillus, Streptomyces, Listeria, Staphylococcus y Streptococcus). En algunos aspectos, se modifica la secuencia de polinucleotidos para generar un polipeptido variante que tiene actividad sintasa III de p-cetoacil-ACP de cadena ramificada y una propiedad mejorada, en comparacion con la del polipeptido parental, que es mas adecuada para la celula microbiana y/o para la via que se este modificando por ingenierfa genetica; tales como, por ejemplo, mayor actividad catalftica o estabilidad mejorada en condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante; inhibicion reducida (por ejemplo, inhibicion por retroalimentacion reducida) por un metabolito celular o por un componente del medio de cultivo y similares. Los ejemplos no limitantes de enzimas p-cetoacil-ACP sintasa III y genes que codifican dichas enzimas para su uso en la modificacion por ingenierfa genetica de la parte (D) de la via de acidos grasos ramificados se proporcionan en la tabla 5, a continuacion.

Una o mas enzimas endogenas para la celula microbiana progenitora pueden competir por el sustrato con enzimas

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de la via biosintetica de AGCR modificadas por ingenierfa genetica en la celula microbiana recombinante o pueden descomponer o de otro modo desviar un intermedio en la via biosintetica de AGCR; los genes que codifican dichas enzimas endogenas no deseadas pueden atenuarse para aumentar la produccion de derivados de acidos grasos ramificados por la celula microbiana recombinante. Por ejemplo, en E. coli, la p-cetoacil-ACP sintasa III endogena (numero de acceso de la protefna de UniProtKB/Swiss-Prot P0A6R0), codificada por el gen fabH de E. coli, utiliza principalmente moleculas de acil-CoA de cadena lineal, tales como acetil-CoA, pero no utiliza moleculas de acil-CoA ramificadas y por lo tanto, compite con enzimas de la via de cadena ramificada por el malonil-ACP y otros sustratos y deriva el flujo metabolico fuera de la via de AGCR. La eliminacion o de otro modo reduccion de la expresion del gen fabH de E. coli aleja por tanto la biosfntesis en E. coli recombinante de la cadena lineal y la acerca hacia los intermedios de p-cetoacil-ACP ramificados y en ultima instancia, mas cerca de la produccion de acidos grasos de cadena ramificada.

El intermedio de p-cetoacil-ACP generado en la parte (D) de la via de AGCR (figura 1) puede someterse a elongacion por ciclos sucesivos de ceto-reduccion, deshidratacion y reduccion de enoflo en el carbono beta y condensacion adicional con moleculas de malonil-ACP catalizada por un complejo de sintasa de acidos grasos (FAS), tal como, por ejemplo, un complejo FAS de tipo II, anadiendo 2 unidades de carbono a la cadena en crecimiento del intermedio de acil-ACP ramificado, tal como se representa por la parte (E) de la figura 1. En una realizacion, un complejo FAS endogeno nativo para la celula microbiana recombinante cataliza ciclos de condensacion con malonil-ACP/ceto-reduccion/deshidratacion/reduccion de enoflo para producir el intermedio de acil-ACP ramificado.

Los derivados de acidos grasos ramificados (tales como acidos grasos ramificados, esteres grasos ramificados, aldehfdos grasos ramificados, alcoholes grasos ramificados, hidrocarburos ramificados y cetonas ramificadas) pueden producirse a partir del intermedio de acil-ACP ramificado, como se describira con mas detalle a continuacion. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la celula microbiana recombinante comprende ademas una o mas secuencias de polinucleotido que codifican cada una un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos, tal como tioesterasa (por ejemplo, TesA), descarboxilasa, reductasa de acidos carboxflicos (CAR; por ejemplo, CarB), alcohol deshidrogenasa/aldehfdo reductasa; aldehfdo descarbonilasa, acil-CoA reductasa formadora de alcoholes grasos (FAR), acil-ACP reductasa (AAR), ester sintasa o acil-CoA reductasa (ACR1), OleA, OleCD u OleBCD, en el que la celula microbiana produce una composicion que comprende un acido graso ramificado, un ester graso ramificado (tal como un metil ester graso ramificado, etil ester graso ramificado, un ester de cera ramificado), un aldehfdo graso ramificado, un alcohol graso ramificado, un hidrocarburo ramificado (tal como un alcano ramificado, una olefina terminal ramificada o una olefina interna ramificada) o una cetona ramificada, cuando la celula microbiana se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. La divulgacion tambien incluye procedimientos para la produccion de un derivado de acido graso ramificado que comprende cultivar una celula microbiana recombinante de la invencion.

Modificacion por ingenierfa genetica de celulas microbianas recombinantes para producir derivados de acidos grasos anteiso-ramificados o iso-ramificados

La ramificacion de las moleculas del derivado de acido graso puede producirse en la configuracion iso o en la configuracion anteiso. Los acidos grasos ramificados y sus derivados, en particular en la configuracion anteiso, son componentes preferidos de las composiciones de combustible, debido a los menores puntos de fusion y mayores estabilidades oxidativas en comparacion con los compuestos no ramificados (es decir, de cadena lineal).

Para producir preferencialmente un derivado de acido graso ramificado particular, tal como, un derivado de acido graso anteiso-ramificado o un derivado de acido graso iso-ramificado, puede modificarse la celula microbiana recombinante para generar una molecula de acil-CoA ramificada particular, que sirve como cebador para iniciar la elongacion de la cadena. La estructura de la molecula cebadora de acil-CoA ramificada determina, en parte, la estructura del producto final.

Por ejemplo, la condensacion de la molecula de acil-CoA ramificada, 2-metil-butiril-CoA con malonil-ACP catalizada por una p-cetoacil-ACP de cadena ramificada sintasa III genera el intermedio de p-cetoacil-ACP anteiso-ramificado, 4-metil-3-oxo-hexanoil-ACP, que da lugar a la produccion de intermedios de acil-ACP anteiso-ramificados y en ultima instancia, a derivados de acidos grasos anteiso-ramificados (figura 2A). Por otra parte, la condensacion de isobutiril- CoA o isovaleril-CoA con malonil-ACP genera los intermedios de p-cetoacil-ACP iso-ramificados, 4-metil-3-oxo- pentanoil-ACP o 5-metil-3-oxo-hexanoil-ACP, respectivamente, que da lugar a la produccion de intermedios de acil- ACP iso-ramificados y en ultima instancia, a derivados de acidos grasos iso-ramificados (figura 2B).

Se ha demostrado que la manipulacion de diversas vfas biosinteticas de aminoacidos aumenta la produccion de estos aminoacidos en celulas microbianas (Guillouet S., y col., Appl. Environ. Microbiol. 65:3100-3107 (1999); Lee K.H., y col., Mol. Syst. Biol. 3:149 (2007)). Se han usado vfas biosinteticas de aminoacidos en la produccion de alcoholes ramificados de cadena corta en E. coli (Atsumi S. y Liao J.C., Appl. Environ. Microbiol. 74(24): 7802- 7808 (2008); Cann A.F. y Liao J.C., Appl Microbiol Biotechnol. 81(l):89-98(2008); Zhang K., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105(52):20653-20658(2008 )). La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que el direccionamiento del flujo de ciertos metabolitos biosinteticos de aminoacidos hacia la produccion de intermedios de a-cetoacidos ramificados y la derivacion de estos intermedios de a-cetoacidos ramificados hacia su conversion en

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acil-CoA ramificadas y su entrada en la via biosintetica de acidos grasos optimiza las estructuras y mejora el rendimiento de los productos de acidos grasos de cadena ramificada.

Por consiguiente, en un aspecto, en el presente documento se desvela una celula microbiana recombinante que comprende polinucleotidos que codifican una o mas enzimas (es decir, "enzimas de la via de AGCR") que participan en la conversion de un azucar en la molecula de a-cetoacido ramificada, 2-ceto-3-metilvalerato (tambien conocida como a-ceto-p-metilvalerato) cuando se cultiva el microorganismo en presencia de una fuente de carbono en condiciones suficientes para expresar los polinucleotidos. La molecula de 2-ceto-3-metilvalerato es un intermedio de a-cetoacido ramificado en la produccion microbiana de derivados de acidos grasos anteiso-ramificados segun la via de AGCR (veanse las figuras 2A y 3B).

En otro aspecto, en el presente documento se desvela una celula microbiana recombinante que comprende polinucleotidos que codifican una o mas enzimas de la via de AGCR que participan en la biosfntesis de un intermedio de acil-ACP anteiso-ramificado cuando se cultiva la celula microbiana en presencia de una fuente de carbono en condiciones suficientes para expresar los polinucleotidos. En otro aspecto, la celula microbiana recombinante comprende ademas uno o mas polinucleotidos que codifican uno o mas polipeptidos, teniendo cada uno una actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acido graso anteiso-ramificado cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones suficientes para expresar los polinucleotidos.

En otro aspecto, en el presente documento se desvelan procedimientos para la produccion de composiciones que comprenden derivados de acidos grasos anteiso-ramificados, que comprenden cultivar una celula microbiana recombinante de la invencion.

Las figuras 3A y 3B muestran vfas biosinteticas ejemplares para la conversion de un material de partida (por ejemplo, un azucar, tal como glucosa) en un intermedio de a-cetoacido anteiso-ramificado, 2-ceto-3-metilvalerato, que despues se convierte en un cebador de acil-CoA anteiso-ramificado, 2-metil-butiril-CoA. La condensacion del cebador de 2-metil-butiril-CoA con malonil-ACP da como resultado un intermedio de p-cetoacil-ACP anteiso- ramificado, 4-metil-3-oxo-hexanoil-ACP. El intermedio de p-cetoacil-ACP anteiso-ramificado es una unidad de partida para ciclos adicionales de elongacion catalizada por FAS por condensacion con moleculas adicionales de malonil- ACP para generar acil-ACP anteiso-ramificado, segun la via general, mostrada como diagrama en la figura 1. Despues, la acil-ACP anteiso-ramificada se convierte en etapas biocatalfticas adicionales, catalizadas por una o mas enzimas derivadas de acidos grasos, para producir un derivado de acido graso anteiso-ramificado.

Parte A de la via: Azucar a 2-cetobutirato

Para generar el intermedio de a-cetoacido anteiso-ramificado, 2-ceto-3-metilvalerato a partir del material de partida, pueden modificarse en la celula microbiana recombinante una cualquiera o las dos vfas, produciendo cada una de estas un intermedio de a-cetobutirato (2-cetobutirato) comun que posteriormente se convierte en 2-ceto-3- metilvalerato. Estas vfas se muestran a modo de diagrama en la figura 3A.

Parte A.1 de la via (intermedio de treonina)

La primera via que da lugar al intermedio de a-cetobutirato comun, representado por la parte (A.1) de la figura 3A, implica la produccion del intermedio de la via treonina, por enzimas biosinteticas de treonina, seguido de la desaminacion de la treonina en un a-cetobutirato, catalizada por una enzima con actividad treonina deshidratasa.

En la parte (A.1) de la via, puede lograrse el aumento del flujo metabolico hacia el intermedio de la via, treonina, expresando polinucleotidos que codifican enzimas implicadas en la biosfntesis de la treonina, incluyendo enzimas con actividad aspartato cinasa (por ejemplo, EC 2.7.2.4; tambien denominada actividad aspartocinasa), que cataliza la conversion de aspartato a fosfato de aspartilo; actividad aspartato-semialdehfdo deshidrogenasa (por ejemplo, EC 1.2.1.11), que cataliza la conversion de fosfato de aspartilo en aspartato semialdehfdo; actividad homoserina deshidrogenasa (por ejemplo, EC 1.1.1.3), que cataliza la conversion de aspartato semialdehfdo a homoserina; actividad homoserina cinasa (por ejemplo, EC 2.7.1.39), que cataliza la conversion de homoserina a O-fosfo-L- homoserina; y actividad treonina sintasa (por ejemplo, EC 4.2.3.1), que cataliza la conversion de O-fosfo-L- homoserina a treonina. No es necesario modificar por ingenierfa genetica todas las actividades listadas anteriormente en la celula microbiana recombinante para aumentar el flujo metabolico hacia el intermedio de treonina; en algunos casos, sera suficiente una actividad previamente presente en la celula microbiana progenitora (por ejemplo, un polipeptido que tiene esa actividad que se produce en la celula microbiana progenitora por un gen nativo no recombinante) para catalizar una etapa listada anteriormente. En un aspecto, la celula microbiana recombinante se modifica por ingenierfa genetica para expresar de manera recombinante uno o mas polinucleotidos seleccionados entre: un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad aspartato cinasa, en el que el polipeptido cataliza la conversion de aspartato a fosfato de aspartilo; un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad aspartato-semialdehfdo deshidrogenasa, en el que el polipeptido cataliza la conversion de fosfato de aspartilo a aspartato semialdehfdo; un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad homoserina deshidrogenasa, en el que el polipeptido cataliza la conversion de aspartato semialdehfdo a homoserina; un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad homoserina cinasa, en el que el polipeptido cataliza la

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conversion de homoserina a O-fosfo-L-homoserina; un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad treonina sintasa, en el que el polipeptido cataliza la conversion de O-fosfo-L-homoserina a treonina; en la que la celula microbiana recombinante tiene un flujo metabolico aumentado hacia el intermedio de la via, treonina, en comparacion con la celula microbiana progenitora. En algunos casos, el polipeptido codificado por el polinucleotido expresado de manera recombinante esta presente en la celula microbiana recombinante a una mayor concentracion, en comparacion con su concentracion en la celula microbiana progenitora cuando se cultiva en las mismas condiciones, es decir, el polipeptido se "sobreexpresa" en la celula recombinante. Por ejemplo, el polinucleotido expresado de manera recombinante puede unirse operativamente a un promotor que expresa el polinucleotido en la celula microbiana recombinante a una mayor concentracion que la normalmente expresada en la celula microbiana progenitora cuando se cultiva en las mismas condiciones. En una realizacion, se usa un gen thrA de E. coli, que codifica una ThrA bifuncional con actividades aspartato cinasa y homoserina deshidrogenasa. En otra realizacion, se usa un gen thrA de E. coli, que codifica una enzima variante con actividades aspartato cinasa y homoserina deshidrogenasa y con una inhibicion de retroalimentacion reducida en relacion con la enzima ThrA parental (denominada ThrA*; Ogawa-Miyata,Y., y col., Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:1149-1154 (2001); Lee J.-H., y col., J. Bacteriol. 185: 5442-5451 (2003)).

La treonina puede desaminarse en a-cetobutirato (tambien conocido como 2-cetobutirato, 2-oxobutanoato y 2- oxobutirato) por una enzima con actividad treonina desaminasa (por ejemplo, EC 4.3.1.19; tambien conocida como actividad treonina amoniaco-liasa y se clasifico previamente como EC 4.2.1.16, treonina deshidratasa), que cataliza la conversion de treonina a a-cetobutirato. En una realizacion, la actividad treonina desaminasa previamente presente (es decir, endogena) en la celula microbiana progenitora es suficiente para catalizar la conversion de treonina a a-cetobutirato. En otra realizacion, la celula microbiana recombinante se modifica por ingenierfa genetica para expresar de manera recombinante un polipeptido que tiene actividad treonina desaminasa, en el que el polipeptido cataliza la conversion de treonina a a-cetobutirato. En algunas realizaciones, el polipeptido que tiene actividad treonina desaminasa se sobreexpresa en la celula microbiana recombinante.

Los ejemplos no limitantes de enzimas de la via de AGCR y de los polinucleotidos que codifican dichas enzimas para su uso en la parte (A. 1) de la via de acidos grasos ramificados se proporcionan en la tabla 1.

Tabla 1. Ejemplos no limitantes de enzimas y secuencias codificantes de acidos nucleicos para su uso en la parte A.1 de la via biosintetica de anteiso-AGCR mostrada en la figura 3A.

Numero de EC: Organismo Sfmbolo del gen Numero de acceso de UniProtKB (SwissProt) o referencia bibliografica Numero de acceso de protefna del NCBI SEQ ID NO: (pp, na)

c\i O ^ LU CM: aspartato cinasa (aspartocinasa)

: E. coli K-12 MG 1655 thrA P00561 NP_414543 116,117

: E. coli (mutante) thrA* Ogawa-Miyata y col, 2001; Lee y col., 2003 118,119

: B. subtilis 168 dapG Q04795 ZP_03591402 120,121

: P. putida F1 Pput1442 A5W0E0 YP_001266784 122,123

: S. cerevisiae hom3 NP_010972 124,125

EC 1.1.1.3: homoserina deshidrogenasa

: E. coli K12 MG 1655 thrA P00561 NP_414543 116,117

: E. coli (mutante) thrA* Ogawa- Miyata y col, 2001; Lee y col., 2003 118,119

: B. subtilis 168 hom P19582 NP_391106 126,127

: P. putida F1 Pput_4251 A5W8B5 YP_001269559 128, 129

: S. cerevisiae hom6 P31116 NP_012673 130, 131

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EC 2.7.1.39: homoserina cinasa

: E. coli K12 MG 1655 thrB P00547 NP_414544 132,133

: B. subtilis 168 thrB P04948 NP_391104 134, 135

: P. putida F1 Pput_0138 A5VWQ3 YP_001265497 136,137

: S. cerevisiae thr1 P17423 NP_011890 138,139

EC 4.2.3.1: treonina sintasa

: E. coli K12 MG 1655 thrC P00934 NP_414545 140,141

: B. subtilis 168 thrC P04990 NP_391105 142,143

: C. glutamicum ATCC13032 thrC P23669 YP_226461 144,145

EC 4.3.1.19: treonina desaminasa (treonina amoniaco-liasa; denominada previamente treonina deshidratasa)

: E. coli K12 MG 1655 tdcB P0AGF6 NP_417587 146,147

: E. coli K12 MG 1655 ilvA P04968 NP_418220 148,149

: B. subtilis 168 ilvA P37946 NP_390060 150,151

: C. glutamicum ATCC 13032 ilvA Q04513 YP_226365 152,153

: C. glutamicum ATCC 13032 tdcB Q8NRR7 YP_225271 154,155

Pueden identificarse polipeptidos adicionales, por ejemplo, efectuando una busqueda en una base de datos relevante (tal como la base de datos KEGG (University of Tokyo), las bases de datos PROTEIN o GENE (bases de datos Entrez; NCBI), las bases de datos UNIPROTkB o ENZyMe (ExPASy; Swiss Institute of Bioinformatics) y la base de datos BRENDA (The Comprehensive Enzyme Information System; Technical University of Braunschweig)), todas las cuales se encuentran disponibles en Internet, para los polipeptidos clasificados mediante los numeros EC anteriormente indicados. Por ejemplo, se pueden identificar polipeptidos de aspartocinasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 2.7.2.4; se pueden identificar polipeptidos de homoserina deshidrogenasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 1.1.1.3; se pueden identificar polipeptidos de homoserina cinasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 2.7.1.39; se pueden identificar polipeptidos de treonina sintasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 4.2.3.1; y se pueden identificar polipeptidos de treonina desaminasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 4.3.1.19.

En algunos aspectos, un polinucleotido que codifica un polipeptido de via de acidos grasos parental (tal como un polipeptido descrito en la tabla 1 o identificado por un numero de EC o por homologfa respecto de un polipeptido ejemplar) se modifica usando procedimientos bien conocidos en la tecnica para generar un polipeptido variante que tenga una actividad enzimatica indicada anteriormente (por ejemplo, actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa, actividad treonina sintasa, actividad treonina desaminasa) y una propiedad mejorada, en comparacion con la del polipeptido parental, que es mas adecuada para la celula microbiana y/o para la via que se este modificando por ingenierfa genetica; tales como, por ejemplo, mayor actividad catalftica o estabilidad mejorada en condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante; inhibicion reducida (por ejemplo, inhibicion por retroalimentacion reducida) por un metabolito celular o por un componente del medio de cultivo y similares.

Parte A.2 de la via (intermedio de citramalato)

La segunda via que da lugar al intermedio de 2-cetobutirato comun, representado por la parte (A.2) de la figura 3A, implica la produccion del intermedio de la via, citramalato (que tambien se conoce como 2-metilmalato) por medio de una enzima con actividad citramalato sintasa y la conversion de citramalato a 2-cetobutirato por la accion de enzimas con actividades isopropilmalato isomerasa y alcohol deshidrogenasa.

La actividad citramalato sintasa (por ejemplo, EC 2.3.1.182), que cataliza la reaccion de acetil-CoA y piruvato para formar (R)-citramalato, puede suministrarse mediante la expresion de un gen cimA de una bacteria, tal como Methanococcus jannaschi o Leptospira interrogans (Howell, D.M. y col., J. Bacteriol. 181(1 ):331-3 (1999); Xu, H., y col., J. Bacteriol. 186:5400-5409(2004)) que codifica un polipeptido CimA, tal como CimA de M. jannaschii (SEQ iD NO: 156) o L. interrogans (SEQ ID NO: 160). Como alternativa, puede usarse una secuencia de acido nucleico de cimA modificada que codifica un CimA variante con actividad catalftica o estabilidad mejorada en la celula microbiana recombinante y/o una inhibicion de retroalimentacion reducida, tal como, por ejemplo, una variante de CimA descrita por Atsumi S. y Liao J.C. (Appl. Environ. Microbiol. 74(24): 7802-7808 (2008)), preferentemente, la variante CimA3.7 (SEQ ID NO: 158) codificada por el gen cimA3.7 (SEQ ID NO: 159). Como alternativa, puede usarse una variante de CimA de Leptospira interrogans (SEQ ID NO: 162). La actividad de isopropilmalato

isomerasa (EC 4.2.1.33; tambien denominada isopropilmalato deshidratasa), que cataliza la conversion de (R)- citramalato primero en citraconato y despues en beta-metil-D-malato, puede proporcionarse, por ejemplo, mediante la expresion de una protefna heterodimerica codificada por genes de E. coli o B. subtilis leuCD. La actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.85; beta-isopropil malato deshidrogenasa), que cataliza la conversion de beta-metil-D- 5 malato a 2-cetobutirato (es decir, alfa-cetobutirato) puede proporcionarse, por ejemplo, mediante la expresion de un gen leuB de E. coli o B. subtilis o un gen leu2 de levadura. Los ejemplos no limitantes de enzimas de la via de acidos grasos y de los polinucleotidos que codifican dichas enzimas para su uso en la modificacion por ingenierfa genetica de la parte (A.2) de la via de acidos grasos ramificados se proporcionan en la tabla 2.

Tabla 2. Ejemplos no limitantes de enzimas y secuencias codificantes de acidos nucleicos para su uso en la parte 10 (A.2) de la via biosintetica de anteiso-AGCR mostrada en la figura 3A.

Numero de EC: Organismo Sfmbolo del gen Numero de acceso de UniProtKB (Swiss-Prot) o referencia bibliografica Numero de acceso de protefna del NCBI SEQ ID NO: (pp, na)

EC 2.3.1.182: (R)-citramalato sintasa

: M. jannaschii cimA Q58787 NP_248395 156,157

: M.jannaschii (mutante) cimA 3.7 Atsumi y Liao (2008) 158,159

: Leptospira interrogans cimA Q8F3Q1 AAN49549 160,161

: Leptospira interrogans (mutante) cimA* (presente divulgacion) 162,163

EC 4.2.1.33: isopropilmalato isomerasa (3-isopropilmalato deshidratasa)

: E. coli K12 MG 1655 leuCD P0A6A6 (C, subunidad Lg); P30126 (D, subunidad Sm) (C) NP 414614 (D) NP_414613 164,165 166,167

: B. subtilis 168 leuCD P80858 (C, subunidad Lg); P94568 (d, subunidad Sm) (C) NP 390704 (D) NP_390703 168,169 170,171

EC 1.1.1.85: beta-isopropilmalato deshidrogenasa (3-isopropilmalato deshidrogenasa)

: E. coli K12 MG1655 leuB P30125 NP_414615 172,173

: B. subtilis leuB P05645 NP_390705.2 174,175

: S. cerevisiae leu2 P04173 NP_009911.2 176,177

Pueden identificarse polipeptidos adicionales, por ejemplo, efectuando una busqueda en una base de datos relevante (tal como la base de datos KEGG (University of Tokyo), las bases de datos PROTEIN o GENE (bases de datos Entrez; NCBI), las bases de datos UNIPROTKB o ENZYME (ExPASy; Swiss Institute of Bioinformatics) y la base de datos BRENDA (The Comprehensive Enzyme Information System; Technical University of Braunschweig)), 15 todas las cuales se encuentran disponibles en Internet, para los polipeptidos clasificados mediante los numeros EC anteriormente indicados. Por ejemplo, se pueden identificar polipeptidos de (R)-citramalato sintasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como Ec 2.3.1.182; se pueden identificar polipeptidos de isopropil malato isomerasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 4.2.1.33; y se pueden identificar polipeptidos de beta-isopropil malato deshidrogenasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 1.1.1.85.

20 En algunos aspectos, un polinucleotido que codifica un polipeptido de via de acidos grasos parental (tal como un polipeptido descrito en la tabla 2 o identificado por un numero de EC o por homologfa respecto de un polipeptido ejemplar) se modifica usando procedimientos bien conocidos en la tecnica para generar un polipeptido variante que tenga una actividad enzimatica indicada anteriormente (por ejemplo, actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropil malato isomerasa, actividad beta-isopropil malato deshidrogenasa) y una propiedad mejorada, en 25 comparacion con la del polipeptido parental, que es mas adecuada para la celula microbiana y/o para la via que se este modificando por ingenierfa genetica; tales como, por ejemplo, mayor actividad catalftica o estabilidad mejorada en condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante; inhibicion reducida (por ejemplo, inhibicion por retroalimentacion reducida) por un metabolito celular o por un componente del medio de cultivo y similares.

Parte B de la via: 2-cetobutirato a 2-ceto-3-metilvalerato

30 El a-cetobutirato producido por la primera y/o la segunda via puede convertirse posteriormente en el a-cetoacido ramificado, 2-ceto-3-metilvalerato, por la accion de enzimas con actividad acetohidroxiacido sintasa (tales como un complejo AHAS), actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa y actividad dihidroxiacido deshidratasa, representado por la parte (B) de la figura 3B.

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La condensacion de a-cetobutirato y piruvato con la descarboxilacion concomitante para formar el intermedio de 2- aceto-2-hidroxibutirato (a-aceto-a-hidroxibutirato) puede lograrse mediante la accion de una acetohidroxiacido sintasa (AHAS; por ejemplo, EC 2.2.1.6). AHAS (tambien denominada acetolactato sintasa) es una enzima de multiples subunidades que comprende una subunidad mayor y una subunidad menor codificadas por dos genes. Hay varias isozimas de AHAS presentes en bacterias, hongos y plantas. E. coli y diversas bacterias diferentes contienen isozimas AHAS denominadas AHAS I (por ejemplo, codificada por genes ilvBN), AHAS II (por ejemplo, codificada por genes ilvGM) y AHAS III (por ejemplo, codificada por genes ilvIH). En una realizacion, la actividad acetohidroxiacido sintasa presente en la celula microbiana progenitora es suficiente para catalizar la reaccion de 2- cetobutirato y piruvato en 2-aceto-2-hidroxibutirato. En otra realizacion, la celula microbiana recombinante se modifica por ingenierfa genetica para expresar de manera recombinante polipeptidos AHAS que tienen actividad acetohidroxiacido sintasa, en la que los polipeptidos AHAS catalizan la reaccion de 2-cetobutirato y piruvato en 2- aceto-2-hidroxibutirato. En algunas realizaciones, los polipeptidos que tienen actividad acetohidroxiacido sintasa se sobreexpresan en la celula microbiana recombinante. En caso de que la celula microbiana que se esta modificando por ingenierfa genetica sea una cepa K-12 de E. coli y, en caso de que se desee actividad AHAS II de E. coli, ha de introducirse un gen ilvG (o una agrupacion de genes ilvGM) procedente de una cepa de E. coli diferente o, el gen ilvG endogeno ha de repararse por procedimientos recombinantes, ya que el gen ilvG endogeno para E. coli K-12 es inactivo. Como alternativa, podrfan utilizarse las actividades AHAS I y AHAS III presentes en la celula E. coli K-12 progenitora (por ejemplo, codificadas por genes ilvBN y/o ilvIH endogenos).

A continuacion, la conversion del intermedio de 2-aceto-2-hidroxibutirato en 2,3-dihidroxi-3-metilvalerato (es decir, a,p-dihidroxi-p-metilvalerato) y despues en 2-ceto-3-metilvalerato (es decir, a-ceto-p-metilvalerato o 3-metil-2- oxopentanoato), puede lograrse expresando genes que codifican enzimas con actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa (por ejemplo, EC 1.1.1.86, codificadas por genes ilvC en bacterias y por genes ilv5 en levaduras y en plantas), que cataliza la conversion de 2-aceto-2-hidroxibutirato a 2,3-dihidroxi-3-metilvalerato; y actividad dihidroxiacido deshidratasa (por ejemplo, EC 4.2.1.9, codificada por genes ilvD en bacterias y por genes ilv3 en levaduras y en plantas), que cataliza la conversion de 2,3-dihidroxi-3-metilvalerato a 2-ceto-3-metilvalerato. En un aspecto, podrfan utilizarse genes endogenos para la celula microbiana progenitora (es decir, genes del hospedador nativos no recombinantes) y enzimas nativas codificadas por estos genes endogenos para las diversas etapas de la parte (B) de la via. Los ejemplos no limitantes de enzimas de la via de acidos grasos y de los polinucleotidos que codifican dichas enzimas adecuadas para su uso en la parte (B) de la via de acidos grasos ramificados se proporcionan en la tabla 3.

Tabla 3. Ejemplos no limitantes de enzimas y secuencias codificantes para su uso en la parte (B) de la via biosintetica de anteiso-AGCR mostrada en la figura 3B.

EC 2.2.1.6: acetohidroxiacido sintasa (acetolactato sintasa)

: E. coli K-12 MG 1655 ilvBN (AHAS 1) (llvB) P08142 (llvN) P0ADF8 (B)NP 418127 (N) NP_418126 178, 179 180, 181

: E. coli B ilvGM (AHAS II) (llvG) C6UI83 (llvM) C6UI84 (G) YP 003046821 (M) YP_003046822 182, 183 184, 185

: E. coli K-12 MG 1655 ilvIH (AHAS III) (llvl) P00893 (llvH) P00894 (1) YP 025294.2 (H) NP_414620 186, 187 188,189

: L. monocytogenes 08-5578 ilvBN (llvB) D2NVG7 (llvN) D2NVG8 (B)YP 003414294 (N)YP_003414295 190, 191 192, 193

EC 1.1.1.86: acetohidroxiacido isomerorreductasa (cetol-acido reductoisomerasa)

: E. coli K-12 MG 1655 ilvC P05793 NP_418222 194, 195

: B. subtilis 168 ilvC P37253 NP_390707 196, 197

EC 4.2.1.9: dihidroxiacido deshidratasa

: E. coli K-12 MG 1655 ilvD P05791 YP_026248 198, 199

: B. subtilis 168 ilvD P51785 NP_390070.2 200, 201

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Pueden identificarse polipeptidos adicionales, por ejemplo, efectuando una busqueda en una base de datos relevante (tal como la base de datos KEGG (University of Tokyo), las bases de datos PROTEIN o GENE (bases de datos Entrez; NCBI), las bases de datos UNIPROTKB o ENZYME (ExPASy; Swiss Institute of Bioinformatics) y la base de datos BRENDA (The Comprehensive Enzyme Information System; Technical University of Braunschweig)), todas las cuales se encuentran disponibles en Internet, para los polipeptidos clasificados mediante los numeros EC anteriormente indicados. Por ejemplo, se pueden identificar polipeptidos de acetohidroxiacido sintasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 2.2.1.6; se pueden identificar polipeptidos de acetohidroxiacido isomerorreductasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 1.1.1.86; y se pueden identificar polipeptidos de dihidroxiacido deshidratasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 4.2.1.9.

En algunos aspectos, un polinucleotido que codifica un polipeptido de via de acidos grasos parental (tal como un polipeptido descrito en la tabla 3 o identificado por un numero de EC o por homologfa respecto de un polipeptido ejemplar) se modifica usando procedimientos bien conocidos en la tecnica para generar un polipeptido variante que tenga una actividad enzimatica indicada anteriormente (por ejemplo, actividad acetohidroxiacido sintasa, actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa, actividad dihidroxiacido deshidratasa) y una propiedad mejorada, en comparacion con la del polipeptido parental, que es mas adecuada para la celula microbiana y/o para la via que se este modificando por ingenierfa genetica; tales como, por ejemplo, mayor actividad catalftica o estabilidad mejorada en condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante; inhibicion reducida (por ejemplo, inhibicion por retroalimentacion reducida) por un metabolito celular o por un componente del medio de cultivo y similares.

Parte C de la via: Alfa-cetoacido ramificado a acil-CoA ramificada

La molecula de acil-CoA ramificada se genera a partir del a-cetoacido ramificado, representado por la parte (C) de las figuras 1 y 3B, por la accion de un complejo de multiples componentes de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos ramificados (BKD). Los polinucleotidos que codifican componentes del complejo BKD pueden obtenerse de una celula microbiana que normalmente produce acidos grasos de cadena ramificada o que puede metabolizar aminoacidos ramificados o a-cetoacidos ramificados (incluyendo, pero sin limitacion, cepas de Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Listeria, Staphylococcus y Streptococcus).

El complejo BKD comprende al menos dos componentes: un componente E1 que tiene actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos (por ejemplo, EC 1.2.4.4) y que, dependiendo de la fuente, puede ser un solo polipeptido (es decir, un monomero) o, un heterodfmero denominado E1alfa y E1beta; y un componente E2 que tiene actividad lipoamida aciltransferasa (por ejemplo, EC 2.3.1.168). Los componentes tanto E1 (o E1alfa/E1beta) como E2 utilizan sustratos ramificados. En algunos casos, el complejo BDK comprende un tercer componente, denominado E3, que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa (por ejemplo, EC 1.8.1.4); en algunos casos, una enzima que tiene actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa y que utiliza sustratos de cadena ramificada puede obtenerse de una celula microbiana que normalmente no produce acidos grasos ramificados (tal como E. coli), que puede usarse en lugar de un componente E3 de BKD.

Para disenar por ingenierfa genetica la parte (C) de la via, la actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos ramificados (actividad de E1, por ejemplo, Ec 1.2.4.4) y la actividad lipoamida aciltransferasa (actividad de E2, por ejemplo, EC 2.3.1.168) del complejo bKd puede introducirse mediante la expresion de polinucleotidos que codifican E1 de BKD (o E1alfa/beta) y polipeptidos del componente E2 de microorganismos que normalmente producen acidos grasos ramificados o que pueden metabolizar aminoacidos ramificados o a-cetoacidos ramificados, tales como, por ejemplo, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus y Streptococcus mutans. La actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa (actividad de E3, por ejemplo, EC 1.8.1.4) puede introducirse igualmente por la expresion de un polinucleotido que codifica un componente E3 de un microorganismo que normalmente produce acidos grasos de cadena ramificada; como alternativa, puede usarse un polinucleotido que codifica un polipeptido con actividad dihidroprolil deshidrogenasa de un microorganismo que normalmente no produce acidos grasos de cadena ramificada, pero que, sin embargo, utiliza sustratos de cadena ramificada (por ejemplo, una dihidrolipolil deshidrogenasa de E. coli). En caso de que la celula microbiana recombinante que se esta modificando por ingenierfa genetica sea una que normalmente produce acidos grasos de cadena ramificada (y, como tal, produce un complejo BKD endogeno), pueden sobreexpresarse uno o mas componentes del complejo BKD endogeno.

Los ejemplos no limitantes de enzimas de la via de acidos grasos y de los polinucleotidos que codifican dichas enzimas para su uso en la modificacion por ingenierfa genetica de la parte (C) de la via de acidos grasos ramificados se proporcionan en la tabla 4.

Tabla 4. Ejemplos no limitantes de polipeptidos y secuencias codificantes del complejo BKD para su uso en la parte C de las vfas biosinteticas de AGCR mostradas en las figuras 1 y 3B.

Numero de EC: Organismo Sfmbolo del gen Numero de acceso de UniProtKB (Swiss-Prot) o referencia bibliografica Numero de acceso de protefna del NCBI SEQ ID NO: PP,na

EC 1.2.4.4: deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (descarboxilasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada; 3-metil-2-oxobutanoato deshidrogenasa (transferidora de 2-metilpropanoflo); 2-oxoisovalerato deshidrogenasa; componente E1 del complejo BKD)

: B. subtilis 168 bkdAA bkdAB P37940(E1a) P37941(E1b) NP 390285(E1a) NP_390284(E1 b) 1, 2 22, 23

: Streptomyces avermitilis MA-4860 bkdA bkdB Q53592 Q82F97 NP 825539 NP_825540 3, 4 24, 25

: Pseudomonas putida F1 Pput 1453 Pput_1452 A5W0F1 A5W0F0 YP 001266795 YP_001266794 5, 6 26, 27

: Listeria monocytogenes 085578 LM5578 1512 LM5578_1513 D2P1Z6 D2P1Z7 YP 003413622 YP_003413623 7, 8 28, 29

: Micrococcus luteus NCTC 2655 Mlut 06800 Mlut_06810 C5C9R0 C5C9R1 YP 002956766 YP_002956767 9, 10 30, 31

: Staphylococcus aureus A8819 D4UFQ9 D4UFQ8 ZP 06816445 ZP_06816444 11, 12 32, 33

: Streptococcus mutans UA159 adhA adhB Q8DWD7 Q8DWD6 NP 720600 NP_720601 13, 14 34, 35

EC 2.3.1.168: lipoamida aciltransferasa (dihidrolipoil transacilasa; transferasa de restos de dihidrolipolisina (2- metilpropanoflo); componente E2 del complejo BKD)

: B. subtilis 168 bkdB P37942 NP_390283 43, 44

: Streptomyces avermitilis MA- 4860 bkdC Q82F96 NP_825541 45, 46

: Pseudomonas putida F1 Pput_1451 A5W0E9 YP_001266793 47, 48

: Listeria monocytogenes 085578 LM5578_1514 D2P1Z8 YP_003413624 49, 50

: Micrococcus luteus NCTC 2655 Mlut_06810 C5C9R1 YP_002956767 51, 52

: Staphylococcus aureus JH1 SaurJH1_1607 A6U1Y7 YP_001316742 53, 54

: Streptococcus mutans UA159 adhC Q8DWD5 NP_720602 55, 56

EC 1.8.1.4: dihidrolipoamida deshidrogenasa (dihidrolipoil deshidrogenasa; componente del complejo E3 de BKD)

: Bacillus subtillis 168 IpdV P54533 NP_390286.2 63, 64

: Streptomyces avermitilis MA-4860 IpdA1 Q82AN3 NP_827200.2 65, 66

: Pseudomonas putida F1 Pput_1450 A5W0E8 YP_001266792 67, 68

: Listeria monocytogenes 085578 pdhD D2P0X6 YP_003413252 69, 70

: Micrococcus luteus NCTC 2655 Mlut_05640 C5C9F0 YP_002956656 71, 72

: Staphylococcus aureus ED98 IpdA D0K5A1 YP_003282417 73, 74

: Streptococcus mutans UA159 adhD Q8DWD4 NP_720603 75, 76

: E. coli IpdA P0A9P0 NP_414658 77, 78

Pueden identificarse polipeptidos adicionales, por ejemplo, efectuando una busqueda en una base de datos

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relevante (tal como la base de datos KEGG (University of Tokyo), las bases de datos PROTEIN o GENE (bases de datos Entrez; NCBI), las bases de datos UNIPROTkB o ENZyMe (ExPASy; Swiss Institute of Bioinformatics) y la base de datos BRENDA (The Comprehensive Enzyme Information System; Technical University of Braunschweig)), todas las cuales se encuentran disponibles en Internet, para los polipeptidos clasificados mediante los numeros EC anteriormente indicados. Por ejemplo, se pueden identificar polipeptidos de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 1.2.4.4; se pueden identificar polipeptidos de lipoamida aciltransferasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 2.3.1.168; y se pueden identificar polipeptidos de dihidrolipoil deshidrogenasa adicionales buscando polipeptidos clasificados como EC 1.8.1.4.

Los polipeptidos componentes del complejo BKD (tales como polipeptidos de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, polipeptidos de lipoamida aciltransferasa y polipeptidos de dihidrolipoil deshidrogenasa) tambien pueden identificarse buscando en una base de datos de estandares de secuencia, tal como la base de datos Prosite (ExPASy Proteomics Server, Swiss Institute of Bioinformatics) respecto de un polipeptido que comprende uno o mas de los motivos de secuencia listados a continuacion. Esto se logra facilmente, por ejemplo, usando la herramienta ScanProsite, que se encuentra disponible en el sitio de Internet del ExPASy Proteomics Server.

En una realizacion, un polipeptido de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos ramificados (subunidad E1-alfa de BKD) comprende uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre:

[S,Q]-x(2)-G-[Q,E]-E-A-x(3)-[G,A]-x-[G,A]-x-[V,A]-[L,T] (SEQ ID NO:15)

D-x(2)-[L,F]-P-x-Y-R (SEQ ID NO:16)

[S,T]-Q-x(2)-[H,Q]-A-[T,V]-G-x-A-[A,G] (SEQ ID NO:17)

[K,G]-x-[T,D]-x(2)-[A,V]-x-[A,V]-x(2)-G-[E,D]-G-x(4)-[G,S]-D-[F,V] (SEQ ID NO:18) F-[A,S]-[H,A]-V-x(2)-[L,A]-P-V-x-[L,F]-x(3)-N-N-x(2)-A-I-S (SEQ ID NO:19)

[K,R]-[G,A]-x-G-[C,Y]-[F,G]-x-[A,P]-[S,G]-x(2)-V-D-G-N-D (SEQ ID NO:20)

[H,R]-A-R-[A,R]-G-x-G-P-x-L-x-E-x(2)-[S,T]-Y-R-x(3)-H-x(3)-D-D-x(3)-Y-R (SEQ ID NO:21)

en los que los restos de aminoacidos en cada uno de los corchetes indican restos de aminoacidos alternativos en la posicion especffica, cada x indica cualquier resto de aminoacido y cada n en "x(n)" indica el numero de x restos en una serie contigua de restos de aminoacidos.

En otra realizacion, un polipeptido de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos ramificados (subunidad E1-beta de BKD) comprende uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre:

V-x-[V,I]-x-G-[Q,E]-D-V-G-x(2)-G-G-V-F-[R,K]-x-T-x-G-l (SEQ ID NO:36)

[Y,F]-G-[E,K]-x-R-[C,V]-x-D-[A,T]-P-[L,I]-[A,S]-E-[A,S]-[A,G]-l (SEQ ID NO:37)

G-T-[A,E]-x-[R,Y]-G-x-R-P-[l,V]-[A,V]-E-x-Q-F (SEQ ID NO:38)

P-[C,Y]-G-G-[V,I]-x-[A,G]-x(3)-H-S-x-S-x-E-A-x-[F,Y] (SEQ ID NO:39)

[E,D]-D-P-V-x-[F,Y]-x-E-[H,P]-K-R-x-Y (SEQ ID NO:40)

[H,E]-V-[l,V]-D-L-R-[T,S]-x(2)-P-x-D (SEQ ID NO:41)

E-x-C-[L,F]-x-[D,H]-L-[D,E]-A-P-x(2)-R-[L,V]-x-G-x-[H,D]-P (SEQ ID NO:42)

En otra realizacion, un polipeptido de lipoamida aciltransferasa (componente E2 de BKD) comprende uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre:

P-x-V-[L,R]-x-[R,L]-A-x(3)-G-x-[D,E]-L (SEQ ID NO:57) [G,P]-[S,T]-G-[A,P]-x-G-x-l (SEQ ID NO:58)

[V,I]-P-[L,V]-x-G-[L,V]-R-x-[A,K]A-x(2)-[L,M]-x(2)-[A,S] (SEQ ID NO:59) G-[G,S]-T-x-T-x(2)-[N,S]-x-G-x-[F,L]-G (SEQ ID NO:60)

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N-x-P-E-x-A-[l,M]-[L,V]-x-V-x(2)-[l,M]-x(3)-P-x-V (SEQ ID NO:61)

L-x-[L,S]-[S,T]-F-[D,L]-H-R-[V,L]-x-D-G (SEQ ID NO:62)

en los que los restos de aminoacidos en cada uno de los corchetes indican restos de aminoacidos alternatives en la posicion especffica, cada x indica cualquier resto de aminoacido y cada n en "x(n)" indica el numero de x restos en una serie contigua de restos de aminoacidos.

En otra realizacion, un polipeptido de dihidrolipoil deshidrogenasa (componente E3 de BKD) comprende uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre:

[I,V]-G-G-[A,T]-[S,C]-[V;L]-x(2)-[G,D]-C-[V,I]-P-[T,S]-K-[A,T]-[M,L]-[I,L] (SEQ ID NO:79)

[L,I]-A-T-G-[G,S]-x-[S,P]-x(2)-L-[A,P]-[D,G]-x(3)-[D,L]-G (SEQ ID NO:80) [V,I]-x-G-[G,S]-G-x-[l,T]-G-x-E-x-[A,G] (SEQ ID NO:81)

T-x(6)-[A, V]-x-G-D-x(2 )-[P,G] (SEQ ID NO:82)

[l,V]-[G,A]-x(2)-[F,I]-[T,H]-x-[Y,H]-P-[S;T]-[Q,L] (SEQ ID NO:83)

En algunos aspectos, un polinucleotido que codifica un polipeptido de via de acidos grasos parental (tal como un polipeptido de complejo bKd descrito en la tabla 4 o identificado por un numero de EC o por homologfa respecto de un polipeptido ejemplar) se modifica usando procedimientos bien conocidos en la tecnica para generar un polipeptido variante que tenga actividad enzimatica de complejo BKD y una propiedad mejorada, en comparacion con la del polipeptido parental, que es mas adecuada para la celula microbiana y/o para la via que se este modificando por ingenierfa genetica; tales como, por ejemplo, mayor actividad catalftica o estabilidad mejorada en condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante; inhibicion reducida (por ejemplo, inhibicion por retroalimentacion reducida) por un metabolito celular o por un componente del medio de cultivo y similares.

La actividad enzimatica del complejo BKD puede medirse de acuerdo con diversos protocolos conocidos. Por ejemplo, Sokatch y col. describieron una mezcla de ensayo que contiene: tampon de fosfato potasico 100 mM (pH 7,0), NAD+ 2 mM, coenzima A 0,1 mM, ditiotreitol 0,2 mM, pirofosfato de tiamina 0,2 mM, cloruro de magnesio 1 mM y L-valina 5 mM. La reaccion puede iniciarse anadiendo 4,0 pmol de la sal sodica de un sustrato de a-cetoacido de cadena ramificada, tal como 2-ceto-3-metilvalerato (Sokatch y col., J. Bacteriology 148(2):647-652 (1981)).

Parte D de la via: Acil-CoA ramificada a B-cetoacil-ACP ramificada

Como se indico anteriormente, la acil-CoA ramificada sirve como cebador para las posteriores etapas de elongacion catalizadas por FAS. El inicio del este proceso implica la condensacion de la acil-CoA ramificada con una molecula de malonil-ACP para formar un intermedio de p-cetoacil-ACP ramificado. Por ejemplo, la molecula de acil-CoA anteiso-ramificada, 2-metilbutiril-CoA, puede condensarse con malonil-ACP para formar un intermedio de p-cetoacil- ACP anteiso-ramificado, 4-metil-3-oxo-hexanoil-ACP, mientras que la molecula de acil-CoA iso-ramificada, isobutiril- CoA, puede condensar con malonil-ACP para formar un intermedio de p-cetoacil-ACP iso-ramificado, 4-metil-3-oxo- pentanoil-ACP (figuras 2A y 2B).

Esta etapa de iniciacion, representada por la parte (D) de las figuras 1 y 3, se cataliza en la celula microbiana recombinante por una enzima que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa (tal como, una beta-cetoacil-ACP sintasa de tipo III (por ejemplo, EC 2.3.1.180)) que utiliza moleculas de acil-CoA ramificadas (por ejemplo, moleculas de acil-CoA anteiso-ramificadas) como sustratos. Dicha enzima tambien se cita en el presente documento como una enzima que tiene "actividad sintasa de beta-cetoacil-ACP de cadena ramificada". Puede obtenerse una secuencia de polinucleotidos que codifica un polipeptido que tiene actividad sintasa de beta-cetoacil-ACP de cadena ramificada a partir de una celula microbiana que normalmente produce acidos grasos de cadena ramificada (incluyendo, pero sin limitacion, cepas de Bacillus, Streptomyces, Stenotrophomonas, Listeria, Staphylococcus, y Streptococcus), y se expresa o sobreexpresa en la celula microbiana recombinante.

En algunos casos, una o mas enzimas endogenas para la celula microbiana progenitora podrfan competir por el sustrato con enzimas de la via biosintetica de acidos grasos ramificados modificada por ingenierfa genetica en la celula microbiana recombinante o podrfan descomponer o de otro modo desviar un intermedio en la via biosintetica; los genes que codifican dichas enzimas endogenas pueden atenuarse para aumentar la produccion de acidos grasos ramificados en la celula microbiana recombinante. Por ejemplo, en E. coli, la p-cetoacil-ACP sintasa III endogena (numero de acceso de la protefna de UniProtKB/Swiss-Prot P0A6R0), codificada por el gen fabH de E. coli, utiliza principalmente moleculas de acil-CoA de cadena lineal, tales como acetil-CoA, pero no utiliza moleculas de acil-CoA ramificadas y por lo tanto, compite con enzimas de la via de cadena ramificada por el malonil-ACP y otros sustratos y deriva el flujo fuera de la via de AGCR. La eliminacion o de otro modo atenuacion del gen fabH de

E. coli dirige, por lo tanto, la biosfntesis de acidos grasos en una E. coli recombinante que comprende una via de AGCR mas hacia la produccion de acidos grasos ramificados. Otras enzimas endogenas que pueden no ser deseables y que pueden atenuarse en la celula microbiana recombinante incluyen, por ejemplo, el gen fadE de E. coli que codifica una acil-CoA deshidrogenasa que metaboliza intermedios de acil-CoA.

5 Los ejemplos no limitantes de enzimas de la via de acidos grasos y de los polinucleotidos que codifican dichas enzimas para su uso en la modificacion por ingenierfa genetica de la parte D de la via de acidos grasos ramificados se proporcionan en la tabla 5.

Tabla 5. Ejemplos no limitantes de enzimas y secuencias codificantes para su uso en la parte D de las vfas biosinteticas de AGCR mostradas en las figuras 1 y 3B.

Numero de EC: Organismo Sfmbolo del gen Numero de acceso de UniProtKB (Swiss-Prot) o referencia bibliografica Numero de acceso de protefna del NCBI SEQ ID NO: pp, na

EC 2.3.1.180: beta-cetoacil-ACP sintasa III

: B. subtilis 168 fabH1 O34746 NP_389015 84, 85

: B. subtilis 168 fabH2 O07600 NP_388898 86, 87

: Staphylococcus aureus MW2 fabH Q8NXE2 NP_645682 88, 89

: Streptomyces avermitilis MA-4680 fabH3 Q82KT2 NP_823466 90, 91

: Streptococcus mutans UA159 fabH Q8DSN2 NP_722071 92, 93

: Lactococcus lactis subsp. lactis fabH Q9CHG0 NP_266927 94, 95

: Streptomyces coelicolor fabH Q9K3G9 CAB99151 96, 97

: Listeria monocytogenes fabH B8DFA8 YP_002349314 98, 99

: L. monocytogenes (mutante) fabH2 (presente divulgacion) 100, 101

: Bacteroides vulgatus fabH A6KXK3 YP_001297789 102, 103

: Clostridium acetobutylicum fabH Q97DA2 NP_350161 104, 105

: Flavobacterium johnsoniae fabH2 A5FM89 YP_001193000 106, 107

: Micrococcus luteus fabH C5CAR9 YP_002957006 108, 109

10 Pueden identificarse polipeptidos de beta-cetoacil-ACP sintasa III adicionales, por ejemplo, efectuando una busqueda en una base de datos relevante (tal como la base de datos KEGG (University of Tokyo), las bases de datos PROTEIN o GENE (bases de datos Entrez; NCBI), las bases de datos UNIPROTKB o ENZYME (ExPASy; Swiss Institute of Bioinformatics) y la base de datos BRENDA (The Comprehensive Enzyme Information System; Technical University of Braunschweig)), todas las cuales se encuentran disponibles en Internet, respecto de 15 polipeptidos clasificados como EC 2.3.1.180.

Tambien se pueden identificar polipeptidos de beta-cetoacil-ACP sintasa III adicionales buscando en una base de datos de estandares de secuencia, tal como la base de datos Prosite (ExPASy Proteomics Server, Swiss Institute of Bioinformatics) respecto de un polipeptido que comprende uno o mas de los motivos de secuencia listados a continuacion. Esto se logra facilmente, por ejemplo, usando la herramienta ScanProsite, que se encuentra disponible 20 en el sitio de Internet del ExPASy Proteomics Server.

En una realizacion, un polipeptido de beta-cetoacil-ACP sintasa III comprende uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre:

D-T-[N,S]D-[A,E]-W-I-x(2)-[M,R]-T-G-I-x-[N,E]-R-[R,H] (SEQ ID NO:110) [S,A]-x-D-x(2)-A-[A,V]-C-[A,S]-G-F-x(3)-[M,L]-x(2)-A (SEQ ID NO:111)

25 D-R-x-T-[A,I]-[I,V]-x-F-[A,G]-D-G-A-[A,G]-[G,A]-[A,V] (SEQ ID NO:112)

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H-Q-A-N-x-R-I-[M,L] (SEQ ID NO:113)

G-N-T-[G,S]-A-A-S-[V,I]-P-x(2)-[I,L]-x(6)-G (SEQ ID NO:114)

[I,V]-x-L-x(2)-F-G-G-G-[L,F]-[T,S]-W-G (SEQ ID NO:115)

En algunos aspectos, un polinucleotido que codifica un polipeptido parental de la via de acidos grasos (tal como un polipeptido descrito en la tabla 5 o identificado por el numero de EC o por el motivo o por homologfa respecto de un polipeptido ejemplar) se modifica usando procedimientos bien conocidos en la tecnica para generar un polipeptido variante que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa III y una propiedad mejorada, en comparacion con la del polipeptido parental, que es mas adecuada para el microorganismo y/o para la via que se este modificando por ingenierfa genetica; tales como, por ejemplo, mayor actividad catalftica o estabilidad mejorada en condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante, inhibicion reducida (por ejemplo, inhibicion por retroalimentacion reducida) por un metabolito celular o por un componente del medio de cultivo y similares.

En el presente documento se describe un polipeptido aislado que comprende una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad respecto de una de las SEQ ID NO: 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 102, 104, 106 y 108 y que comprende una sustitucion en la posicion W310 o en una posicion equivalente a esta, en el que el polipeptido tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa. Ademas, en el presente documento se describe un polinucleotido aislado que codifica uno cualquiera de dichos polipeptidos. En un aspecto, el polipeptido comprende una sustitucion W310G. En un aspecto, el polipeptido comprende una secuencia que tiene al menos un 80% de identidad respecto de la SEQ ID NO: 98 y comprende la sustitucion W310G. En otro aspecto, el polipeptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 100. En algunos aspectos, el polinucleotido codifica la secuencia SEQ ID NO: 100 o comprende la secuencia de SEQ ID NO: 101.

La actividad enzimatica y la especificidad por sustratos ramificados de las beta-cetoacil-ACP sintasas pueden determinarse usando procedimientos conocidos. Por ejemplo, Choi y col. (J. Bacteriology 182(2):365-370 (2000)) describieron en detalle un ensayo en disco filtrado adecuado para determinar la actividad p-cetoacil-ACP sintasa ("FabH") contra sustratos de acetil-CoA, que puede modificarse para usar sustratos de acil-CoA de cadena ramificada. El ensayo contiene ACP 25 pM, p-mercaptoetanol 1 mM, malonil-CoA 65 pM, [l-14C]acetil-CoA 45 pM (actividad especffica de 45,8 Ci/mol), FadD de E.coli (0,2 pg) y tampon de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,0) en un volumen final de 40 pl. Para evaluar la actividad sintasa de p-cetoacil-ACP de cadena ramificada, puede sustituirse la [I-14C]acetil-CoA por una acil-CoA ramificada marcada con 14C. La reaccion se inicia por la adicion de FabH y la mezcla se incuba a 37°C durante 12 minutos. Despues, se retira una alfcuota de 35 ml y se deposita en un disco de filtro Whatman de 3 MM. Despues, se lavan los discos con tres cargas (20 ml/disco durante 20 minutos cada una) de acido tricloroacetico enfriado en hielo. Despues, se reduce la concentracion del acido tricloroacetico del 10 al 5 a 1% en cada lavado sucesivo. Los discos se secan y se cuentan en 3 ml de coctel de centelleo.

Como alternativa, puede determinarse la actividad de FabG usando electroforesis en gel para separar y cuantificar los productos (Choi y col., anteriormente citado). La mezcla de ensayo contiene ACP 25 pM, p-mercaptoetanol 1 mM, [2-14C] malonil-CoA 70 pM (actividad especffica, ~ 9 Ci/mol), 45 pM de un sustrato de CoA (tal como acetil-CoA; o, para evaluar la sintasa de p-cetoacil-ACP de cadena ramificada, isobutiril-CoA, isovaleril-CoA o 2-metilbutiril- CoA), FadD (0,2 pg), NADPH 100 pM, FabG (0,2 pg) y tampon de fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,0) en un volumen final de 40 pl. La reaccion puede iniciarse por la adicion de FabH. La mezcla se incuba a 37°C durante 12 y despues se coloca en una suspension de hielo, despues se anade tampon de carga de gel y la mezcla se carga en un gel de poliacrilamida al 13% sensible a la conformacion que contiene urea de 0,5 a 2,0 M. La electroforesis puede llevarse a cabo a 25°C a 32 mA/gel. Despues, se secan los geles y se cuantifican las bandas por exposicion del gel a una pantalla PhosphoImager. La actividad especffica puede calcularse a partir de las pendientes de la grafica de formacion de producto frente a concentracion de protefna FabH en el ensayo.

Parte E de la via; B-cetoacil-ACP ramificada a acil-ACP grasa ramificada

El intermedio de p-cetoacil-ACP ramificado generado en la parte (D) puede sufrir elongacion por ciclos sucesivos de condensacion con malonil-ACP/ceto-reduccion/deshidratacion/reduccion de enoflo, catalizados por un complejo de sintasa de acidos grasos (FAS), tal como, por ejemplo, un complejo de sintasa de acidos grasos de tipo II, anadiendo de este modo 2 unidades de carbono a la cadena de acido graso en crecimiento de la acil-ACP ramificada resultante, como se representa por la parte (E) de la figura 1. En un aspecto, un intermedio de p-cetoacil-ACP anteiso-ramificado produce un intermedio de acil-ACP anteiso-ramificado. En otro aspecto, un intermedio de p- cetoacil-ACP iso-ramificado produce un intermedio de acil-ACP iso-ramificado. En un aspecto, se usa un complejo de enzima FAS (tal como, por ejemplo, un complejo FAS de tipo II) endogeno para la celula microbiana para catalizar ciclos de condensacion con malonil-ACP/ceto-reduccion/deshidratacion/reduccion de enoflo para producir el intermedio de acil-ACP ramificado.

Derivados de acidos grasos ramificados

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Los derivados de acidos grasos ramificados (incluyendo acidos grasos ramificados, esteres grasos ramificados, aldehfdos grasos ramificados, alcoholes grasos ramificados, hidrocarburos ramificados y cetonas ramificadas, en forma iso-ramificada o anteiso-ramificada) pueden producirse por una celula microbiana recombinante de la presente divulgacion. El intermedio de acil-ACP ramificado se convierte en un derivado de acido graso en una reaccion catalizada por una enzima que tiene actividad derivada de acidos grasos (es decir, una enzima derivada de acidos grasos). Una enzima derivada de acidos grasos puede, por ejemplo, convertir una acil-ACP ramificada en un derivado de acido graso inicial o, puede convertir el derivado de acido graso inicial en un segundo derivado de acido graso. En algunos casos, el derivado de acido graso inicial se convierte en un segundo derivado de acido graso por medio de una enzima que tiene una actividad derivada de acidos grasos diferente. En algunos casos, el segundo derivado de acidos grasos se convierte adicionalmente en un tercer derivado de acidos grasos por medio de otra enzima derivada de acidos grasos y asf sucesivamente.

Por consiguiente, en algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas uno o mas polinucleotidos, codificando cada polinucleotido un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos grasos ramificados cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

En diversos aspectos, la actividad derivada de acidos grasos comprende actividad tioesterasa, en la que la celula microbiana recombinante produces acidos grasos ramificados; actividad ester sintasa, en la que la celula microbiana recombinante produces esteres grasos ramificados; actividad biosintetica de aldehfdos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produces aldehfdos grasos ramificados; actividad biosintetica de alcoholes grasos, en la que la celula microbiana recombinante produces alcoholes grasos ramificados; actividad biosintetica de cetonas, en la que la celula microbiana recombinante produces cetonas ramificadas; o actividad biosintetica de hidrocarburos, en la que la celula microbiana recombinante produces hidrocarburos ramificados. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende polinucleotidos que codifican dos o mas polipeptidos, teniendo cada polipeptido actividad de enzima derivada de acidos grasos.

En aspectos mas particulares, la celula microbiana recombinante expresa o sobreexpresa uno o mas polipeptidos que tienen actividad de enzima derivada de acidos grasos como se ha descrito anteriormente en el presente documento, en la que la celula microbiana recombinante produce una composicion que comprende acidos grasos ramificados, esteres grasos ramificados, esteres de cera ramificados, aldehfdos grasos ramificados, alcoholes grasos ramificados, alcanos ramificados, alcanos ramificados, olefinas internas ramificadas, olefinas terminales ramificadas o cetonas ramificadas.

A continuacion se presentan ejemplos adicionales de enzimas derivadas de acidos grasos y de derivados de acidos grasos producidos mediante reacciones catalizadas por dichas enzimas, de acuerdo con diversas realizaciones de la invencion.

Acido graso ramificado

En un aspecto, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica una tioesterasa y el intermedio de acil-ACP graso ramificado producido por la celula microbiana recombinante se hidroliza por la tioesterasa (por ejemplo, 3.1.1.5, EC 3.1.2.-; tales como, por ejemplo, EC 3.1.2.14) dando como resultado la produccion de un acido graso ramificado. En algunos aspectos, se produce una composicion que comprende acidos grasos ramificados (tambien citada en el presente documento como una "composicion de acidos grasos ramificados") cultivando la celula recombinante en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. En algunos aspectos, la composicion se recupera del cultivo celular. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad tioesterasa y uno o mas polinucleotidos adicionales que codifican polipeptidos que tienen otras actividades de enzima derivada de acidos grasos. En algunos casos similares, el acido graso ramificado producido por la accion de la tioesterasa se convierte mediante una o mas enzimas que tienen diferentes actividades de enzima derivada de acidos grasos en otros derivados de acidos grasos ramificados, tales como, por ejemplo, un ester graso ramificado, un aldehfdo graso ramificado, un alcohol graso ramificado o un hidrocarburo ramificado.

Como se describe en el presente documento, un intermedio de acil-ACP graso anteiso-ramificado reacciona con una tioesterasa para formar un acido graso anteiso-ramificado. El acido graso anteiso-ramificado puede recuperarse del cultivo celular o puede convertirse adicionalmente en otro derivado de acido graso anteiso-ramificado, tal como un ester graso anteiso-ramificado, un aldehfdo graso anteiso-ramificado, un alcohol graso anteiso-ramificado o un hidrocarburo anteiso-ramificado.

La longitud de la cadena de un acido graso o de un derivado de acido graso producido a partir del mismo, puede seleccionarse modificando la expresion de ciertas tioesterasas. La tioesterasa ejerce influencia en la longitud de cadena de los acidos grasos producidos, asf como en la de los derivados producidos a partir de los mismos. Por lo tanto, la celula microbiana recombinante puede modificarse por ingenierfa genetica para que exprese, sobreexprese, tenga una expresion atenuada o no exprese una o mas tioesterasas seleccionadas para aumentar la produccion de un acido graso o sustrato de derivado de acido graso preferido. Por ejemplo, pueden producirse acidos grasos C10 expresando una tioesterasa que tiene preferencia por la produccion de acidos grasos C10 y atenuando las

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tioesterasas que tienen preferencia por la produccion de acidos grasos distintos de acidos grasos C10 (por ejemplo, una tioesterasa que prefiere la produccion de acidos grasos C14). Esto podna dar como resultado una poblacion relativamente homogenea de acidos grasos que tienen una longitud de la cadena de carbono de 10. En otros casos, pueden producirse acidos grasos C14 atenuando las tioesterasas endogenas que producen acidos grasos no C14 y expresando tioesterasas que usan C14-ACP. En algunas situaciones, pueden producirse acidos grasos C12 expresando tioesterasas que usan C12-ACP y atenuando tioesterasas que producen acidos grasos no C12. Puede verificarse la sobreproduccion de acidos grasos usando procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante el uso de precursores radiactivos, HPlC o CG-EM posterior a la lisis celular.

Se proporcionan ejemplos no limitantes adicionales de tioesterasas y polinucleotidos que las codifican para su uso en la via de acidos grasos ramificados en la tabla 6 y en la Publicacion PCT n.° WO 2010/075483.

Tabla 6. Ejemplos no limitantes de tioesterasas y secuencias codificantes de las mismas para su uso en la via de AGCR mostrada en la figura 1.

Numero de EC: Organismo Sfmbolo del gen Numero de acceso de UniProtKB (Swiss-Prot) o referencia bibliografica Numero de acceso de protema del NCBI SEQ ID NO: pp, na

EC 3.1.2.-,: Tioesterasa

: E. coli K-12 MG 1655 tesA P0ADA1 AAC73596 202, 203

: E. coli (sin secuencia lfder) 'tesA Cho y col, J. Biol. Chem., 270:4216-4219 (1995) 204, 205

: E. coli K-12 MG 1655 tesB P0AGG2 AAC73555 206, 207

: Arabidopsis thaliana fatA Q42561 NP_189147 208, 209

: Arabidopsis thaliana fatB Q9SJE2 NP_172327 210, 211

: Umbellularia California fatB Q41635 AAA34215 212, 213

: Cuphea hookeriana fatAI Q9ZTF7 AAC72883 214, 215

: Cuphea hookeriana fatB2 039514 AAC49269 216, 217

: Cuphea hookeriana fatB3 Q9ZTF9 AAC72881 218, 219

: Cinnamonum camphorum fatB Q39473 AAC49151 220, 221

: Brassica juncea fatA Q94IN9 CAC39106 222, 223

: Helianthus annus fatAI Q6K1M5 AAL79361 224,225

Ester graso ramificado

En un aspecto, la celula microbiana recombinante produces un ester graso ramificado (por ejemplo, un ester graso anteiso-ramificado o un ester graso iso-ramificado), tal como, por ejemplo, un metil ester de acido graso ramificado o un etil ester de acido graso ramificado o un ester de cera ramificado. En algunos aspectos, se convierte un acido graso ramificado producido por la celula microbiana recombinante en el ester graso ramificado.

En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido (es decir, una enzima) que tiene actividad ester sintasa (tambien citada en el presente documento como "polipeptido de ester sintasa" o una "enzima ester sintasa"), y el ester de acido graso ramificado se produce mediante una reaccion catalizada por el polipeptido de ester sintasa expresado o sobreexpresado en la celula microbiana recombinante. En algunos aspectos, se recupera del cultivo celular una composicion que comprende esteres grasos ramificados (tambien citada en el presente documento como una "composicion de esteres grasos ramificados") producida cultivando la celula recombinante en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. En algunos aspectos, la celula recombinante produce una composicion de ester graso ramificado que comprende esteres grasos anteiso-ramificados.

Los polipeptidos de ester sintasa incluyen, por ejemplo, un polipeptido de ester sintasa clasificado como EC 2.3.1.75 o cualquier otro polipeptido que catalice la conversion de un acil-tioester en un ester graso, incluyendo, sin limitacion, una sintasa de ester de cera, una transacilasa de acil-CoA:alcohol, una aciltransferasa o una aciltransferasa de acil- CoA graso:alcohol graso. Por ejemplo, el polinucleotido puede codificar cera/dgat, una ester sintasa/acil- CoA:diacilglicerol aciltransferasa bifuncional de Simmondsia chinensis, Acinetobacter sp. cepa ADP1, Alcanivorax borkumensis, Pseudomonas aeruginosa, Fundibacter jadensis, Arabidopsis thaliana o Alkaligenes eutrophus. En una realizacion particular, el polipeptido de ester sintasa es una diacilglicerol O-aciltransferasa de Acinetobacter sp. (wax- dgaT; UniProtKB Q8GGG1, GenBank AAO17391) o cera sintasa de Simmondsia chinensis (UniProtKB Q9XGY6, GenBank AAD38041). En una realizacion particular, se sobreexpresa el polinucleotido que codifica el polipeptido de ester sintasa en la celula microbiana recombinante. En algunas realizaciones, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica una tioesterasa.

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En otro aspecto, la celula microbiana recombinante produce un ester de acido graso ramificado, tal como, por ejemplo, un metil ester de acido graso ramificado o un etil ester de acido graso ramificad, en el que la celula microbiana recombinante expresa un polinucleotido que codifica un polipeptido de ester sintasa/aciltransferasa clasificado como 2.3.1.20, tal como AtfA1 (una aciltransferasa procedente de Alcanivorax borkumensis SK2, UniProtKB Q0VKV8, GenBank YP_694462) o AtfA2 (otra aciltransferasa procedente de Alcanivorax borkumensis SK2, UniProtKB Q0VNJ6, GenBank YP_693524). En un aspecto particular, se sobreexpresa el polinucleotido que codifica el polipeptido de ester sintasa en la celula microbiana recombinante. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica una tioesterasa.

En otro aspecto, la celula microbiana recombinante produce un ester de acido graso ramificado, tal como, por ejemplo, un metil ester de acido graso ramificado o un etil ester de acido graso ramificad, en la que la celula microbiana recombinante expresa un polinucleotido que codifica un polipeptido de ester sintasa, tal como ES9 (una sintasa de ester de cera de Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798, UniProtKB A3RE51, GenBank ABO21021, codificada por el gen ws2) o ES376 (otra sintasa de ester de cera procedente de Marinobacter hydrocarbonoclasticus DsM 8798, UniProtKB A3RE50, GenBank ABO21020, codificada por el gen wsl). En un aspecto particular, se sobreexpresa el polinucleotido que codifica el polipeptido de ester sintasa en la celula microbiana recombinante. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica una tioesterasa.

Algunos ejemplos adicionales no limitantes de polipeptidos de ester sintasa y de polinucleotidos que los codifican adecuados para su uso en estos aspectos incluyen los descritos en las Publicaciones PCT n.° WO 2007/136762 y WO2008/119082.

Aldehido graso ramificado

En un aspecto, la celula microbiana recombinante produce un aldehido graso ramificado. En algunos aspectos, se convierte un acido graso ramificado producido por la celula microbiana recombinante en un aldehido graso ramificado. En algunos aspectos, el aldehido graso ramificado producid por la celula microbiana recombinante se convierte posteriormente en un alcohol graso ramificado o un hidrocarburo ramificado.

En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido (es decir, una enzima) que tiene actividad biosintetica de aldehfdos grasos (tambien citada en el presente documento como un "polipeptido biosintetico de aldehfdos grasos" o una "enzima biosintetica de aldehfdos grasos") y el aldehido graso ramificado se produce mediante una reaccion catalizada por el polipeptido biosintetico de aldehfdos grasos expresado o sobreexpresado en la celula microbiana recombinante. En algunos aspectos, se recupera del cultivo celular una composicion que comprende aldehfdos grasos ramificados (tambien citada en el presente documento como una "composicion de aldehfdos grasos ramificados") producidos cultivando la celula recombinante en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. En algunos aspectos, la celula recombinante produce una composicion de aldehido graso ramificado que comprende aldehfdos grasos anteiso-ramificados.

En algunos aspectos, el aldehido graso ramificado se produce expresando o sobreexpresando en la celula microbiana recombinante un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad biosintetica de aldehfdos grasos, tal como una actividad acido carboxflico reductasa (CAR) (codificado, por ejemplo, por un gen car). Algunos ejemplos de polipeptidos de reductasa de acidos carboxflicos (CAR) y de polinucleotidos que los codifican utiles de acuerdo con este aspecto incluyen, pero sin limitacion, FadD9 (EC 6.2.1.-, UniProtKB Q50631, GenBank NP_217106), CarA (GenBank ABK75684), CarB (GenBank YP889972) y polipeptidos relacionados descritos en la Publicacion PCT n.° WO 2010/062480. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica una tioesterasa.

En algunos aspectos, el aldehido graso ramificado se produce expresando o sobreexpresando en la celula microbiana recombinante un polinucleotido que codifica un polipeptido biosintetico de aldehfdos grasos, tal como un polipeptido que tiene actividad acil-ACP reductasa (AAR), codificado, por ejemplo, por un gen aar. Algunos ejemplos de polipeptidos de acil-ACP reductasa utiles de acuerdo con este aspecto incluyen, pero sin limitacion, acil-ACP reductasa de Synechococcus elongatus PCC 7942 (GenBank YP_400611) y polipeptidos relacionados descritos en la Publicacion PCT n.° WO 2010/042664.

En algunos aspectos, el aldehido graso ramificado se produce expresando o sobreexpresando en la celula microbiana recombinante un polinucleotido que codifica un polipeptido biosintetico de aldehfdos grasos, tal como un polipeptido que tiene actividad acil-CoA reductasa (por ejemplo, EC 1.2.1.x), codificado, por ejemplo, por un gen acr1. Algunos ejemplos de polipeptidos de acil-CoA reductasa utiles de acuerdo con este aspecto incluyen, pero sin limitacion, ACR1 de Acinetobacter sp. cepa ADP1 (GenBank YP_047869) y polipeptidos relacionados descritos en la Publicacion PCT n.° WO 2010/042664. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas polinucleotidos que codifican una tioesterasa y una acil-CoA sintasa.

Alcohol graso ramificado

En un aspecto, la celula microbiana recombinante produces un alcohol graso ramificado (por ejemplo, un alcohol

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graso anteiso-ramificado o un alcohol graso iso-ramificado). En algunos aspectos, se convierte un aldehfdo graso ramificado producido por la celula microbiana recombinante en el alcohol graso ramificado.

En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido (es decir, una enzima) que tiene actividad biosintetica de alcoholes grasos (tambien citado en el presente documento como un "polipeptido biosintetico de alcoholes grasos" o una "enzima biosintetica de alcoholes grasos") y el alcohol graso ramificado se produce mediante una reaccion catalizada por la enzima biosintetica de alcoholes grasos expresada o sobreexpresada en la celula microbiana recombinante. En algunos aspectos, se recupera del cultivo celular una composicion que comprende alcoholes grasos ramificados (tambien citada en el presente documento como una "composicion de alcoholes grasos ramificados") producidos cultivando la celula recombinante en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. En algunos aspectos, la celula recombinante produce una composicion de alcohol graso ramificado que comprende alcoholes grasos anteiso-ramificados.

En algunos aspectos, el alcohol graso ramificado se produce expresando o sobreexpresando en la celula microbiana recombinante un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad biosintetica de alcoholes grasos, tal como una actividad alcohol deshidrogenasa (aldehfdo reductasa), por ejemplo, EC 1.1.1.1. Algunos ejemplos de polipeptidos de alcohol deshidrogenasa utiles de acuerdo con este aspecto incluyen, pero sin limitacion, alcohol deshidrogenasa YqhD de E. coli (GenBank AP_003562) y polipeptidos relacionados descritos en las Publicaciones PCT n.° WO 2007/136762 y} WO2008/119082. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica un polipeptido biosintetico de aldehfdos grasos. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica una tioesterasa.

En algunos aspectos, el alcohol graso ramificado se produce expresando o sobreexpresando en la celula microbiana recombinante un polinucleotido que codifica un polipeptido biosintetico de alcoholes grasos, tal como un polipeptido que tiene actividad acil-CoA reductasa (FAR) formadora de alcohol graso, por ejemplo, EC 1.1.1.x. Algunos ejemplos de polipeptidos FAR utiles de acuerdo con este aspecto incluyen, pero sin limitacion, los descritos en la Publicacion PCT n.° WO 2010/062480. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas polinucleotidos que codifican una tioesterasa y una acil-CoA sintasa.

Hidrocarburo ramificado

En un aspecto, la celula microbiana recombinante produce un hidrocarburo ramificado (por ejemplo, un hidrocarburo anteiso-ramificado o un hidrocarburo iso-ramificado), tal como un alcano ramificado o un alqueno ramificado (por ejemplo, una olefina terminal ramificada o una olefina interna ramificada). En algunos aspectos, se convierte un aldehfdo graso ramificado producido por la celula microbiana recombinante en el hidrocarburo ramificado.

En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido (es decir, una enzima) que tiene actividad biosintetica de hidrocarburos (tambien citado en el presente documento como un "polipeptido biosintetico de hidrocarburos" o una "enzima biosintetica de hidrocarburos") y el hidrocarburo ramificado se produce mediante una reaccion catalizada por la enzima biosintetica de hidrocarburos expresada o sobreexpresada en la celula microbiana recombinante. En algunos aspectos, se recupera del cultivo celular una composicion que comprende hidrocarburos ramificados (tambien citada en el presente documento como una "composicion de hidrocarburos ramificados") producidos cultivando la celula recombinante en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos. En algunos aspectos, la celula recombinante produce una composicion de hidrocarburo ramificado que comprende hidrocarburos anteiso- ramificados.

En algunos aspectos, el hidrocarburo ramificado se produce expresando o sobreexpresando en la celula microbiana recombinante un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad biosintetica de hidrocarburos, tal como una actividad aldehfdo descarbonilasa (ADC) (por ejemplo, EC 4.1.99.5), por ejemplo, un polinucleotido que codifica una aldehfdo descarbonilasa de Prochlorococcus marinus MIT9313 (GenBank NP_895059). Algunos ejemplos adicionales de aldehfdo descarbonilasa y de polipeptidos relacionados utiles de acuerdo con este aspecto incluyen, pero sin limitacion, los descritos en las Publicaciones PCT n.° WO 2007/136762 y WO2008/119082. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica un polipeptido biosintetico de aldehfdos grasos. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica una acil-ACP reductasa.

En algunos aspectos, se produce una olefina terminal ramificada expresando o sobreexpresando en la celula

microbiana recombinante un polinucleotido que codifica un polipeptido biosintetico de hidrocarburos, tal como un

polipeptido que tiene actividad descarboxilasa, tal como se describe, por ejemplo, en la Publicacion PCT n.° 2009/085278. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica una tioesterasa.

En algunos aspectos, se produce una olefina interna ramificada expresando o sobreexpresando en la celula

polipeptido que tiene actividad OleCD u OleBCD, tal como se describe, por ejemplo, en la Publicacion PCT n.° WO

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2008/147781. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende ademas un polinucleotido que codifica una tioesterasa y una acil-CoA sintasa.

Niveles de saturacion derivados de acidos grasos ramificados

Puede controlarse el grado de saturacion de las acil-ACP ramificadas (que despues pueden convertirse en diversos derivados de acidos grasos ramificados, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento) regulando el grado de saturacion de los intermedios de acidos grasos. Por ejemplo, se pueden expresar, sobreexpresar o expresar a niveles reducidos (por ejemplo, atenuados) las familias de genes sfa, gns, y fab, para controlar la cantidad de saturacion de una acil-ACP ramificada.

Polipeptidos y polinucleotidos de la via de AGCR

La divulgacion identifica polinucleotidos utiles en las celulas microbianas recombinantes, procedimientos y composiciones descritas en el presente documento; aunque se reconocera que no es necesaria una identidad de secuencia absoluta para dichos polipeptidos. Por ejemplo, pueden efectuarse cambios en una secuencia de polinucleotidos particular y evaluarse la actividad del polipeptido codificado. Dichos cambios comprenden normalmente mutaciones conservativas y mutaciones silentes (tales como, por ejemplo, optimizacion de codones). Puede evaluarse una funcion deseada en los polinucleotidos modificados o mutados (es decir, mutantes) y los polipeptidos variantes codificados, tal como, una funcion mejorada en comparacion con el polipeptido parental, incluyendo, pero sin limitacion, actividad catalftica aumentada, estabilidad aumentada o inhibicion reducida (por ejemplo, inhibicion de retroalimentacion reducida), usando procedimientos conocidos en la tecnica.

La divulgacion identifica actividades enzimaticas implicadas en diversas etapas (es decir, reacciones) de las vfas biosinteticas de AGCR descritas en el presente documento segun el numero de clasificacion de enzimas (EC) y proporciona polipeptidos ejemplares (es decir, enzimas) clasificados segun dichos numeros de EC y polinucleotidos ejemplares que codifican dichos polipeptidos. Dichos polipeptidos y polinucleotidos ejemplares, que se identifican en el presente documento por sus numeros de referencia y/o numeros de identificador de secuencia (SEQ ID NO), se usan para modificar por ingenierfa genetica vfas de AGCR en celulas microbianas progenitoras para obtener las celulas microbianas recombinantes descritas en el presente documento. Ha de entenderse, sin embargo, que los polipeptidos y polinucleotidos descritos en el presente documento son ejemplares y no limitantes. Las secuencias de homologos de polipeptidos representativos descritos en el presente documento se encuentran disponibles para los expertos en la materia usando bases de datos, tales como, por ejemplo, las bases de datos Entrez proporcionadas por el National Center for Biotechnology Information (NCBI), las bases de datos ExPasy proporcionadas por el Swiss Institute of Bioinformatics y las bases de datos KEGG proporcionadas por el Bioinformatics Center of Kyoto University y la University of Tokyo, todas las cuales se encuentran disponibles en Internet.

Ademas, ha de entenderse que se puede modificar una serie de celulas microbianas para que contengan la via de AGCR descrita en el presente documento, dando como resultado celulas microbianas recombinantes para la produccion de derivados de acidos grasos de cadena ramificada. Asimismo, se entiende que una serie de celulas pueden proporcionar fuentes de material genetico, incluyendo secuencias de polinucleotidos que codifican polipeptidos adecuados para su uso en una celula microbiana recombinante proporcionada en el presente documento.

La divulgacion proporciona numerosos ejemplos de polipeptidos (es decir, enzimas) que tienen actividades adecuadas para su uso en las vfas biosinteticas de AGCR descritas en el presente documento. Dichos polipeptidos se denominan de manera colectiva en el presente documento como "polipeptidos de la via de AGCR" (como alternativa, "enzimas de la via de AGCR"). En las tablas y la descripcion y en los ejemplos del presente documento se proporcionan algunos ejemplos no limitantes de polipeptidos de la via de AGCR adecuados para su uso en las celulas microbianas recombinantes de la invencion.

En algunos aspectos, la divulgacion incluye una celula microbiana recombinante que comprende una secuencia de polinucleotidos (tambien citada en el presente documento como una secuencia de "polinucleotidos de la via de AGCR") que codifica un polipeptido de la via de AGCR.

Mediante diversos procedimientos, pueden obtenerse polipeptidos de la via de AGCR adicionales y polinucleotidos que los codifican adecuados para su uso en la modificacion por ingenierfa genetica de una via de AGCR en una celula microbiana recombinante de la divulgacion.

Por ejemplo, Los numeros EC clasifican enzimas segun la reaccion catalizada. Pueden identificarse enzimas que catalizan una reaccion en una via biosintetica descrita en el presente documento buscando el numero de EC correspondiente a dicha reaccion en una base de datos, tal como, por ejemplo: la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; Kyoto University y University of Tokyo); la base de datos UNIPROTKB o la base de datos ENZYME (ExPASy Proteomics Server; Swiss Institute of Bioinformatics); la base de datos PROTEIN o la base de datos GENE (bases de datos Entrez; National Center for Biotechnology Information (NCBI)); o la base de datos BRENDA (The Comprehensive Enzyme Information System; Technical University of Braunschweig); todas las cuales se encuentran disponibles en Internet. En un aspecto, se usa en la modificacion por ingenierfa genetica de la etapa correspondiente de una via de AGCR en una celula microbiana recombinante un polinucleotido de la via de

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AGCR que codifica un polipeptido de la via de AGCR que tiene una actividad enzimatica categorizada por un numero de EC (tal como un numero de EC listado en la descripcion o en una de las tablas del presente documento) o un fragmento o variante del mismo que tiene dicha actividad.

En algunos aspectos, una secuencia de polinucleotido de la via de AGCR codifica un polipeptido que es endogeno para la celula progenitora de la celula recombinante que se esta modificando por ingenierfa genetica. Algunos de estos polipeptidos endogenos se sobreexpresan en la celula microbiana recombinante. Un "polipeptido endogeno", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido que esta codificado por el genoma de la celula progenitora (por ejemplo, de tipo silvestre) que se esta modificando por ingenierfa genetica para producir la celula microbiana recombinante.

Puede sobreexpresarse por cualquier medio adecuado un polipeptido de la via de AGCR, tal como, por ejemplo, un polipeptido endogeno de la via de AGCR. Tal como se usa en el presente documento, "sobreexpresar" significa expresar o provocar la expresion de un polinucleotido o polipeptido en una celula a una concentracion mayor a la que normalmente se expresa en una celula progenitora correspondiente (por ejemplo, de tipo silvestre) en las mismas condiciones. Por ejemplo, se "sobreexpresa" un polipeptido en una celula microbiana recombinante cuando esta presente en una mayor concentracion en la celula recombinante, en comparacion con su concentracion en una celula hospedadora no recombinante de la misma especie (por ejemplo, la celula progenitora) cuando se cultiva en las mismas condiciones.

En algunos aspectos, la secuencia de polinucleotidos de la via de AGCR codifica un polipeptido exogeno o heterologo. En otras palabras, el polipeptido codificado por el polinucleotido es exogeno para la celula microbiana progenitora. Un polipeptido "exogeno" (o "heterologo"), tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido no codificado por el genoma de la celula microbiana progenitora (por ejemplo, de tipo silvestre) que se esta modificando por ingenierfa genetica para producir la celula microbiana recombinante. Dicho polipeptido tambien puede citarse como un polipeptido "no nativo". Un polipeptido variante (es decir, un mutante) es un ejemplo de un polipeptido exogeno.

En ciertos aspectos, un polipeptido de la via de AGCR comprende una secuencia de aminoacidos distinta de la de uno de los polipeptidos ejemplares proporcionados en el presente documento; por ejemplo, el polipeptido de la via de AGCR puede comprender una secuencia que es un homologo, un fragmento o una variante de la secuencia del polipeptido ejemplar.

El termino "homologo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleotido o polipeptido que comprende una secuencia que es al menos un 50%, preferentemente, al menos un 60%, mas preferentemente, al menos un 70% (por ejemplo, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99%) homologa a la secuencia de polinucleotidos o polipeptido correspondiente. Un experto en la materia sera consciente de los procedimientos para determinar la homologfa entre dos o mas secuencias. En resumen, pueden llevarse a cabo calculos de "homologfa" entre dos secuencias del siguiente modo. Las secuencias se alinean con el fin de una comparacion optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o em ambas de una primera secuencia de aminoacidos o polinucleotidos para un alineamiento optimo y las secuencias no homologas pueden descartarse con fines de comparacion). En un aspecto preferido, la longitud de una primera secuencia que se alinea con fines de comparacion es al menos aproximadamente un 30%, preferentemente, al menos aproximadamente un 40%, mas preferentemente, al menos aproximadamente un 50%, aun mas preferentemente, al menos aproximadamente un 60% e incluso mas preferentemente al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90% o aproximadamente un 100% de la longitud de una segunda secuencia. Despues, se comparan los restos de aminoacido o nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o las posiciones de nucleotido correspondientes de las secuencias primera y segunda. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto de aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, las moleculas son identicas en dicha posicion (tal como se usa en el presente documento, "identidad" de aminoacidos o acidos nucleicos es equivalente a "homologfa" de aminoacidos o acidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que han de introducirse para un alineamiento optimo de las dos secuencias.

La comparacion de secuencias y la determinacion del porcentaje de homologfa (es decir, porcentaje de identidad) entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matematico, tal como BLAST (Altschul y col., J. Mol. Biol., 215(3): 403-410 (1990)). El porcentaje de homologfa entre dos secuencias de aminoacidos tambien puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informatico GCG, usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y una ponderacion por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y una ponderacion por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 444453 (1970)). Tambien puede determinarse el porcentaje de homologfa entre dos secuencias de nucleotidos usando el programa GAP en el paquete informatico GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderacion por hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y una ponderacion por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Un experto habitual en la materia puede llevar a cabo calculos iniciales de homologfa y ajustar los parametros del algoritmo en consecuencia. Un conjunto de parametros preferido (y el que ha de usarse en caso de que un experto no este seguro acerca de los

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parametros que han de aplicarse para determinar si una molecula se encuentra dentro de una limitacion de homologfa de las reivindicaciones) son una matriz de puntuacion Blossum 62 con una penalizacion por hueco de 12, una penalizacion por extension de huevo de 4 y una penalizacion por desplazamiento de fase de 5. Se conocen en la tecnica de biotecnologfa procedimientos adicionales de alineamiento de secuencias (vease, por ejemplo, Rosenberg, BMC Bioinformatics, 6: 278 (2005); Altschul y col., FEBSJ., 272(20): 5101-5109 (2005)).

Una "posicion equivalente" (por ejemplo, una "posicion de aminoacido equivalente" o una "posicion de acido nucleico equivalente") se define en el presente documento como una posicion (tal como una posicion de aminoacido o una posicion de acido nucleico) de una secuencia de polipeptido de ensayo (o polinucleotido de ensayo) que se alinea con una posicion correspondiente de una secuencia de polipeptido de referencia (o de polinucleotido de referencia), cuando se alinea de manera optima usando un algoritmo de alineamiento, como se describe en el presente documento. No es necesario que la posicion de aminoacido equivalente del polipeptido de ensayo tenga el mismo numero de posicion numerica que la posicion correspondiente del polipeptido de referencia; igualmente, no es necesario que la posicion de acido nucleico equivalente del polinucleotido de ensayo tenga el mismo numero de posicion numerica que la posicion correspondiente del polinucleotido de referencia.

En algunos aspectos, el polipeptido de la via de AGCR es una variante de un polipeptido de referencia (por ejemplo, uno parental), tal como una variante de un polipeptido de la via de AGCR ejemplar descrito en el presente documento. Un polipeptido "variante" (como alternativa, "mutante"), tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que difiere de la de un polipeptido parental (por ejemplo, de tipo silvestre) en al menos un aminoacido. La variante puede comprender una o mas sustituciones de aminoacidos conservativas y/o puede comprender una o mas sustituciones no conservativas, en comparacion con la secuencia de polipeptido parental. En algunos aspectos, el polipeptido variante tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o mas sustituciones, adiciones, inserciones o eliminaciones de aminoacidos en comparacion con la secuencia de polipeptido parental. En algunos aspectos, la secuencia del polipeptido variante es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% identica a la secuencia del polipeptido parental.

En algunos aspectos, el polipeptido de la via de AGCR es un fragmento de un polipeptido de referencia (por ejemplo, uno parental), tal como un fragmento de un polipeptido de la via de AGCr ejemplar descrito en el presente documento. El termino "fragmento" se refiere a una porcion mas corta de un polipeptido o protefna de longitud completa que varfa en cuanto a su tamano desde cuatro restos de aminoacidos hasta la secuencia de aminoacidos completa menos un resto de aminoacido. En ciertos aspectos, un fragmento se refiere a la secuencia de aminoacidos completa de un dominio de un polipeptido o protefna (por ejemplo, un dominio de union a sustrato o un dominio catalftico).

En algunos aspectos, un homologo, una variante o un fragmento comprende ademas uno o mas motivos de secuencia, como se definen en el presente documento. En un aspecto, un homologo, una variante o un fragmento de un polipeptido de subunidad E1-alfa de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada comprende ademas uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre las SEQ ID NO: 15-21. En otro aspecto, un homologo, una variante o un fragmento de un polipeptido de subunidad E1-beta de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada comprende ademas uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre las SEQ ID NO: 36-42. En otro aspecto, un homologo, una variante o un fragmento de un polipeptido de lipoamida aciltransferasa comprende ademas uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre las SEQ ID NO: 57-62. En otro aspecto, un homologo, una variante o un fragmento de un polipeptido de dihidrolipoil deshidrogenasa comprende ademas uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre las sEq ID NO: 79-83. En otro aspecto, un homologo, una variante o un fragmento de un polipeptido de beta-cetoacil-ACP sintasa III comprende ademas uno o mas motivos de secuencia seleccionados entre las SEQ ID NO: 110-115. Puede lograrse facilmente la determinacion de que una secuencia contiene un motivo de secuencia concreto, por ejemplo, usando la herramienta ScanProsite, disponible en el sitio de Internet del ExPASy Proteomics Server.

Se entiende que un polipeptido de AGCR puede tener sustituciones de aminoacidos conservativas o no esenciales, en relacion con un polipeptido parental, que no tienen un efecto sustancial en una funcion biologica o una propiedad del polipeptido de AGCr. Puede determinarse si una sustitucion concreta se tolerara o no (es decir, no afectara negativamente a una funcion biologica deseada, tal como actividad enzimatica), por ejemplo, como se describe en Bowie y col. (Science, 247:1306-1310 (1990)).

Una "sustitucion de aminoacidos conservativa" es una en la que el resto de aminoacido se reemplaza por un resto de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la tecnica familias de restos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistefna), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

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Las variantes pueden ser de origen natural o crearse in vitro. En particular, pueden crearse variantes usando tecnicas de ingeniena genetica, tales como mutagenesis de sitio dirigido, mutagenesis qmmica al azar, procedimientos de eliminacion con exonucleasa III o tecnicas de clonacion convencionales. Como alternativa, dichas variantes, fragmentos, analogos o derivados pueden crearse usando smtesis qmmica o procedimientos de modificacion.

Se conocen bien en la tecnica procedimientos para producir variantes. Estos incluyen procedimientos en los que se modifican secuencias de acido nucleico obtenidas de aislados naturales para generar acidos nucleicos que codifican polipeptidos que tienen caractensticas que potencian su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio (incluyendo, pero sin limitacion, actividad catalftica aumentada (numero de regeneracion), estabilidad mejorada e inhibicion por retroalimentacion reducida). En dichos procedimientos, se genera y caracteriza un gran numero de secuencias de acido nucleico modificadas que tienen diferencias de uno o mas nucleotidos respecto de la secuencia obtenida del aislado natural. Normalmente, estas diferencias de nucleotidos dan como resultado cambios de aminoacidos respecto de los polipeptidos codificados por los acidos nucleicos de los aislados naturales. Por ejemplo, pueden prepararse variantes usando mutagenesis aleatoria o de sitio dirigido.

Tambien pueden crearse variantes mediante mutagenesis in vivo. En algunos aspectos, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de acido nucleico propagando la secuencia en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que porta mutaciones en una o mas de las vfas de reparacion del ADN. Dichas cepas "mutadoras" tienen una mayor tasa de mutacion aleatoria que las de una cepa de tipo silvestre. La propagacion de una secuencia de ADN en una de estas cepas generara, en ultima instancia, mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para su uso para mutagenesis in vivo se describen en, por ejemplo, la Publicacion de Solicitud de Patente Internacional n.° WO 1991/016427.

Tambien pueden generarse variantes usando mutagenesis de casete. En la mutagenesis de casete, se reemplaza una pequena region de una molecula de ADN bicatenario por "casete" de oligonucleotido sintetico que es diferente a la secuencia nativa. El oligonucleotido contiene normalmente una secuencia nativa completa y/o parcialmente aleatorizada.

Tambien puede usarse mutagenesis recursiva de conjunto para generar variantes. La mutagenesis recursiva de conjunto es un algoritmo para la ingeniena genetica de protemas (es decir, mutagenesis de protemas) desarrollado para producir poblaciones diversas de mutantes fenotfpicamente relacionados cuyos miembros difieren en su secuencia de aminoacidos. Este procedimiento usa un mecanismo de retroalimentacion para controlar las sucesivas rondas de mutagenesis de casete combinatoria. La mutagenesis recursiva de conjunto se describe en, por ejemplo, Arkin y col., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 89: 7811- 7815 (1992).

En algunos aspectos, se crean variantes usando mutagenesis de conjunto exponencial. La mutagenesis de conjunto exponencial es un procedimiento para crear bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes unicos y funcionales, en los que se aleatorizan pequenos grupos de restos en paralelo para identificar, en cada posicion alterada, aminoacidos que originan protemas funcionales. La mutagenesis de conjunto exponencial se describe en, por ejemplo, Delegrave y col., Biotech. Res, 11:1548-1552 (1993).

Los fragmentos o variantes preferidas de un polipeptido parental (por ejemplo, fragmentos o variantes de un polipeptido de la via de AGCR parental) conservan parteo la totalidad de una funcion o propiedad biologica (tal como actividad enzimatica, estabilidad termica) del polipeptido parental. En algunos aspectos, el fragmento o la variante conserva al menos un 75% (por ejemplo, al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 95%) de una funcion o propiedad biologica del polipeptido parental. En otros aspectos, el fragmento o la variante conserva aproximadamente un 100% de una funcion o propiedad biologica del polipeptido parental.

En algunos aspectos, el fragmento o la variante del polipeptido parental muestra una actividad catalftica aumentada (como se refleja, por ejemplo, por un mayor numero de regeneracion, un pH optimo o una Km reducida para un sustrato deseado), en relacion con la del polipeptido parental, en las condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante.

Por ejemplo, en caso de que el polipeptido parental sea endogeno para (es decir, proceda de) una celula termofila y en caso de que la celula microbiana recombinante se cultive normalmente a una temperatura menor que la de la celula termofila, el polipeptido parental puede mostrar una actividad significativamente reducida a la temperatura menor; en cuyo caso, el polipeptido variante muestra preferentemente una actividad catalftica aumentada (tal como un mayor numero de regeneracion), en relacion con la del polipeptido parental, a esa temperatura menor.

En otros aspectos, el fragmento o la variante del polipeptido parental muestra una estabilidad mejorada, en relacion con la del polipeptido parental, en las condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante. Dicha estabilidad puede incluir estabilidad frente a cambios en la temperatura, fuerza ionica, pH o cualquier otra diferencia en las condiciones de crecimiento o del medio entre la celula microbiana recombinante y la celula de la que procede el polipeptido parental. Por ejemplo, en caso de que el polipeptido parental proceda de una celula psicotropica y en caso de que la celula microbiana recombinante se cultive generalmente a una mayor temperatura que la celula psicotropica, el polipeptido parental puede ser relativamente inestable a la mayor temperatura; en cuyo caso, el

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polipeptido variante muestra preferentemente una estabilidad mejorada en relacion con la del polipeptido parental a la temperatura mayor.

En otros aspectos, el fragmento o la variante del polipeptido parental muestra inhibicion reducida de la actividad catalftica (tal como inhibicion por retroalimentacion reducida) mediante un metabolite celular o mediante un componente del medio de cultivo, en relacion con dicha inhibicion mostrada por el polipeptido parental, en las condiciones en las que se cultiva la celula microbiana recombinante.

En ciertos aspectos, un polipeptido de la via de AGCR es un homologo, un fragmento o una variante de un polipeptido parental, en el que el polipeptido de la via de AGCR es eficaz para llevar a cabo una reaccion de la via de AGCR en una celula microbiana recombinante. Dicho polipeptido de la via de AGCR es adecuado para su uso en una celula microbiana recombinante de la invencion.

La eficacia de un polipeptido de ensayo (tal como, por ejemplo, un polipeptido de la via de AGCR descrito en el presente documento o un homologo, un fragmento o una variante del mismo) para llevar a cabo la reaccion de una via de AGCR puede determinarse mediante una serie de procedimientos. Por ejemplo, para determinar la eficacia de un polipeptido de ensayo a la hora de catalizar una reaccion especffica de una via bioqufmica, en primer lugar se modifica por ingenierfa genetica para obtener una celula progenitora que comprende todas las actividades necesarias para catalizar las reacciones de la via bioqufmica en cuestion, a excepcion de la reaccion especffica de la via que se este evaluando (aunque, en algunos casos, la celula progenitora puede expresar polipeptidos endogenos que catalizan la reaccion especffica de la via que se este evaluando; en dichos casos, la actividad endogena sera preferentemente lo suficientemente baja como para detectar facilmente un aumento en el producto causado por la actividad del polipeptido de ensayo). Despues, se introduce un polinucleotido que codifica el polipeptido de ensayo, unido operativamente a un promotor adecuado (por ejemplo, en un vector de expresion) en la celula progenitora, generando una celula de ensayo. La celula de ensayo y la celula progenitora se cultivan por separado en condiciones identicas que son suficientes para la expresion de los polipeptidos de la via en los cultivos de la celula progenitora y de ensayo y la expresion del polipeptido de ensayo en el cultivo de la celula de ensayo. En diversos instantes durante y/o despues del cultivo, se obtienen muestras del cultivo de la celula de ensayo y del cultivo de la celula progenitora. La presencia de un intermedio o producto de la via se evalua en las muestras. La presencia del intermedio o producto de la via puede determinarse mediante procedimientos que incluyen, pero sin limitacion, cromatograffa de gases (CG), espectroscopfa de masas (EM), cromatograffa en capa fina (TLC), cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPlC), cromatograffa lfquida (CL), CG acoplada con un detector de ionizacion de llama (FID), CG-EM y CL-EM. El ejemplo 11 en el presente documento proporciona procedimientos para analizar muestras de cultivo respecto de la presencia de un intermedio o producto de la via de AGCR, tal como un acido graso ramificado, un alcohol graso ramificado, un ester graso ramificado o un hidrocarburo ramificado. La presencia de un intermedio o producto de la via de AGCR en las muestras del cultivo de la celula de ensayo y la ausencia (o una cantidad reducida) del intermedio o producto de la via de AGCR en las muestras del cultivo de la celula progenitora, indica que el polipeptido de ensayo es eficaz para llevar a cabo una reaccion de la via de AGCR y es adecuado para su uso en una celula microbiana recombinante de la invencion.

Produccion de derivados de acidos grasos ramificados en celulas microbianas recombinantes

En un aspecto, la divulgacion incluye un procedimiento para producir una composicion de derivado de acido graso ramificado, comprendiendo el procedimiento cultivar una celula microbiana recombinante de la invencion en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono, en condiciones eficaces para expresar las secuencias de polinucleotido recombinantes y opcionalmente, aislar la composicion de derivado de acido graso ramificado producida.

Una "composicion de derivado de acido graso ramificado" es una composicion que comprende un derivado de acido graso ramificado como se define en el presente documento, tal como, por ejemplo, un acido graso ramificado, un ester graso ramificado (por ejemplo, un metil ester graso ramificado, un etil ester graso ramificado, un ester de cera ramificado), un aldehfdo graso ramificado, un alcohol graso ramificado, un hidrocarburo ramificado (tal como un alcano ramificado, un alqueno ramificado, una olefina terminal ramificada, una olefina interna ramificada) o una cetona ramificada. De forma similar, una "composicion de acido graso ramificado" es una composicion que comprende un acido graso ramificado y asf sucesivamente.

En un aspecto, la divulgacion incluye un procedimiento para producir una composicion que comprende un derivado de acido graso ramificado, comprendiendo el procedimiento: obtener una celula microbiana recombinante (tal como un cultivo que comprende una celula microbiana recombinante) que comprende: (a) polinucleotidos que codifican un complejo deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD), que comprende polipeptidos que tienen actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, actividad lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa y (b) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil- ACP sintasa que utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato, en la que al menos un polinucleotido de acuerdo con (a) o (b) codifica un polipeptido que es exogeno para la celula microbiana parental o se modula la expresion de dicho polinucleotido en la celula microbiana recombinante; comprendiendo ademas la celula microbiana recombinante uno o mas polinucleotidos que codifican cada uno un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos

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grasos de cadena ramificada cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos; cultivar la celula microbiana recombinante en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos y producir una composicion de derivados de acidos grasos que comprende derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos ramificados, comprendiendo los derivados de acidos grasos ramificados derivados de acidos grasos iso- ramificados y/o derivados de acidos grasos anteiso-ramificados; y opcionalmente, recuperar la composicion del medio de cultivo.

En algunos aspectos, la composicion de derivado de acidos grasos producida por la celula recombinante comprende derivados de acidos grasos ramificados, en la que al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% en peso de los derivados de acidos grasos en la composicion son derivados de acidos grasos ramificados. En algunos aspectos, la composicion de derivados de acidos grasos comprende derivados de acidos grasos ramificados en una cantidad (por ejemplo, un tftulo) de al menos 10 mg/l, al menos 15 mg/l, al menos 20 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 50 mg/l, al menos 75 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 125 mg/l, al menos 150 mg/l, al menos 175 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 225 mg/l, al menos 250 mg/l, al menos 275 mg/l, al menos 300 mg/l, al menos 325 mg/l, al menos

350 mg/l, al menos 375 mg/l, al menos 400 mg/l, al menos 425 mg/l, al menos 450 mg/l, al menos 475 mg/l, al

menos 500 mg/l, al menos 525 mg/l, al menos 550 mg/l, al menos 575 mg/l, al menos 600 mg/l, al menos 625 mg/l, al menos 650 mg/l, al menos 675 mg/l, al menos 700 mg/l, al menos 725 mg/l, al menos 750 mg/l, al menos 775

mg/l, al menos 800 mg/l, al menos 825 mg/l, al menos 850 mg/l, al menos 875 mg/l, al menos 900 mg/l, al menos

925 mg/l, al menos 950 mg/l, al menos 975 mg/l, al menos 1000 mg/l, al menos 1050 mg/l, al menos 1075 mg/l, al menos 1100 mg/l; al menos 1125 mg/l, al menos 1150 mg/l, al menos 1175 mg/l, al menos 1200 mg/l, al menos 1225 mg/l, al menos 1250 mg/l, al menos 1275 mg/l, al menos 1300 mg/l, al menos 1325 mg/l, al menos 1350 mg/l, al menos 1375 mg/l, al menos 1400 mg/l, al menos 1425 mg/l, al menos 1450 mg/l, al menos 1475 mg/l, al menos 1500 mg/l, al menos 1525 mg/l, al menos 1550 mg/l, al menos 1575 mg/l, al menos 1600 mg/l, al menos 1625 mg/l, al menos 1650 mg/l, al menos 1675 mg/l, al menos 1700 mg/l, al menos 1725 mg/l, al menos 1750 mg/l, al menos 1775 mg/l, al menos 1800 mg/l, al menos 1825 mg/l, al menos 1850 mg/l, al menos 1875 mg/l, al menos 1900 mg/l, al menos 1925 mg/l, al menos 1950 mg/l, al menos 1975 mg/l, al menos 2000 mg/l o un intervalo limitado por cualesquiera dos de los valores anteriores.

En diversos aspectos, la actividad de enzima derivada de acidos grasos comprende una actividad tioesterasa, una actividad ester sintasa, una actividad biosintetica de aldehfdos grasos, una actividad biosintetica de alcoholes grasos, una actividad biosintetica de cetonas y/o una actividad biosintetica de hidrocarburos. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende polinucleotidos que codifican dos o mas polipeptidos, teniendo cada polipeptido actividad de enzima derivada de acidos grasos.

En diversos aspectos, los uno o mas polipeptidos tienen actividad de enzima derivada de acidos grasos como se ha descrito anteriormente en el presente documento, en la que la celula microbiana recombinante produce una composicion que comprende acidos grasos ramificados, esteres grasos ramificados, esteres de cera ramificados, aldehfdos grasos ramificados, alcoholes grasos ramificados, alcanos ramificados, alquenos ramificados, olefinas internas ramificadas, olefinas terminales ramificadas o cetonas ramificadas.

En otro aspecto, la divulgacion incluye un procedimiento para producir una composicion que comprende un derivado de acido graso anteiso-ramificado, comprendiendo el procedimiento: obtener una celula microbiana recombinante (tal como un cultivo que comprende una celula microbiana recombinante) que comprende: (a) polinucleotidos que codifican un complejo deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD), que comprende polipeptidos que tienen actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, actividad lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa y (b) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato; y que ademas comprende (c) polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa, actividad treonina sintasa y actividad treonina desaminasa, o (d) polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa y actividad beta-isopropil malato deshidrogenasa o (c) y (d); y (e) polipeptidos que tienen actividad acetohidroxiacido sintasa, actividad acetohidroxiacido isomerorreductasa y actividad dihidroxiacido deshidratasa; en el que al menos un polinucleotido de acuerdo con (a), (b), (c), (d) o (e) codifica un polipeptido que es exogeno para la celula microbiana recombinante o se modula la expresion de dicho polinucleotido en la celula microbiana recombinante; comprendiendo ademas la celula microbiana recombinante uno o mas polinucleotidos que codifican cada uno un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos, en la que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos grasos de cadena anteiso-ramificada cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos; cultivar la celula microbiana recombinante en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos y producir una composicion de derivados de acidos grasos que comprende derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos ramificados, comprendiendo los derivados de acidos grasos ramificados derivados de acidos grasos anteiso-ramificados; y opcionalmente, recuperar la composicion del medio de cultivo.

En algunos aspectos, la composicion de derivado de acidos grasos producida por el cultivo de celulas microbianas

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recombinantes comprende derivados de acidos grasos anteiso-ramificados, en la que al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70% o al menos un 80% en peso de los derivados de acidos grasos ramificados en la composicion son derivados de acidos grasos anteiso-ramificados. En algunos aspectos, la composicion de derivados de acidos grasos comprende derivados de acidos grasos anteiso-ramificados en una cantidad (por ejemplo, un tftulo) de al menos 10 mg/l, al menos 15 mg/l, al menos 20 mg/l, al menos 25 mg/l, al menos 50 mg/l, al menos 75 mg/l, al menos 100 mg/l, al menos 125 mg/l, al menos 150 mg/l, al menos 175 mg/l, al menos 200 mg/l, al menos 225 mg/l, al menos 250 mg/l, al menos 275 mg/l, al menos 300 mg/l, al menos 325 mg/l, al menos 350 mg/l, al menos 375 mg/l, al menos 400 mg/l, al menos 425 mg/l, al menos 450 mg/l, al menos 475 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 525 mg/l, al menos 550 mg/l, al menos 575 mg/l, al menos 600 mg/l, al menos 625 mg/l, al menos 650 mg/l, al menos 675 mg/l, al menos 700 mg/l, al menos 725 mg/l, al menos 750 mg/l, al menos 775 mg/l, al menos 800 mg/l, al menos 825 mg/l, al menos 850 mg/l, al menos 875 mg/l, al menos 900 mg/l, al menos 925 mg/l, al menos 950 mg/l, al menos 975 mg/l, al menos 1000 mg/l, al menos 1050 mg/l, al menos 1075 mg/l, al menos 1100 mg/l, al menos 1125 mg/l, al menos 1150 mg/l, al menos 1175 mg/l, al menos 1200 mg/l, al menos 1225 mg/l, al menos 1250 mg/l, al menos 1275 mg/l, al menos 1300 mg/l, al menos 1325 mg/l, al menos 1350 mg/l, al menos 1375 mg/l, al menos 1400 mg/l, al menos 1425 mg/l, al menos 1450 mg/l, al menos 1475 mg/l, al menos 1500 mg/l, al menos 1525 mg/l, al menos 1550 mg/l, al menos 1575 mg/l, al menos 1600 mg/l, al menos 1625 mg/l, al menos 1650 mg/l, al menos 1675 mg/l, al menos 1700 mg/l, al menos 1725 mg/l, al menos 1750 mg/l, al menos 1775 mg/l, al menos 1800 mg/l, al menos 1825 mg/l, al menos 1850 mg/l, al menos 1875 mg/l, al menos 1900 mg/l, al menos 1925 mg/l, al menos 1950 mg/l, al menos 1975 mg/l, al menos 2000 mg/l o un intervalo limitado por cualesquiera dos de los valores anteriores.

En diversos aspectos, la actividad de enzima derivada de acidos grasos comprende una actividad tioesterasa, una actividad ester sintasa, una actividad biosintetica de aldehfdos grasos, una actividad biosintetica de alcoholes grasos o una actividad biosintetica de hidrocarburos. En algunos aspectos, la celula microbiana recombinante comprende polinucleotidos que codifican dos o mas polipeptidos, teniendo cada polipeptido actividad de enzima derivada de acidos grasos.

En aspectos mas particulares, la celula microbiana recombinante expresa o sobreexpresa uno o mas peptidos que tienen una actividad enzimatica derivada de acidos grasos, como se ha descrito anteriormente en el presente documento, en el que la celula microbiana recombinante produce una composicion que comprende acidos grasos anteiso-ramificados, esteres grasos anteiso-ramificados, esteres de cera anteiso-ramificados, aldehfdos grasos anteiso-ramificados, alcoholes grasos anteiso-ramificados, alcanos anteiso-ramificados, alquenos anteiso- ramificados, olefinas internas anteiso-ramificadas, olefinas terminales anteiso-ramificadas o cetonas anteiso- ramificadas.

Los derivados de acidos grasos ramificados (incluyendo derivados de acidos grasos iso-ramificados y derivados de acidos grasos anteiso-ramificados) producidos mediante los procedimientos de la invencion pueden recuperarse o aislarse del cultivo de celulas microbianas recombinantes. El termino "aislado", tal como se usa en el presente documento en referencia a los productos, tales como acidos grasos y derivados de los mismos, se refiere a productos que estan separados de los componentes celulares, los medios de cultivo celular o de precursores qufmicos o sinteticos. Los acidos grasos ramificados y los derivados de los mismos producidos mediante los procedimientos descritos en el presente documento pueden ser relativamente inmiscibles en el caldo de fermentacion, asf como en el citoplasma. Por lo tanto, los acidos grasos ramificados y los derivados de los mismos pueden recogerse en una fase organica, ya sea de manera intracelular o extracelular. La recogida de los productos en la fase organica puede aminorar el impacto del derivado del acido graso ramificado, por ejemplo, aldehfdo graso ramificado o alcohol graso ramificado en la funcion celular y puede permitir que la celula microbiana recombinante produzca mas producto.

En algunos aspectos, los derivados de acidos grasos ramificados producidos mediante los procedimientos de la invencion estan purificados. Tal como se usa en el presente documento, los terminos "purificar", "purificado" o "purificacion" significan la eliminacion o el aislamiento de una molecula de su ambiente mediante, por ejemplo, aislamiento o separacion. Las moleculas "sustancialmente purificadas" se encuentran libres en al menos aproximadamente un 60% (por ejemplo, libres en al menos aproximadamente un 70%, libres en al menos aproximadamente un 75%, libres en al menos aproximadamente un 85%, libres en al menos aproximadamente un 90%, libres en al menos aproximadamente un 95%, libres en al menos aproximadamente un 97%, libres en al menos aproximadamente un 99%) de otros componentes con los que estan asociados. Tal como se usa en el presente documento, estos terminos tambien se refieren a la retirada de contaminantes de una muestra. Por ejemplo, la eliminacion de contaminantes puede dar como resultado un aumento en el porcentaje de derivado de acido graso ramificado (tal como un acido graso ramificado o un aldehfdo graso ramificado o un alcohol graso ramificado o un ester graso ramificado o un hidrocarburo ramificado) en relacion con otros componentes en la muestra. Por ejemplo, cuando se produce un aldehfdo graso ramificado o un aldehfdo graso ramificado en una celula microbiana recombinante, pueden purificarse el aldehfdo graso ramificado o el alcohol graso ramificado mediante la eliminacion de protefnas de la celula microbiana recombinante. Tras la purificacion, aumenta el porcentaje del aldehfdo graso ramificado o del alcohol graso ramificado en la muestra en relacion con otros componentes.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "purificar", "purificado" y "purificacion" son terminos relativos que no requieren una pureza absoluta. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se produce un acido graso

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ramificado o un derivado de acido graso ramificado (por ejemplo, un aldehfdo graso ramificado, un alcohol graso ramificado y asf sucesivamente) en celulas microbianas recombinantes, un acido graso ramificado o un derivado purificado es un acido graso ramificado o un derivado que esta sustancialmente separado de otros componentes celulares (por ejemplo, acidos nucleicos, polipeptidos, lfpidos, carbohidratos u otros hidrocarburos).

El derivado de acido graso ramificado puede presentarse en el ambiente extracelular o puede aislarse del ambiente extracelular de la celula microbiana recombinante.

En ciertos aspectos, se secreta un derivado graso ramificado del mismo por la celula microbiana recombinante. En otros aspectos, se transporta un derivado de acido graso ramificado al ambiente extracelular. En otros aspectos mas, el derivado de acido graso ramificado se transporta de manera pasiva al ambiente extracelular. Puede aislarse un derivado de acido graso ramificado de una celula recombinante usando procedimientos conocidos en la tecnica.

Los derivados de acidos grasos (incluyendo derivados de acidos grasos ramificados producidos de acuerdo con los procedimientos de la presente invencion) pueden distinguirse de los compuestos organicos procedentes de carbono petroqufmico basandose en la huella isotopica dual de carbono o por datacion por 14C. Ademas, puede determinarse la fuente especffica del carbono obtenido de fuentes biologicas (por ejemplo, glucosa frente a glicerol) mediante la huella isotopica dual de carbono (vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.169.588).

La posibilidad de distinguir los derivados de acidos grasos producidos por celulas microbianas recombinantes de los compuestos organicos a base de petroleo es beneficiosa para efectuar un seguimiento de estos materiales en el comercio. Por ejemplo, pueden distinguirse los compuestos o agentes qufmicos organicos que comprenden perfiles de isotopos de carbono tanto de base biologica como a base de petroleo de los compuestos y agentes qufmicos organicos producidos unicamente con materiales a base de petroleo. Por lo tanto, puede efectuarse un seguimiento de los materiales preparados de acuerdo con los procedimientos de la invencion en el comercio basandose en su perfil unico de isotopos de carbono.

Los derivados de acidos grasos producidos por celulas microbianas recombinantes pueden distinguirse de los compuestos organicos a base de petroleo comparando la proporcion de isotopos estables de carbono (13C/12C) en cada combustible. La proporcion de 13C/12C en un derivado de acidos grasos producido de acuerdo con los procedimientos de la invencion es una consecuencia de la proporcion de 13C/12C en el dioxido de carbono atmosferico en el momento en que se fija el dioxido de carbono. Tambien refleja la via metabolica especffica. Tambien se producen variaciones regionales. El petroleo, las plantas C3 (de hoja ancha), las plantas C4 (las herbaceas) y los carbonatos marinos muestran diferencias significativas en 13C/12C y los valores correspondientes de 613C. Ademas, la materia lipfdica de las plantas C3 y C4 tienen un analisis diferente al de los materiales procedentes de los componentes de carbohidratos de las mismas plantas, a consecuencia de la via metabolica.

La escala de medicion de 13C se definio originalmente mediante un cero determinado por caliza Pee Dee Belemnita (PDB), en la que los valores se proporcionan en partes por mil desviaciones a partir de este material. Los valores de "613C" se expresan en partes por millar (por mil), de manera abreviada, %o y se calculan del siguiente modo:

613C (%o) = [(13C/12C)muestra - (13C/12C)estandar] / (13C/12C)estandar x 1000

En algunos aspectos, los acidos grasos o los derivados de los mismos producidos de acuerdo con los procedimientos de la invencion tienen un 613C de aproximadamente -30 o mayor, aproximadamente -28 o mayor, aproximadamente -27 o mayor, aproximadamente -20 o mayor, aproximadamente -18 o mayor, aproximadamente - 15 o mayor, aproximadamente -13 o mayor o aproximadamente -10 o mayor. Como alternativa o ademas, un acido graso o derivado del mismo tiene un 613C de aproximadamente -4 o menor, aproximadamente -5 o menor, aproximadamente -8 o menor, aproximadamente -10 o menor, aproximadamente -13 o menor, aproximadamente -15 o menor, aproximadamente -18 o menor o aproximadamente -20 o menor. Por lo tanto, los acidos grasos o los derivados de los mismos pueden tener un 613C limitado por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, un acido graso o derivado del mismo puede tener un 613C de aproximadamente -30 a aproximadamente - 15, de aproximadamente -27 a aproximadamente -19, de aproximadamente -25 a aproximadamente -21, de aproximadamente -15 a aproximadamente -5, de aproximadamente -13 a aproximadamente -7 o de aproximadamente -13 a aproximadamente -10. En algunos aspectos, un acido graso o derivado del mismo puede tener un 613C de aproximadamente -10, -11, -12 o -12,3. En otros aspectos, un acido graso o derivado del mismo tiene un 613C de aproximadamente -15,4 o mayor. En otros aspectos mas, un acido graso o un derivado del mismo tiene un 613C de aproximadamente -15,4 a aproximadamente -10,9 o un 613C de aproximadamente -13,92 a aproximadamente -13,84.

Un derivado de acido graso producido por una celula microbiana recombinante tambien puede distinguirse de los compuestos organicos a base de petroleo comparando la cantidad de 14C en cada compuesto. Debido a que el 14C tiene una semivida nuclear de 5730 anos, los combustibles a base de petroleo que contienen carbono "mas antiguo" pueden distinguirse de los acidos grasos o derivados de los mismos que contienen carbono "mas nuevo" (vease, por ejemplo, Currie, "Source Apportionment of Atmospheric Particles", Characterization of Environmental Particles, J. Buffle y H. P. van Leeuwen, Eds., Vol. I de IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series, Lewis Publishers, Inc., pags. 3-74 (1992)).

Tal como se usa en el presente documento, la "fraccion de carbono moderno" o fM tiene el mismo significado que el definido por el National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B y 4990C, conocidos como estandares de acidos oxalicos HOxI y HOxII, respectivamente. La definicion fundamental se refiere a 0,95 veces la proporcion de isotopos 14C/12C de HOxI (referenciada a 1950 d.c.). Esto practicamente 5 equivale a madera previa a la revolucion industrial, corregida respecto de la desintegracion. Para la biosfera viva en la actualidad (material vegetal), fM es de aproximadamente 1,1.

En algunos aspectos, un derivado de acido graso producido de acuerdo con los procedimientos de la invencion tiene un fM14C de al menos aproximadamente 1, por ejemplo, al menos aproximadamente 1,003, al menos aproximadamente 1,01, al menos aproximadamente 1,04, al menos aproximadamente 1,111, al menos 10 aproximadamente 1,18 o al menos aproximadamente 1,124. Como alternativa o ademas, el acido graso o derivado tiene un fM14C de aproximadamente 1,130 o menor, por ejemplo, aproximadamente 1,124 o menor, aproximadamente 1,18 o menor, aproximadamente 1,111 o menor o aproximadamente 1,04 o menor. Por lo tanto, el acido graso o derivado puede tener un fM14C limitado por dos cualesquiera de los extremos anteriores. Por ejemplo, el acido graso o el derivado puede tener un fM14C de aproximadamente 1,003 a aproximadamente 1,124, un fM14C de 15 aproximadamente 1,04 a aproximadamente 1,18 o un fM14C de aproximadamente 1,111 a aproximadamente 1,124.

Ha de interpretarse que el uso de los terminos "un", "una/o" y "el" o "la" y referentes similares en el contexto de la descripcion de la invencion (especialmente en el contexto de las reivindicaciones adjuntas) abarca tanto el singular como el plural, a menos que en el presente documento se indique otra cosa o el contexto lo contradiga claramente. Las expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" han de interpretarse como terminos 20 abiertos (es decir, significan "que incluye, pero sin limitacion") a menos que se indique otra cosa. La cita de intervalos de valores en el presente documento pretende servir unicamente como procedimiento abreviado para referirse de manera individual a cada valor por separado que se encuentre dentro del intervalo, salvo que en el presente documento se indique otra cosa y cada valor por separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se citara de forma individual en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente 25 documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado salvo que se indique lo contrario en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos o del lenguaje ejemplar ("p. ej.", "tal como", "por ejemplo") proporcionado en el presente documento, unicamente pretende ilustrar mejor la invencion y no impone una limitacion al ambito de la invencion, a menos que se reivindique otra cosa. No debe interpretarse que cualquier expresion en la memoria descriptiva indique ningun elemento no reivindicado como 30 esencial para la practica de la invencion.

En el presente documento se describen realizaciones preferidas de la presente invencion, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invencion.

Ejemplos

Composiciones de medio:

35 Medio mfnimo M9: 6 g/l de Na2HPO4/ 3 g/l de KH2PO4; 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH4Cl, 1 mg/l de tiamina, MgSO4 1 mM, CaCl2 0,1 mM.

Medio FA-2: M9 complementado con tampon de Bis-Tris (0,2 M), Triton X-100 (al 0,1% v/v) y minerales traza que no contienen hierro (2mg/l de ZnCl. 4H2O, 2mg/l de CaCl2. 6H2O, 2 mg/l de Na2MoO4.2H2O, 1,9mg/l de CuSO4.5H2O, 0,5mg/l de H3BO3, 100 ml/l de HCl concentrado), citrato ferrico (10 mg/l) y 30 g/l de glucosa.

40 Medio Che-9: M9 complementado adicionalmente con NH4Cl (1 g/l adicional), tampon de Bis-Tris (0,2 M), Triton X- 100 (al 0,1% v/v) y minerales traza (27 mg/l de FeCb.6 H2O, 2 mg/l de ZnCl.4H2O, 2mg/l de CaCl2. 6H2O, 2 mg/l de Na2MoO4.2H2O, 1,9 mg/l de CuSO4.5H2O, 0,5mg/l de H3BO3, 100 ml/l de HCl concentrado).

Medio V9-C: Che-9 sin FeCl3.6H2O

Medio Che-9 2N-BT: Che-9 complementado con 20 g/l de glucosa (al 2% p/v).

45 4NBT: Che-9 complementado con 40 g/l de glucosa (al 4% p/v).

Ejemplo 1. Modificacion por ingenierfa genetica de las cepas de produccion

E.coli MG 1655 AfadE (Cepa "D1")

Este ejemplo describe la construccion de una celula microbiana recombinante en la que se atenua la expresion de una enzima degradadora de acidos grasos. El gen fadE de E.coli (tambien conocido como yafH), que codifica una 50 acil-coenzima A deshidrogenasa (n.° de acceso de GenBank AAC73325) implicada en la degradacion de acidos grasos, se elimino de la cepa de E. coli MG1655 usando el sistema Red descrito por Datsenko, K.A. y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645 (2000)), con las siguientes modificaciones.

Se usaron los dos cebadores a continuacion para crear la eliminacion de fadE:

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De\-fadE-F 5' AAAAACAGCA ACAATGTGAG CTTTGTTGTAATTAT ATTGTAA ACATATT

GATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ \D NO: 238); y

De\-fadE-R 5' AAACGGAGCCT TTCGGCTCCGTTATT CATTTACGCGGCTTCAAC TTTCCTG

TAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ \D NO: 239)

Los cebadores De\-fadE-F y De\-fadE-R se usaron para amplificar el casete de resistencia a kanamicina (KmR) del plasmido pKD13 (Datsenko y col., anteriormente citado) mediante la PCR. Despues, se uso el producto de la PCR para transformar celulas de E. coli MG1655 electrocompetentes que contenfan el plasmido pKD46, que expresa recombinasa Red (Datsenko y col., anteriormente citado), que se habfa inducido previamente con arabinosa durante 3-4 horas. Despues de un recrecimiento de 3 horas en medio SOC a 37°C, se sembraron las celulas en placas de agar Luria que contenfan 50 pg/ml de kanamicina. Las colonias resistentes se identificaron y aislaron tras una incubacion durante una noche a 37°C. La alteracion del gen fadE se confirmo en algunas de las colonias mediante amplificacion por la PCR usando los cebadores fadE-12 y fadE-R1, que se disenaron para flanquear el gen fadE de E.coli.

fadE-L2 5'-CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC (SEQ \D NO: 240); y

fadE-R1 5'-CGCGGCGTTGACCGGCAGCCTGG (SEQ \D NO: 241)

Tras confirmarse la eliminacion de fadE, se uso una sola colonia para eliminar el marcador KmR usando el plasmido pCP20 (Datsenko y col., anteriormente citado). La cepa MG1655 de E.coli resultante con eliminacion del gen fadE y eliminacion del marcador KmR se denomino E.coli MG1655 AfadE, o cepa "D1".

E.coli MG 1655 AfadE AtonA (Cepa "DV2")

Este ejemplo describe la construccion de una celula microbiana recombinante en la que se atenuan la expresion de una enzima degradadora de acidos grasos y la expresion de una protefna de la membrana externa. El gen tonA (tambien conocido como fhuA) de E.coli MG1655, que codifica un transportador de ferrocromo de la membrana externa que tambien actua como receptor de bacteriofagos (n.° de acceso de GenBank NP_414692) se elimino de la cepa D1 (descrita anteriormente) usando el sistema Red de acuerdo con Datsenko y col., anteriormente citado, con las siguientes modificaciones:

Los cebadores usados para crear la eliminacion de tonA fueron los siguientes:

Del-tonA-F 5'-ATCATTCTCGTTTACGTTATCATTCACTTTACATCAGAGATATAC

CAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ \D NO: 242); y

Del-tonA-R 5'-GCACGGAAATCCGTGCCCCAAAAGAGAAATTAGAAACGGAAG GTTGCGG

TTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ \D NO: 243)

Los cebadores Del-tonA-F y Del-tonA-R se usaron para amplificar el casete de resistencia a la kanamicina (KmR) desde el plasmido pKD13 mediante la PCR. El producto de la PCR obtenido de este modo se uso para transformar celulas de E. coli MG1655 D1 electrocompetentes que contenfan pKD46 (Datsenko y col., anteriormente citado), habiendose inducido dichas celulas previamente con arabinosa durante 3-4 horas. Despues de un recrecimiento de 3 horas en medio SOC a 37°C, se sembraron las celulas en placas de agar Luria que contenfan 50 pg/ml de kanamicina. Las colonias resistentes se identificaron y aislaron tras una incubacion durante una noche a 37°C. La alteracion del gen tonA se confirmo en algunas de las colonias mediante amplificacion por la PCR usando cebadores que flanquean el gen tonA de E.coli: tonA-verF y tonA-verR:.

tonA-verF 5'-CAACAGCAACCTGCTCAGCAA (SEQ \D NO: 244); y

tonA-verR 5'-AAGCTGGAGCAGCAAAGCGTT (SEQ \D NO: 245)

Tras confirmarse la eliminacion de tonA, se uso una sola colonia para eliminar el marcador KmR usando el plasmido pCP20 (Datsenko y col., anteriormente citado). La cepa MG1655 de E.coli resultante que tenia eliminaciones genicas de fadE y tonA se denomino E.coli MG 1655 AfadE AtonA, o cepa "DV2".

E. coli MG1655 AfadE AtonA lacI: tesA (Cepa "DV2 ’tesA")

Este ejemplo describe la construccion de una celula microbiana recombinante que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad de enzima derivada de acidos grasos. La secuencia de polinucleotidos tesA que codifica la acil-CoA tioesterasa \ de E.coli (EC 3.1.1.5, 3.1.2.-; por ejemplo, acceso de GenBank AAC73596; SEQ \D NO: 202) se modifico para retirar la secuencia lfder, de tal forma que el producto genico de 'tesA resultante estaba truncado en 25 aminoacidos y el aminoacido en la posicion 26 original, alanina, estaba reemplazado por metionina, que despues se convirtio en el primer aminoacido de la secuencia de polipeptido de 'TesA (SEQ \D NO: 204; Cho y col., J. Biol. Chem, 270:4216-4219 (1995)).

Se amplifico por la PCR un casete de integracion que contenfa la secuencia codificante de 'tesA unida

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operativamente al promotor PTrc mas un gen de resistencia a la kanamicina a partir del plasmido pACYC-Pirc-tesA (ejemplo 2) usando los cebadores lacl-directo: GGCTGGCTGGCATAAATATCTC (SEQ ID NO:313) and lacZ- inverso: GCGTTAAAGTTGTTCTGCTTCATCAGCAGGATATCCTG CACCATCGTCTGGATTTTGAACTTTTGCTTT GCCACGGAAC (SEQ ID NO:314), se electroporo en una cepa DV2 y se integro en el cromosoma usando recombinasa Red expresada a partir del plasmido pKD46 (Datsenko y col., anteriormente citado). Los transformantes se seleccionaron en placas de LB complementado con kanamicina. La integracion correcta se evaluo usando PCR diagnostica.

Ejemplo 2. Modificacion por ingenierfa genetica de celulas para la produccion de acidos grasos de cadena ramificada

Los siguientes ejemplos describen la construccion de celulas microbianas recombinantes que comprenden secuencias de polinucleotido que codifican complejos de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos ramificados (BKD) de acuerdo con la parte (C) de la via de AGCR mostrada en la figura 1 y secuencias de polinucleotidos que codifican p - cetoacil-ACP sintasas especfficas para cadena ramificada (es decir, polipeptidos FabH) de acuerdo con la parte (D) de la via de AGCR de la figura 1. Las cepas representadas en el presente documento tambien comprenden secuencias de polinucleotido que codifican enzimas derivadas de acidos grasos, tales como el gen 'tesA de E. coli modificado que expresa una tioesterasa y genera acidos grasos. Este ejemplo demuestra que las cepas de E. coli recombinantes modificadas por ingeniena genetica para expresar un complejo BKD y una sintasa de p -cetoacil-ACP de cadena ramificada producen acidos grasos de cadena ramificada.

I. Plasmidos de BDK

bkd de Bacillus subtilis (plasmido pKZ2)

Los genes bkd de B. subtilis se amplificaron a partir de ADN genomico de B. subtilis 168 usando los siguientes cebadores:

B.s.BKD_R: 5'-GCTCTCGAGTTAGTAACAGATGTCTTC-3' (SEQ ID NO: 246); y B.s.BKD_F(4g): 5'-GCGGATCCATGGCAACTGAGTATGACG-3' (SEQ ID NO: 247)

Los cebadores B.s.BKD_F(4g) y B.s.BKD_R amplificaron genes bkdAA (que codifican la subunidad alfa del componente E1, UniProtKB P37940, GenBank NP_390285; SEQ ID NO: 1), bkdAB (que codifica la subunidad beta del componente E1, UniProtKB P37941, GenBank NP_390284; SEQ ID nO: 22), bkdB (que codifica el componente E2, UniProtKB P37942, GenBank NP_390283; SEQ ID NO: 43) e IpdV (que codifica el componente E3, UniProtKB P54533, GenBank NP_390286.2; SEQ ID NO: 63). Los productos de la PCR se clonaron en el vector pGL10.173B (SEQ ID NO: 228), un plasmido basado en pBR322 con un promotor Ptrc, para producir el plasmido pKZ2. La correcta insercion de los productos de la PCR se verifico usando digestiones con enzimas de restriccion diagnosticas.

bkd de Pseudomonas putida (plasmido pKZ4)

Los genes bkd de P. putida se amplificaron a partir de ADN genomico de P. putida F1 usando los siguientes cebadores:

P.p.BKDFusion_F: 5'-ATAAACCATGGATCCATGAACGAGTACGCCCC-3' (SEQ ID NO: 248

P.pBKDFusion_R: 5'-CCAAGCTTCGAATTCTCAGATATGCAAGGCGTG-3' (SEQ ID NO: 249

Los cebadores P.p.BKDFusion_F y P.p.BKDFusion_R amplificaron los genes de P. putida Pput_1450 (que codifica el componente E3, n.° de acceso de UniProtKB A5W0E08; SEQ ID NO: 67), Pput_1451 (que codifica el componente E2, n.° de acceso de UniProtKB A5W0E9; SEQ ID NO: 47), Pput_1452 y Pput_1453 (que codifican las subunidades E1 alfa y E1 beta, UniProtKB A5W0F1 y A5W0F0, SEQ ID nO: 5 y 26, respectivamente). Los productos de la PCR se clonaron en el vector pGL10.173B (un plasmido basado en pBR322 con un promotor Ptrc; SEQ ID NO: 228) para producir el plasmido pKZ4 (SEQ ID NO: 231). La correcta insercion de los productos de la PCR se verifico usando digestiones con enzimas de restriccion diagnosticas.

bkd de Listeria monocytogenes (plasmido pTB85)

Los genes bkd de Listeria monocytogenes se amplificaron a partir de ADN genomico de Listeria monocytogenes Li23 (ATCC 19114D-5) usando los siguientes cebadores:

cebador 81 (BKD_directo) GAGGAATAAACCGTGGCAACAGAATATGATGTCGTTATTCT (SEQ ID NO: 250)

cebador 82 (BKD_inverso) CCCAAGCTTCGAATTTTAATACAATGCTGTATTTTCTTTGGAAAT (SEQ ID NO: 251)

Se clono el operon bkd de L. monocytogenes (SEQ ID NO: 232) generado mediante la PCR en los sitios de Ncol y EcoRI de pGL10.173B (un plasmido basado en pBR322 con un promotor Ptrc; SEQ ID NO: 228) para generar el

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plasmido pTB85.

II. Plasmidos de FabH

Vector de expresion pDG2

El vector de expresion pDG2 fue el plasmido de base para muchas de las construcciones descritas a continuacion. El vector pCDFDuet-1 (Novagen/EMD Biosciences) porta el replicon CloDF13, el gen lacI y el gen de resistencia a estreptomicina/espectinomicina (aadA). Para construir el plasmido pDG2, la porcion C-terminal del gen pisX, que contiene un promotor interno para el gen fabH cadena abajo (Podkovyrov y Larson, Nucl. Acids Res. (1996) 24 (9): 1747-1752 (1996)) se amplifico a partir de ADN genomico de E. coli MG1655 usando cebadores

5'-TGAATTCCATGGCGCAACTCACTCTTCTTTTAGTCG-3' (SEQ ID NO: 252) y

5'-CAGTACCTCGAGTCTTCGTATACATATGCGCTCAGTCAC-3' (SEQ ID NO: 253)

Estos cebadores introdujeron sitios de restriccion de Ncol y Xhol proximos a los extremos, asf como un sitio interno de Ndel.

Tanto el inserto de pIsX (que contiene el promotor de EcfabH) como el vector pCDFDuet-1, se digirieron con las enzimas de restriccion Ncol y Xhol. El vector cortado se trato con fosfatasa Antarctic. Se ligo el inserto en el vector y se transformo en celulas E. coli competentes para transformacion. Los clones se seleccionaron mediante secuenciacion de ADN. La secuencia del plasmido pDG2 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 229.

fabH1 de B. subtilis (pDG6), fabH2 de B. subtilis (pDG7) y fabH de Streptomyces coelicolor (pDG8)

El plasmido pDG6 se construyo usando el plasmido pDG2. La secuencia codificante de fabH1 se amplifico a partir de Bacillus subtilis cepa 168 usando los cebadores

5'-CCTTGGGGCATATGAAAGCTG-3' (SEQ ID NO: 254) y

5'-TTTAGTCATCTCGAGTGCACCTCACCTTT-3' (SEQ ID NO: 255). Estos cebadores introdujeron sitios de restriccion de Ndel y Xhol en los extremos del producto de amplificacion.

Se digirieron tanto el inserto de fabH1 como el vector pDG2 con las enzimas de restriccion Ndel y Xhol. El vector cortado se trato con fosfatasa Antarctic. Se ligo el inserto en el vector y se transformo en celulas E. coli competentes para transformacion. Los clones se seleccionaron mediante secuenciacion de ADN. La secuencia del plasmido pDG6 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 230 y expresa el polipeptido FabH1 de B. subtilis (sEq ID NO: 84) bajo el control del promotor EcfabH.

Se prepararon otros plasmidos basados en pDG2 usando una estrategia similar a la empleada para el plasmido pDG6. El plasmido pDG7 comprende un inserto de fabH2 de Bacillus subtilis que expresa el polipeptido FabH2 de B. subtilis (SEQ ID NO: 86). El plasmido pDG8 comprende un inserto de fabH de Streptomyces coelicolor que expresa el polipeptido FabH de S. coelicolor (sEq ID NO: 96).

fabH1 de B. subtilis (plasmido pKZ5)

El plasmido pKZ5 se construyo clonando el fragmento Ncol-Avrll de pDG6, que contenfa BsFabH1 bajo el control del promotor EcfabH, en el vector cortado en Ncol-Avrll, pACYCDuet-1 (Novagen). El plasmido pKZ5 porta un gen de resistencia al cloranfenicol y un gen de resistencia a estreptomicina/espectinomicina.

III. Otros plasmidos

Plasmidos pACYC-Ptc -tesA y pACYC-Prrc? -tesA

El plasmido pACYC-PTrc se construyo amplificando por la PCR laclq, el promotor PTrc y la region de terminador de pTrcHis2A (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando los cebadores

pTrc_F TTTCGCGAGGCCGGCCCCGCCAACACCCGCTGACG (SEQ ID NO: 258) y

pTrc_R AAGGACGTCTTAATTAATCAGGAGAGCGTTCACCGACAA (SEQ ID NO: 259)

Despues, se digirio el producto de la PCR con Aatll y Nrul y se inserto en el plasmido pACYC177 (Rose, R.E., Nucleic Acids Res., 16:356 (1988)) digerido con Aatll y Seal. la secuencia de nucleotidos del vector pACYC-PTrc se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 233.

Para generar el vector pACYC-Prrc2, se introdujo una sola mutacion puntual en el promotor PTrc del vector pACYC- PTrc para generar el promotor variante PTrc2 y el vector pACYC-PTrc2. La secuencia del promotor PTrc de tipo silvestre se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 234, y el promotor variante PTrc2 se proporciona en el

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presente documento como la SEQ ID NO: 235.

La secuencia de nucleotidos que codifica acil-CoA tioesterasa I de E.coli (TesA, EC 3.1.1.5, 3.1.2.-; por ejemplo, acceso de GenBank AAC73596; SEQ ID NO: 202) se modifico para retirar la secuencia lider, de tal forma que el producto genico de 'tesA resultante estaba truncado en 25 aminoacidos y el aminoacido en la posicion 26 original, alanina, estaba reemplazado por metionina, que despues se convirtio en el primer aminoacido del polipeptido de 'TesA (SEQ ID NO: 204; Cho y col., J. Biol. Chem, 270:4216-4219 (1995)). El ADN que codifica el polipeptido 'TesA se inserto en los sitios de Ncol y EcoRI del vector pACYC-Pirc y el vector pACYC-PTrc2, produciendo los plasmidos pACYC-Ptrc -tesA y pACYC-PTrc2-tesA, respectivamente. La correcta insercion de la secuencia 'tesA en los plasmidos se confirmo por digestion de restriccion.

Fosfotransbutirilasa-butirato cinasa de C. acetobutylicum (plasmido pDG10)

El plasmido pDG10 se preparo usando el vector PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) y un inserto de operon ptb_buk de C. acetobutylicum, en el que la parte ptb representa el gen que codifica fosfotransbutirilasa de C. acetobutylicum (acceso de GenBank AAA75486.1, SEQ ID NO: 227) y la parte buk representa el gen que codifica butirato cinasa de C. acetobutylicum (acceso de GenBank JN0795, SEQ ID NO: 226). El operon buk_ptb se amplifico a partir de ADN genomico de C. acetobutylicum (ATCC 824) usando los cebadores 5'- CTTAACTTCATGTGAAAAGTTTGT-3' (SEQ ID NO: 260) y 5'-ACAATACCCATGTTTATAGGGCAA-3' (SEQ ID NO: 261). El producto de la PCR se ligo en el vector PCR-Blunt siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 3: Produccion de acidos grasos ramificados en E. coli modificada por ingenierfa genetica para expresar genes bkd y fabH exogenos

Se prepararon las siguientes cepas de E. coli como se ha descrito anteriormente:

DV2'tesA (MG1655 AfadE AtonA lacI:tesA) es la cepa DV2 de E. coli que ademas, expresa un gen 'tesA sin lider para la produccion de acidos grasos.

DV2'tesA + BsfabH1 es la cepa DV2'tesA transformada con el plasmido pDG6 que expresa el gen fabH1 de B. subtilis.

DV2'tesA + BsfabH1 + Bsbkd es la cepa DV2'tesA trasformada con el plasmido pDG6 que expresa el gen fabH1 de B. subtilis y el plasmido pKZ2 que expresa el operon bkd de B. subtilis.

DV2'tesA + BsfabH1 + Ppbkd es la cepa DV2'tesA trasformada con el plasmido pDG6 que expresa el gen fabH1 de B. subtilis y el plasmido pKZ4 que expresa el operon bkd de P. putida.

Los cultivos de siembra se cultivaron en LB complementado con los antibioticos adecuados. Tras 4 horas de cultivo, se diluyeron los cultivos a 1:25 en medio Che-9 2NBT (glucosa al 2%, medio limitado para nitrogeno, Bis-Tris 0,2 M, pH 7,0, Triton al 0,1%) + antibioticos adecuados y se cultivo durante una noche. Despues, se diuyeron los cultivos en 4NBT (glucosa al 4%, medio limitado para nitrogeno, Bis-Tris 0,2 M, pH 7,0, Triton al 0,1%) hasta una DO600 final de ~0,2. Tras 6 horas de cultivo, se anadio IPTG a una concentracion final de 1 mM. 24 horas despues de la induccion, se extrajo 1 ml de cultivo con 500 pl de acetato de etilo (que contenfa HCl al 1%), derivatizado con TMAH recien preparado y se sometio a analisis CG/EM.

Tabla 7: Produccion de acidos grasos ramificados

Cepa: Tftulo de AGL total Tftulo de AGCR total Total de AGCR/Total de AGL Tftulo total de anteiso-AGCR Anteiso/Total AGCR

DV2'tesA: ~2000 0 0 0 0

DV2'tesA + BsfabH1 (pDG6): ~2000 3 0,0015 0 0

DV2'tesA + BsfabH1 (pDG6) + Ppbkd(pKZ4): 2130 580 0,27 100 0,17

todos los tftulos son en miligramos por litro

AGL = acido graso libre; AGCR = acido graso de cadena ramificada

Resultados:

E. coli normalmente no produce acidos grasos de cadena ramificada. La figura 4(b) es un analisis por CG/EM de los acidos grasos libres (AGL) producidos por la cepa de control de E. coli (DV2'tesA) que expresa un gen de tioesterasa pero que carece de las enzimas de las partes (C) y (D) de la via de AGCR y que no muestra produccion detectable de acidos grasos de cadena ramificada. La modificacion por ingenierfa genetica de la cepa de E. coli para que tambien expresase un gen fabH, que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa III que utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato correspondiente a la parte (D) de la via de AGCR, dio

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como resultado la produccion de una cantidad apenas detectable de acidos grasos de cadena ramificada, correspondientes a menos de aproximadamente un 2% del total de AGL producidos (figura 4(a)). La cepa DV2'tesA de E. coli produjo aproximadamente 2000 mg/l de acidos grasos libres, sin acidos grasos de cadena ramificada detectables, mientras que la cepa DV2'tesA + BsfabHI que expresa el gen BsfabHI produjo igualmente aproximadamente 2000 mg/l de aGl, aproximadamente 3 mg/l (< 2%) de los cuales eran acidos grasos de cadena ramificada, encontrandose esencialmente todos en la configuracion iso-ramificada (tabla 7).

La produccion de acidos grasos ramificados aumento drasticamente cuando se modifico la cepa de E. coli para que expresase genes bkd que codifican actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, actividad lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa (correspondientes a la parte (C) de la via de AGCR), junto con el gen fabH exogeno. Tal como puede observarse en la figura 5, la expresion de los genes bkd de B. subtilis junto con el gen fabHI de B. subtilis produjo una serie de estructuras de acidos grasos ramificados, incluyendo acidos grasos ramificados con longitudes de cadena de C13 a C17 en sus formas iso-ramificadas (anotadas como "i-") y anteiso-ramificadas (anotadas como "a-").

Cuando se expresaron genes bkd de P. putida junto con el gen fabHI de B. subtilis, la cepa DV2'tesA + BsfabHI + Ppbkd resultante produjo igualmente acidos grasos ramificados con longitudes de cadena de C13 a C17 en sus formas iso-ramificadas y anteiso-ramificadas (figura 6). Aproximadamente un 27% (en peso) de los AGL producidos por esta cepa eran acidos grasos ramificados; aproximadamente un 83% de estos acidos grasos ramificados se encontraban en la forma iso y aproximadamente un 17% de estos acidos grasos ramificados se encontraban en la forma anteiso (tabla 7).

Ejemplo 4. Modificacion por ingenierfa genetica de E. coli para la produccion de acidos grasos anteiso- ramificados por la via (A.1)

El siguiente ejemplo describe la construccion de cepas de E. coli recombinantes que expresan genes exogenos y/o sobreexpresan genes endogenos que codifican enzimas que sirven para aumentar el flujo metabolico hacia los intermedios a-cetobutirato, el intermedio de a-cetoacido anteiso-ramificado, a-ceto-p-metilvalerato y el cebador de cadena anteiso-ramificada, 2-metilbutiril-CoA mediante la parte (A.1) de la via de la figura 3A, que da lugar a la produccion aumentada de acil-ACP anteiso-ramificada y en ultima instancia, a derivados de acidos grasos anteiso- ramificados, en estas celulas recombinantes.

Este ejemplo tambien describe el efecto de atenuar la expresion de un gen endogeno no deseado en la produccion de AGCR. En este ejemplo, el gen fabH de E. coli que codifica una beta-cetoacil-ACP sintasa III, que utiliza moleculas de acil-CoA de cadena lineal en lugar de moleculas de acil-CoA de cadena ramificada, se atenuo mediante la eliminacion de este gen. Este efecto tambien describe el efecto en la produccion de AGCR de integrar cromosomicamente un operon exogeno de BKD (correspondiente a la parte (C) de la via de AGCR de las figuras 1 y 3B).

DV2 Pl thrA*BC

Este ejemplo describe la construccion de una cepa de E. coli recombinante en la que se muto uno de los genes cromosomicos implicados en la biosfntesis de treonina y se coloco bajo el control de un promotor lambda Pl integrado cromosomicamente.

Para introducir una sola mutacion en el gen de aspartocinasa I (thrA) nativo, el gen se amplifico a partir de ADN de E.coli MG1655 en dos partes. La primera parte se amplifico usando los cebadores TREE026 y TREE028, mientras que la segunda parte se amplifico usando TREE029 y TREE030 (tabla 8). Los cebadores usados para amplificar los dos componentes contenfan secuencias solapantes, que despues se usaron para "coser" juntas las piezas individuales. Los dos productos de la PCR se combinaron en una sola reaccion PCR y los cebadores TREE026 y TREE030 para amplificar el gen thrA completo. Se disenaron los cebadores TREE028 y TREE029 para crear una mutacion en thrA nativo en el codon 345, que dio como resultado una variante S345F de aspartocinasa I (SEQ ID NO: 118). Los trabajos previos demostraron que esta mutacion elimina la inhibicion por retroalimentacion por treonina en la cepa hospedadora (Ogawa-Miyata,Y., y col., Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:1149-1154 (2001); Lee J.-H., y col., J. Bacteriol. 185: 5442-5451 (2003)). La version modificada de este gen se denomino "thrA*".

El promotor Pl se amplifico usando los cebadores Km_trc_overF y TREE027 (tabla 8) usando el plasmido pDS80 (ejemplo 2) como molde. Despues, se cosio este fragmento a un casete de resistencia a la kanamicina flanqueado por sitios FRT, que se amplifico a partir del plasmido pKD13 usando los cebadores TREE025 y Km_trc_overR (tabla 8). El producto de la PCR resultante que contenfa el casete KmFRT y el promotor Pl se cosio al producto de la PCR, thrA*. Se usaron los cebadores TREE025 y TREE030 para amplificar el casete mutagenico de KmFRT-PL-thrA* completo. Estos cebadores tambien contienen aproximadamente 50 pb de homologfa con el sitio de integracion en el extremo 5' y el gen thrA completo como homologfa en el extremo 3', dirigiendo el casete al sitio thrA nativo en E. coli, que forma parte de un operon que comprende los genes thrA, thrB y thrC. Este casete mutagenico se electroporo en la cepa progenitora, E.coli DV2 (ejemplo 1) que contiene el plasmido auxiliar pKD46 que expresa recombinasa Red (Datsenko y col., anteriormente citado). Los clones que contenfan la integracion cromosomica se seleccionaron en presencia de kanamicina y se verificaron mediante PCR diagnostica. Despues, se retiro el marcador de kanamicina

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mediante la expresion del plasmido pCP20 (Datsenko y col., anteriormente citado). Se verified la integration adecuada y la elimination del marcador mediante PCR y secuenciacion. La cepa resultante, en la que se sobreexpresaron el gen thrA* mutante y los genes thrB y thrC endogenos por medio del promotor lambda Pl integrado cromosomicamente, se denomino DV2 Pl thrA*BC.

Tabla 8: Cebadores

Cebador: Secuencia (5' ^ 3') SEQ ID NO:

TREE025: C CTG AC AG TG CG G G CTTTTTTTT1CG ACCAAAG GT AACG AGGT AACAACC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG 262

TREE026: GTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACCATGCGAGTGT TGAAGTTCGGCG 263

TREE027: CTGATGTACCGCCG AACTT C AACACT CG CAT G GTTTATTCCT CCTT ATTT AA TCGATAC 264

TREE028: GCGCCCGTAI11TCGTGGTGCTGATTAC 265

TREE029: G T A AT C AG C ACCACGTA A AT ACG G G CG C 266

TREE030: T CAG ACT CCT AACTTCCATG AG AG G 267

Km_trc_overR: AATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC 268

Km_trc_overF: CTTCGAACTGCAGGTCGACGGATCCCCGGAATGCCGACATCATAACGGTT CTGGC 269

EG238: GCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACC 270

TREE017: ACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTAAG 271

TREE018: TCACTG CCCG CTTT CC 272

TREE019: ACCGGCAGATCGTATGTAATATGCATGGTTTATTCCTCCTTATTTAATCGAT ACA 273

TREE020: AT G CAT ATT ACAT ACG ATCTG CC 274

TREE021: G GTCG ACGG AT CCCCG G AATT A AG CGT CAACG AAACCG 275

TREE022: GAAGCAGCTCCAGCCTACACCAGACGATGGTGCAGGAT 276

TREE023: GCAAAGACCAGACCGTTCATA 277

Kan/Chlor 1: ATTCCGGGGATCCGTCGACC 278

Kan/Chlor 4: TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG 279

TREE025: GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG 280

TREE026: GTATATATT AAT GTATCG ATTA AAT AAG G AGG AAT A AACC AT G CG AGTGT TGAAGTTCGGCG 281

Para evaluar el efecto de la sobreexpresion de Pl thrA*BC en DV2, se transformaron los tres plasmidos a continuation (descritos en el ejemplo 2) en esta cepa: pKZ4, que expreso el operon de BKD de P. putida; pDG6, que expreso fabHI de B. subtilis; y pACYC-ptrc2-tesA, que expreso una forma truncada de tesA de E. coli. Se llevaron a cabo experimentos de fermentation en matraces de agitation y se proporcionan los tltulos de acidos grasos libres (AGL), acidos grasos ramificados (AGCR) y acidos grasos anteiso-ramificados (anteiso-AGCR), junto con la fraction de aGl producidos en forma de AGCR y la fraccion de AGCR producidos en forma de anteiso-AGCR, en la tabla 10.

DV2 Pl thrA*BC Pl tdcB

Se sobreexpreso el gen de treonina desaminasa catabolica (tdcB) de E.coli (tambien conocido como treonina amoniaco-liasa) integrando una copia adicional del gen en el locus de lacZ y colocandolo bajo el control de un promotor fuerte no inducible.

La treonina desaminasa catabolica cataliza la degradation de la treonina en a-cetobutirato (2-oxobutanoato), la primera reaction de la via de degradacion de treonina/produccion de isoleucina. La reaction catalizada probablemente implica la eliminacion inicial del agua (a esto se debe que la identification anterior de la enzima fuese como treonina deshidratasa), seguida de la isomerization e hidrolisis del producto con la rotura del enlace C-N. Se ha demostrado que la expresion aumentada de este gen aumenta drasticamente los niveles de isoleucina en organismos heterologos (Guillouet S. y col., Appl. Environ. Microbiol. 65:3100-3107 (1999)). Ademas, la treonina desaminasa es relativamente resistente a los mecanismos de retroalimentacion de isoleucina (Guillouet y col., anteriormente citado).

Se amplifico ADN genomico de E.coli MG1655 usando los cebadores TREE020 y TREE021 (tabla 8) para obtener el gen tdcB nativo. Al mismo tiempo, se usaron los cebadores Chlor 1 y Chlor 4 (tabla 8) para amplificar un casete de

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FRT-resistencia a kanamicina para su uso en la seleccion/exploracion de la integration, como se ha descrito previamente. Usando ADN genomico de E.coli MG1655 como molde, se usaron los cebadores EG238 y TREE018 (tabla 8) para amplificar una region de homologfa 3' respecto del sitio de integration de lacZ, mientras que se usaron los cebadores TREE022 y TREE023 (tabla 8) para amplificar una region de homologfa 5' respecto del sitio de lacZ. Se uso el plasmido pDS80 (ejemplo 2) como molde para amplificar un fragmento que contenfa el promotor Pl usando los cebadores TREE017 y TREE018 (tabla 8). Cada uno de estos fragmentos se diseno con salientes para el trozo adyacente correspondiente y se cosieron juntos usando tecnicas de PCR SOEing. El casete mutagenico de Pl tdcB resultante (aprox. 4.3kb) contenfa aproximadamente 700pb de homologfa respecto del sitio de integration en el extremo 5' y 750pb de homologfa respecto del sitio de integration en el extremo 3'. El casete mutagenico de Pl tdcB se electroporo en la cepa hospedadora, E.coli DV2 Pl thrA*BC que contenfa el plasmido auxiliar, pKD46 (Datsenko y col., anteriormente citado). Se seleccionaron los clones que contenfan la integration cromosomica en presencia de kanamicina y se verificaron mediante la PCR y analisis de secuenciacion. Despues, se retiro el marcador de kanamicina usando el plasmido pCP22 (Datsenko y col., anteriormente citado). La cepa resultante se denomino DV2 Pl thrA *BC Pl tdcB.

Para evaluar el efecto de la integration de Pl tdcB en DV2 Pl thrA*BC, se transformaron los tres plasmidos a continuation (descritos en el ejemplo 2) en esta cepa: pKZ4, que expreso el operon de BKD de P. putida; pDG6; que expreso fabHI de B. subtilis; y pACYC-ptrc2-tesA, que expreso una forma truncada de tesA de E. coli. Se llevaron a cabo experimentos de fermentation en matraces de agitation y se proporcionan los tftulos de acidos grasos libres (AGL), acidos grasos ramificados (AGCR) y acidos grasos anteiso-ramificados (anteiso-AGCR), junto con la fraction de aGl producidos en forma de aGcR y la fraction de AGCR producidos en forma de anteiso-AGCR, en la tabla 10.

DV2 PL-thrA*BC PT5-BsfabH1

Este ejemplo describe la construction de una celula microbiana recombinante en la que se integro el gen de fabH1 de B. subtilis en el cromosoma y se coloco bajo el control transcripcional del promotor fuerte constitutivo T5.

En primer lugar, se genero un producto de la PCR para la integration cromosomica de un casete de integration loxPcat que comprende un gen de resistencia al cloranfenicol, un promotor T5 (Pts) y la secuencia codificante de BsfabH1, en el sitio de la marca de elimination de fadE de DV2 Pl thrA*BC. En primer lugar, se amplificaron por la PCR los componentes individuales del casete de integration. El componente loxP-cat- loxP Pt5 se amplifico a partir del plasmido p100.38 (SEQ ID NO: 237) usando los cebadores TREE133 y TREE135 (tabla 9). Se amplifico el gen BsfabH1 a partir de un plasmido que portaba el gen BsfabH1 usando los cebadores TREE134 y TREE136. Los cebadores TREE133 y TREE136 contiene los 50 pb de secuencia de homologfa 5' y 3' para la integration. Los cebadores usados para amplificar los componentes contienen secuencia solapante que despues se usaron para "coser" juntas las piezas individuales. Se cosieron juntos los productos de la PCR loxP-cat-PT5 y BsfabH1 combinando ambas piezas en una sola reaction PCR y usando los cebadores TREE133 y TREE136 para amplificar el casete de integration final loxPcat-PT5-BsfabH1.

Tabla 9: Cebadores

Nombre del cebador: Secuencia Fin SEQ ID NO:

TREE133: AAAAACAG CAACAATGTG AG CTTTGTTGTAATTATATTG T AA AC AT ATT GTCCG CT GTTT CT G C ATT CTT ACgt Amplificar el casete loxPcat-T5 282

TREE134: GATGACGACGAACACGCATTaagGAGGTGAATAAGGAG GAATAAcatATGAAAGCTGGCATTCTTGGTGTTG Amplificar BsfabH1 283

TREE135: GTAACGT CCAACACCAAG AAT G CCAG CTTT CAT atgTT AT TCCT CCTTATT C ACCT Cctt AAT G CGTGTTCG Amplificar el casete loxPcat-T5 284

TREE136: AAACG GAG CCTTT CG G CTCCGTTATT CATTT ACG CG G CTT CAACTTTCCGTTATCG GCCCCAG CG G ATTG Amplificar BsfabH1 285

TREE137: CGCAGTTTGCAAGTGACGGTATATAACCGAAAAGTGACT GAGCGTACatgATTCCGGGGATCCGTCGACC Amplificar el casete de elimination EcfabH 286

TREE138: G CAAATT G CGTCAT G 1 T 1 1 AA I'CCTTATCCTAG AAACG AA CCAGCGCGGATGTAGGCTGGAGCTGCTTCG Amplificar el casete de elimination EcfabH 287

TREE139: G C AG CG AC A AGTTCCTC AG C Verificar la elimination de EcfabH 288

TREE140: CCG CAG AAG CTTCAG CAAACG Verificar la elimination de EcfabH 289

fadE-L2: CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC Verificar la integration de BsfabH1 290

fadE-R2: GGGCAGGATAAGCTCGGGAGG Verificar la integration de BsfabH1 291

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Se integro el casete loxP-cat-PT5-BsfabH1 usando el sistema de recombinasa Red (Datsenko, y col., anteriormente citado). El producto de la PCR de loxP-cat-PT5-BsfabH1 se uso para transformar celulas DV2 Pi-thrA*BC electrocompetentes que contenfan el plasmido pKD46, que se habfan inducido previamente con arabinosa durante 3 - 4 horas a 30°C. Despues de un recrecimiento de 3 horas a 37°C en medio SOC, se sembraron las celulas en placas de agar Luria que contenfa 17 pg/ml de cloranfenicol y se incubaron durante una noche a 37°C. Las colonias resistentes al cloranfenicol se seleccionaron mediante PCR respecto de la integracion adecuada de loxP-cat-PT5- BsfabH1. Para confirmar la integracion, se usaron los cebadores fadE-L2 y fadE- R2 (tabla 9) que flanquean al sitio de integracion cromosomica. Tras verificar la integracion, se retiro el gen marcador de cloranfenicol expresando una recombinasa Cre que promueve la recombinacion entre los dos sitios de loxP que flanquean al gen de resistencia al cloranfenicol. El plasmido pJW168, que porta el gen de recombinasa cre, se transformo en la cepa DV2 PL-thrA*BC loxP-cat-PT5-BsfabH1 y se retiro el marcador de acuerdo con el procedimiento descrito por Palmeros y col., (Gene 247:255-264 (2000)). La cepa resultante, DV2 PL-thrA*BC PT5-BsfabH1, se verifico por secuenciacion.

DV2 Pi -thrA*BC PT5-BsfabH1 AEcfabH

Este ejemplo describe la construccion de una celula de E. coli recombinante en la que se atenuo la expresion de un gen endogeno no deseado (en este caso, el gen fabH de E. coli, que codifica una beta-cetoacil-ACP sintasa III que utiliza moleculas de acil-CoA de cadena lineal en lugar de moleculas de acil-CoA de cadena ramificada) mediante la eliminacion de este gen.

Se elimino el gen fabH de E.coli de DV2 PL-thrA*BC PT5-BsfabH1 usando el sistema de recombinasa Red (Datsenko y col., anteriormente citado). Se usaron los cebadores TREE137 y TREE138 (tabla 9), para amplificar el casete de resistencia a kanamicina del plasmido pKD13 mediante la PCR. Despues, se uso el producto de la PCR para transformar celulas DV2 PL-thrA*BC PT5-BsfabH1 electrocompetentes que contenfan el plasmido pKD46. La eliminacion de EcfabH y la extraccion del marcador de kanamicina se llevaron a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito por Wanner y Datsenko, anteriormente citado. Se usaron los cebadores TREE139 y TREE140 para confirmar la eliminacion de EcfabH. La cepa final sin marcador se denomino DV2 PL-thrA*BC Pt5- BsfabHI AEcfabH.

DV2 PL-thrA*BC PL-tdcB PT5-BsfabH1 AEcfabH

Se construyo una cepa de E. coli recombinante que contenfa genes integrados cromosomicamente que sobreexpresaban las enzimas de las partes (A.1) y (D) de la via biosintetica de anteiso-AGCR de las figuras 3A y 3B. Se integro el casete mutagenico PL-tdcB (preparado como se ha descrito anteriormente) en la cepa DV2 PL-thrA*BC PT5-BsfabH1 AEcfabH para generar la cepa DV2 PL-thrA*BC PL-tdcB PT5-BsfabH1 AEcfabH. En esta cepa, los genes thrA*BC de E. coli integrados y el gen tdcB de E. coli integrado se encuentran bajo el control de promotores lambda Pl fuertes y el gen fabH1 de B. subtilis integrado se encuentra bajo el control del promotor fuerte T5. Se elimino de esta cepa el gen fadH de E. coli endogeno.

Plasmido pOP80

Se construyo el plasmido pOP80 digiriendo el vector de clonacion pCL1920 (GenBank AB236930; Lerner C.G. e Inouye M., Nucleic Acids Res. 18:4631 (1990)) con las enzimas de restriccion Aflll y Sfol. En esta digestion se produjeron tres fragmentos de ADN. El fragmento de 3737 pb se purifico en gel usando un kit de purificacion en gel (Qiagen, Inc., Valencia, CA). En paralelo, se amplifico un fragmento de secuencia de ADN que contenfa el promotor PTrc y la region lacI del plasmido comercial pTrcHis2 (Invitrogen, Carlsbad, CA) por la PCR usando los cebadores LF302 (5'-atatgacgtcGGCATCCGCTTACAGACA-3', SEQ ID NO: 292) y LF303 (5'-

aattcttaagTCAGGAGAGCGTTCACCGACAA-3', SEQ ID NO: 293) introduciendo los sitios de reconocimiento para las enzimas Zral y Aflll, respectivamente. Tras la amplificacion, los productos de la PCR se purificaron usando un kit de purificacion para PCR (Qiagen, Inc. Valencia, CA) y se digirieron con Zral y Aflll siguiendo las recomendaciones del proveedor (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA). Tras la digestion, el producto de la PCR se purifico en gel y se ligo con el fragmento de secuencia de ADN de 3737 pb obtenido a partir de pCL1920 para generar el plasmido de expresion pOP80 que contenfa el promotor PTrc.

Plasmido de ilvA de C. glutamicum

Se construyo un plasmido que expresa el gen ilvA que codifica una treonina desaminasa de Corynebacterium glutamicum, y se comprobo su idoneidad para su uso en la parte (A.1) de la via biosintetica de anteiso-AGCR de la figura 3A. Se uso el ADN genomico de Corynebacterium glutamicum para amplificar el gen ilvA usando los siguientes cebadores:

ilvA_F TAAGGAGGAATAAACCATGAGTGAAACATACGTGTCTGAGA (SEQ ID NO: 294)

ilvA_R CGGGCCCAAGCTTCGAATTTTATTAGGTCAAGTATTCGTACTCAGGG (SEQ ID NO: 295)

El gen se inserto en los sitios de Ncol y EcoRI del plasmido OP80 (anterior). Se verifico la secuencia del plasmido, despues se transformo en DV2 Pi-thrA*BC PT5-BsfabH1 AEcfabH. Se evaluo la produccion de acidos grasos de cadena ramificada de esta cepa frente a DV2 Pi-thrA*BC Pi-tdcB PT5-BsfabH1 AEcfabH, que tiene un gen tdcB

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integrado bajo el control del promotor Pl. Las cepas se cultivaron en medio FA-2 siguiendo el protocolo indicado a continuacion.

Fermentacion en matraces de agitacion y extraccion (protocolo con medio FA-2)

Se evaluo la produccion de acidos grasos de cadena ramificada en las cepas mediante fermentacion en matraces de agitacion. Generalmente, se uso el protocolo en medio FA-2 convencional. Brevemente, se usaron tres colonias individuales de una transformacion para inocular un cultivo en LB + antibioticos adecuados durante una noche. A la manana siguiente, se usaron 50 pl de los cultivos de una noche para inocular 2 ml de cultivos de siembra de LB + antibioticos. Tras 3 - 4 horas de crecimiento, se transfirio todo el cultivo de siembra de 2 ml de LB + antibioticos a 18ml de medio FA-2 en matraces de agitacion con deflectores de 125ml. Los cultivos se indujeron con IPTG 1 mM una vez que la DO600 alcanzo 1,5 y se tomaron muestras para su extraccion 20 - 22 horas despues de la induccion. Se acidificaron muestras de cultivo de 400 pl con 40 pl de HCl 1N y despues se extrajeron con 400 pl de acetato de butilo al que se anadio un estandar interno de 500mg/l de alcano C24. Los extractos se derivatizaron con un volumen igual de N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) antes de analizarlos por CG/EM. El estandar interno de alcano C24 se uso para cuantificar los acidos grasos libres (AGL) presentes en las muestras.

Tabla 10: Produccion de acidos grasos ramificados

: Cepa Pp bkd pKZ4 Bs fabH1 Ec fabH Tftulo de AGL total Tftulo de AGCR total AGCR/AGL total Tftulo de Anteiso- AGCR Anteiso/Total AGCR

1: DV2 + P 2008 533 0,27 66 0,12

2: DV2 thrA*BC + P 1955 535 0,27 214 0,40

3: DV2 thrA*BC + int 1908 651 0,34 245 0,38

4: DV2 thrA *BC + int A 1563 705 0,45 255 0,36

5: DV2 thrA *BC tdcB + P 2012 589 0,29 334 0,57

6: DV2 thrA *BC tdcB + int A 1470 918 0,62 609 0,66

7: DV2 thrA *BC Cg ilvA + int A 1257 704 0,56 513 0,73

todos los tftulos son en miligramos por litro

AGL = acido graso libre; AGCR = acido graso de cadena ramificada

todas las cepas tambien expresan el gen 'tesA en el plasmido pACYC-pTrc2-tesA

p = BsfabHI expresado en plasmido (pDG6)

int = gen BsfabHl integrado cromosomicamente

A = gen fabH cromosomico de E. coli eliminado

Resultados:

Comparando las cepas 1 y 2, el aumento de la produccion del intermedio de la via de anteiso-AGCR, treonina, sobreexpresando los genes thrA*BC aumento significativamente la proporcion de anteiso-AGCR producido por las celulas; aproximadamente un 12% (en peso) de los AGCR producidos por la cepa 1 se encontraban en la forma anteiso, que aumento en la cepa 2 a aproximadamente el 40% de los AGCR producidos. Por otra parte, la proporcion de AGCR total producida por estas celulas permanecio practicamente constante; aproximadamente un 27% de los AGL producidos por cada cepa se encontraba en la forma ramificada (AGCR).

La comparacion de las cepas 2 y 3 muestra que se obtuvo una ligera mejora integrando cromosomicamente un gen de la via de AGCR. Este ejemplo muestra un aumento en la cantidad y la proporcion de AGCR producidos por la cepa 3, en la que se integro extracromosomicamente el gen BsfabH1 (que codifica un polipeptido que tiene actividad de sintasa III de beta-cetoacil-ACP de cadena ramificada), en comparacion con los producidos por la cepa 2 que contenfa el gen BsfabH1 expresado por el plasmido. La proporcion de anteiso-AGCR producidos por las cepas que contenfan BsFabH1 integrado cromosomicamente y expresado por el plasmido permanecieron relativamente sin alterar; aproximadamente un 38 a 40% de los AGCR totales producidos por estas cepas fueron anteiso-AGCR.

La comparacion de las cepas 3 y 4 demuestra que la atenuacion de un gen endogeno no deseado que aleja el flujo de la via de AGCR aumenta la produccion de AGCR. La cepa 3 contenfa el gen fabH de E. coli endogeno implicado

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en la produccion de acidos grasos de cadena lineal. La eliminacion de ese gen de la cepa 4 aumento significativamente la cantidad de AGCR producida por esta cepa, aumentando desde aproximadamente un 34% de los AGL producidos en forma ramificada en la cepa 3, hasta aproximadamente un 45% de los AGL producidos en forma ramificada en la cepa 4. Por otra parte, la proporcion de anteiso-AGCR producidos por estas cepas permanecio relativamente sin cambiar; en estas dos cepas, se produjo entre un 36% y un 38% de los AGCR en la forma anteiso.

La comparacion de las cepas 1, 2, 5 y 6 muestra que la proporcion de anteiso-AGCR producidos por una celula microbiana recombinante aumenta drasticamente cuando las celulas se modifican por ingenierfa genetica para sobreexpresar uno o mas genes que codifican polipeptidos endogenos o exogenos que tienen actividades correspondientes a la parte (A1) de la via de anteiso-AGCR. Por ejemplo, la cepa 1 (DV2), que no sobreexpresaba ninguna de las actividades de la via (A1), produjo aproximadamente un 12% de AGCR en la forma anteiso-AGCR. Por otra parte, la cepa 2 (DV2 thrA*BC), que sobreexpresaba polipeptidos que tienen actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa y actividad treonina sintasa, produjo aproximadamente un 40% de AGCR en la forma anteiso-AGCR. La cepa 2 tambien muestra que la actividad treonina desaminasa nativa presente en la celula microbiana parental era suficiente para la produccion de acidos grasos de cadena anteiso-ramificada por la via de anteiso-AGCR mostrada en la fig. 3A.

La comparacion de la cepa 2 y la cepa 5 demuestra que, aunque fue suficiente un nivel nativo (es decir, sin modificar) de actividad treonina desaminasa de E. coli para la produccion de anteiso-AGCR en la cepa 2, el aumento de esa actividad sobreexpresando una enzima treonina desaminasa endogena aumento adicionalmente la produccion de anteiso-AGCR. Aunque la cepa 2 produjo aproximadamente un 40% de AGCR en la forma anteiso, la cepa 5 (DV2 thrA*BC tdcB), que era identica a la cepa 2 salvo por que tambien sobreexpresaba un polipeptido que tenia actividad treonina desaminasa codificado por el gen tdcB de E. coli, produjo aproximadamente un 57% de AGCR en la forma anteiso.

Comparando las cepas 5 y 6 se demuestra ademas el efecto de la manipulacion de la actividad beta-cetoacil-ACP sintasa III (etapa (D) de la via de AGCR) en la produccion de AGCR. Las dos cepas, 5 y 6 sobreexpresan los genes thrA*BC y tdcB. La eliminacion del gen FabH de E.coli endogeno (descrito anteriormente en el contexto de la cepa 4) e integrando cromosomicamente el gen BsFabHI exogeno (descrito anteriormente en el contexto de la cepa 3) practicamente se duplico la proporcion de AGCR producidos, de aproximadamente un 30% de los AGL por la cepa 5 a mas del 60% de los AGL por la cepa 6. En este caso, la cepa 6 tambien mostro un aumento en la proporcion de anteiso-AGCR producidos (de aproximadamente un 57% de los AGCR por la cepa 5, a aproximadamente un 66% de los AGCR por la cepa 6), que fue quiza un aumento relativo menos drastico que en la proporcion de los AGCR producidos.

Comparando las cepas 6 y 7 se demuestra que una enzima que cataliza una reaccion particular de la via puede sustituirse por una enzima diferente que cataliza la misma reaccion de la via. En este ejemplo, una enzima endogena codificada por el gen tdcB de E. coli que estaba sobreexpresada en la cepa 6 se sustituyo en la cepa 7 por una enzima exogena codificada por el gen ilvA de C. glutamicum. El gen tdcB de E. coli codifica una treonina desaminasa catabolica, mientras que el gen ilvA de C. glutamicum codifica una treonina desaminasa anabolica. Estas dos enzimas catalizan la conversion de treonina en a-cetobutirato (es decir, 2-oxobutanoato) y ambas se clasifican como EC 4.3.1.19. Aunque estas enzimas proceden de diferentes fuentes naturales y estan codificadas por genes diferentes, la tabla 10 muestra que estas dos enzimas son adecuadas para su uso en una celula microbiana recombinante para llevar a cabo la conversion de treonina en a-cetobutirato en la via de anteiso-AGCR descrita en el presente documento: la cepa 6 produjo aproximadamente un 66% de AGCR en la forma anteiso, mientras que la cepa 7 produjo mas de un 70% de AGCR en la forma anteiso. Este resultado no solo confirma que la treonina desaminasa anabolica de C. glutamicum es adecuada para su uso en una celula microbiana recombinante para catalizar la conversion de treonina en a-cetobutirato de acuerdo con la via de anteiso-AGCR, demuestra que una enzima de la via (tal como una enzima de la via descrita en el presente documento) que cataliza una reaccion concreta de la via puede "reemplazarse funcionalmente" en la celula microbiana recombinante por una enzima diferente que cataliza la misma reaccion.

Ejemplo 5. Modificacion por ingenierfa genetica de E. coli para la produccion de acidos grasos anteiso- ramificados por la via (A.2).

El siguiente ejemplo describe la construccion de cepas de E. coli recombinantes que expresan genes exogenos y/o sobreexpresan genes endogenos que codifican enzimas que sirven para aumentar el flujo metabolico hacia los intermedios a-cetobutirato, el intermedio de a-cetoacido anteiso-ramificado, a-ceto-p-metilvalerato y el cebador de cadena anteiso-ramificada, 2-metilbutiril-CoA mediante la parte (A.2) de la via de AGCR de la figura 3a, que da lugar a la produccion aumentada de acil-ACP anteiso-ramificada y en ultima instancia, a derivados de acidos grasos anteiso-ramificados, en estas celulas recombinantes.

Este ejemplo tambien describe la construccion de plasmidos que expresan un gen fabH de Listeria monocytogenes y un nuevo gen mutante fabH de L. monocytogenes, que proporciona enzimas beta-cetoacil-ACP sintasa III alternativas para la parte (D) de las vfas biosinteticas de AGCR de las figuras 1 y 3.

DV2 PTrc-cimA3.7 leuBCD

Para preparar una cepa de E. coli que sobreexpresa genes leuBCD endogenos y un gen cimA3.7 exogeno, se genera un producto de la PCR para la integration cromosomica de un casete KmFRT, un promotor PTrc y cimA3.7 entre los genes cromosomicos de E. coli, leuA y leuB. Esta integracion altero el operon leuABCD nativo, colocando a 5 cimA3.7y leuBCD en un operon bajo el control del promotor fuerte inducible por IPTG, PTrc.

El ADN que codifica CimA3.7 se sintetizo por Geneart AG (Regensburg, Alemania). El ADN se clono en el sitio de Sfil del plasmido pMK-RQ (kanR) (Geneart AG, Regensburg, Alemania). Flanqueando a la secuencia codificante, se introdujeron un sitio de restriction 5' de Kpnl y un sitio de restriction 3' de Sacl directamente cadena arriba del codon de inicio ATG e inmediatamente cadena abajo del codon de parada TAA, respectivamente. El vector de donation 10 cimA3.7 se verifico por secuenciacion.

Los componentes individuales del casete de integracion se amplificaron por la PCR del siguiente modo. El componente KmFRT se amplifico a partir del plasmido pKD13 usando los cebadores TREE146 y Km_trc_overR (tabla 11). El promotor PTrc se amplifico a partir de pOP80 (ejemplo 4) usando los cebadores Km_trc_overF y TREE033.

15 La secuencia codificante de cimA3.7 se amplifico a partir del vector de clonacion cimA3.7 descrito anteriormente usando los cebadores TREE032 y TREE035. Para proporcionar la secuencia de homologfa 3' para la integracion, se amplificaron los genes nativos de E. coli de leuBC usando ADN genomico de E. coli y los cebadores TREE034 y TREE104. El cebador directo, TREE146, que se uso para amplificar el casete KmFRT, incluyo la secuencia de homologfa de 50pb 5' para la integracion. Cada uno de los cebadores usados para amplificar los componentes 20 contenfa secuencia solapante que se usaban para "coser" juntas las piezas individuales. En primer lugar, se cosieron juntos KmFRT y PTrc combinando ambas piezas en una sola reaction PCR y usando los cebadores TREE146 y TREE033 para amplificar el producto de KmFRT-Pirc. Despues, se cosio KmFRT-PTrc con cimA3.7 usando los cebadores TREE146 y TREE035 para generar KmFRT-PTrc-cimA3.7. La pieza final, leuBC, se cosio a KmFRT-PTrc-cimA3.7 usando los cebadores TREE146 y TREE104 para generar el casete de integracion final: 25 KmFRT-PTrc-cimA3.7 leuBC.

Tabla 11: Cebadores

Nombre del cebador: Secuencia de cebador (5' --> 3') Fin SEQ ID NO:

Km_trc_overF: CTT CG AACT G CAGGTCG ACGG AT CCCCG G AAT G CCG ACATCATAACGGTTCTGGC Amplificar el promotor pTrc 296

Km_trc_overR: AATATTTG CCAG AACCGTTATG ATGTCGG CATTCCG GGGATCCGTCGACC Amplificar el casete KmFRT 297

TREE032: GTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATA AACCatgatggtaaggatatttgatacaacac Amplificar cimA3.7 298

TREE033: ctaagtgttgtatcaaatatccttaccatcatGGTTTATTCCTCC TTATTTAATCGATAC Amplificar el promotor pTrc 299

TREE034: gatttgttggctatagttagagaagttactggaaaattgTAACAAG GAAACCGTGTGATGTCGAAG Amplificar leuBC 300

TREE035: GT A ATT CTT CG AC AT C AC ACG GTTT CCTT G TTAca a ttt tccagtaacttctctaactatag Amplificar cimA3.7 301

TREE104: GGTAGCGAAGGTTTTGCCCGGC Amplificar leuBC 302

TREE106: GATTGGTGCCCCAGGTGACCTG Verificar la integracion 303

TREE146: GAGTTG CAACG CAAAG CT CAACACAACG AAAACAAC AAGGAAACCGTGTGaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG Amplificar el casete KmFRT 304

TREE151: CTTCCACGGCGTCGGCCTG Verificar la integracion 305

El casete KmFRT-PTrc-cimA3.7 leuBC se integro en el genoma de E. coli usando el sistema de recombinasa Red (Datsenko y col., anteriormente citado). El producto de la PCR, KmFRT-PIrc-cimA3.7 leuBC, se uso para transformar celulas E. coli MG1655 DV2 electrocompetentes que contenfan el plasmido pKD46, que se habfan inducido 30 previamente con arabinosa durante 3 - 4 horas a 30°C. Despues de un recrecimiento de 3 horas a 37°C en medio SOC, las celulas se sembraron en placas de agar Luria que contenfan 50 pg/ml de kanamicina y se incubaron durante una noche a 37°C. Las colonias resistentes a la kanamicina se seleccionaron mediante PCR respecto de la integracion adecuada de KmFRT-PIrc-cimA3.7. Los cebadores TREE151 y TREE106, que flanquean al sitio de integracion cromosomica, se usaron para confirmar la integracion. Tras verificar la integracion, se retiro el gen 35 marcador de kanamicina de acuerdo con el procedimiento descrito por Datsenko y col., anteriormente citado. La integracion con exito de PTrc-cimA3.7 y la elimination del gen marcador de kanamicina en la cepa final, DV2 PTrc cimA3.7leuBCD, se verifico por secuenciacion.

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Las cepas se transformaron con los plasmidos pDG6, que expresaba BsfabHI; pKZ4, que expresaba PpBKD; y pACYC-Pirc2-fesA que expresaba 'tesA de E. coli sin lfder, del modo indicado y se evaluo su produccion de acidos grasos de cadena ramificada.

fabH1 y fabH2 de L. monocytogenes (plasmidos pTB.079 y pTB.081)

Se uso el ADN genomico de Listeria monocytogenes Li23 (ATCC 19114D-5) como molde para amplificar el gen fabH usando los siguientes cebadores:

TREE044 (fabH_directo) GAGGAATAAACCATGAACGCAGGAATTTTAGGAGTAG (SEQ ID NO: 256); cebador 61 (fabH_inverso)

CCCAAGCTTCGAATTCTTACTTACCCCAACGAATGATTAGG (SEQ ID NO: 257)

Despues, se clono el producto de la PCR en los sitios de Ncol/ EcoRI de pDS80 (un vector basado en pCL1920 que porta el promotor Pl de fago lambda; SEQ ID NO: 236) y se transformo en celulas de E. coli competentes para transformacion. Se recogieron colonias individuales para la verificacion de secuencia de los insertos clonados. La secuencia de acido nucleico de fabH de L monocytogenes de tipo silvestre (SEQ ID NO: 99) codifica la protema LmFabH1 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 98) y el plasmido que contema esta secuencia se denomino pTB.079.

Se descubrio un gen fabH de L. monocytogenes mutante que contema un cambio de T a G en la posicion 928, dando como resultado un cambio en la protema expresada en la posicion de aminoacido 310 de triptofano (W) a glicina (G), es decir, una variante W310G. El nuevo gen fabH de L. monocytogenes mutante (SEQ ID NO: 101) que codifica la variante FabH W310G se denomino LmFabH2 (SEQ ID NO: 100) y el plasmido que contema esta secuencia, pTB.081.

Los plasmidos que conteman el gen LmfabH1 de tipo silvestre (pTB.079) y el gen LmfabH2 mutante (pTB.081) se transformaron en la cepa DV2 PTrc-cimA3.7_leuBCD/pACYCtrc2_tesA. Las cepas se transformaron con los plasmidos pKZ4 (BKD de P. putida) y pDG6 (fabH1 de B. subtilis) y se evaluo su produccion de AGCR.

Tabla 12: Produccion de acidos grasos ramificados

: Cepas bkd fabH Tftulo de AGL total Tftulo de AGCR total AGCR/AGL total Tftulo de Anteiso-AGCR Anteiso/Total AGCR

1: DV2 Pp BsH1 2008 533 0,27 66 0,12

2: DV2 cimm A3.7 leuBCD (-) (-) 3764 0 0 0 0

3: DV2 cimA3.7 leuBCD Pp (-) 2691 6 0,002 0 0

4: DV2 cimA3.7 leuBCD Pp BsH1 1945 522 0,27 362 0,69

5: DV2 cimA3.7 leuBCD Pp LmH 322 122 0,38 91 0,75

6: DV2 cimA3.7 leuBCD Pp LmH2 1597 419 0,26 385 0,92

todos los tftulos son en miligramos por litro todas las cepas tambien expresan el gen 'tesA en el plasmido pACYC-pTrc2-tesA AGL = acido graso libre; AGCR = acido graso ramificado Pp = operon de BKD de P. putida expresado en plasmido (pKZ4) BsH1 = FabH1 de B. subtilis expresado en plasmido (pDG6) LmH1 = FabH1 de L monocytogenes expresado en plasmido (pTB.079) LmH2 = FabH2 W310G de L. monocytogenes expresado en plasmido (pTB.081)

Resultados:

Junto con los datos descritos en el ejemplo 3 anterior, las cepas 2 y 3 de la tabla 12 demuestran que se produce de poco a nada de AGCR en celulas microbianas que carecen de actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD) y/o actividad de beta-cetoacil-ACP sintasa III (por ejemplo, FabH) espedfica para sustratos de cadena ramificada, correspondientes a las etapas (C) y (D) de la via de AGCR de la figura 1.

La comparacion de las cepas 1 y 4 demuestra el efecto de modificar por ingeniena genetica las actividades correspondientes a la parte (A.2) de la via de AGCR en celulas microbianas recombinantes en la produccion de anteiso-AGCR. Las cepas 1 y 4 produjeron cantidades y proporciones practicamente identicas de AGCR (aproximadamente un 27% de los AGL totales producidos en estas celulas eran acidos grasos ramificados), sin embargo, la cepa 1 produjo principalmente iso-AGCR, encontrandose solo aproximadamente un 12% de los AGCR

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totales en la forma anteiso. Por otra parte, la cepa 4, que expresa genes que codifican polipeptidos que tienen actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa y actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa (correspondientes a la parte (A.2) de la via de AGCR) produjo sustancialmente mas anteiso-AGCR, con practicamente un 70% de los AGCR totales en la forma anteiso.

La comparacion de las cepas 4, 5 y 6 muestra que puede utilizarse una serie de polipeptidos que tienen actividad sintasa III de beta-cetoacil-ACP de cadena ramificada para producir acidos grasos de cadena ramificada en celulas microbianas recombinantes. Mas particularmente, este ejemplo demuestra que FabH de L. monocytogenes de tipo silvestre y una nueva variante W310G de FabH de L monocytogenes tienen actividades adecuadas para su uso en la via de AGCR. La comparacion de los AGL producidos por cultivos de estas tres cepas, que son identicas salvo por los genes de fabH empleados, muestra que la cepa 5 que expresa FabHI de B. subtilis produjo aproximadamente un 27% del total de AGL en forma ramificada, con practicamente un 70% de estos acidos grasos ramificados en la forma anteiso; la cepa 6 que expresa FabH de L. monocytogenes de tipo silvestre produjo aproximadamente un 38% de AGL totales en forma ramificada, con aproximadamente un 75% de estos acidos grasos ramificados en forma anteiso; y la cepa 7 que expresa una variante W310G de FabH de L. monocytogenes (denominada FabH2) produjo aproximadamente un 26% de AGL totales en forma ramificada, con, notablemente, mas de un 90% de estos acidos grasos ramificados en la forma anteiso.

Ejemplo 6. Produccion de acidos grasos anteiso-ramificados en E. coli por las vfas A.1 y A.2. combinadas

El siguiente ejemplo describe la construccion de cepas de E. coli recombinantes que expresan genes exogenos y/o sobreexpresan genes endogenos que codifican enzimas que sirven para aumentar el flujo metabolico hacia los intermedios a-cetobutirato, el intermedio de a-cetoacido anteiso-ramificado, a-ceto-p-metilvalerato y el cebador de cadena anteiso-ramificada, 2-metilbutiril-CoA mediante las partes (A.1) y (A.2) combinadas de la via de la figura 3A, que da lugar a la produccion aun mayor de acil-ACP anteiso-ramificada y en ultima instancia, a derivados de acidos grasos anteiso-ramificados, en estas celulas recombinantes.

Este ejemplo tambien describe la construccion de un plasmido que expresa genes bkd de Listeria monocytogenes, lo que proporciona otro ejemplo de enzimas de complejo de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD) adecuadas para su uso en la parte (C) de la via biosintetica de AGCR de la figura 1.

DV2 PL-thrA*BC PJrc-cimA3.7leuBCD PT5-BsfabH1 AEcfabH (cepa "G1")

Para comenzar a combinar las partes (A.1) y (A.2) de la via de anteiso-AGCR de la figura 3A, se integro el casete Pjrc-cimA3.7_leuBCD (ejemplo 5) en la cepa Dv2 PL-thrA*BC Pjs-BsfabH1 AEcfabH (ejemplo 4) para generar la cepa DV2 PL-thrA*BC PTrc- cimA3.7_leuBCD Pjs-BsfabH1 AEcfabH, que tambien se denomino cepa G1. Esta cepa sobreexpresaba polipeptidos que tienen actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa y actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa de acuerdo con la parte (A.2) de la via de anteiso-AGCR y sobreexpresaba polipeptidos que tienen actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa y actividad treonina sintasa de acuerdo con la parte (A.1) de la via de anteiso-AGCR.

DV2 PL-thrA*BC PL-tdcB PTrc-cimA3.7 leuBCD PT5-BsfabH1 AEcfabH (cepa "G2")

Para crear una cepa modificada por ingenierfa genetica para sobreexpresar polipeptidos que tienen actividades correspondientes a las partes (A.1) y (A.2) combinadas de la via de anteiso-AGCR, se integro el casete Pl- tdcB (ejemplo 4) en la cepa G1, para generar la cepa DV2 PL-thrA*BC PL-tdcB PTrc-cimA3.7_leuBCD PT5-BsfabH1 AEcfabH, que tambien se denomino cepa G2. En esta cepa, los genes thrA*BC de E. coliintegrados y el gen tdcB de E. coli integrado (que codifican polipeptidos que tienen actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa, actividad treonina sintasa y actividad treonina desaminasa, correspondientes a la parte (A.1) de la via de AGCR) se colocaron bajo el control de promotores fuertes Pl de lambda y como tal, se sobreexpresaron. El gen cimA3.7 exogeno y los genes leuBCD de E. coli nativos (que codifican polipeptidos que tienen actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa y actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa correspondientes a la parte (A.2) de la via de AGCR), tambien se integraron en el cromosoma de E. coli bajo el control del promotor fuerte inducible por IPTG PTrc y por lo tanto, tambien se sobreexpresaron. El gen integrado fabH1 de B. subtilis, que codifica una sintasa III de beta-cetoacil-ACP de cadena ramificada correspondiente a la parte (C) de la via, se encontraba bajo el control del promotor fuerte T5. Se elimino de esta cepa el gen fadH de E. coli endogeno.

Plasmido pTB85 (que expresa el complejo BKD de L. monocytogenes)

Se uso el ADN genomico de Listeria monocytogenes Li23 (ATCC 19114D-5) para la amplificacion de los genes bkd usando los siguientes cebadores:

cebador81 (BKD_for) GAGGAATAAACCGTGGCAACAGAATAT GAT GTC GTT ATT CT (SEQ ID NO: 306) cebador82 (BKD_rev) CCCAAGCTTCGAATTTTAATACAATGCTGTATTTTCTTTGGAAAT (SEQ ID NO: 307)

El producto de la PCR de Lmbkd se clono en los sitios de Ncol y EcoRI de pGL10.173B (SEQ ID NO: 228) bajo el

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control del promotor Ptrc. El plasmido con la secuencia verificada se transformo en la cepa G1 (anterior). Las cepas tambien se transformaron con los plasmidos pACYC-PTrc2-tesA (TesA de E. coli sin lfder), pKZ4 (BKD de P. putida) y pDG6 (fabHI de B. subtilis) y se evaluo su produccion de AGCR usando el protocolo para medio FA-2 como se describe en el ejemplo 4.

Evaluacion de la produccion de AGCR

Para evaluar la produccion de AGCR, las cepas DV2 PL-thrA*BC PT5-BsfabH1, DV2 PL-thrA*BC PT5-BsfabH1 AEcfabH, DV2 PL-thrA*BC PL-tdcB PT5-BsfabH1 AEcfabH, G1 y G2 se transformaron con los plasmidos pKZ4, que expresa PpBKD, y pACYC-PTrc2-tesA, que expresa 'tesA de E. coli sin lfder. La cepa DV2 PL-thrA*BC transformada con los plasmidos pKZ4, pACYC-PTrc2-tesA, y pDG6 (que expresan BsfabH1) sirvieron como control para estos experimentos. Por comparacion, pueden encontrarse en las tablas 10 y 12 anteriores los tftulos de acidos grasos y composiciones producidas por la cepa de produccion DV2 y las cepas modificadas por ingenierfa genetica para sobreexpresar polipeptidos que tienen actividades correspondientes a la via (A.1) o la via (A.2).

Tabla 13: Produccion de acidos grasos ramificados

: Cepa bkd fabH Tftulo de AGL total Tftulo de AGCR total AGCR/AGL total Tftulo de Anteiso- AGCR Anteiso/Total AGCR

1: DV2 thrA *BC Pp Int BsH1 AEc 1563 705 0,45 255 0,36

2: DV2 thrA *BC tdcB Pp Int BsH1 AEc 1470 918 0,62 609 0,66

3: DV2 thrA *BC cimA3.7 leuBCD (G1) Pp Int BsH1 AEc 1483 880 0,59 741 0,84

4: DV2 thrA *BC cimA3.7 leuBCD Lm Int BsH1 AEc 830 95 0,11 83 0,87

5: DV2 thrA *BC tdcB cimA3.7 leuBCD (G2) Pp Int BsH1 AEc 1429 702 0,49 633 0,90

todos los tftulos son en miligramos por litro

todas las cepas tambien expresan el gen 'tesA en el plasmido pACYC-pTrc2-tesA

AGL = acido graso libre; AGCR = acido graso de cadena ramificada

Pp = operon de BKD de P. putida expresado en plasmido

Lm = operon de BKD de L. monocytogenes expresado en plasmido

int BsH1= gen BsfabH1 integrado cromosomicamente

AEc = gen fabH cromosomico de E. coli eliminado

Resultados:

Como se habfa indicado anteriormente en el ejemplo 4, la cepa DV2 thrA*BC tdcB (cepa 2 en la tabla 13 anterior), que sobreexpresaba polipeptidos que tienen actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa, actividad treonina sintasa y actividad treonina desaminasa (de acuerdo con la parte (A.1) de la via de anteiso-AGCR) y un polipeptido con actividad sintasa III de beta-cetoacil-ACP de cadena ramificada por un gen BsfabH1 integrado cromosomicamente, produjo aproximadamente dos tercios (66%) se sus acidos grasos ramificados en la forma anteiso.

Comparando la cepa 2 con la cepa 3 (DV2 thrA*BC cimA3.7 leuBCD, tambien denominada "cepa G1"), que sobreexpresaba polipeptidos que tienen actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa y actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa (de acuerdo con la parte (A.2) de la via de anteiso-AGCR) ademas de polipeptidos que tienen actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa y actividad treonina sintasa, la cantidad y proporcion de AGCR producidos fue comparable (aproximadamente un 59% de los AGL producidos en forma de AgCr en la cepa 2, en comparacion con aproximadamente un 62% de AGL producidos en forma de AGCR en la cepa 3), pero la proporcion de anteiso-AGCR fue mucho mayor en la cepa 3 (G1) que en la cepa 2, de tal forma que aproximadamente un 84% de los AGCR producidos por la cepa 3 se encontraba en la forma anteiso en comparacion con un 66% en la cepa 2.

La comparacion de las cepas 3 y 4 muestra el efecto de diferentes complejos de enzima BKD en la produccion de AGCR y anteiso-AGCR. La cepa 3 expreso genes bkd de P. putida mientras que la cepa 4 expreso genes bkd de L.

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monocytogenes. Aunque la cepa que expresaba los genes bkd de L. monocytogenes mostro una produccion general menor (tftulo) tanto de AGL como de AGCR que la cepa que expresaba los genes bkd de P. putida, las proporciones de acidos grasos anteiso-ramificados producidos por estas cepas fueron notablemente consistentes, produciendo cada cepa aproximadamente un 85% de los acidos grasos de cadena ramificada en la forma anteiso.

Comparando la cepa 3 con la cepa 5 (DV2 thrA*BC tdcB cimA3.7 leuBCD, tambien denominada "cepa G2"), que es identica a la cepa 3, salvo por la sobreexpresion de treonina desaminasa, aproximadamente un 90% de los AGCR producidos por la cepa 5 se encontraba en la forma anteiso, en comparacion con aproximadamente un 84% en la cepa 3, que utilizo la actividad treonina desaminasa nativa de la celula hospedadora.

Tomados en conjunto, los datos obtenidos de la cepa 3 (G1) y la cepa 5 (G2) indican que la modificacion por ingeniena genetica de una celula microbiana que es capaz de producir acidos grasos de cadena ramificada (debido a la presencia de actividades BKD y sintasa de beta-cetoacil-ACP de cadena ramificada) para expresar o sobreexpresar polipeptidos que tienen actividad de (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa y actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa (de acuerdo con la parte (A.2) de la via de anteiso-AGCR) junto con polipeptidos que tienen actividad aspartocinasa, actividad homoserina deshidrogenasa, actividad homoserina cinasa, actividad treonina sintasa y opcionalmente actividad treonina desaminasa (de acuerdo con la parte (A.1) de la via de anteiso-AGCR) no solo da como resultado la produccion de composiciones que comprenden acidos grasos anteiso- ramificados, sino composiciones en las que mas de un 80% de los acidos grasos ramificados se encuentran en la forma anteiso.

Ejemplo 7: Produccion de esteres grasos ramificados en E. coli

Para producir metil esteres de acidos grasos de cadena ramificada y etil esteres de acidos grasos de cadena ramificada, se transformo la cepa DV2 de E. coli (ejemplo 1) con los plasmidos pKZ4 (que expresaba genes bkd de P. putida), pDG6 (que expresaba fabH1 de B. subtilis), y un plasmido que expresa el polipeptido de ester sintasa ES9 de Marinobacterhydrocarbonoclasticus DSM 8798 (n.° de acceso de GenBank ABO21021; SEQ ID NO: 308).

Se sintetiza un polinucleotido que codifica ES9 mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA), se somete a digestion de restriccion con BspHI yXhol, y se clona en el plasmido pOP80 (ejemplo 4) tambien digerido con BspHI yXhol, dando como resultado un plasmido que expresa ES9 bajo el control del promotor PTrc.

Las colonias individuales de DV2 transformadas con los plasmidos pKZ4, pDG6 y el plasmido ES9 se usan para inocular un cultivo de una noche de LB + antibioticos adecuados. A la manana siguiente, se usaron 50 pl de los cultivos de una noche para inocular 2ml de cultivos de siembra de LB + antibioticos. Tras 4 h de cultivo, se diluyen los cultivos a 1:25 en medio Che-9 2NBT que contema los antibioticos adecuados y se cultivaron durante una noche. Los cultivos se diluyeron en 4NBT hasta una DO600 final (densidad optica a 600 nm) de aproximadamente 0,2. Tras 6 h de cultivo, se anadio IPTG al cultivo a una concentracion final de 1 mM y metanol o etanol al 2% (v/v). A las 24 horas despues de la induccion, se extrajo 1 ml de cultivo con 500 pl de acetato de etilo (que contema HCl al 1%), derivatizado con TMAH recien preparado y se sometio a analisis CG-EM.

Una cepa DV2 de E. coli que expresaba un polipeptido ES9 de ester sintasa y transformada con los plasmidos pKZ4 y pDG6, que se cultivo esencialmente como se ha descrito anteriormente y que se complemento con metanol, produjo una serie de acidos grasos de cadena lineal y metil-esteres de acidos grasos ramificados (FAME). El FAME de cadena ramificada detectado inclma metil esteres de iso-C1C12:0, iso-C1C13:0, anteiso-C1C13:0, iso-C1C14:0, iso- C1C15:0, anteiso-C1C15:0, iso-C1C16:0, iso-C1C17:0 y anteiso- C1C17:0. Aproximadamente un 31% de los FAME producidos eran FAME ramificados. Aproximadamente un 74% de los FAME ramificados eran FAME iso-ramificados y aproximadamente un 26% eran FAME anteiso-ramificados (tabla 14).

Cuando el cultivo se complemento con etanol, se produjo una variedad de etil esteres de acidos grasos de cadena lineal y de cadena ramificada (FAEE). El FAEE de cadena ramificada detectado inclma etil esteres de iso-C2C12:0, iso-C2C13:0, anteiso-C2C13:0, iso-C2C14:0, iso-C2C15:0, anteiso-C2C15:0, iso-C2C16:0, iso-C2C17:0 y anteiso- C2C17:0. Aproximadamente un 22% de los FAEE producidos eran FAEE ramificados. Aproximadamente un 81% de estos FAEE ramificados eran FAEE iso-ramificados y aproximadamente un 26% eran FAEE anteiso-ramificados (tabla 14).

Tabla 14: Produccion of esteres grasos ramificados

: Ester graso (FE) producido Tftulo total de FE Tftulo de ester graso ramificado (BFE) total BFE / FE total Tftulo de anteiso-BFE Anteiso- BFE/BFE total

1: Metil esteres de acido graso (FAME) 232 73 0,31 19 0,26

2: Etil esteres de acido graso (FAEE) 325 72 0,22 14 0,19

todos los tftulos son en miligramos por litro

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Ejemplo 8. Produccion de esteres grasos ramificados en Bacillus

Las celulas de B. subtilis que expresan una ester sintasa ES9 de Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798 (n.° de acceso de GenBank ABO21021) producen esteres grasos ramificados.

Se clono una secuencia de polinucleotidos que codifica el polipeptido de ester sintasa ES9 (SEQ ID NO: 308) en el vector de expresion en B. subtilis pHT01 (MoBiTec GmbH, Goettingen, Alemania). El vector pHT01 es un vector lanzadera para Escherichia coli - Bacillus subtilis que porta el promotor fuerte Pgrac para la expresion de protefnas en B. subtilis. La secuencia codificante de ES9 se inserta entre los sitios de clonacion BamHI y Xbal. Una cepa de B. subtilis 1HA01 (lacA::spec leuB8 metB5 r(-)m(+) Sp; obtenida del Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, OH, Numero de cepa BGSC 1A785) se transforma con pHT01_ES9 de acuerdo con el protocolo de Anagnostopoloulos y Spizizen (J. Bacteriol. 1961, 81:741) con las siguientes modificaciones:

Las celulas de B. subtilis 1HA01 se cultivan a 37°C en el medio mfnimo como se ha descrito en Anagnostopoloulos y Spizizen (anteriormente citado), complementado con 50 pg/ml de metionina (requisitos auxotrofos) durante 5 horas, hasta que la DO600 alcanzo de 0,6 a 1,0. A cada cultivo de 1 ml, se le anadieron 15 pl de plasmido (1-2 pg de ADN) y se dejan crecer las celulas durante otros 90 minutos a 37°C. Las celulas se sedimentan por centrifugacion. Se retira y desecha el sobrenadante y las celulas se resuspenden en 100 pl de LB y se siembran en placas de LB agar que contenfan 10 pg/ml de cloranfenicol. Se recogen colonias individuales de los transformantes resultantes y se usan para preparar soluciones madre para congelacion y se evalua su produccion de esteres grasos ramificados.

B. subtilis transformada con el vector pHT01_ES9 produce metil esteres ramificados (cuando el cultivo se complementa con metanol) o etil esteres ramificados (cuando el cultivo se complementa con etanol), incluyendo esteres ramificados con longitudes de cadena C13, C15 y C17.

Ejemplo 9: Produccion de alcanos ramificados en E. coli

Se producen alcanos ramificados por una celula microbiana recombinante de la invencion que expresa polinucleotidos que codifican polipeptidos que tienen actividad de enzima derivada de acidos grasos, en los que la actividad de enzima derivada de acidos grasos es actividad biosintetica de hidrocarburos. El siguiente ejemplo demuestra la produccion de alcanos ramificados por una cepa que expresa un polipeptido que tiene actividad acil- ACP reductasa (AAR) y un polipeptido que tiene actividad aldehfdo descarbonilasa (ADC). La actividad AAR convierte al intermedio de acil-ACP ramificado en un aldehfdo ramificado y la actividad ADC convierte el aldehfdo ramificado en un alcano ramificado.

Para producir alcanos ramificados, el gen aar de Synechococcus elongatus PCC7942, que codifica una reductasa de acil-ACP graso (n.° de acceso de GenBank YP_400611; SEQ ID NO: 309) se integro en la cepa de E.coli MG1655 AfadE AtonA (cepa DV2; ejemplo 1) para producir la cepa MG1655 AfadE AtonA AARkan del siguiente modo: Se amplifico un polinucleotido que codifica el gen aar controlado por un promotor Ptrc y flanqueado por un gen lacI parcial y un casete de resistencia a la kanamicina a partir del plasmido pSL67-78A (SEQ ID NO: 315) usando los cebadores AAR_F (5'-GGCT GGCTGG CATAAAT ATCTC-3'; SEQ ID NO: 310) y AAR_R (5'-GTTATGATAT GTTGGTCGGATA AGCGTCGCGCCGCA TCCGACATTGATTGC GAG AGC GTT CAC CGA CAA-3'; SEQ ID NO: 311) y se integro entre los genes lacI y lacA usando el sistema de recombinasa Red (Datsenko, y col., anteriormente citado). La cepa resultante se denomino SL106A. La cepa SL106A se transformo con el plasmido pTB38, que codifica aldehfdo descarbonilasa (ADC) de Nostoc punctiforme PCC73102 (n.° de acceso de GenBank YP_001865325; SEQ ID NO: 312) bajo el control del promotor Ptrc y contiene un casete de resistencia a la espectinomicina.

Despues, se transformo la cepa con los plasmidos pKZ4 (que expresaba los genes bkd de P. putida) y pKZ5 (que expresaba fabH1 de B. subtilis) y se evaluo su produccion de alcanos. Se siguio el protocolo en matraz de agitacion usando medio Che-9 (ejemplo 7). 24 horas despues de la induccion, se extrajo 1 ml de cultivo con 0,5 ml de acetato de etilo (que contenfa HCl al 1%) y se sometio a analisis por CG/EM.

Se produjo una serie de alcanos de cadena lineal y ramificados (tabla 15). Los alcanos ramificados incluyeron alcanos iso-C14:0, anteiso-C14:0, iso-C16:0, y anteiso-C16:0. Aproximadamente un 14% de los alcanos producidos fueron alcanos ramificados. Aproximadamente un 54% de los alcanos ramificados eran alcanos iso-ramificados y aproximadamente un 46% eran alcanos anteiso-ramificados (tabla 15).

Tabla 15: Produccion de alcanos ramificados

: Cepa Tftulo total de alcanos Tftulo total de alcanos de cadena ramificada (BC) alcano BC/alcano total Tftulo de alcano anteiso- BC Tftulo de anteiso- BC/alcano BC total

1: AAR, ADC, BsfabH1, PpBKD 109 15 0,14 6,9 0,46

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Ejemplo 10: Produccion of alcoholes grasos ramificados en E. coli

El gen aar de Synechococcus elongatus PCC7942, que codifica una reductasa de acil-ACP graso (n.° de acceso de GenBank YP_400611; SEQ ID NO: 309) se integro en el cromosoma de la cepa de E.coli MG1655 AfadE_AtonA como se describe en el ejemplo 9. La cepa de E.coli MG 1655 AfadE_AtonA AAR:kan se transformo con los plasmidos pKZ4 (que expresaba los genes bkd de P. putida) y pDG6 (que expresaba fabHI de B. subtilis). Se evaluo la produccion de alcoholes grasos de cadena ramificada por la cepa usando fermentacion con matraces en agitacion.

Como controles, se usaron cultivos de E. coli MG1655 AfadE_AtonA AAR:kan sin plasmidos o que portaban plasmidos individuales. Los cultivos de siembra se cultivaron en caldo LB complementado con los antibioticos adecuados. Tras 4 horas de cultivo, los cultivos se diluyeron a 1:25 en medio Che-9 2NBT + marcador de seleccion adecuado y se cultivaron durante una noche. Despues, se diluyeron los cultivos en 4NBT hasta una DO600 de ~0,2. Tras 6 horas de cultivo, se anadio IPTG a una concentracion final de 1 mM. 24 horas despues de la induccion, se extrajo 1 ml de cultivo con 0,5 ml de terc-butil eter de metilo (MTBE) y se sometio a analisis por CG/EM. La figura 7(A) muestra que se produjeron alcoholes grasos C14-C17 iso-ramificados y anteiso-ramificados por la cepa recombinante microbiana que expresaba una reductasa de acil-ACP grasa (AAR), un complejo de deshidrogenasa de alfa-cetoacidos ramificados (BKD) y una sintasa III de p-cetoacil-ACP (FabH) especffica para cadenas ramificadas. La figura 7(B) muestra que no se produjeron alcoholes grasos ramificados por la cepa microbiana recombinante que expresaba AAR pero no BKD ni la FabH especffica para cadenas ramificadas.

Ejemplo 11: Identificacion y cuantificacion de derivados de acidos grasos ramificados

Instrumentacion:

El instrumento es un sistema Agilent 5975B MSD equipado con una columna DB-5 de 30 mx0,25 mm (pelfcula de 0,10 pm). El espectrometro de masas esta equipado con una fuente de ionizacion de impacto de electrones. Se utilizaron dos programas de CG/EM.

Programa de CG/EM n.° 1: Se mantiene isotermica la temperatura de la columna a 90°C durante 5 min, despues se eleva a 300°C con una rampa de 25°C/min y finalmente se mantiene a 300°C durante 1,6 min. El tiempo de ejecucion total es de 15 min. Con este programa, la temperatura de entrada se mantiene a 300°C. El inyector se configura en un modo sin division. Se inyecta 1 pl de muestra por cada inyeccion. El gas portador (helio) se libera a 1,0 ml/min. La temperatura de la fuente del espectrometro de masas se mantiene a 230°C.

Programa de CG/EM n.° 2: Se mantiene isotermica la temperatura de la columna a 100°C durante 3 min, despues se eleva a 320°C con 20°C/min y finalmente se mantiene isotermica a 320°C durante 5 min. El tiempo total de ejecucion es de 19 min. El inyector se configura en un modo sin division. Se inyecta 1 pl de muestra por cada inyeccion. El gas portador (helio) se libera a 1,2 ml/min. La temperatura de la fuente de ionizacion se ajusta a 230°C.

Muestras:

Los extractos que contenfan acidos grasos ramificados, derivados de acidos grasos ramificados y/o alcanos ramificados producidos por celas de E. coli modificadas por ingenierfa genetica se analizaron por CG/eM. Como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 7, se detectaron diversos acidos grasos de cadena ramificada, derivados de acidos grasos, tales como esteres grasos y alcanos ramificados.

Analisis semicuantitativo por CG/EM:

Ademas del analisis cualitativo, se llevo a cabo un analisis semicuantitativo para obtener la proporcion entre los compuestos de cadena ramificada y los isomeros de cadena lineal.

Estandares:

Una mezcla de metil ester acido bacteriano (BAME, Sigma-Aldrich, n.° de cat: 47080-U, concentracion de 10 mg/ml) contiene los 26 compuestos a continuacion:

Undecanoato de metilo

(±)-2-hidroxidecanoato de metilo

Dodecanoato de metilo

Tridecanoato de metilo

2-hidroxidecanoato de metilo

(±)-3-hidroxidecanoato de metilo

Miristato de metilo

5

10

15

20

25

30

35

13-metiltetradecanoato de metilo

12-metiltetradecanoato de metilo Pentadecanoato de metilo

2- hidroxitetradecanoato de metilo

3- hidroxitetradecanoato de metilo

14- metilpentadecanoato de metilo c/s-9-hexadecenoato de metilo Palmitato de metilo

15- metilhexadecanoato de metilo c/s-9,10-metilenhexadecanoato de metilo heptadecanoato de metilo 2-hidroxihexadecanoato de metilo Linoleato de metilo

Oleato de metilo

Trans-9-octadecenoato de metilo Estearato de metilo

c/s-9,10-metilenoctadecanoato de metilo Nonadecanoato de metilo Eicosenoato de metilo

Entre estos compuestos, hay 4 FAME ramificados junto con sus isomeros de cadena lineal: /S0-C1C150, ante/so- C1C15:0 y n-C1C15:0; IS0-C1C1Q.0 y n-C1C16:0; /so-C1C17:0 y n-C1C17:0. Esta mezcla se diluyo 4 veces con acetato de etilo, de tal forma que cada compuesto en la mezcla tenia una concentracion de aproximadamente 100 mg/l. Despues, se analizo la mezcla diluida por CG/EM para proporcionar informacion cualitativa para todos los compuestos de acilo de cadena ramificada producidos.

Los estandares de BAME se analizaron usando CG/EM. La hoja de datos que proporciona la secuencia de elucion de la CG de los 26 componentes en la mezcla de BAME se obtuvo de una columna de fase SPB-1. En la tabla a continuacion se lista el tiempo de retencion (TR) de estos compuestos analizados con estos dos programas de CG. Estos tiempos de retencion se usaron para identificar los compuestos ramificados producidos por las cepas microbianas recombinantes.

Tabla 16: Tiempos de retencion de los estandares de BAME

Compuestos: TR en el programa de CG n.° 1, min TR en el programa de CG n.° 2, min

/s0-C1C15:0: 11,37 9,73

ante/so-C1C15:0: 11,41 9,77

n-C1C15:0: 11,53 9,94

/so-C1C16:0: 11,8 10,27

n-C1C16:0: 12,0 10,46

/so-C1C17:0: 12,21 10,79

n-C1C17:0: 12,36 10,97

Con estos tiempos de retencion, fue posible la identificacion y cuantificacion de los compuestos exactos medidos anteriormente. Sin embargo, se esperaba que las cepas de E. col/ modificadas por ingenieria genetica producirian compuestos ramificados con longitudes de cadena distintas de las listadas, incluyendo, por ejemplo, compuestos C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, o C14. Sin estandares comercialmente disponibles, podria haber sido problematica la identificacion de sus estructuras.

5

10

15

20

25

30

35

Se emplearon dos estrategias. En la primera estrategia, se determino el TR relativo de los compuestos de cadena ramificada frente a los isomeros de cadena lineal. Se descubrio que el compuesto n-C1C15:0 de cadena lineal se retuvo en la columna durante el mayor espacio de tiempo y el compuesto iso- C1C150 se retuvo en la columna durante el menos espacio de tiempo entre los tres isomeros. Esta tendencia fue consistente con el hecho de que la columna DB-5 usada en la CG separa los compuestos volatiles basandose en el punto de ebullicion de los compuestos. Los compuestos con mayores puntos de ebullicion normalmente tienen un mayor tiempo de retencion que los compuestos con menor punto de ebullicion. Se sabfa que los puntos de ebullicion de los compuestos de acidos grasos ramificados son menores que los de sus isomeros homologos de cadena lineal. Esta informacion se uso como herramienta cuantitativa para asignar la estructura de isomeros con diferentes longitudes de cadena.

En la segunda estrategia, se obtuvieron los espectros de masas de los isomeros iso-C1C150, anteiso-C1C15:o y n- C1C150. Debido a que el radical formado por la fragmentacion entre C12 y C11 es muy estable, los espectros de iso- y n- C1C150 parecieron practicamente identicos, mientras que el espectro de anteiso-C1C15:o fue sustancialmente diferente a 199 m/z. Combinando la informacion obtenida de las dos estrategias, pudo predecirse de manera fiable la estructura de los productos de cadena ramificada.

Usando estos procedimientos, se observo que los siguientes derivados de acidos grasos ramificados (por ejemplo, acidos grasos ramificados, alcoholes, esteres e hidrocarburos) podfan detectarse usando cG/EM y los procedimientos descritos en el presente documento (tabla 17).

Tabla 17

Acido graso: iso-C12:0; iso-C13:0, anteiso-C13:0, iso-C14:0, iso-C15:0, anteiso-C15:0, iso-C16:0, iso-C17:0, anteiso-C17:0

Alcohol graso: iso-C14:0, iso-C15:0, anteiso-C15;0, iso-C16:0, iso-C17:0, anteiso-C17:0

fame: iso-C12:0, iso-C13:0, anteiso-C13:0, iso-C14:0, iso-C15:0, anteiso-C15:0, iso-C16:0, iso-C17:0, anteiso-C17:0

FAEE: iso-C12:0, iso-C13:0, anteiso-C13;0, iso-C14:0, iso-C15:0, anteiso-C15:0, iso-C16:0, iso-C17:0, anteiso-C17:0

3-OH-FAEE: iso-C13:o, anteiso-C13:o, iso-C15:o, anteiso-C15:o,

alcano: iso-C14:0, anteiso-C14:0, iso-Cmo, anteiso-Cmo

Mediciones de rendimiento semicuantitativas

Debido a la frecuente ausencia de estandares comercialmente disponibles para diversos acidos grasos ramificados, derivados de acidos grasos ramificados y/o hidrocarburos ramificados, fue diffcil la cuantificacion precisa de los compuestos de cadena ramificada. Sin embargo, usando un estandar de cadena lineal con el mismo grupo funcional, se estimo de manera semicuantitativa la cantidad relativa o el rendimiento de compuestos de cadena ramificada en relacion con el rendimiento de su homologo de cadena lineal (isomero).

Se aplico un procedimiento de cuantificacion mediante una curva estandar, en el que se analizaron mezclas estandar con diferentes concentraciones mediante el mismo programa de GC/EM que las muestras. Tras la recogida de los datos, se represento la respuesta del instrumento (corriente ionica total) frente a las concentraciones de los estandares. Se obtuvieron curvas de calibracion lineal. La concentracion de alcoholes ramificados en una muestra concreta se calculo mediante la ecuacion y = ax+b, en la que y es la respuesta del instrumento para un compuesto particular en una muestra. Por consiguiente, se calculo la concentracion relativa de compuestos ramificados en la mezcla de produccion.

La tabla 18 lista los metil esteres de grasos usados como estandares para cuantificar diversos metil esteres de acidos grasos ramificados.

Tabla 18

Compuesto FAME en la muestra: Estandar usado para cuantificacion

iso-C1C12:0: C1C12:0

C1C12:0
C1C12:0

Iso-C1C13:0: C1C13:0

Anteiso-C1C13:o: C1C13:0

C1C13:0
C1C13:0

Iso-C1C14:0: C1C14:0

C1C14:1
C1C14:1

C1C14:0
C1C14:0

Iso-C1C15:0: C1C15:0

Compuesto FAME en la muestra: Estandar usado para cuantificacion

Anteiso-CiCi5:o: ClCl5:0

ClCl5:0
ClCl5:0

Iso-ClCl6:0: ClCl6:0

ClCl6:1
ClCl6:1

ClCl6:0
ClCl6:0

Iso-ClCl7:0: C1C16:0

Anteiso-CiCi7:o: C1C16:0

ClCl8:1: C1C18:1

ClCl8:0: C1C18:0

La tabla 19 lista etil esteres grasos usados como estandares para cuantificar diversos etil esteres de acidos grasos ramificados.

Tabla 19

Compuesto FAEE en la muestra: Estandar usado para cuantificacion

C2C8:0: C-2C-8:0

C2C10:0
C2C10:0

Iso-C2C12:0: C2C12:0

C2C12:1: C2C12:0

C2C12:0
C2C12:0

Iso-C2C13:0: C2C12:0

Anteiso-C2C13:0: C2C12:0

Iso-C2C14:0: C2C14:0

C2C14:1: C2C14:0

C2C14:0
C2C14:0

Iso-C2C15:0: C2C14:0

Anteiso-C2C15:o: C2C14:0

Iso-C2C16:0: C2C16:0

C2C16:1: C2C16:0

C2C16:0
C2C16:0

Iso-C2C17:0: C2C16:0

Anteiso-C2C17:o: C2C16:0

C2C18:1: C2C18:0

C2C18:0
C2C18:0

5 Se analizaron acidos grasos libres ramificados y varios derivados de acidos grasos diferentes usando los estandares listados a continuacion (tabla 20):

Tabla 20

Compuestos de acilo en la muestra: Estandar usado para cuantificacion

alcohol de cadena lineal: alcohol C15:0

alcohol de cadena ramificada

aldehfdo

Acido graso libre

Como alternativa, se uso un metil ester de acido graso C1C140 como estandar para cuantificar los acidos grasos ramificados derivatizados en el extracto de cualquier cepa de produccion (tabla 21). Despues, se volvieron a convertir las concentraciones medidas a concentraciones de acidos grasos ramificados basandose en sus pesos 5 moleculares.

Tabla 21

Compuesto de AGL en la muestra (derivatizado en FAME): Estandar de FAME usado para la cuantificacion

AGL de cadena lineal: C1C14:0

AGL de cadena ramificada

Los alcanos ramificados se midieron usando los siguientes estandares (tabla 22) que tambien se usaron para verificar la cantidad de aldehfdos grasos ramificados o de alcoholes grasos ramificados.

Tabla 22

Alcano, aldehfdo y alcohol en la muestra: Estandar usado para cuantificacion

Alq C13:0: Alq C12:0

Iso-Alq C14:0: Alq C15:1

Anteiso-Alq C14:0: Alq C15:1

Alq C14:0: Alq C15:1

Alq C15:0: Alq C16:1

Iso-Alq C16:0: Alq C16:1

Anteiso-Alq C16:0: Alq C16:1

Ald C14:0: Alc C15:0

Alq C16:0: Alq C16:1

Alc C16:0: Alc C15:0

Alq C17:1: Alq C17:0

Iso-Alc C15:0: Alc C15:0

Anteiso-Alc C15:0: Alc C15:0

Alc C15:0
Alc C15:0

Ald C16:0: Alc C15:0

Alc C16:0: Alc C15:0

10 Para una composicion dada de derivado de acido graso producido, se determino el porcentaje de derivado que se produjo en la forma de cadena ramificada de acuerdo con la ecuacion:

Porcentaje de derivado ramificado =

100 x (Total de producto derivado ramificado en mg/l)

(Total de derivado de producto de cadena ramificada + lineal en mg/l)

Asimismo, para una composicion dada de derivado de acido graso producido, se determino el porcentaje del derivado de cadena ramificada que se produjo en la forma de cadena anteiso-ramificada de acuerdo con la ecuacion:

Porcentaje de derivado anteiso-ramificado =

100 x (Total de producto derivado anteiso-ramificado en mg/l)

(Total de producto derivado ramificado en mg/l)

15 Cabe destacar que aunque la invencion se ha descrito junto con la descripcion detallada de la misma, la descripcion anterior pretende ilustrar la invencion, que se define por el ambito de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

10

15

<110> LS9, Inc.

<120> PRODUCCION DE ACIDOS GRASOS DE CADENA RAMIFICADA Y DERIVADOS DE LOS MISMOS EN CELULAS MICROBIANAS RECOMBINANTES

<130> LS00024 PCT CIP (708122)

<150> 13/006.933 <151> 14/01/2011

<150> 13/007.100 <151> 14/01/2011

<160> 315

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Bacillus subtilis

<220>

<221> MISC_FEATURE <223> Subunidad E1alpha de BKD

<400> 1

imagen1

Val: Pro His Ala Val Gly lie Ala Leu Ala Gly Arg Met Glu Lys Lys

: 130 135 140

Asp: He Ala Ala Phe Val Thr Phe Gly Glu Gly Ser Ser Asn Gin Gly

145: 150 155 160

Asp: Phe His Glu Gly Ala Asn Phe Ala Ala Val His Lys Leu Pro Val




: 165 170 175

lie: Phe Met Cys Glu Asn Asn Lys Tyr Ala lie Ser Val Pro Tyr Asp



: 180 185 190

Lys: Gin Val Ala Cys Glu Asn lie Ser Asp Arg Ala lie Gly Tyr Gly


: 195 200 205

Met: Pro Gly Val Thr Val Asn Gly Asn Asp Pro Leu Glu Val Tyr Gin

: 210 215 220

Ala: Val Lys Glu Ala Arg Glu Arg Ala Arg Arg Gly Glu Gly Pro Thr

225: 230 235 240

Leu: lie Glu Thr lie Ser Tyr Arg Leu Thr Pro His Ser Ser Asp Asp




: 245 250 255

Asp
Asp: Ser Ser Tyr Arg Gly Arg Glu Glu Val Glu Glu Ala Lys Lys



: 260 265 270

Ser: Asp Pro Leu Leu Thr Tyr Gin Ala Tyr Leu Lys Glu Thr Gly Leu


: 275 280 285

Leu: Ser Asp Glu lie Glu Gin Thr Met Leu Asp Glu lie Met Ala lie

: 290 295 300

Val: Asn Glu Ala Thr Asp Glu Ala Glu Asn Ala Pro Tyr Ala Ala Pro

305: 310 315 320

Glu: Ser Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Ala Lys




: 325 330

<210>2 <211> 993 <212>ADN

5 <213> Bacillus subtilis

<220>

<221> misc_feature

<223> Codifica la subunidad E1alpha de BKD <400>2

5

ctacttcgca: taaacataat caagcgctga ctcaggagct gcatatgggg cgttctccgc 60

ttcatccgtc: gcttcattta cgattgccat aatttcatcc agcatggttt gttctatctc 120

atcggacagc: aggcctgttt cctttaagta agcttgataa gtaagcaggg gatcactttt 180

tttcgcttcc: tctacttctt cacggcctct gtagctgctg tcatcgtcat cactggaatg 240

tggtgtaagg: cggtaagaaa tcgtttcaat taatgtcggg ccttctcctc tgcgtgccct 300

ttcgcgtgct: tctttaaccg cttgataaac ttccagcgga tcatttccat tcacagttac 360

gccaggcatc: ccatagccta tggcacggtc ggaaatgttc tcacatgcga cttgcttatc 420

gtaaggcact: gagattgcgt atttgttgtt ttcacacatg aaaataaccg gcagcttatg 480

gacagcggca: aagtttgccc cttcatggaa atcgccttgg tttgaagacc cttccccgaa 540

tgtaacaaag: gctgcgatat cctttttctc catacgtccc gcaagcgcaa taccgactgc 600

gtgcggcact: tgcgttgtaa ccggagatga tcccgtcaca atgcggtttt tcttttgtcc 660

gaaatgtccc: ggcatctggc ggcctcctga gttcggatct gctgcttttg caaacccgga 720

catcattaag: tcctttgctg tcatgccaaa cgcgagcacg acacccatgt ctctgtagta 780

cggcaataca: taatccattt cacggtcaag tgcgaaagcc gctcctacct gtgctgcttc 840

ctgtccttga: caagagatta caaatggaat tttgccagaa cggtttaaca gccacattct 900

ttcatcgatt: tttcttgcta acagcatggt tctatacata tcaacggctt cctgatcagt 960

cagccctagt: gcttgatgtc ggtttgtact cat 993

<210>3 <211> 381 <212> PRT

<213> Streptomyces avermitilis <220>

<221> MISC_FEATURE <223> Subunidad E1alpha de BKD

<400>3

Met Thr Val Met Glu Gin Arg Gly Ala Tyr Arg Pro Thr Pro Pro Pro 15 10 15

Ala Trp Gin Pro Arg Thr Asp Pro Ala Pro Leu Leu Pro Asp Ala Leu 20 25 30

Pro His Arg Val Leu Gly Thr Glu Ala Ala Ala Glu Ala Asp Pro Leu 35 40 45

Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Ala Glu Leu Val Arg Gly Arg Arg Tyr Asn 50 55 60

Claims

1. Una celula microbiana recombinante que comprende:

(a) polinucleotidos que codifican un complejo deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada (BKD) que

5 comprende polipeptidos que tienen actividad deshidrogenasa de alfa-cetoacidos de cadena ramificada, actividad

lipoamida aciltransferasa y actividad dihidrolipoamida deshidrogenasa,

(b) un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato,

(c) uno o mas polinucleotidos que codifican un polipeptido que tiene actividad enzimatica de derivacion de acidos

10 grasos seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) un polipeptido que tiene actividad tioesterasa;

(ii) un polipeptido que tiene actividad descarboxilasa;

(iii) un polipeptido que tiene actividad de acido carboxflico reductasa;

(iv) un polipeptido que tiene actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1);

15 (v) un polipeptido que tiene actividad aldehfdo descarbonilasa (EC 4.1.99.5);

(vi) un polipeptido que tiene actividad acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50);

(vii) un polipeptido que tiene actividad acil-ACP reductasa;

(viii) un polipeptido que tiene actividad ester sintasa (EC 3.1.1.67);

(ix) un polipeptido que tiene actividad OleA; y

20 (x) un polipeptido que tiene actividad OleCD u OleBCD, y

en el que al menos un polinucleotido de acuerdo con (a), (b) o (d) codifica un polipeptido que es heterologo para la celula microbiana recombinante y

en el que la celula microbiana recombinante produce un derivado de acidos grasos anteiso-ramificados cuando 25 se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

2. La celula microbiana recombinante de la reivindicacion 1, que ademas comprende

(e) uno o mas polinucleotidos que codifican un polipeptido que tiene actividad (R)-citramalato sintasa, actividad isopropilmalato isomerasa o actividad beta-isopropilmalato deshidrogenasa.

3. La celula microbiana recombinante de la reivindicacion 1, que produce una composicion de derivado de acidos 30 grasos que comprende derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos ramificados, en la

que al menos un 5% de los derivados de acidos grasos en la composicion son derivados de acidos grasos ramificados, cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos.

4. La celula microbiana recombinante de la reivindicacion 1, que produce al menos 25 mg/l de derivados de acidos 35 grasos ramificados cuando se cultiva en presencia de una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar

los polinucleotidos.

5. La celula microbiana recombinante de la reivindicacion 1, que comprende una secuencia de polinucleotidos endogena que codifica un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa que no utiliza una molecula de acil-CoA ramificada como sustrato, en la que la expresion de la secuencia de polinucleotidos endogena que codifica

40 un polipeptido que tiene actividad beta-cetoacil-ACP sintasa en la celula microbiana recombinante esta atenuada.

6. La celula microbiana recombinante de la reivindicacion 1, en la que la celula microbiana recombinante es un miembro del genero Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, Pantoea, Zymomonas, Rhodococcus, Pseudomonas, Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Humicola, Rhizomucor, Kluyveromyces, Pichia, Mucor, Myceliophtora, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus, Trametes, Chrysosporium, Saccharomyces,

45 Stenotrophamonas, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Streptomyces, Synechococcus, Chlorella o Prototheca.

5

10

15

20

25

30

35

7. Un cultivo celular que comprende la celula microbiana recombinante de la reivindicacion 1.

8. La celula microbiana recombinante de la reivindicacion 1, que produce al menos 10 mg/l de un derivado de acido graso anteiso-ramificado.

9. Un procedimiento de fabricacion de una composicion que comprende un derivado de acido graso anteiso- ramificado, comprendiendo el procedimiento:

obtener la celula microbiana recombinante de la reivindicacion 1,

cultivar la celula microbiana recombinante en un medio de cultivo que contiene una fuente de carbono en condiciones eficaces para expresar los polinucleotidos y producir una composicion de derivados de acidos grasos que comprende derivados de acidos grasos de cadena lineal y derivados de acidos grasos ramificados, en la que al menos un 10 % de los derivados de acidos grasos ramificados en la composicion son derivados de acidos grasos anteiso-ramificados y

opcionalmente, recuperar la composicion del medio de cultivo.

10. El procedimiento de la reivindicacion 9, en el que la composicion de derivados de acidos grasos ramificados producida en el medio de cultivo comprende al menos 10 mg/l de derivados de acidos grasos anteiso-ramificados.

11. El procedimiento de la reivindicacion 9, en el que la celula microbiana recombinante expresa uno o mas polipeptidos que tienen una actividad enzimatica derivada de acidos grasos seleccionada entre el grupo que consiste en:

(i) un polipeptido que tiene actividad tioesterasa;

(ii) un polipeptido que tiene actividad descarboxilasa;

(iii) un polipeptido que tiene actividad de acido carboxflico reductasa;

(iv) un polipeptido que tiene actividad alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1);

(v) un polipeptido que tiene actividad aldehfdo descarbonilasa (EC 4.1.99.5);

(vi) un polipeptido que tiene actividad acil-CoA reductasa (EC 1.2.1.50);

(vii) un polipeptido que tiene actividad acil-ACP reductasa;

(viii) un polipeptido que tiene actividad ester sintasa (EC 3.1.1.67);

(ix) un polipeptido que tiene actividad OleA; y

(x) un polipeptido que tiene actividad OleCD u OleBCD;

en el que la celula microbiana recombinante produce una composicion que comprende uno o mas acidos grasos anteiso-ramificados, esteres grasos anteiso-ramificados, esteres de cera anteiso-ramificados, aldehfdos grasos anteiso-ramificados, alcoholes grasos anteiso-ramificados, alcanos anteiso-ramificados, alquenos anteiso- ramificados, olefinas internas anteiso-ramificadas, olefinas terminales anteiso-ramificadas y cetonas anteiso- ramificadas.

12. La celula recombinante de la reivindicacion 1, en la que el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa tiene ademas actividad homoserina deshidrogenasa.

13. La celula recombinante de la reivindicacion 1, en la que el polipeptido que tiene actividad aspartocinasa es ThrA.

imagen1

a-cetoacido ramificado

Compleio BKD

alfa-cetoacido deshidrogenasa

hpoamida aciltransferasa

dihidrolipoamida deshidrogenasa

acil-CoA ram if icada

+ malonil-ACP

fi-cetoacil-ACP smtasa III

FabH)

(3-cetoacil-ACP ramificada

+ ma om -ACP

complejo de smtasa de

acidos grasos (FAS)

acil-ACP ramificada

enzimas derivadas

de acidos grasos

derivado de acido graso ramificado

Fig. 1

404

2-metil-butiril-CoA

{0)

+ malonil-ACP

fi-cetoacil-ACP sintasa III O ("FabH')

4-metil-3-oxo-hexanoil-ACP

+ malonil-ACP

J complejo de sintasa de j acidos grasos (FAS)

v

acil-ACP anteiso-ramificada

imagen2

enzimas derivadas de acidos grasos

derivado de acido graso anteiso-ramificado

Fig. 2A

isobutiril-CoA

(D)

+ malonil-ACP

fi-cetoacil-ACP sintasa III

4-metil-3-oxo-pentanoil-ACP

A

(E)

imagen3

+ malonil-ACP

complejo de sintasa de iicidos grasos (FAS)

acil-ACP iso-ramificada

enzimas derivadas de acidos grasos

derivado de acido graso iso-ramificado

Fig. 2B

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v (a Fig, 3B) Fig 3A

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Fig. 4

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Fig. 5

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Fig. 6

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Tiemipi

Ale C16:0

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Fig. 7